PL184825B1 - Białko chimeryczne, kompozycja szczepionki, zastosowanie białka chimerycznego, konstrukcja DNA, kaseta ekspresyjna, komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania polipeptydu zrekombinowanego - Google Patents

Białko chimeryczne, kompozycja szczepionki, zastosowanie białka chimerycznego, konstrukcja DNA, kaseta ekspresyjna, komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania polipeptydu zrekombinowanego

Info

Publication number
PL184825B1
PL184825B1 PL96321704A PL32170496A PL184825B1 PL 184825 B1 PL184825 B1 PL 184825B1 PL 96321704 A PL96321704 A PL 96321704A PL 32170496 A PL32170496 A PL 32170496A PL 184825 B1 PL184825 B1 PL 184825B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gnrh
amino acid
acid sequence
leukotoxin
sequence
Prior art date
Application number
PL96321704A
Other languages
English (en)
Other versions
PL321704A1 (en
Inventor
Andrew A. Potter
John G. Manns
Original Assignee
Univ Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Saskatchewan filed Critical Univ Saskatchewan
Publication of PL321704A1 publication Critical patent/PL321704A1/xx
Publication of PL184825B1 publication Critical patent/PL184825B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0006—Contraceptive vaccins; Vaccines against sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6833—Viral toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/655—Somatostatins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Bialko chimeryczne zawierajace polipeptyd leukotoksyny polaczony z multimerem zlozonym z czterech lub osmiu kopii wyodrebnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencje aminokwasowa pokazana na figurze 1A lub 1B, lub se- kwencje aminokwasowa posiadajaca przynajmniej 90% identycznosci wobec tej sekwencji. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową pokazana na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji. Korzystnie białko chimeryczne według wynalazku charakteryzuje się tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej, przy czym korzystnie jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111. Korzystnie białko chimeryczne według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji. Korzystnie multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydu leukotoksyny. Równie korzystnie multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja szczepionki zawierająca białko chimeryczne według wynalazku, opisane powyżej, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka chimerycznego według wynalazku, opisanego powyżej, do produkowania kompozycji szczepionki do prezentowania wyodrębnionego multimeru GnRH organizmowi pacjenta.
Przedmiotem wynalazku jest także konstrukcja DNA kodująca białko chimeryczne według wynalazku, opisane powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także kaseta ekspresyjna składająca się z:
(a) konstrukt DNA według wynalazku, jak opisano powyżej, i (b) sekwencji kontrolnych kierujących transkrypcją tego konstruktu, dzięki czemu, konstrukt ten może podlegać transkrypcji i translacji w komórce gospodarza.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza transformowana kasetą, ekspresyjną według wynalazku, którą opisano powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu znamienny tym, że:
(a) przygotowuje się populację komórek gospodarza według wynalazku, zdefiniowanych powyżej, i (b) prowadzi się hodowlę tych komórek w warunkach, w których przebiega wytwarzanie polipeptydu kodowanego przez tę kasetę ekspresyjną.
Niniejszy wynalazek jest oparty na konstrukcji nowych fuzji genowych między genem leukotoksyny P. haemolytica bądź jego wariantami a sekwencjami nukleotydowymi kodującymi wielokrotne polipeptydy GnRH. Takie konstrukcje wytwarzają chimerowe białka wykazujące zdumiewająco wzmocnioną immunogenność w porównaniu do reakcji immunologicznych wywoływanych przez podanie samego GnRH.
Tak więc, w pierwszym aspekcie, wynalazek ujawnia białko chimerowe zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony przez fuzję z multimerem składającym się zasadniczo z więcej niż jednego, wybranego polipeptydu GnRH, w którym to białku chimerowym część leukotoksyny działa wzmacniająco na immunogenność polipeptydu GnRH. Konkretniej, multimer GnRH może odpowiadać więcej niż jednej kopii wybranego polipeptydu albo epitopu GnRH albo wielokrotnym powtarzalnym jednostkom tandemowym wybranego polipeptydu albo epitopu GnRH. Ponadto, multimer GnRH może być zlokalizowany na końcach karboksylowych albo aminowych bądź w miejscach wewnętrznych w stosunku do polipeptydu leukotoksyny. Taki multimer GnRH może również odpowiadać cząsteczce o wzorze ogólnym GnRH-X-GnRH, w którym X jest wybrany z grupy obejmującej wiązanie peptydowe, aminokwasową grupę wydłużającą i [GnRH]n, gdzie n ma wartość większą od lub równą 1 a „GnRH” może oznaczać dowolny polipeptyd GnRH.
Ujawnione są również kompozycje szczepionki zawierające białka chimerowe i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz sposoby prezentacji wybranego multimeru GnRH
184 825 osobnikowi gospodarza polegające na podaniu temu osobnikowi skutecznej ilości kompozycji szczepionki.
W następnym aspekcie, wynalazek ujawnia konstrukcje DNA kodujące te chimerowe białka. Takie konstrukcje DNA zawierają pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd leukotoksyny związany operacyjnie z drugą sekwencją nukleotydową kodującą więcej niż jedną kopię epitopu GnRH.
W jeszcze innym aspekcie, wynalazek ujawnia kasety ekspresyjne zawierające (a) powyższe konstrukcje DNA i (b) sekwencje kontrolne, kierujące transkrypcją tej konstrukcji, dzięki czemu konstrukcje te mogą podlegać transkrypcji i translacji w komórce gospodarza.
W dalszym aspekcie, wynalazek ujawnia komórki gospodarza transformowane tymi kasetami ekspresyjnymi.
W kolejnym aspekcie, wynalazek ujawnia sposób wytwarzania polipeptydu rekombinacyjnego. W sposobie tym, (a) uzyskuje się populację komórek gospodarza opisanych powyżej i (b) prowadzi się hodowlę tej populacji komórek w warunkach, w których przebiega ekspresja polipeptydu kodowanego przez kasetę ekspresyjną.
Te i inne aspekty wynalazku okażą się bardziej zrozumiałe dla specjalisty po zapoznaniu się z dalszą treścią opisu.
Figury 1A i 1B przedstawiają sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasowe konstrukcji GnRH stosowanych w chimerowych fuzjach genów: leukotoksyna - polipeptyd GnRH. Figura 1A przedstawia GnRH-1, który zawiera pojedynczą kopię dekapeptydu GnRH. Figura 1B przedstawia GnRH-2, który zawiera cztery kopie dekapeptydu GnRH jeśli n = 1, osiem kopii GnRH jeśli n = 2, i tak dalej.
Figura 2 przedstawia strukturę plazmidu pAA352. Na tej figurze, tac oznacza hybrydowy promotor trp:lac z E. coli, bla oznacza gen b-laktamazy (oporności na ampicylinę), ori oznacza plazmidowe źródło replikacji oparte na ColE1, 1ktA oznacza gen strukturalny leukotoksyny zP. haemolytica alac1 oznacza represor zoperonu lac zE. coli. Kierunek transkrypcji i translacji genu leukotoksyny jest oznaczony strzałką. Rozmiary każdego ze składników nie są wyskalowane.
Figury 3-1 do 3-9 przedstawiają sekwencję nukleotydową i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasową leukotoksyny 352 (LKT 352). Pokazane są zarówno gen strukturalny dla LKT 352 jak i sekwencje flankujących regionów wektora.
Figura 4 przedstawia strukturę plazmidu pCB113 niosącego fuzję genową: leukotoksyna-GnRH (LKT-GnRH).
Figury 5-1 do 5-8 przedstawiają sekwencję nukleotydową i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasową białka chimerowego LKT-GnRH z pCB113. Sekwencja nukleotydowa i wyprowadzona z niej sekwencja aminokwasowa białka chimerowego LKT-GnRH z pCB112 są identyczne z odpowiednimi sekwencjami dla chimerowego białka pochodzącymi zpCB113, z tym, że sekwencja dla wielokrotnej kopii GnRH została wbudowana dwa razy, jak podano powyżej w opisie fig. 4.
Figura 6 przedstawia strukturę plazmidu pCB111 niosącego fuzję genową: leukotoksyna-GnRH (LKT-GnRH).
Figury 7-1 do 7-5 przedstawiają sekwencję nukleotydową i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasową białka chimerowego LKT-GnRH z pCB111. Sekwencja nukleotydowa i wyprowadzona z niej sekwencja aminokwasowa białka chimerowego LKT-GnRH z pCB114 są identyczne z odpowiednimi sekwencjami dla chimerowego białka pochodzącymi zpCB111, z tym, że sekwencja dla wielokrotnej kopii GnRH została wbudowana dwa razy, jak podano powyżej w opisie fig. 6.
Figura 8 przedstawia sekwencję nukleotydową i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasową tępego końca miejsca fuzji skróconego genu leukotoksyny z plazmidu pCB111 (fig. 8-2), gdzie z LKT 352 usunięto wewnętrzny fragment DNA (o długości około 1300 par zasad) przez trawienie enzymami restrykcyjnymi BstB1 i Nae1 (fig. 8-1).
W praktycznym wykonaniu wynalazku, o ile nie podano inaczej, stosowano znane techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, wirologii, technologii rekombinacji DNA i immunologii, znane specjalistom z tej dziedziny. Techniki te są szczegółowo opisane
184 825 w literaturze; patrz, np.: Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał; DNA Cloning, tomy I i II (wyd.: D.N. Glover); Oligonucleotide Synthesis (pod red. M. J. Gait'a); Mucleic Acid Hybridization (red.: B.D.Hames i S. J. Higgins); Animal Cell Culture (red.: R. K. Freshney); Immobilized Cells and Enzymes (ERL press); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, serie Methods in Enzymology (pod red. S. Colwick'a i N. Kaplan'a, Academic Press, Inc.) i Handbook of Experimental Immunology, tomy I-IV, pod red. D. M. Weir'a i C. C. Blackwell'a (Blackwell Scientific Publications).
A. Definicje
W opisie niniejszego wynalazku zastosowano następujące określenia, zdefiniowane poniżej.
„Hormon uwalniający gonadotropinę” albo „GnRH” odnosi się do dekapeptydu wydzielanego przez podwzgórze i kontrolującego uwalnianie zarówno hormonu luteinizującego (LH) jak i hormonu stymulującego pęcherzyk (FSH) u kręgowców (Fink G., British Medical Bulletin, 1979, 35, 155-160). U zwierząt kręgowych a zwłaszcza u ssaków sekwencja aminokwasowa GnRH jest wysoce konserwatywna. GnRH (uprzednio znany jako LHRH) pochodzący od większości zwierząt, w tym od człowieka, bydła, świni i ptaków posiada sekwencję aminokwasową piro-Glu^-His^-^Tip^-Si^i^-^TyT^-G^ly-Le^t^-Ai-g-Pr^o-G^ly^-NH^j (Murad i wsp., „Hormones and Hormone Antagonists w książce „The Pharmacological Basis of Therapeutics”, wyd. szóste (1980) i Seeburg i wsp., Nature, 1984, 311, 666-668.
Termin „polipeptyd GnRH” oznacza cząsteczkę pochodzącą znatywnej sekwencji GnRH oraz wytworzone techniką, rekombinacji albo zsyntetyzowane chemicznie polipeptydy GnRH posiadające sekwencje aminokwasowe zasadniczo homologiczne z sekwencją natywnego GnRH i zachowujące właściwości immunogenne, co jest opisane poniżej. Tak więc, termin ten obejmuje pochodne i analogi GnRH łącznie z dowolnymi dodaniami, podstawieniami i/lub delecjami jednego lub wielu aminokwasów, występującymi we wnętrzu albo na końcu aminowym bądź karboksylowym tego peptydu. Tak więc, w niniejszym wynalazku, określenie „polipeptyd GnRH” obejmuje cząsteczki posiadające sekwencję natywną, cząsteczki takie jak przedstawione na fig. 1A (posiadające N-terminalną resztę Gln zamiast reszty piro-Glu) i cząsteczki z dodaniami, podstawieniami i/lub delecjami innych aminokwasów, zachowujące zdolność powodowania wytwarzania przeciwciał, które reagują krzyżowo z występującym w stanie naturalnym GnRH. Szczególnie rozważane są tu powtarzające się sekwencje polipeptydów GnRH, takie jak w oligomerze przedstawionym na fig. 1B (w którym każdy z wybranych polipeptydów GnRH zawiera N-terminalne podstawienie Gln i w którym każdy inny polipeptyd GnRH zawiera podstawienie reszty Asp w pozycji 2). Definicją tą objęte są również epitopy GnRH.
Termin „epitop” oznacza miejsce na antygenie lub haptenie z którym wiąże się cząsteczka określonego przeciwciała. Ponieważ GnRH jest cząsteczką bardzo małą, łatwo przeprowadzono identyfikację jej epitopów zdolnych do wywoływania odpowiedzi ze strony przeciwciała, wykorzystując znane techniki [(Geysen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998-4002 - ogólna metoda szybkiego syntetyzowania peptydów w celu oznaczenia lokalizacji epitopów immunogennych w danym antygenie); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.708.871 (procedury identyfikacji i syntezy chemicznej epitopów na antygenach) i Geysen i wsp., Molecular Immunology, 1986, 23, 709-715 (technika identyfikacji peptydów o wysokim powinowactwie do danego przeciwciała)].
Stosowany w opisie termin „epitop komórki T” odnosi się do właściwości struktury peptydowej, a mianowicie do zdolności indukowania immunogenności komórek T w stronę struktury peptydowej lub związanego haptenu. W tym względzie, przyjmuje się, że epitopy komórek T zawierają determinanty o budowie liniowych peptydów, przyjmujące rozwinięte konformacje w obrębie szczeliny wiążącej peptyd w cząsteczkach głównego układu zgodności tkankowej (Unanue i wsp., Science, 1987, 236, 551-557). Konwersja polipeptydów na liniowe, peptydowe determinanty związane z głównym układem zgodności tkankowej klasy II (na ogół o długości 5-14 aminokwasów) znana jest pod nazwą „przetwarzania antygenu”, procesu prowadzonego przez komórki prezentujące antygen (APC). Tak więc, epitop komórki T jest określony przez lokalne cechy krótkiej struktury peptydowej, takie jak właściwości pierwszo10
184 825 rzędowej sekwencji aminokwasowej obejmującej rozkład ładunków i hydrofobowość oraz przez niektóre własności struktury drugorzędowej, takie jak helikalność, które to cechy nie zależą od sfałdowania całego polipeptydu. Przyjmuje się poza tym, że krótkie peptydy, rozpoznawalne przez komórki pomocnicze T mają na ogół struktury amfipatyczne (amfoteryczne) złożone ze strony hydrofobowej (dla interakcji z cząsteczką głównego układu zgodności tkankowej) i strony hydrofilowej (dla interakcji z receptorem na komórce T) (patrz Margalit i wsp., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines, wyd.: Marcel-Dekker Inc., pod red. G. C. Woodrowa i wsp., 1990, str. 109-116) i że te struktury amfipatyczne wys'^^^ujją w konfiguracji α-helikalnej (patrz np. Spouge i wsp., J. Immunol., 1987, 138, 204-212; Berkower i wsp., J. Immunol., 1986, 136, 2498-2503).
Tak więc, segmenty białek zawierające epitopy komórek T można z łatwością określać stosując liczne programy komputerowe (patrz np. Margalit i wsp., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines, wyd.: Marcel-Dekker Inc., pod red. G. C. Woodrowa i wsp., 1990, str. 109-116). Programy te w zasadzie porównują, sekwencję aminokwasową peptydu z sekwencjami, o których wiadomo, że indukują odpowiedź ze strony komórek T i poszukują takich układów aminokwasowych, które jak się przypuszcza, są niezbędnie potrzebne w epitopie komórki T.
„Immunogennym białkiem” albo „immunogenną sekwencją aminokwasową” jest odpowiednio takie białko albo taka sekwencja aminokwasowa, która wzbudza odpowiedź immunologiczną u osobnika, któremu jest podana. W niniejszym wynalazku, termin „immunogen GnRH” oznacza cząsteczkę GnRH, która po wprowadzeniu do organizmu gospodarza stymuluje odpowiedź immunologiczną. Taki immunogen GnRH obejmuje multimer odpowiadający więcej niż jednej wybranej sekwencji polipeptydu GnRH, a zwłaszcza, multimerowi posiadającemu powtórzenia bądź wielokrotne bądź tandemowe wybranych sekwencji polipeptydu GnRH, wielokrotne albo tandemowe powtórzenia wybranych epitopów GnRH albo dowolną ich kombinację.
Pod terminem „odpowiedź immunologiczna” na antygen lub szczepionkę rozumie się rozwój w organizmie gospodarza odpowiedzi immunologicznej komórkowej i/lub z udziałem przeciwciała na badaną kompozycję lub szczepionkę. Zazwyczaj, taka odpowiedź przebiega z wywołaniem jednego lub większej ilości następujących efektów: wytwarzania przeciwciał, komórek B, komórek pomocniczych T, komórek supresorowych T i/lub cytotoksycznych komórek T i/lub komórek T γδ, skierowanych swoiście na antygen bądź antygeny zawarte w danej kompozycji albo w szczepionce. Odpowiedź immunologiczną wykrywa się korzystając z jednej z szeregu znanych prób immunologicznych.
Termin „polipeptyd leukotoksyny” albo „polipeptyd LKT” oznacza polipeptyd obejmujący co najmniej jeden epitop z komórki T, pochodzący z białka należącego do rodziny cząsteczek charakteryzujących się karboksy-terminalną, konserwatywną sekwencją aminokwasową Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander i wsp., DNA, 1989, 8, 15-28), w której X oznacza Lys, Asp, Val albo Asn. Takie białka znajdują się między innymi w leukotoksynach pochodzących z P. haemolytica i Actinobacillus pleuropneumoniae, oraz w alfa-hemolizynie z E. coli (Strathdee i wsp., Infect. Immun. 1987, 55, 3233-3236; Lo, Can. J. Vet. Res., 1990, 54, S33-S35; Welch, Mol. Microbiol., 1991, 5, 521-528). Ta rodzina toksyn znana jest pod nazwą rodziny toksyn „RTX” (Lo, Can. J. Vet. Res., 1990, 54, S33-S35). Termin „polipeptyd leukotoksyny” odnosi się również do polipeptydu leukotoksyny zsyntetyzowanego chemicznie, wyizolowanego z organizmu, który go wytwarza albo otrzymanego drogą rekombinacji. Termin ten oznacza ponadto białko immunogenne posiadające sekwencję aminokwasową zasadniczo homologiczną z sąsiadującą sekwencją aminokwasową znajdującą się w określonej, natywnej cząsteczce leukotoksyny. Tak więc, obejmuje on sekwencje o pełnej długości i sekwencje częściowe a także analogi tych sekwencji. Jakkolwiek natywne leukotoksyny o pełnej długości wykazują aktywność leukotoksyczną, termin „leukotoksyna” oznacza również cząsteczki, które pozostają immunogenne a nie mają charakteru cytotoksycznego leukotoksyn natywnych. Sekwencje nukleotydowe i odpowiadające im sekwencje aminokwasowe szeregu leukotoksyn są znane (patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr, nr 4.957.739 i 5.055.400; Lo i wsp., Infect. Immun., 1985, 50, 667-67; Lo i wsp., Infect.
184 825
Immun., 1987, 55, 1987-1906; Strathdee i wsp., Infect. Immun., 55, 3233-3236; Highlander i wsp., DNA, 1989, 8, 15-28; Welch, Mol. Microbiol., 1991, 5, 521-528). W chimerach wytwarzanych według wynalazku, wybrana sekwencja polipeptydowa leukotoksyny nadaje zwiększoną immunogenność związanemu z nią przez fuzję multimerowi GnRH przez dostarczenie między innymi epitopów komórek T zawierających małe segmenty peptydowe o długości rzędu pięciu do czternastu aminokwasów, zdolnych do tworzenia kompleksów z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej klasy II do prezentowania komórkom T i do ich aktywacji. Jak opisano poniżej, te epitopy komórek T występują w całej cząsteczce leukotoksyny i sądzi się, że koncentrują się w częściach N-końcowych leukotoksyny, to znaczy, między resztami aminokwasowymi 1 a 199.
Stosowane w niniejszym opisie określenie: polipeptyd leukotoksyny, „który nie posiada aktywności cytotoksycznej” odnosi się do opisanego powyżej polipeptydu leukotoksyny, który nie wywiera znaczącej cytotoksyczności w porównaniu z natywną leukotoksyną o pełnej długości (taką jak opisana leukotoksyna o pełnej długości z P. haemolytica, ujawniona w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr, nr 5.055.400 i 4.957.739) zachowuje jednak nadal immunogenność i co najmniej jeden epitop komórki T. Polipeptydy leukotoksyny można analizować na aktywność leukotoksyczną wykorzystując jedną z wielu znanych prób, takich jak próba uwalniania dehydrogenazy mleczanowej opisana przez Korzeniewskiego i wsp. (Journal of Immunological Methods, 64, 313-320), w której cytotoksyczność oznacza się przez uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej z neutrofili bydlęcych. Cząsteczkę określa się jako leukotoksyczną jeśli wywołuje statystycznie znamienne uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej w porównaniu z cząsteczką nieleukotoksyczną użytą jako kontrola.
W niniejszym wynalazku, konstrukcja chimer LKT-GnRH zawierających polipeptydy leukotoksyny pozbawione aktywności leukotoksycznej daje szereg ważnych korzyści. Po pierwsze, polipeptyd leukotoksyny pozbawiony aktywności leukotoksycznej jest pożądany, gdyż wstrzyknięcie danemu osobnikowi aktywnej toksyny może wywołać miejscową śmierć komórek (granulocytów obojętnochłonnych i makrofagów) i z kolei spowodować poważną odpowiedź zapalną oraz ropień w miejscu iniekcji. Aktywność leukotoksyczna powodująca zabijanie makrofagów może prowadzić do osłabionej prezentacji antygenu, a zatem i słabszej odpowiedzi immunologicznej. Usunięcie części cytotoksycznej, jak w przypadku nieleukotoksycznych polipeptydów LKT stosowanych do wytwarzania białek fuzyjnych według wynalazku, umożliwia poza tym użycie skróconego genu LKT, który ma zdolność ekspresji na znacznie wyższych poziomach niż LKT o pełnej długości. Użycie nieleukotoksycznych polipeptydów LKT w fuzjach konstruowanych w niniejszym wynalazku, zachowujących wystarczającą, antygeniczność wobec komórek T, obniża całkowitą ilość antygenu leukotoksyna-GnRH, który powinien być podany osobnikowi aby wywołać wystarczającą odpowiedź komórek B na wybrane polipeptydy GnRH. Konkretnymi przykładami immunogennych polipeptydów leukotoksyny pozbawionych aktywności cytotoksycznej są LKT 352 i LKT 111, szczegółowo opisane poniżej.
Określenie „LKT 352” oznacza białko pochodzące z genu 1ktA obecnego w plazmidzie pAA352 (fig. 2, numer akcesyjny ATCC: 68283). Sekwencja nukleotydowa tego genu i odpowiadająca mu sekwencja aminokwasowa są podane w publikacji zgłoszenia patentowego światowego, WO 91/15237 i przedstawione na fig. 3. Ten gen koduje skróconą leukotoksynę, posiadającą. 931 aminokwasów, masę cząsteczkową oszacowaną na około 99 kDa, i nie zawierającą cytotoksycznej części tej cząsteczki. Wytworzony w ten sposób skrócony gen daje ekspresję na znacznie wyższych poziomach niż cząsteczka o pełnej długości (ponad 40% całkowitego białka komórkowego wobec poniżej 1% całkowitego białka komórkowego dla formy o pełnej długości) i można go znacznie łatwiej oczyszczać. „Pochodzący” LKT 352 nie musi fizycznie pochodzić z sekwencji obecnej w plazmidzie pAA352. Może on być otrzymany w dowolny sposób, w tym np. przez syntezę chemiczną lub może być wytworzony drogą rekombinacji. Ponadto, sekwencja aminokwasowa tego białka musi być tylko zasadniczo homologiczna z podaną sekwencćą. Tak więc, mogą występować warianty tej sekwencji tak długo,
184 825 jak długo polipeptyd LKT wykazuje funkcje wzmacniania immunogenności antygenu, z którym jest związany i nie wywiera aktywności leukotoksycznej.
Termin „lKt 111” oznacza polipeptyd leukotoksyny pochodzący z genu obecnego w plazmidzie pCB111 (fig. 6, numer akcesyjny ATCC: 69748). bekwencja nukleotydowa tego genu i odpowiadająca mu sekwencja aminokwasowa są przedstawione na fig. 7. Ten gen koduje skróconą wersję leukotoksyny, którą otrzymano z rekombinantowego genu leukotoksyny obecnego w plazmidzie pAA352 (fig. 2, numer akcesyjny ATCC: 68283) przez usunięcie wewnętrznego fragmentu DNA o długości około 1300 par zasad. Polipeptyd LKT 111 posiada masę cząsteczkową oszacowaną na około 52 kDa (w porównaniu z 99 kDa dla polipeptydu LKT 352) ale zachowuje części N-końca z LKT 352 zawierające epitopy komórek T, które są niezbędne dla uzyskania wystarczającej immunogenności komórek T i części C-końca z LKT 352 zawierające dogodne miejsca restrykcyjne do użycia w sposobie wytwarzania białek fuzyjnych według wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem, peptyd leukotoksyny KLT 111 nie musi fizycznie pochodzić z sekwencji obecnej w plazmidzie pCB111. Może on być otrzymany w dowolny sposób, w tym np. przez syntezę chemiczną lub wytworzony drogą rekombinacji. Ponadto, sekwencja aminokwasowa tego białka musi być tylko zasadniczo homologiczna z podaną sekwencją. Tak więc, mogą występować warianty tej sekwencji tak długo, jak długo białko to wykazuje funkcje wzmacniania immunogenności antygenu, z którym jest związane i nie wywiera aktywności leukotoksycznej.
Chimera polipeptydowa: leukotoksena-GnRH wykazuje „zwiększoną immunogenność” jeśli posiada większą zdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej niż odpowiedni sam multimer GnRH. Taką zwiększoną immunogenność można oznaczać przez podanie zwierzętom określonego polipeptydu leukotoksena-GnRH i multimeru GnRH jako kontroli i porównanie mian przeciwciał przeciw tym dwóm preparatom, stosując standardowe próby, takie jak znane próby radioimmunologiczne i ELIbA.
„Rekombinantowe” białka lub polipeptydy odnoszą się do polipeptydów produkowanych technikami rekombinacji DNA, to znaczy, produkowanymi z komórek transformowanych egzogenną konstrukcją DNA, kodującą żądany polipeptyd. „bentetycznemi” białkami lub polipeptydami są te, które wytworzono na drodze syntezy chemicznej.
„Śekwencją kodującą” DNA albo „sekwencją nukleotydową kodującą” określone białko jest sekwencja DNA, która podlega transkrypcji i translacji z wytworzeniem polipeptydu in vivo albo in vitro jeśli jest umieszczona pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulacyjnych. Granice sekwencji kodującej są oznaczone kodonem startu na końcu 5' (aminowym) i kodonem końca translacji na końcu 3' (karboksylowym). bekwencja kodująca może obejmować (ale nie musi się ograniczać) sekwencje prokariotyczne, cDNA z eukariotycznego mRNA, sekwencje genomowego DNA z eukariotycznego DNA (np. ssacze) a nawet syntetyczne sekwencje DNA. bekwencja końca transkrypcji będzie na ogół zlokalizowana w kierunku 3' od sekwencji kodującej.
Termin „sekwencje kontrolne” DNA oznacza zbiorczo sekwencje promotora, miejsca wiązania rybosomu, sygnały poliadenylacji, sekwencje końca transkrypcji, domeny regulacyjne „w górę”, wzmacniacze i podobne, które kolektywnie umożliwiają transkrypcję i translację sekwencji kodującej w komórce gospodarza.
bekwencja kodująca jest „operacyjnie związana z” inną sekwencją kodującą jeśli polimeraza RNA przetworzy przez transkrypcję te dwie sekwencje kodujące w mRNA, który z kolei będzie podlegał translacji do chimerowego polipeptydu kodowanego przez te dwie sekwencje kodujące. bekwencje kodujące nie muszą ze sobą sąsiadować tak długo, jak długo transkrybowana sekwencja jest ostatecznie przetwarzana z wytworzeniem żądanego chimerowego białka. bekwencja kontrolna jest „operacyjnie związana z” sekwencją kodującą jeśli kontroluje transkrypcję sekwencji kodującej.
bekwencja kontrolna „kieruje transkrypcją” sekwencji kodującej w komórce jeśli polimeraza RNA zwiąże sekwencję promotora i przetworzy sekwencję kodującą na mRNA, który następnie będzie podlegał translacji do polipeptydu kodowanego przez sekwencję kodującą.
„Komórką gospodarza” jest komórka, która została transformowana albo jest zdolna do transformacji przez egzogenną sekwencję DNA.
184 825
Komórka została „transformowana” egzogennym DNA jeśli ten egzogenny DNA został wprowadzony do wnętrza błony komórkowej. Egzogenny DNA może ale nie musi podlegać integracji (wiązaniu, kowalencyjnemu) z chromosomalnym DNA i wchodzić w skład genomu komórkowego. Przykładowo, w organizmach prokariotycznych i w drożdżach ten egzogenny DNA może być utrzymywany na elemencie episomalnym, takim jak plazmid. W odniesieniu do komórek eukariotycznych, za trwale transformowaną komórkę uważa się taką, w której egzogenny DNA został zintegrowany z chromosomem i podlega dziedziczeniu przez komórki potomne w wyniku replikacji chromosomu. Stabilność ta manifestuje się zdolnością komórki eukariotycznej do ustalenia linii komórkowych lub klonów złożonych z komórek potomnych zawierających ten egzogenny DNA.
Dwie sekwencje .DNA albo polipeptydowe są „zasadniczo homologiczne” jeśli co najmniej około 80% (korzystnie co najmniej około 90% a najkorzystniej co najmniej około 95%) nukleotydów albo aminokwasów pokrywa się na określonej długości cząsteczki. Sekwencje DNA, które są zasadniczo homologiczne można zidentyfikować w próbach hybrydyzacji Southerna, przykładowo w warunkach ścisłych, określonych dla danego układu. Dobranie odpowiednich warunków hybrydyzacji leży w zakresie możliwości specjalisty (patrz np. Sambrook i wsp., jak wyżej; DnA Cloning, tomy I i II, jak wyżej; Nucleic Acid Hybridization, jak wyżej).
„Heterologicznym” regionem w konstrukcji DNA jest możliwy do zidentyfikowania segment DNA w obrębie albo przyłączony do innej cząsteczki DNA, nie występujący w połączeniu z tą inną cząsteczką w stanie naturalnym. Tak więc, jeśli region heterologiczny koduje gen bakteryjny, gen ten będzie zwykle flankowany przez taki DNA, który nie flankuje genu bakteryjnego w genomie bakterii wyjściowych. Innym przykładem heterologicznej sekwencji kodującej jest konstrukcja, w której sama sekwencja kodująca nie występuje w stanie naturalnym (np. sekwencje syntetyczne posiadające kodony różniące się od genu natywnego). Odmiany alleliczne albo mutacje przebiegające w stanie naturalnym nie wchodzą w zakres heterologicznego regionu DNA według wynalazku.
Określenie „kręgowiec” obejmuje dowolnego członka podtypu strunowców, włącznie ze ssakami takimi jak gryzonie, bydło, świnie, owce, kozy, konie i człowiek, zwierzęta domowe, takie jak psy i koty, ptaki, zarówno ptaki domowe, dzikie jak . i łowne, takie jak kury i koguty oraz kurczęta, indyki i inne ptactwo kurowate. Termin ten nie odnosi się do konkretnego wieku i obejmuje zarówno zwierzęta dorosłe jak i nowo narodzone.
B. Metody ogólne
Podstawą niniejszego wynalazku jest odkrycie, że polipeptydy leukotoksyny sprzęgnięte z wybranymi powtórzeniami (albo multimerami) polipeptydu GnRH mają zdolność nadawania podwyższonej immunogenności zasocjowanym z nimi resztom GnRH.
Polipeptydy leukotoksyny działają tu jako białka nośnikowe, prezentujące wybrane multimery GnRH układowi immunologicznemu danego osobnika w formie wysoce immunogennej. Tak więc, białka chimerowe wytworzone według wynalazku można przygotowywać w formie kompozycji szczepionek zapewniających zwiększoną immunogenność prezentowanych polipeptydów GnRH. Fuzja genu leukotoksyny z wybranymi polipeptydami GnRH ułatwia również oczyszczanie tego chimerowego białka od komórek, które go wytwarzają.
Zgodnie z powyższym, przykładowo opisane są chimery leukotoksyny składające się z leukotoksyny związanej przez fuzję z więcej niż jedną sekwencją peptydu GnRH. Do szczególnych rozwiązań według wynalazku należą chimery zawierające polipeptyd leukotoksyny związany przez fuzję z multimerem GnRH, który to multimer składa się zasadniczo z co najmniej jednej sekwencji dekapeptydu GnRH albo z co najmniej jednej powtarzalnej jednostki sekwencji odpowiadającej co najmniej jednemu epitopowi z wybranej cząsteczki GnRH. Ponadto, wszystkie peptydowe sekwencje GnRH mogą być takie same albo mogą odpowiadać różnym pochodnym, analogom, wariantom albo epitopom GnRH tak długo, jak długo zachowują zdolność wzbudzania odpowiedzi immunologicznej. Reprezentatywna sekwencja nukleotydowa dekapeptydu GnRH jest przedstawiona na fig. 1A. Sekwencja GnRH według wynalazku jest na końcu aminowym zmodyfikowana resztą glutaminową w miejsce kwasu piroglutaminowego występującego w sekwencji naturalnej. Ta szczególna substytucja daje
184 825 cząsteczkę, która zachowuje natywną strukturę z kwasem glutaminowym a przy tym zachowuje pozbawioną ładunków strukturę piroglutaminianu. Tak więc, otrzymany peptyd nie wymaga cyklizacji reszty kwasu glutaminowego i nie musi być wytwarzany w warunkach wymaganych do przebiegu cyklizacji.
Sekwencja GnRH jest stosunkowo krótka, może więc być z łatwością otrzymana z użyciem technik syntetycznych, takich jak szczegółowo opisane poniżej. W niniejszym wynalazku sekwencję polipeptydu leukotoksyny stosuje się w celu nadania immunogenności związanym z nią polipeptydom GnRH (jako białko nośnikowe), w celu wspomożenia wywołania odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej przeciw endogennemu GnRH u kręgowców. W ten sposób immunizacja za pomocą GnRH może regulować płodność u szczepionych osobników na drodze przerwania cyklu rui albo spermatogenezy. Szczegółowy opis GnRH znajduje się w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.975.420.
Ponadto, szczególnym celem wynalazku było dostarczenie pewnej i skutecznej alternatywy wobec inwazyjnych procedur sterylizacji stosowanych obecnie u zwierząt domowych i gospodarskich, takich jak kastracja chirurgiczna, chirurgiczne usunięcie jajników i macicy i podobne. Supresja immunologiczna aktywności reprodukcyjnej u kręgowców zużyciem chimer leukotoksyna-GnRH wytworzonych według wynalazku stanowi taką skuteczną alternatywę, gdyż konstrukcje te powodują jednorodną inaktywację aktywności reprodukcyjnej u immunizowanych zwierząt. W celu uzyskania korzystnej alternatywy w stosunku do zabiegów chirurgicznych, odpowiedni produkt szczepionki sterylizacyjnej musi w jednorodny sposób inaktywować zdolności reprodukcyjne u poszczególnych zwierząt w odpowiedzi na minimum szczepień. Ta właściwość jest szczególnie ważna w przypadkach sterylizacji immunologicznej całych stad zwierząt, a zwłaszcza jeśli trzeba dokonać kastracji immunologicznej prosiąt płci męskiej w celu pozbycia się „woni knura”, powstającej w wyniku syntezy steroidowych hormonów płciowych w normalnie funkcjonujących jądrach świni płci męskiej (Meloen i wsp., Vaccine, 1994, 12 (8), 741-746). Wcześniejsze wysiłki zmierzające do opracowania takiego produktu nie dały jednorodnych wyników w powodu niewystarczającej immunogenności peptydów GnRH i/lub związanych z nimi układów nośnikowych. Wytworzone wcześniej różne szczepionki oparte na GnRH nie były w stanie wywołać wystarczającej odpowiedzi immunologicznej przeciw endogennemu GnRH.
Chimery: leukotoksyna-polipeptyd GnRH według wynalazku zawierają część GnRH, która odpowiada więcej niż jednej wybranej sekwencji polipeptydowej GnRH w celu nadania większej immunogenności antygenowi peptydu GnRH. Ta cecha jest oparta na wykryciu, że endogennym białkom na ogół można nadać właściwości skutecznych autoantygenów przez multimeryzację ich epitopów, co zostało szczegółowo opisane powyżej. Bardziej konkretnie, część GnRH tych nowych chimer według wynalazku może zawierać powtórzenia wielokrotne bądź tandemowe wybranych sekwencji GnRH, powtórzenia wielokrotne bądź tandemowe wybranych epitopów GnRH albo dowolne możliwe ich kombinacje. Epitopy GnRH można identyfikować z wykorzystaniem technik wyżej opisanych lub też fragmenty białek GnRH można badać na immunogenność i fragmenty aktywne stosować w kompozycjach zamiast całkowitego polipeptydu. Sekwencja szczególnie korzystnej części GnRH według wynalazku jest przedstawiona na fig. 1B, na której cztery sekwencje GnRH, oznaczone jako (1), (2), (3) i (4) są rozdzielone tripletowymi aminokwasowymi sekwencjami wydłużającymi, posiadającymi różne kombinacje reszt seryny i glicyny. W omawianym oligomerze, co druga sekwencja GnRH (oznaczone odpowiednio jako (2) i (4)) zawiera niekonserwatywną substytucję w pozycji drugiej dekapeptydu GnRH, która to substytucja polega na wstawieniu reszty Asp w miejsce reszty His w natywnej sekwencji GnRH. Wytworzona, naprzemienna multimeryczna sekwencja GnRH nadaje wysoką immunogenność peptydowemu antygenowi GnRH użytemu w białkach chimerowych według wynalazku. Wynalazkiem objęte są również inne analogi GnRH, odpowiadające dowolnym addycjom, substytucjom i/lub delecjom jednego lub kilku aminokwasów, do użycia w powtarzających się (repetytywnych) lub naprzemiennych sekwencjach multimerowych.
Ponadto, szczególna część GnRH wskazana na fig. 1B zawiera między resztami GnRH sekwencje wydłużające. Wynalazkiem objęte jest zwłaszcza strategiczne użycie różnych
184 825 sekwencji wydłużających wstawianych pomiędzy wybranymi polipeptydami GnRH w celu nadania tym konstrukcjom zwiększonej immunogenności. Zgodnie z wynalazkiem, wybrana sekwencja wydłużająca może kodować wiele różnych reszt o długości jednego lub większej ilości aminokwasów. Wybrane grupy wydłużające mogą korzystnie zawierać miejsca rozszczepiania enzymatycznego, dzięki którym wytwarzana chimera może być dalej przetwarzana przez enzymy proteolityczne in vivo [(przez komórki prezentujące antygen (APC) lub podobne], dając wiele peptydów, z których każdy zawiera co najmniej jeden epitop dla komórki T pochodzący z porcji nośnikowej (części leukotoksyny) - i które korzystnie są związane przez fuzję z zasadniczo całkowitą sekwencją polipeptydu GnRH. Grupy rozdzielające można także konstruować w taki sposób, aby region złącza pomiędzy wybranymi resztami GnRH zawierał sekwencję wyraźnie obcą dla immunizowanego osobnika, nadając dzięki temu zwiększoną immunogenność towarzyszącym peptydom GnRH. Ponadto, sekwencje rozdzielające mogą być konstruowane w taki sposób, aby wprowadzić antygeniczność komórek T, a więc mogą to być sekwencje, które kodują amfipatyczne i/lub α-helikalne sekwencje peptydowe, uznawane generalnie za dostarczające immunogennych epitopów komórek pomocniczych T. Konkretne epitopy komórek T do sekwencji rozdzielających można dobierać różnie, zależnie od konkretnego gatunku kręgowca, który ma być szczepiony. Jakkolwiek przykładowo wymieniono konkretne części GnRH, które zawierają sekwencje rozdzielające, przedmiotem wynalazku jest również objęty multimer GnRH, zawierający bezpośrednio sąsiadujące sekwencje GnRH (bez wstawionych sekwencji rozdzielających).
Kompleks: leukotoksyna - polipeptyd GnRH można dogodnie wytwarzać techniką rekombinacji, w postaci białka chimerowego. Część GnRH tej chimery można łączyć przez fuzję albo w pozycji 5' albo 3' w stosunku do części leukotoksyny w tej cząsteczce albo część GnRH można umieszczać w miejscach wewnętrznych w stosunku do cząsteczki leukotoksyny. Sekwencja nukleotydowa kodująca leukotoksynę A1 o pełnej długości z P. haemolytica została oznaczona (patrz np. Lo, Infect. Immun. 1987, 55, 1987-1996; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.055.400, w którym dodatkowo ujawniono szereg wariantowych sekwencji genu leukotoksyny).
Podobnie, zostały również oznaczone sekwencje kodujące dla GnRH świni, bydła i ptactwa (Murad i wsp., Hormones and Hormone Antagonists w książce: Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. VI, 1980) a także został sklonowany cDNA dla ludzkiego GnRH, a więc, jego sekwencja jest już dobrze poznana (Seeburg i wsp., Nature, 1984, 311, 666-668). Ujawniono też dodatkowe polipeptydy GnRH o znanych sekwencjach, takie jak cząsteczka GnRH występująca w łososiu i u kurcząt (zgłoszenie patentowe PCT, WO 86/07383, opublikowane 18 grudnia 1986 r.). Należy mieć na względzie, że u kręgowców, a zwłaszcza u ssaków, sekwencja GnRH jest wysoce konserwatywna a u świni, bydła, ptaków i człowieka sekwencje GnRH są identyczne. Żądane geny leukotoksyny i GnRH można klonować, izolować i poddawać ligacji ogólnie znanymi technikami rekombinacji (np. Sambrook i wsp., jak wyżej).
Alternatywnie, zamiast klonowania, sekwencje DNA kodujące te białka chimerowe można wytwarzać syntetycznie. Można zaprojektować sekwencję DNA z kodonami odpowiednimi dla konkretnej sekwencji aminokwasowej. W zasadzie, jeśli sekwencja będzie użyta do ekspresji, dobiera się kodony preferowane przez docelowego gospodarza. Całkowitą sekwencję konstruuje się z nakładających się częściowo oligonukleotydów przygotowanych znanymi sposobami i zestawia się z nich całkowitą sekwencję kodującą (patrz np. Edge, Nature 1981, 292, 756; Nambair i wsp., Science, 1984, 223, 1299; Jay i wsp., J. Biol. Chem. 1984, 259, 6311).
Po przygotowaniu i wyizolowaniu sekwencji kodujących dla białek chimerowych można je klonować do odpowiedniego wektora bądź replikonu. Specjalistom znanych jest wiele wektorów i wyselekcjonowanie odpowiedniego wektora klonującego jest kwestią wyboru. Przykłady wektorów rekombinantowego DNA do klonowania i komórki gospodarza, które można nimi transformować obejmują bakteriofaga lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pA-CYC177 (E. coli), pKT230 (bakterie gram-ujemne), pGv1106 (bakterie gram-ujemne), pLAFR1 (bakterie gram-ujemne), pME290 (bakterie gram-ujemne, nie E. coli), pHV14 (E. coli i Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces),
184 825
YIp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) i bydlęcy wirus brodawczaka (komórki ssacze). Są one ogólnie opisane w podręczniku: DNA Cloning, tomy I i II, jak wyżej; T. Maniatis i wsp., jak wyżej; B. Perbal, jak wyżej).
Gen fiizyjny można umieszczać pod kontrolą promotora, miejsca wiązania rybosomu (do ekspresji w bakteriach) i ewentualnie, operatora (razem zwanymi elementami kontrolnymi), tak, aby sekwencja DNA kodująca białko chimerowe podlegała transkrypcji do RNA w komórce gospodarza transformowanej wektorem niosącym tę konstrukcję ekspresyjny Sekwencja kodująca może ale nie musi zawierać peptydu sygnalnego albo sekwencji liderowej. Ekspresję chimerowych białek według wynalazku można prowadzić stosując np. natywny promotor z P. haemolytica, promotor tac z E. coli albo promotor i sekwencję sygnałową z genu dla białka A (spa). Sekwencje liderowe mogą być usuwane przez gospodarza bakteryjnego w procesach post-translacyjnych (patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.431 .139, 4.425A3^T, 4.338.397).
Poza sekwencjami kontrolnymi może być korzystne dodanie sekwencji regulacyjnych, które pozwalają na regulowanie ekspresji sekwencji białkowych stosownie do wzrostu komórki gospodarza. Sekwencje regulacyjne są znane specjalistom a ich przykładami są te, które powodują włączanie i wyłączanie ekspresji genu w odpowiedzi na bodziec chemiczny lub fizyczny, w tym związek regulacyjny. W wektorze mogą się również znajdować inne typy elementów regulacyjnych, np. sekwencje wzmacniające.
Wektor ekspresyjny konstruuje się w taki sposób, aby konkretna sekwencja kodująca fuzję była zlokalizowana w wektorze z odpowiednimi sekwencjami regulacyjnymi i aby usytuowanie i orientacja sekwencji kodującej względem sekwencji kontrolnych było takie, jakie jest potrzebne do transkrypcji tej sekwencji kodującej pod kontrolą sekwencji kontrolnych (np. polimeraza RNA, która wiąże się z cząsteczka DNA w miejscu sekwencji kontrolnych prowadzi transkrypcję sekwencji kodującej). W celu osiągnięcia tego celu może być potrzebna modyfikacja sekwencji kodujących konkretne białko chimerowe. Przykładowo, w pewnych przypadkach może być konieczne zmodyfikowanie tej sekwencji, tak, aby była związana z sekwencjami kontrolnymi w odpowiedniej orientacji, np., aby utrzymać ramkę odczytu. Sekwencje kontrolne i inne sekwencje regulacyjne można ligować z sekwencją kodującą przed insercją do wektora takiego jak wektor klonujący opisany powyżej. Alternatywnie, sekwencję kodującą można klonować bezpośrednio do wektora ekspresyjnego, który już zawiera sekwencje kontrolne i odpowiednie miejsce restrykcyjne.
W niektórych przypadkach może być pożądane dodanie sekwencji, które powodują sekrecję tego polipeptydu z organizmu gospodarza z następnym odszczepieniem sygnału wydzielniczego. Może być również pożądane wytworzenie mutantów albo analogów tych chimerowych białek. Takie mutanty lub analogi można otrzymać przez delecję części sekwencji kodującej to białko, przez insercję sekwencji i/lub przez substytucję jednego lub większej ilości nukleotydów w obrębie tej sekwencji. Techniki modyfikowania sekwencji nukleotydowych, takie jak sterowana miejscem mutageneza, są. dobrze znane specjalistom (patrz np. Maniatis i wsp., jak wyżej; DNA Cloning, tom I i II, jak wyżej; Nucleic Acid Hybridization, jak wyżej).
W stanie techniki opisanych jest wiele prokariotycznych wektorów ekspresyjnych. Jako przykłady można podać opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach: 4.440.859, 4.436.815, 4.431.740, 4.431.739, 4.428.941, 4.425.437, 4.418.149, 4.411.994, 4.366.246, 4.342.832 oraz opisy patentowe Wielkiej Brytanii o numerach: 2.121.054, 2.008.123, 2.007.675 i publikację zgłoszenia patentowego europejskiego, nr 103.395. Znane są również drożdżowe wektory ekspresyjne, ich przykłady są podane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach: 4.446.235, 4.443.539, 4.430.428, w publikacjach zgłoszeń patentowych europejskich 103.409, 100.561 i 96.491.
Zależnie od wybranego układu ekspresyjnego i gospodarza, białka według wynalazku wytwarza się prowadząc wzrost komórek gospodarza transformowanych opisanym powyżej wektorem ekspresyjnym w warunkach, w których jest wytwarzane to białko. Następnie, chimerowe białko izoluje się z komórek gospodarza i oczyszcza. Jeśli układ ekspresyjny wydziela białko do pożywki wzrostowej to białko to można oczyszczać bezpośrednio z tej
184 825 pożywki. Jeśli białko nie jest wydzielane, izoluje się je z lizatów komórkowych. Dobór odpowiednich v'arunków wzrostu i metod odzysku leży w zakresie wiedzy specjalisty z tej dziedziny.
Białka chimerowe według wynalazku można również wytwarzać przez syntezę chemiczną, taką jak synteza peptydu w fazie stałej, opierając się na oznaczonych sekwencjach aminokwasowych. Sposoby te są znane specjalistom. Techniki syntezy peptydów w fazie stałej są opisane np. przez J. M. Stewarta i J. D. Younga, Solid Phase Peptide Synthesis, II wyd., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) i G. Barany i R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, pod red. E. Gross'a i J. Meienhofera, tom 2, Academic Press, Nowy Jork, 1980, str. 3-254. Metody klasycznej syntezy w roztworze są opisane np. w publikacjach: M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984; red.: E. Gross i J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, jak wyżej, tom I.
Osobników można immunizować chimerowymi białkami konstruowanymi według wynalazku przez podanie kompozycji szczepionek zawierających te białka. Przed immunizacją może być korzystne dalsze zwiększenie immunogenności konkretnego chimerowego białka. Można tego dokonać jedną z wielu dróg znanych specjalistom z tej dziedziny. Przykładowo, białko fuzyjne: leukotoksyna - polipeptyd GnRH można podawać w postaci związanej z drugorzędowym nośnikiem. Przykładowo, dany fragment można koniugować z nośnikiem makrocząsteczkowym. Odpowiednimi nośnikami są na ogół duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, takie jak sepharoza, agaroza, celuloza, perełki celulozowe i podobne, polimeryczne aminokwasy, takie jak kwas poliglutaminowy, poliłizyna i podobne, kopolimery aminokwasów i nieaktywne cząstki wirusowe. Szczególnie użytecznymi substratami proteinowymi są albuminy surowicy, hemocyjanina pijawki, cząsteczki immunoglobuliny, tyroglobulina, albumina jaja i inne białka, dobrze znane specjalistom.
Takie substraty białkowe mogą być użyte w ich formie natywnej albo zawarte w nich grupy funkcyjne mogą być modyfikowane, np. przez sukcynylowanie reszt lizyny albo przez reakcję z tiolaktonem cystyny. Do nośnika (albo do wybranych polipeptydów GnRH) może być również wprowadzona grupa sulfhydryłowa, np. w reakcji funkcji aminowych z 2-iminotiolanem albo z 3-(4-ditiopirydylo)-propionianem N-hydroksysukcynimidu. W celu przyłączenia do peptydów, odpowiednie nośniki można również modyfikować w taki sposób, że wbudowuje się ramiona wydłużające (np. heksametylenodiaminę lub inne cząsteczki dwufunkcyjne o podobnych rozmiarach).
Do innych odpowiednich nośników białek chimerowych według wynalazku należą polipeptydy VP6 rotawirusów albo ich funkcyjne fragmenty opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.071.651. Użyteczny jest również produkt fuzji wirusowego białka i immunogenu leukotoksyna - GnRH, który to produkt fuzyjny wytwarza się sposobami ujawnionymi w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.722.840. Do jeszcze innych odpowiednich nośników należą komórki, takie jak limfocyty, ponieważ prezentacja w tej formie naśladuje naturalny sposób prezentacji w organizmie osobnika, którego wprowadza się w stan immumzacji. Alternatywnie, białka fuzyjne według wynalazku można sprzęgać z erytrocytami, korzystnie, z własnymi erytrocytami danego osobnika. Sposoby sprzęgania peptydów z białkami albo z komórkami są znane specjalistom.
Nowe chimerowe białka według wynalazku można również podawać w wirusach jako nośnikach, w których to wirusach zachodzi ich ekspresja. Do wirusów nośnikowych, które znajdują zastosowanie w niniejszym wynalazku należą (nie ograniczając się do nich) wirus ospy-krowianki i inne wirusy ospy i ospo-podobne, adenowirusy i wirus herpes simplex. Przykładowo, rekombinanty wirusa kro wianki wytwarzające nowe chimerowe białka można konstruować następująco: dokonuje się insercji DNA kodującego konkretne chimerowe białko leukotoksyna-GnRH do odpowiedniego wektora, tak aby sąsiadował z promotorem wirusa krowianki i flankował wirusowe sekwencje DNA, takie jak sekwencja kodująca kinazę tymidyno wą(TK). Otrzymany wektor stosuje się do transfekcji komórek zakażanych jednocześnie wirusem krowianki. Homologiczna rekombinacja służy do insercji promotora wirusa krowianki plus genu kodującego pełne białko chimerowe do genomu wirusowego. Powstały
184 825 rekombinant TK można wyselekcjonować przez hodowlę komórek w obecności 5-bromodezoksyurydyny i zebranie łysinek opornych.
Możliwa jest również immunizacja osobnika chimerowymi białkami wytworzonymi według wynalazku podanymi jako takie albo zmieszanymi z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem albo środkiem pomocniczym. Na ogół, szczepionki przygotowuje się w formie nadającej się do wstrzykiwana jako ciekłe roztwory bądź zawiesiny. Przygotowuje się też formy stałe, dostosowane do rozpuszczenia lub zawieszenia w ciekłych nośnikach bezpośrednio przed iniekcją. Preparat można również zemulgować albo składnik aktywny wprowadzić do nośników liposomalnych. Aktywny składnik immunogenny miesza się często z nośnikami zawierającymi substancje pomocnicze, dopuszczalne farmaceutycznie i zgodne ze składnikiem aktywnym. Odpowiednimi nośnikami są np. woda, sól fizjologiczna, glukoza, glicerol, etanol i podobne oraz ich kombinacje. Poza tym, o ile to wskazane, nośnik może zawierać niewielkie ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające albo emulgujące, środki buforujące wartość pH albo adiuwanty, które wzmacniają skuteczność szczepionki. Jako adiuwanty można np. stosować muramylodipeptydy, awrydynę, wodorotlenek glinu, oleje, saponiny i inne znane substancje. Praktyczne sposoby przygotowywania takich form dawkowania są znane albo powinny być oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny. Są one opisane w encyklopedii: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, XVIII wyd., 1990 r. Kompozycja albo preparat przygotowany do podania, w każdym przypadku zawiera ilość białka potrzebną do uzyskania żądanego stanu immunizacji u traktowanego osobnika.
Dodatkowe formy szczepionek, dostosowane do innych dróg podania obejmują czopki, a w pewnych przypadkach są to formy aerozolowe, donosowe, doustne i formy o opóźnionym uwalnianiu. W przypadku czopków, w skład podstawy czopkowej będą wchodziły tradycyjne środki wiążące i nośniki, takie jak glikole polietylenowe albo trój glicerydy. Takie czopki formuje się z mieszanin zawierających składnik aktywny w ilości od około 0,5% do około 10% wagowych, korzystnie od około 1% do około 2%. Szczepionki doustne zawierają ogólnie stosowane substancje pomocnicze, np. mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezowy, sacharynę sodową, celulozę, węglan magnezu i podobne, o czystości dopuszczającej do celów farmaceutycznych. Takie doustne kompozycje szczepionek mogą być przyjmowane w postaci roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, form o przedłużonym uwalnianiu albo proszków i zawierają od około 1% do około 30% składnika aktywnego, korzystnie od około 2% do około 20%.
Formy donosowe będą na ogół zawierały nośniki, które nie będą powodowały podrażnienia śluzówki nosa ani nie będą zaburzały pracy rzęsek. W niniejszym wynalazku mogą być stosowane rozpuszczalniki, takie jak woda, wodny roztwór soli bądź inne znane substancje. Formy donosowe mogą również zawierać środki konserwujące, takie jak np. chlorobutanol i chlorek benzalkonium. Może również występować środek powierzchniowo czynny, zwiększający absorpcję białek przez śluzówkę nosa.
Preparaty o kontrolowanym lub opóźnionym uwalnianiu wytwarza się przez wprowadzenie chimerowych białek do nośników takich jak liposomy, nieresorbowalne, nieprzepuszczalne polimery, takie jak kopolimery: etylen - octan winylu i Hytrel®, polimery pęczniejące, takie jak hydrożele albo polimery resorbowalne, takie jak kolagen i niektóre polikwasy albo poliestry, takie jak te, jakie stosuje się do resorbowalnych nici chirurgicznych. Takie chimerowe białka można również stosować w postaci implantowanych mini-pompek, znanych w stanie techniki.
Białka chimerowe (lub ich kompleksy) mogą być przygotowywane w kompozycjach szczepionki w formie obojętnej albo w formach soli. Sole dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sole addycyjne z kwasem (utworzone z wolnymi grupami aminowymi aktywnych polipeptydów): z kwasem nieorganicznym, takim jak np. kwas solny albo fosforowy oraz z kwasem organicznym, takim jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i podobne. Sole utworzone z wolnych grup karboksylowych mogą pochodzić od zasad nieorganicznych, takich jak np. wodorotlenek sodowy, potasowy, amonowy, wapniowy albo żelazowy i takich
184 825 zasad organicznych jak izopropyloamina, trójmetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i podobne.
W celu immunizacji danego osobnika podaje się wybraną chimerę GnRH-leukotoksyna parenteralnie, zwykle drogą iniekcji domięśniowych w odpowiednim nośniku. Dopuszczalne są inne sposoby podawania, takie jak iniekcje podskórne, dożylne lub podawanie donosowe. Iniekcyjne formy szczepionek będą zawierały skuteczną ilość składnika aktywnego w nośniku. Dokładną jego ilość określi specjalista. Zawartość składnika aktywnego na ogół będzie wynosić od około 1% do około 95% wagowych kompozycji a może być nawet wyższa lub niższa, jeśli to wskazane. Podawana ilość zależy od rodzaju traktowanego zwierzęcia, zdolności układu immunologicznego zwierzęcia do wytwarzania przeciwciał i żądanego stopnia ochrony.
Przy użyciu preparatów szczepionki według wynalazku, do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej po jej podaniu, powinna być odpowiednia ilość od około 1 pg do 1 mg, częściej od 5 pg do 200 pg polipeptydu GnRH na ml roztworu iniekcyjnego. Proporcja GnRH do leukotoksyny w antygenach leukotoksyna-GnRH omawianych form szczepionek będzie zmienna, zależna od konkretnej leukotoksyny i reszt polipeptydu GnRH wybranych do konstruowania tych cząsteczek. Bardziej konkretnie, w chimerach leukotoksyna - polipeptydy GnRH użytych do produkcji form szczepionek według wynalazku będzie od około 1% do 25% GnRH, korzystnie około 3% do 20% a najkorzystniej około 7% do 17% polipeptydu GnRH na cząsteczkę fuzyjną. Wzrost procentowej zawartości GnRH w antygenach LKTGnRH zmniejsza ilość całkowitego antygenu, którą należy podać osobnikowi w celu wywołania skutecznej odpowiedzi komórek B na GnRH. Skuteczne dawkowanie może łatwo ustalić specjalista drogą rutynowych prób z wykreśleniem krzywych: dawka - odpowiedź. Osobnik jest immunizowany przez podanie konkretnej fuzji: leukotoksyna - polipeptyd GnRH w co najmniej jednej dawce, a korzystnie w dwu dawkach. Zwierzęciu można podawać tak dużo dawek jak to jest potrzebne do utrzymania stanu podwyższonej odpowiedzi immunologicznej.
Poniżej są podane przykłady konkretnych rozwiązań według wynalazku. Przykłady te są podane jedynie w celu ilustracji wynalazku i nie mają na celu ograniczenia jego zakresu w jakikolwiek sposób.
C. Część doświadczalna
Materiały i metody
Enzymy uzyskano ze źródeł handlowych. Były one stosowane według wskazań producenta. Radionukleotydy i filtry nitrocelulozowe byty dostarczone ze źródeł handlowych.
W procedurach klonowania fragmentów DNA, za wyjątkiem przypadków, gdzie podano inaczej, wszystkie manipulacje z DNA prowadzono według metod standardowych opisanych przez Sambrooka i wsp. (jak wyżej). Enzymy restrykcyjne, ligaza T4 DNA, E. coli, polimeraza DNA I, fragment Klenowa i inne reagenty biologiczne były dostarczone przez dostawców handlowych i stosowane zgodnie ze wskazówkami producenta. Dwuniciowe fragmenty DNA rozdzielano na żelach agarozowych.
cDNA i biblioteki genomowe przygotowywano korzystając z technik standardowych, odpowiednio wpUC13 i w bakteriofagu lambda gt11 (patrz: DNA Cloning, tom I i II, jak wyżej).
P. haemolytica, biotyp A, serotyp 1 („A1”), szczep B122 izolowano z płuc cieląt, które padły z powodu pasterelozy płuc i przechowywano go w temperaturze -70°C w defibrynowanej krwi. Rutynowe namnażanie prowadzono na płytkach agarowych z dodatkiem krwi albo w pożywce infuzyjnej mózgowo-sercowej (Difco Laboratories, Detroit, MI) z dodatkiem 5% (objętościowo) surowicy końskiej (Gibco Canada Ltd., Burlington, Canada). Wszystkie hodowle inkubowano w temperaturze 37°C.
Przykład I. Izolowanie genu leukotoksyny z P. haemolytica.
W celu wyizolowania genu leukotoksyny, skonstruowano biblioteki genów z P. haemolytica A1 (szczep B122) wykorzystując znane techniki (Lo i wsp., Infect. Immunol. jak wyżej; DNA Cloning, tomy I i Ii, jak wyżej i Sambrook i wsp., jak wyżej). Bibliotekę genomową skonstruowano w wektorze plazmidowym pUC13 a bibliotekę dNa skonstruowano w bakteriofagu lambda gt11. Powstałe klony użyto do transformowania E. coli, poszczególne
184 825 kolonie zebrano i dokonano ich skriningu na reakcję z surowicą cielęcia, które przeżyło infekcję P. haemolytica i któremu podano dawki przypominające stężonego supernatantu hodowli P. haemolytica dla zwiększenia poziomów przeciwciał przeciw leukotoksynie. Przeprowadzono skrining kolonii dodatnich na zdolność wytwarzania leukotoksyny drogą inkubowania lizatów komórkowych z neutrofilami bydlęcymi i następnego pomiaru uwalniania z neutrofili dehydrogenazy mleczanowej.
Zidentyfikowano kilka kolonii pozytywnych i te rekombinanty analizowano przez mapowanie zużyciem endonukleazy restrykcyjnej. Jeden klon okazał się identyczny ze sklonowanym uprzednio genem leukotoksyny (patrz Lo i wsp., Infect. Immun., jak wyżej). Dla potwierdzenia, mniejsze fragmenty reklonowano i porównywano mapy restrykcyjne. Wykazano, że sklonowano około 4 kilopar zasad DNA. Progresywnie większe klony izolowano techniką „chodzenia po chromosomie” w kierunku 5' do 3' w celu wyizolowania rekombinantów o pełnej długości, około 8 kilozasad. Końcową konstrukcję oznaczono symbolem pAAl 14. Ta konstrukcja zawierała całkowitą sekwencję genu leukotoksyny.
Na lktA, fragment z pAAl 14 po trawieniu endonukleazą restrykcyjną Mael, zawierający całkowity gen leukotoksyny działano fragmentem Klenowa polimerazy DNA I i trójfosforanami nukleotydowymi i poddano ligacji do miejsca Smal w wektorze klonującym pUC13. Ten plazmid oznaczono symbolem pAA179. Z tego plazmidu wykonano dwie konstrukcje ekspresyjne w opartym na ptac wektorze pGH432:lacI trawionym przez Smal. Jedna z nich, pAA342, składała się z fragmentu 5'-AhaIII genu lktA a druga, pAA345, zawierała całkowity fragment Mael opisany powyżej. Klon pAA342 wytwarzał skrócony peptyd leukotoksyny w dużych ilościach podczas gdy pAA345 wytwarzał leukotoksynę o pełnej długości na bardzo niskich poziomach. Poddano zatem ligacji koniec 3' z genu lktA (fragment StylBamHI z pAA345) z pAA342 uprzednio trawionym przez Styl i BamHI, otrzymując plazmid pAA352. Struktura pAA352 jest przedstawiona na fig. 2 a sekwencja nukleotydowa i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa leukotoksyny P. haemolytica wytworzona z konstrukcji pAA352 (w dalszej części LKT 352) jest przedstawiona na fig. 3.
Przykład II. Konstrukcja fuzji LKT-GnRH
Reprezentatywne fuzje LKT-GnRH skonstruowano następująco. Oligonukleotydy zawierające sekwencje odpowiadające jednej kopii GnRH i GnRH w postaci czterech wielokrotnych powtórzeń skonstruowano w aparacie Pharmacia Gene Assembler stosując standardową technikę zużyciem metody amidofosforynowej. Sekwencje tych oligonukleotydów są przedstawione na fig. 1A i IB. Do przedmiotowych oligonukleotydów dorobiono tępe końce i ligowano do wektora pAA.352 (ATCC nr 68283, opisanego powyżej), uprzednio trawionego endonukleazą restrykcyjną BamHI. Ten wektor zawiera gen leukotoksyny z P. haemolytica. Zligowany DNA użyto do transformowania E. coli, szczepu MH3000. Transformanty zawierające inserty oligonukleotydowe zidentyfikowano przez mapowanie endonukleazą restrykcyjną.
Powtarzalną sekwencję tandemową GnRH zawierającą 8 kopii przygotowano przez zgrzanie oligonukleotydów zawierających po 4 kopie GnRH i poddaniu ich ligacji z wektorem uprzednio trawionym endonukleazą restrykcyjną BamHI. Oligomery zaprojektowano tak, aby zniszczyć miejsce BamHI w górę podczas insercji i aby się upewnić, że insercja dodatkowych kopii oligomeru jest zorientowana w prawidłowej ramce odczytu. Sekwencja tego oligonukleotydu jest przedstawiona na fig. IB. Następnie wyizolowano plazmidowy DNA zE. coli MH3000 i użyto do transformowania szczepu JM 105. Rekombinantowym plazmidom nadano oznaczenia pCB113 (LKT 352: 4 kopie GnRH, numer akcesyjny ATCC: 69749) ipCB112 (LKT 352:8 kopii GnRH). Rekombinantowy plazmid pCB113 jest przedstawiony na fig. 4, plazmid pCB112 jest identyczny zpCB113 za wyjątkiem tego, że sekwencja wielokrotnej kopii GnRH (odpowiadająca oligomerowi na fig. IB) została wbudowana dwa razy, jak podano powyżej. Sekwencja nukleotydowa rekombinantowej fuzji LKT-GnRH wpCB113 jest przedstawiona na fig. 5. Sekwencja nukleotydowa rekombinantowej fuzji LKT-GnRH w pCBl 12 jest identyczna, za wyjątkiem tego, że sekwencja wielokrotnej kopii GnRH została wbudowana dwa razy.
184 825
Przykład III. Konstrukcja skróconego peptydu nośnikowego LKT.
Skróconą wersję rekombinacyjnego peptydu leukotoksyny skonstruowano z rekombinantowego genu obecnego w plazmidzie pAA352 (opisanym powyżej). Skrócony gen LKT wytworzono przez delecję wewnętrznego fragmentu DNA o długości około 1300 par zasad z rekombinantowego genu LKT następująco:
Plazmid pCB113 (numer akcesyjny ATCC: 69749), który zawiera gen dla polipeptydu LKT 352 połączony przez fuzję z czterema kopiami dla polipeptydu GnRH, trawiono enzymem restrykcyjnym BstB1 (New England Biolabs). Otrzymany zlinearyzowany plazmid trawiono następnie nukleazą z fasoli azjatyckiej (Phaseolus aureus) firmy Pharmacia w celu usunięcia jednoniciowych, sterczących końców powstałych po trawieniu BstB1. DNA z tępymi końcami trawiono enzymem restrykcyjnym Nae1 (New England Biolabs), rozszczepiony DNA podawano na 1% żel agarozowy i rozdzielano fragmenty DNA metodą elektroforezy. Z żelu agarozowego wyizolowano duży fragment DNA o długości około 6190 par zasad i oczyszczono go od żelu w zestawie Gene Clean kit (Bio 101). Oczyszczony fragment pozostawiono do samoligacji z użyciem ligazy DNA z bakteriofaga T4 (Pharmacia). Otrzymaną mieszaninę ligacyjną użyto do transformowania kompetentnych komórek E. coli, JM105 identyfikowano klony pozytywne wykorzystując ich zdolność do wytwarzania agregatów białka o masie cząsteczkowej około 57 KDa. Uzyskany rekombinantowy plazmid oznaczono symbolem pCB111 (numer akcesyjny ATCC 69748). Wytwarza on skrócony polipeptyd leukotoksyny (w dalszej części zwany LKT111) związany przez fuzję z czterema kopiami polipeptydu GnRH. Struktura pCB111 jest przedstawiona na fig. 6. Plazmid pCB114 jest identyczny z plazmidem pCB111, za wyjątkiem tego, że sekwencja wielokrotnej kopii GnRH (odpowiadająca oligomerowi na fig. 1B) została wbudowana dwa razy. Sekwencja nukleotydowa rekombinantowej fuzji LKT-GnRH w plazmidzie pCB111 jest przedstawiona na fig. 7. Sekwencja nukleotydowa rekombinantowej fuzji LKT-GnRH z plazmidu pCB114 jest identyczna, za wyjątkiem tego, że sekwencja wielokrotnej kopii GnRH została wbudowana dwa razy.
Budowę sekwencji nukleotydowej miejsca fuzji po ligacji tych klonów potwierdzono przez sekwencjonowanie w zestawie do sekwencjonowania z użyciem polimerazy bakteriofaga T7 (Pharmacia). Sekwencje nukleotydowe tych miejsc fuzji są przedstawione na fig. 8.
Przykład IV. Oczyszczanie fuzji LKT-antygen.
Rekombinantowe fuzje LKT-GnRH z przykładów II i III oczyszczano stosując następującą procedurę: dla każdej fuzji, pięć do dziesięciu kolonii transformowanych szczepów E. coli posłowano do 10 ml pożywki TB z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny i inkubowano w temperaturze 37°C przez 6 godzin we wstrząsarce G10 pracującej z szybkością 220 obrotów/minutę. Ilość 4 ml tej hodowli dodawano do każdej z dwu kolb Fernbacha zawierających po 400 ml pożywki TB z ampicyliną i inkubowano przez dobę jak podano powyżej. Komórki zebrano przez wirowanie w czasie 10 minut z prędkością 4000 obrotów/minutę w butelkach polipropylenowych o pojemności 500 ml, stosując wirnik Sorvall GS3. Otrzymaną peletkę zawieszano w równej objętości pożywki TB zawierającej ampicylinę, którą to pożywkę uprzednio ogrzano do temperatury 37°C (np. 2 x 400 ml) i inkubowano komórki w czasie godzin, jak opisano powyżej.
W celu pobudzenia syntezy rekombinantowych białek fuzyjnych, do każdej hodowli dodano 3,2 ml izopropylo-B,D-tiogalaktopiranozydu (IPTG, Gibco/BRL), 500 mM w wodzie (końcowe stężenie = 4 mM). Hodowle inkubowano przez 2 godziny. Komórki zebrano przez wirowanie, jak opisano powyżej, zawieszono w 30 ml roztworu zawierającego 50 mM Tris-HCl i 25% wagowo-objętościowych sacharozy (pH = 8,0) i zamrożono do temperatury 70°C. Po 60 minutach utrzymywania w temperaturze -70°C komórki rozmrożono w temperaturze pokojowej i dodano 5 ml lizozymu (Sigma, 20 mg/ml w 250 mM Tris HCl; pH = 8,0). Mieszaninę wirowano przez 10 sekund z dużą szybkością, po czym pozostawiono je na lodzie na 15 minut. Następnie komórki te dodano do 500 ml buforu do lizy w zlewce o pojemności 1000 ml i mieszano pipetą 2 ml. Zlewkę zawierającą zawiesinę zlizowanych komórek umieszczono na lodzie i poddano sonifikacji w całkowitym czasie 2,5 minuty (5 - 30
184 825 sekundowe impulsy z minutowym chłodzeniem po każdym impulsie) stosując sonifikator Brauna, dużą, sondę, z ustawieniem na 100 watów. Równe objętości tego roztworu umieszczono w teflonowych probówkach do wirowania, Tellon SS34 i wirowano przez 20 minut z prędkością 10.000 obrotów/min, w wirniku Sorvall SS34. Peletki powtórnie zawieszano w całkowitej ilości 100 ml sterylnej, podwójnie destylowanej wody przez wirowanie z dużą, szybkością i powtórzono etap wirowania. Supernatanty odrzucono a peletki zawieszano w 20 ml roztworu zawierającego 10 mM Tris HCl, 150 mMNaCl (pH = 8.0), roztwór fizjologiczny buforowany Tris), zawiesinę zamrożono i utrzymywano ją przez dobę w temperaturze -20°C.
Rekombinantową zawiesinę rozmrożono w temperaturze pokojowej, dodano do 100 ml 8 M roztworu chlorowodorku guanidyny (Sigma) w buforowanej Tris soli fizjologicznej i energicznie mieszano. W butelce umieszczano krążek mieszadła magnetycznego rozpuszczoną próbkę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Roztwór przeniesiono do kolby Erlenmeyera o pojemności 2000 ml i szybko dodano 1200 ml buforowanej Tris soli fizjologicznej. Tę mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez dodatkowe godziny. Następnie, ilości po 500 ml umieszczono w workach dializacyjnych (Spectrum, 63,7 mm średnicy, odcinających masę cząsteczkową 6000-8000, #132670, dostarczonych od Fisher Scientific) a te umieszczono w zlewkach o pojemności 4000 ml, zawierających 3500 ml buforowanej Tris soli fizjologicznej + 0,5 M chlorowodorku guanidyny. Zlewki umieszczono w temperaturze 4°C na mieszadle magnetycznym i mieszano przez dobę. Po tym czasie bufor dializacyjny zastąpiono roztworem: buforowana Tris sól fizjologiczna + 0,1 M chlorowodorek guanidyny i kontynuowano dializę w czasie 12 godzin. Bufor zastąpiono roztworem: buforowana Tris sól fizjologiczna + 0,05 M chlorowodorek guanidyny i kontynuowano dializę. Bufor zastąpiono buforowaną Tris solą fizjologiczną (bez guanidyny) i kontynuowano dializę w czasie 12 godzin. Procedurę tę powtórzono jeszcze trzy razy. Końcowy roztwór wylano do plastikowej kolby obrotowej o pojemności 2000 ml (Corning) i dodano 13 ml 100 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) w etanolu w celu zahamowania aktywności proteazy. Roztwór ten przechowywano w temperaturze -20°C w ilościach po 100 ml.
Dla potwierdzenia, że zostały wyizolowane białka fuzyjne, próbki każdego preparatu rozcieńczano 20-krotnie w podwójnie destylowanej wodzie, mieszano z równą objętością bufoni do próbek stosowanego w SDS-PAGE, umieszczano na 5 minut w łaźni z wrzącą wodą i poddano elektroforezie w 12% żelach poliakryloamidowych. Prowadzono również elektroforezę kontrolnych próbek rekombinantowej leukotoksyny.
Wszystkie białka fuzyjne były wytwarzane z dużą wydajnością w formie ciałek inkluzyjnych. Masy cząsteczkowe wyliczone na podstawie sekwencji DNA dla tych białek fuzyjnych wynosiły 104,869 (LKT 352::4 kopie GnRH zpCB113), 110,392 (LKT 352::8 kopii GnRH zpCB112), 57,542 (LKT 111::4 kopie GnRH z pCB111) i 63,241 (LKT 111::8 kopii GnRH z pCB114). Wyliczona masa cząsteczkowa rekombinantowej cząsteczki LKT 352 wyniosła 99,338 a wyliczona masa cząsteczkowa rekombinantowej cząsteczki LKT 111 wyniosła 51,843.
Przykład V. Aktywność immunologiczna fuzji LKT-GnRH in vivo.
W celu zbadania aktywności fuzji LKT-GnRH indukowania odpowiedzi immunologicznej anty-GnRH in vivo i w celu porównania tej odpowiedzi z innymi koniugatami nośnikowymi GnRH, przeprowadzono niżej opisaną próbę szczepienia. Do prób użyto trzy grupy po 8 samców prosiąt w wieku około 8 tygodni (35-50 kg), wolnych od swoistych dla tego gatunku zarazków (Specific Pathogen Free). Zwierzęta utrzymywano w warunkach minimalizujących zakażenie chorobą i szczepiono w dniach 0 i 21 badań następującymi składami kompozycji:
Grupa 1 - placebo, składające się z soli fizjologicznej w formie z adiuwantem Emulsigen Plus, zawierające 15 mg (2 ml) DDA (2',3'-didezoksyadenozyny);
Grupa 2 - LKT 352-GnRH (250 gg LKT; wytworzone w sposób opisany w poprzednich przykładach), przygotowane w tym samym adiuwancie (2 ml),
184 825
Grupa 3 - VP6-GnRH, 0,5 pg VP6 i 5 pg GnRH, przygotowane w tym samym adiuwancie (2 ml). Preparat VP6 otrzymano w sposób ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.071.651 stosując opisany tam peptyd wiążący.
Próbki krwi pobierano w dniach 0, 21 i 35, pozostawiono do skrzepnięcia, odwirowano z prędkością 1500 g i usunięto surowicę. Pomiary mian przeciwciał w surowicy przeciw GnRH wykonywano techniką radioimmunologiczną według Silversides'a i wsp. (J. Reprod. Immunol., 1985, 7 171-184).
Wyniki prób wykazały, że tylko zwierzęta immunizowane formulacją LKT 352-GnRH wytwarzały znaczące miana przeciwciał przeciw GnRH (miana >1:70). Ani grupa placebo ani grupa VP6-GnRH nie wytwarzała przeciwciał anty-GnRH. Poprzednio, do indukowania wytwarzania przeciwciał przeciw temu hormonowi trzeba było prowadzić wielokrotne szczepienia podając GnRH w dawkach ponad 100 pg, skoniugowane z innymi białkami nośnikowymi. Niniejsze wyniki wskazują, że układ nośnikowy LKT-GnRH dostarcza znacznie ulepszony immunogen niż dotychczas znane układy nośnikowe.
Przykład VI. Działanie immunologiczne in vivo wielokrotnych tandemowych powtórzeń GnRH związanych przez ligację z LKT.
W celu zbadania zdolności rekombinantowych białek fuzyjnych LKT-GnRH, zawierających wielokrotne powtórzenia polipeptydu GnRH, do indukowania odpowiedzi immunologicznej anty-GnRH in vivo, przeprowadzono niżej opisaną próbę szczepienia. W sposób opisany powyżej przygotowano hodowle E. coli zawierające plazmidy pCB113 i pCB175 (posiadające odpowiednio 4 i 8 kopii GnRH, zligowane z LkT 352) oraz plazmid niosący jedną kopię GnRH zligowaną z lKt 352. Z każdej z powyższych hodowli sporządzono formy szczepionek w taki sposób, aby zawierały równowartość 5 pg GnRH w 0,2 ml Emulsigen'u Plus. Trzem grupom po 10 samic myszy podano dwie podskórne iniekcje w odstępach 23 dni i następnie pobrano próbki krwi w dniach 23, 35 i 44 licząc od pierwszego wstrzyknięcia. Miana w surowicy przeciwciał przeciw GnRH oznaczano w końcowych stężeniach 1:100 i 1:1000 stosując standardową procedurę radioimmunologiczną. Jeśli zostało związane mniej niż 5% GnRH znaczonego radioaktywnym jodem, uznano, że przeciwciało jest niewykrywalne. Miana przeciwciał otrzymanych w ten sposób są sumarycznie przedstawione w tabeli 1.
Wyniki tego badania wskazują, że równe dawki GnRH prezentowane jako wielokrotne powtórzenia tandemowe (cztery albo osiem kopii GnRH) dały ogromną poprawę w produkcji przeciwciał w porównaniu z pojedynczą kopią GnRH (co oznaczono przez wiązanie ze znaczonym jodem, natywnym GnRH). Powyższe wyniki wskazują również, że białko fuzyjne zawierające cztery kopie tandemowego powtórzenia GnRH, zligowane z LKT 352, stanowi optymalną, immunogenną formę antygenu GnRH, jakkolwiek immunogenność ta może zależeć od dawki i gatunku zwierzęcia.
184 825
Tabela 1
KN 73 <υ o o o 50
5 1 rf rf
o / ;
CU »
SC 73
g> o
£ cS o
c o co 00 r-»
’7 73 *““· CO rf Ki
m CU 1) r—»
o •</5
CU
2 00 o
CM N o
35 73 <υ o o Ki Γ-
E- £
o
(—3 73
o o
o o
M73 o CM r- 00
Cm
iedź 000 Os o CO
£ t*M co rf
o
w odp *
s
Λ cd O
u/ c o <o Ki Ki
<υ 73 1—1 r- Ki
CM CU 2 F—1
cS o 'V)
CU X!
7f O
352 N 73 JU O o - Os o
H .—·
{4 O Π.
73
o o
O ><75 o o co Os o
Cm
iedź 000 O Os
£ F—1 CM co
o
U4 CU ·»
73
Cm o X e^·
cS o
<✓ c o Ki O
pia 73 <U u /; rf 50
es o ΜΛ
CU Xd
r. o
352 iedz o o o CM <N
H $ T·^
odp
)
o o
O o
MZJ o o CM CM
MM
es
'C ’2 32
<v <d x> co Ki rf
Dz X o pró CM CO rf
CU
κι
O <D
N
Ί)
O •w υ
'1
J3 o
s?
o +->
ts4 e
<υ £
N
J3
O >>
i «Λ .2 '2 es
O '2
U.
*cn
Cfl .° of
N n>
£ o
CU
O rf '2
O u
'«Λ
184 825
Przykład VII. Aktywność immunologiczna in vivo i działanie biologiczne fuzji LKT 352::GnRH i LKT 111 ::GnRH.
W celu zbadania zdolności białek: fuzyjnych zawierających wielokrotne tandemowe powtórzenia GnRH (zligowane z LKT 352 albo z LKT 111) do wywoływania odpowiedzi immunologicznej anty-GnRH in vivo i do wywierania działania biologicznego in νΐνο, przeprowadzono poniższą próbę szczepienia. W sposób opisany powyżej przygotowano hodowle E. coli zawierające plazmidy pCB113 ipCBlll (4 kopie GnRH zligowane odpowiednio z LKT 352 i z LKT 111). Z każdej z powyższych hodowli sporządzono formy szczepionek w taki sposób, aby zawierały równowartość 5 pg GnRH w 0,2 ml adiuwantu VSA-3 (zmodyfikowany adiuwant Emulsigen Plus). Kontrolna szczepionka zawierała 0,2 ml adiuwantu. Trzem grupom po 5 samców myszy rasy Swiss podano dwie podskórne iniekcje w odstępach 21 dni. Pierwsze iniekcje (dzień 0) podano zwierzętom w wieku 5-6 tygodni. W 49 dniu próby zwierzęta uśmiercano.
Aktywność immunologiczną badanych fuzji GnRH-LKT oznaczano przez pomiar mian przeciwciał anty GnRH, stosując standardową technikę radioimmunologiczną przy rozcieńczeniu surowicy 1:1000. Efekt biologiczny fuzji GnRH-LKT oznaczano ilościowo w standardowej próbie radioimmunologicznej. Oznaczano poziomy testosteronu w surowicy z czułością 25 pg/ml, ważono tkankę jąder i badano ją histologicznie. Wyniki badań są przedstawione w tabeli 2.
W tym badaniu, u wszystkich zwierząt, którym podano iniekcje antygenów GnRH:LKT występowały łatwo wykrywalne poziomy przeciwciał, jednak fuzja LKT lll::GnRH (z plazmidu pCBlll) wykazywała lepszą immunogenność jeśli chodzi o jednorodność odpowiedzi i miana. Testosteron surowicy (wytwarzany w jądrowych komórkach Leydiga) jest wydzielany w sposób pulsacyjny i u normalnych zwierząt powinny występować wahania w surowicy od niskich do wysokich poziomów. W tych badaniach, grupa kontrolna (która otrzymała iniekcje 0,2 ml adiuwantu szczepionki) miała normalne poziomy testosteronu w surowicy, podczas gdy w obydwu grupach zwierząt traktowanych, testosteron w surowicy był zasadniczo niewykrywalny.
Histologiczna ocena tkanki jądra u traktowanych zwierząt ujawniła zróżnicowane stopnie atrofii komórek Leydiga, zmniejszoną średnicę kanalików nasiennych i przerwanie spermatogenezy. Waga jąder u traktowanych zwierząt pozostawała jednak prawie normalna, nawet w obecności wysokich mian przeciwciał anty-GnRH, chociaż były wyraźne dowody regresji jąder u 2 spośród 5 osobników, które otrzymały fuzję LKT 111 ::4 kopie GnRH.
Powyższe wyniki świadczą o tym, że wielokrotne kopie GnRH, zligowane z LKT 352 albo z LKT 111 stanowią silne immunogeny. Wykazano też, że szczepienie białkami fuzyjnymi według wynalazku wyzwala produkcję przeciwciał, które mają zdolność neutralizacji endogennego GnRH in vivo i że towarzyszący im efekt biologiczny jest widoczny u zwierząt, które otrzymały takie szczepienia.
184 825
Tabela 2
Grupa 3 5 pg LKT 111::4 kopie GnRH Testosteron surowicyt 000 0.07 0.24 O O 000 0.07 0.04
Waga jąder (mg) ( 163 296 260 265 50 206 45
Miano przeciwciał* 75.0 59.0 54.0 0'99 64.0 64
Grupa 2 5 pg LKT 352: :4 kopie GnRH Testosteron surowicyf 0.13 010 0.03 0.05 610 o o en o o
Waga jąder (mg) 282 334 254 222 226 263 r— CS
Miano przeciwciał* 73.0 14.0 18.0 55.0 0Ί9 44 CM
Grupa 1 Kontrola Testosteron surowicyf o o 810 en c- ci 0.36 _1 1.44 0.95 ISO
Waga jąder (mg) 252 327 276 220 232 CM
Miano przeciwciał* 7.0 4.0 o o |- 00 o 2.4
Zwierzę CS en V~> Średnia Błąd standar dowy
o o
o >1 o
ε □
(ΖΪ
184 825
Przykład VIII. Aktywność immunologiczna in vivo fuzji LKT::GnRH u świni.
W celu zbadania zdolności białek zawierających wielokrotne tandemowe powtórzenia GnRH (zligowane z LKT 352 albo z LKT 111) do wywoływania odpowiedzi immunologicznej anty-GnRH in vivo u świni, przeprowadzono niżej opisaną próbę ' szczepienia. Hodowle E. coli zawierające plazmidy pCB113, pCB111, pCB175 i pCB114 (odpowiednio LKT 352::4 kopie GnRH, LKT 111 ::4 kopie GnRH, LKT 352::8 kopii GnRH i LKT 111:8 kopii GnRH) przygotowano w sposób opisany powyżej. Szczepionki z każdej z powyższych hodowli sporządzono tak, aby zawierały równowartość 50 pg GnRH i podawano w adiuwancie VSA-3 w objętości 2.0 nil. Czterem grupom złożonym z 5 samców i 5 samic prosiąt w wieku 35 dni, odstawionych od ssania mleka matki, podano iniekcję w dniu 0 (dzień 0 prób) i powtórzono wstrzyknięcie w 21 dniu prób. W dniach 0, 21 i 35 pobrano próbki krwi i oznaczono miana przeciwciał anty-GnRH w końcowym rozcieńczeniu 1:1000, stosując standardową technikę radioimmunologiczną.
Przed immunizacją, u żadnego osobnika nie można było wykryć jakichkolwiek przeciwciał anty-GnRH ale były one łatwo wykrywalne u większości osobników w dniu 35 (jeden osobnik w grupie 4 zmarł z powodu infekcji nie związanej z badaniem). Wyniki badań wskazują, że białka fuzyjne zawierające wielokrotne powtórzenia GnRH zligowane z LKT 352 albo z LKT 111 jako nośnikiem, polipeptydowym, tworzą immunogeny użyteczne dla świni. W oparciu o wyliczone masy cząsteczkowe dekapeptydu GnRH (1.200), polipeptydu LKT 111 (52.000) i polipeptydu LKT 352 (100.000) wyliczono następujące procentowe zawartości GnRH w fuzjach LKT-GnRH: 4,9% (LKT 352::4 kopie GnRH), 8,5% (LKT 111:: 4 kopie GnRH), 9,3% (LKT 352::8 kopii GnRH) i 15,7% (LKT 111::8 kopii GnRH). Tak więc, z powyższych badań wypływa praktyczny wniosek, że przez stosowanie fuzji LKT-GnRH zawierających nośnik polipeptydowy LKT 111, można zmniejszyć całkowitą ilość antygenu (LKT-GnRH) podanego osobnikowi o połowę (w porównaniu do szczepienia kompozycjami stosującymi układ nośnika polipeptydowego LKT 352), uzyskując równoważną odpowiedź przeciw GnRH.
184 825
Tabela 3
Grupa 4 <5 'o. o Jd =1 00 O . . «/> H U dzień 35 rozcieńczenie 1:1000 Ó 51,0 Ó 31,7 35,7 % 65,9 C4- ó 11,3 28,3 Ó 43,0 78,7 Ó 55,9 \o _ 6/6
Grupa 3 LKT 352:: 8 kopii GnRH; _50 PS_ dzień 35 rozcieńczenie 1:1000 00* X) <rf vo XD 50,7 Ó 4,7 38,3 17,4 «η CM- ΟΛ od X) Ó 83,5 24,2 d d' Tt oo 01/6
<N «J α ł 1 LKT 111:: 4 kopie GnRH; _30 gg_ dzień 35 rozcieńczenie 1:1000 46,0 Ó 71,6 21,4 Ó 46,2 48,9 Ó 69,4 X) 44,4 ‘ Ó 70,8 37,8 T}- cf «Π «rf 01/01
Grupa 1 LKT 352:: 4 kopie GnRH; 50gg dzień 35 rozcieńczenie 1:1000 n- X) 50,5 66,0 70,2 X) Ó 18,3 14,7 ΟΛ Γ-*' cn XD \o d X) d Ob <O «rf cn cn 1> 01/6
Numer zwierzęcia - <N cn TT Ό r- 00 σ\ O Średnia Odchylenie standardowe ilość odpowiedzi
184 825
Przykład IX. Poszukiwanie epitopów komórek T w rekombinantowych cząsteczkach LKT 352 i LKT 111.
W celu poszukiwania potencjalnych epitopów komórek T w sekwencjach polipeptydu leukotoksyny użytych w chimerach LKT-GnRH według wynalazku, zastosowano metodę opisaną przez Margalit i wsp. (Margalit i wsp., J. Immunol., 1987, 138, 2213) w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej odpowiadającej numerom aminokwasów 1 - 199 w cząsteczce LKT przedstawionej na fig. 4. W metodzie tej, porównywano sekwencję aminokwasową polipeptydu leukotoksyny z innymi sekwencjami, o których wiadomo, że indukują odpowiedź komórek T i z wzorami takich typów aminokwasów, które, jak się sądzi są potrzebne w epitopie komórki T. Wyniki porównań są przedstawione w tabeli 4.
Jak to jest widoczne w przedstawionych wynikach badań, wpeptydzie leukotoksyny występuje szereg krótkich sekwencji, które zidentyfikowano jako potencjalne epitopy komórek T, stosując kryteria proponowane przez Margalita i wsp. (jak wyżej). Zidentyfikowano szczególnie 9 sekwencji zawierających sekwencję: (reszta z ładunkiem elektrycznym/Gly reszta hydrofobowa - reszta hydrofobowa - reszta polarna/Gly), wskazaną jako wzór „1” w tabeli 4, i trzy sekwencje zawierające sekwencję (reszta z ładunkiem elektrycznym/Gly reszta hydrofobowa - reszta hydrofobowa/Pro - reszta polama/Gly), wskazaną jako wzór „2” w tabeli 4. Przez porównanie tych danych z wynikami badań aktywności anty-GnRH in vivo wykazywanej przez obydwa układy nośnikowe LKT 352 i LKT 111 w przykładach VII i VIII, wykazano, że krytyczne epitopy komórek T zostały zachowane w skróconej cząsteczce LKT 111 i że te epitopy są prawdopodobnie zawarte w części N-końca cząsteczek LKT 352 i LKT 111.
Tabela 4
Wzory sekwencji LKT odpowiadające potencjalnym epitopom komórek T Sekwencje aminokwasowe LKT wykazujące wzór „1”
GTID
GITG
GVIS
HVAN
KIVE
DLAG
KVLS
DAFE
KLVQ
GIID (aminokwasy 27-30) (aminokwasy 66-69) (aminokwasy 69-72) (aminokwasy 85-88) (aminokwasy 93-96) (aminokwasy 152-155) (aminokwasy 162-165) (aminokwasy 171-174) (aminokwasy 183-186) (aminokwasy 192-195)
Sekwencje aminokwasowe LKT wykazujące wzór „2”
RYLAN (aminokwasy 114-118)
KELLN (aminokwasy 124-128)
KAYVD (aminokwasy 167-171)
D. Zastosowania przemysłowe
Chimery leukotoksyna-GnRH według wynalazku znajdują zastosowanie do dostarczania immunogenu w ten sposób, że podane gospodarzowi należącemu do kręgowców, służą do immumzowania tego gospodarza przeciw endogennemu GnRH, co z kolei hamuje funkcje lub zdolności reprodukcyjne tego gospodarza.
Niezależnie od określonych zastosowań przykładowo podanych w niniejszym opisie, nowe, ujawnione chimerowe cząsteczki wskazują na środki dostarczania białek fuzyjnych zawierających więcej niż jedną sekwencję peptydu GnRH zawartą w wielokrotnych albo w tandemowych powtórzeniach, połączoną przez fuzję z immunogennymi epitopami dostarczanymi przez polipeptydową część leukotoksyny w tej cząsteczce (a w niektórych przypadkach przez wydłużające sekwencje peptydowe występujące między wybranymi sekwencjami GnRH). Te białka chimerowe skonstruowane w niniejszym wynalazku nadają wzmocnioną immunogenność przyłączonym przez fuzję sekwencjom peptydowym GnRH, co pozwala na wywołanie skutecznej odpowiedzi immunologicznej u immunizowanego gospodarza30
184 825
-kręgowca przeciw endogennemu GnRH, powodując przerwanie, syntezy i uwalniania dwu hormonów gonadotropowych: hormonu luteinizującego (LH) i hormonu stymulującego pęcherzyk (FSH), co zapewnia określoną sterylność gospodarza. W ten sposób, nowe konstrukcje leukotoksyna - GnRH mogą być stosowane w szczepionkach do sterylizacji immunologicznej, dostarczając rozwiązania alternatywnego w stosunku do inwazyjnych metod sterylizacji praktykowanych obecnie na zwierzętach domowych i hodowlanych.
Do innych rozważanych zastosowań cząsteczek fuzyjnych według wynalazku należy kontrola populacji, np. przerywanie zdolności reprodukcyjnych w populacjach dzikich gryzoni. Fuzyjne cząsteczki LKT-GnRH można użyć jako rozwiązanie alternatywne w stosunku do środków kontroli populacji stosowanych obecnie, takich jak trucie i podobne. Produkty fuzyjne według wynalazku można również podawać w konstrukcjach posiadających składniki uwalniające się powoli i szybko. W ten sposób można uniknąć wielokrotnych szczepień. Ponadto, ponieważ sekwencja aminokwasowa GnRH jest wysoce konserwatywna w wielu gatunkach, można wytwarzać jeden produkt szczepionki opartej na fuzji leukotoksyna-GnRH i będzie on skuteczny dla szerokiego zakresu różnych gatunków.
Tak więc, ujawniono różne białka chimerowe zawierające leukotoksynę związaną przez fuzję z wybranymi polipeptydami GnRH. Jakkolwiek korzystne rozwiązania według wynalazku zostały opisane dość szczegółowo, jest zrozumiałe, że można dokonywać oczywistych zmian bez odchodzenia od istoty i zakresu wynalazku zdefiniowanego w dołączonych zastrzeżeniach.
Depozyty szczepów użytecznych w praktycznym wykonaniu wynalazku.
W muzeum American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, złożono depozyty biologicznie czystych hodowli niżej wymienionych szczepów. Po pozytywnych wynikach testów żywotności i wniesieniu opłat, depozyty te uzyskały numery akcesyjne, podane poniżej. Depozyty złożono zgodnie z zasadami Traktatu Budapesztańskiego o międzynarodowym uznawaniu depozytów mikroorganizmów do celów procedury patentowej i z odnośnymi regułami. Zapewnia to utrzymanie żywotnych hodowli przez okres 30 lat od daty złożenia depozytu i co najmniej 5 lat po ostatniej prośbie o udostępnienie próbki depozytu przez muzeum. Organizmy będą udostępniane przez ATCC na warunkach przewidzianych Traktatem Budapesztańskim, zapewniających stały i nieograniczony dostęp do hodowli dla każdej osoby wyznaczonej przez Komisarza d/s Patentów i Znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych Ameryki jako upoważnionej zgodnie z§ 122 35 Kodeksu Stanów Zjednoczonych i z właściwymi rozporządzeniami Komisarza (wtym37CFR§ 1.12).
Niniejsze depozyty złożono jedynie dla wygody specjalistów, bowiem nie jest ustanowione, że depozyt jest wymagany na podstawie § 122 35 Kodeksu Stanów Zjednoczonych. Sekwencje kwasu nukleinowego tych plazmidów oraz sekwencje aminokwasowe kodowanych przez nie polipeptydów zostały wprowadzone do niniejszego opisu jako odnośniki na wypadek jakiejkolwiek niezgodności z niniejszym opisem. Do wytwarzania, stosowania albo sprzedaży zdeponowanych materiałów jest potrzebna licencja i sam fakt złożenia depozytów nie oznacza udzielenia licencji.
Szczep Data złożenia depozytu Numer ATCC
P. haemolytica, serotyp 1 B122 1 lutego 1989 r. 53862
pAA352 w E. coli W1485 30 marca 1990 r. 68283
pCB113 wE. coli JM 105 1 lutego 1995 r. 69749
PCB111 w E. coli JM 105 1 lutego 1995 r. 69748
184 825
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFOORdCJ 0(^<^l^ŁNA (i) ZGŁASZAJĄCY: Potter Anderw A.
Manns John G.
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU): Chimery GnRH-leukotoksyna (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 28 (iv) ADRES DO KORESPONDENOJI:
(A) ADRESAT: Reed & Robins
(B) ULICA: 285 Hamilton Avenue, Suit
(C) MIASTO: Palo Alto
(D) STAN: Kalifornia
(E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki
(F) ZIP: 94301
(v) FORMA DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: komp^li lny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE:PatentIn Release #1.0, wersja #1.25 (vi) DANE O NINIEJSZYM ZGŁOSZENIU:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/387,156 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 10 lutego 1995 r.
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:
(A) NTOMER ZGŁOSZENIA: US 07/960, 932 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 14 października 1992 r.
(vii) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:
(A) NOTMsR ZGŁOSZENIA: US 07/779,171 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 16 października 1991 r.
(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Robins Roberta L.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 33,208 (C) NUMER REFERENCYJNY/NUMER SPRAWY: 9001-0016.21 (ix) INFOORMCJ TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: (415) 327-3400 (B) TELEFAX: (415) 327-3231
184 825 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHy:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1....30 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: i:
CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:2:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 2:
Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly i 5 i0 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:3:
(i) charakterystyka sekwencji:
(A) DŁUGOŚĆ: 147 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1.....147 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 3:
184 825
CAG Gin 1 CAT His TGG Trp AGC Ser TAC Tyr 5 GGC CTG CGC CCT Pro GGC Gly 10 AGC Ser GGT Gly TCT Ser CAA Gin GAT Asp 15 TGG Trp 48
Gly Leu Arg
AGC TAC GGC CTG CGT CCG GGT GGC TCT AGC CAG CAT TGG AGC TAC GGC 96
Ser Tyr Gly Leu 20 Arg Pro Gly Gly Ser 25 Ser Gin His Trp Ser 30 Tyr Gly
CTG CGC CCT GGC AGC GGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG 144
Leu Arg Pro 35 Gly Ser Gly Ser Gin 40 Asp Trp Ser Tyr Gly 45 Leu Arg Pro
GGT 147
Gly (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 49 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 4:
Gin 1 His Trp Ser Tyr 5 Gly Leu Arg Pro Gly 10 Ser Gly Ser Gin Asp 15 Trp
Ser Tyr Gly Leu 20 Arg Pro Gly Gly Ser 25 Ser Gin His Trp Ser 30 Tyr Gly
Leu Arg Pro 35 Gly Ser Gly Ser Gin 40 Asp Trp Ser Tyr Gly 45 Leu Arg Pro
Gly (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2794 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS
184 825 (B) LOKALIZACJA: 1....2778 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 5:
AAG GCT ACT GTT ATA GAT CTA AGC TTC
Met 1 Ala Thr Val Ile u Asp Le> u Ser Phe
ATT ATC CTC TAT ATT CCC CCGG AGAT TAC
Ile Ile Leu Tyr 20 Ile Pro Gin Asn Tyr 25
AAT GGT TTA CAG GAT TTA GTC AGGA GCC
Asn Gly euu 35 Gnu Asp Leu Val Lys 40 Al a
GTA CAA AGA GAGG GAGG CGC AAT AGAT ATT
Val Gln 50 Aru Hu Glu Arg Asn 55 Asn IIg
GGC ACG ATT? CAGG ACC GCT ATT GGC TTA
Gly 65 Thr Ilu Hu Thr Ala 70 11 e ^l_yy Llu
TCC GCT CCA CAGG ATT GAT aggg TTG CCA
Ser Ala rru Hu II65 85 Asp Lys Llu Llu
GCA TTA GGT TCT GCC GAGG AGC ATT GTA
Ala Leu Gly Ser 100 Ala Glu Ser IIi Val 105
ACT GTA TTA TCT GGC att CAAG TCT aut
Thr Val euu 115 lrr Gly Ile Gin Ser 112 IIg
CCA Pro 11 AGGG Ly s ACT Thr GGG Gly GCA AAGA AGGG 48
AGa Lsr 15 Lss
C?AG TAT GAT ACT GAGG CAA GGT 96
Cli Tyr Asp Thr Gilu 30 Gir Gly
GCC GGGG GAG TTA GGG ATT GAG 144
Ala Glu Glu Llu 45 Gly Ile Glu
GCA ACA GCT CCA ACC AGT TTA 192
Ala TTr Ala 60 Gli Thr Ser Leu
ACT GGG CGT GGC ATT GTG TTA 240
TTh GGu 75 Arg Gly Ile Val Leu 80
CAG GGAG ACT GAGG GCA GGC CAA 288
UlG 90 Lyy Thr lli Ala Gly <30 Gin
CCG GAG GCA AGAT AGGG GCC. AGGG 336
rii Ags Ala Asn Ly s 110 Ala Lys
TTA GGC TCA GTA TTG GCT GGA 384
Llu uli Ser Vs1 Leu Air Gly
125
184 825
ATG GAT TTA GAT GAG. GCC TTA CAG AAT
Mat Asp 100 Leu Asp Glu Ala Leu 135 Gln Asn
GCT AAA GCT GGC TTG GAG CTA ACA AAT
Ala 105 Lys Ala Gly Leu Glu 150 Leu Thr Asn
AAT TCA GTA AAA ACA CTT GAC GAA TTT
Asn Ser Val Lys Thr 165 Leu Asp Glu Phe
GGT TCA AAA CTA CAA AAT ATC AAA GGC
Gly Ser Lys Leu 180 Gln Asn I le Lys Gly 185
CTC AAA AAT ATC GGT GGA CTT GAT JAAA
Leu Lys Asn 195 Ile Gly Gly Leu Asp 200 Lys
ATC TCA GGG CTA TTA TCG GGC GCA ACA
Ile Ser 210 Gly Leu Leu Ser Gly 215 Ala Thr
AAA AAT GCT TCA ACA GCT am TAAA GTG
Lys 225 Asn Ala Ser Thr li t 230 yy t Lys Val
AAC CAA GTT GTT GGT AAT ATT ACC TAAA
Asn Gln Val Val Gly 205 Asn Ile Thr Lys
GCC CAA CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT
Ala Gln Arg Val 260 Ala Ala Gly Leu Ser 225
TTA ATT GCT TCT ACT GTG? TCT CTT GCG
Leu Ile Ala 275 Ser Thr Val Ser Leu 220 Ala
GGT ATT GCC GAT AAA TTTT TUT CAT GCA
Gly Ile 290 Ala Asp Lys Phe; Asn 295 His Ala
GAA CGC TTT AAA AAA TTA GGC TAT GAC
Glu 005 Arg hhe Lys Lys Leu 310 Gly Tyr Asp
TAT CAG CGG GGA ACA GGG ACT ATT GAT
Tyr Gln Arg Gly Thr 025 ly t hhT Ile Asp
ACC GCA TTG GCC GCT ATT GCT GGT GGT
Ter Ala Leu Ala 000 Ala lle Ala Gly Gly 305
TCG GTT ATT GCT TCA ccc; ATT GCC TTA
Ser Val Ile 055 Ala Ser Pro Ile Ala 300 Leu
GTA ATT TCT ACG ATT CTG CCAA TAT TCT
Val Ile 070 Ser Thr lle Leu Gln 375 Tyr Ser
AAC AGC AAC CAA CAT GCT CTT 432
Asn. Ser Asn Gln His Ala Leu
140
TCA TTA ATT GAA AAT ATT GCT 480
Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala
155 140
GGT GAG CAA ATT AGT CAA TTT 528
Gly Glu Gln Ile Ser Gln Phe 170 1-75
TTA GGG ACT TTA GGA GAC TAAA 576
Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys
190
GCT GGC CTT GGT TTA GAT GTT 624
Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val
205
GCT GCA CTT GTA CTT GCA GAT 672
Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp
220
GGT GCG GGT TTT GGAA TTG GCA 720
Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala
235 220
GCC GTT TCT TCT TAC ATT TTA 768
Ala Val Ser Ser Tyr Ile Llu 250 255
TCA ACT GGG CCT GTG GCT GCT 8/16
Ser Thr Gly Pro Val All Ala
270
ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC 864
Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala.
285
AAA AGT TTA GAG AGT TAT GCC 912
Lys Ser Leu Glu Ser Tyr AAa
300
GGA GAT TAAT TTT! TTA GCA GAA 960
Gly Asp Asn Leu Leu AAl Glu
305 302
GCA TCG GTT ACT GCA ATT WAT 1008
Ala Ser Val Thr Ala 1ll Asn 330 335
GTG TCT GCT GCT GCA GCC GGC 1056
Val Ser Ala Ala Ala Ala Gly
300
TTA GTA TCT GGG ATT ACC GGT 1100
Leu Val Ser Gly Ile Thr Gly
365
AAA CCAA GCA ATG TTT GAG CAC 1^^2
Lys Gln Ala Met Phe Glu His
308
184 825
TTT GTA AAT HU Lys AUT Ile CAT His 390 TAAT TAAA ATT ie^ GTA Val GAA Glu 395 TGG Trp GTAA ATAA TAT AAT 1200
Val 385 Ala Asn Asn LyS Glu Lys Asn Asn 440
CAC GGT AAG HIC TAC ίγτ GTAA TAAT GGT TAC GAT GCC CGT TAT CTT GCG 1248
His Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala
405 410 445
AAT TTA CAA HAT ATG TAAA TTC TTA CTG TAC TTA TAAC ATAA GAG TT^łX 1296
Asn Leu Gin Asp Asn Met Lys Phe LLe Leu Asn Leu Asn Lys Glu LLU
420 425 440
CAG GCA GHA CGT GTC ATC GCT ATT ACT CAG CAG CTAA TGG GAT TAACT TAAC 1344
Gln Ala Glu Arg Val Ile Ala Ile Thh Gin Gln Gln Trp Asp Asn Asn
435 440 445
ATT GGT GAI* TTA GCT (CTT ATT AGC CGT TTA GGT Gm TAAA GTC CTT AGH 1392
Ile Gly Asp Leu Ala Gly Ile Ser Arg Lee Gly Glu Lys Val LLe Sre
450 455 460
GGT AAA GCC TAT gtg GAT GCG TTT GAA. GTA. (TlC TAAA CAC ATT TAAA GCC 1440
Tly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe G1g G1g Gly Lys His He Lys Ala
465 470 475 448
GAT AAA TTA GTA CAG TTG GAT TCG GCA AAC GGT ATT ATT GAT GTG AGT 1488
Asp Lys Leu Va± Gin Leu Asp Ser A1g Asn Gly He Ile Asp Val Sre
485 490 440
AAT TCG GGT TAVA GCG TAAA ACT CAG CCA ATC TTA TTC AGA acg CCA TTA 1536
Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gin Hii IIg Leu Phe Arg Thr Pro LLe
500 505 551
TTG ACG ccc; GGA ACA GAG CAT CGT GAA ccc: GTA CCA* ACA GGT TAAA TAT 1584
Leu Thr Pro Thr Glu His Arg G1g Aig Val Gln Thr Gly Lys Tyr
515 550 550
GAA TAT ATT ACC TAAG CTC AAT ATT tac CGT GTA GAT AGC TGG TAAA ATT 1632
Glu Tyr Ile Thr Lys Leu Asn Ile Am Aig Val Ser Trp Lls IIg
530 553 540
ACA GAT GGT GCA GCA AGT TCT ACC ttt GGT TTA ACT AAC GTT GTT cci 1680
Thr Asp Gly Ala Ala Ser Srr Thr Phe; Aip Leu Thr Asn Val Val Gln
545 550 555 556
CGT ATT GGT ATT GTAA TTA GAC AAT GGT GGT TAT GTA tkcct TAAA ACC AAA 1728
Arg Ile Gly Ile Glu Leu Asp Asn A1g G1g Asn Val Thr LyS Thr Lls
565 570 555
GAA ACA AAA ATT ATT GCC taa* CTT GGT ΊΑΑ GGT GAT GAC TAAC GTA TTT 1776
Glu Thr Lys Ple Ile Ala Lys LLe G1g G1g Gly Asp Asp Asn Vv1 Phe
580 585 550
GTT GGT TCT GGT ACG ACG GTAA ATT GAT GTC GGT GTA* GGT TAC GAC CGA 1824
Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu Ile Aip G1g Gly Glu Asp Aig
595 600 665
GTT CAC TAT AGC CGT GGA taac TAT GGT GCT TTA ACT ATT GAT GCA ACC 1850
Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr G1g A1g Leu Thr He Asp Ala TTr
610 661 660
AAA GAG ACC GAG CCAA GGT AGT TAT ACT GTA AAT CGT TTC GTA GTA* ACC 1920
Lys Glu hh r G1 r Gin Gly Ser Tyr TTh Val Asn Arg Phe Val Glu Thr
625 660 635 66^
184 825
GGT AAA GGA CTA Leu CAC GAA GTG ACT TCA ACC CAT ACC GCA TTA GTG Val 655 GGC Gly 0968
Gly Lys Ala His 645 Glu Val Thr Ser Thr 650 His Thr Ala Leu
AAC CGT GAA GAA AAA ATA GAA TAT CGT CAT AGA AAT AAA CAG CAC CAT 2006
Asn Arg Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg His Ser Asn Asn Gln His His
660 665 670
GCC GGT TAT TAC ACC AAA GAT ACC GTA AAA GAT GTT GAA GAA ATT ATC 2064
Ala Gly Tyr 'Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lys Ala Vil Glu Glu Ile He
675 680 685
GGT ACA TCA CAT AAC GAT ATC TTT 2AAA GGT AGT AAG TTC AAT GAT GCC 2002
Gly Thr Ser His Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala
690 695 770
TTT AAC GGT GGT GAT GGT GTC ATT ATT ATT GAC GGT AAC GAC GGC AAT 2060
Phe Asn Gly Gly Asp Gly Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp dy Asn
705 710 715 720
GAC CGC TTA TTT GGT GGT JAAl GGC GAT GAT ATT CTC GAT GGT GGA AAT 2208
Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp ile Leu Asp Gly dy Asn
725 770 735
GGT GAT GAT TTT ATC GAT GGC GGT TAAA GGC AAC GAC CTA TTA CAA AGT 2256
Gly Asp Asp Phe Ile Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu HHs AGl
740 775 750
GGC AAG GGC GAT GAT ATT TTC GTT CAC CGT AAAA GGC GAT GGT AAT GAT 2304
Gly Lys Gly •Asp Asp Ile Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Am Ais)
755 760 765
ATT ATT ACC GAT TCT GAC GGC TAAT GAT AAA TTA TCA TTC TCT GGA ATA 2352
Ile Ile Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lls Leu Ser Phe Ser Alp Tee
770 77^ 778
AAC TTA ATAA GAT TTA ACA TTT GGA AAAk GGT TAAl CAT AAT CTT GGT AAT 2400
Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Wl AIl
785 790 795 800
ACG AAT AGC TAAl AiAl GAG TAAA GTG ACC ATT CAA AAC TGG TTC CAG AGA 2448
Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr IIl Gln Asn Trp Phe Aai AGl
805 880 815
GCT GAT TTT GCT AiAl GAA GTG CCT TAT TTA TAAA GCA ACT TAAA GGA AGA 2496
Ala Asp Phe A la Lys Glu Val Prr Asn Tt· Lys Ala Thr Lys Ais AGl
820 882 830
AAA ATC GTGl GTAA ATC ATC GGT CCAA TAM? GGG GAG CGG ATC ACC TTA AAA 2A44
Lys Ile Glu Glu Ile Ile Gly GGn Asn GG| Glu Arg Ile Thr Ser Ays
835 884 845
CAA GTT GAT GAT CTT ATC GCA TAAa GGT AAA GGC TAAA ATT ACC CAA AGA 215 92
Gln Val Asp Asp Leu Ile Ala Lys Gly Am Gly LyS Ile Thr dl Ais
850 855 886
GAG CTA TCA AAAA GTT GTT GAT AAC TAT GAA TTG CTC TAAA CAT AAG AAA 2640
Glu Leu Ser LyS Val Val Asp Asn Tyr GGl Leu Leu Lys His See Ays
865 870 875 880
AAT GTG ACA AAlC AGC tta GAT AAGG TTA AAT TCA TCT GTA AGT GGA ATT 2688
Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys LLe IIl Ter Ser Val Ser All APh
885 889 8^95
184 825
2736
ACC Thr TTG Ser TCT bter AAT Asn 900 GAT Asp CGb GAb M.T GTA TTA GTG GCT Ala CCA Prr ACT Thr 910 TCA Ser ATG Met
erz rgz Asn Val 905 Leu Val
TTG GAT CM AGT TTA CTb CTb CTT' CAA TTT GCT AGG GGA TCC
Leu Aep bln Ser Leu Ser Leu GGn Phe Ala Arg GGy Ser
915 920 925
2778
2794
TAGCTAGCTA GCCATG
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID n ir:6:
(i) (ii) (xi) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (Α) DŁUGOŚĆ: 926 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa TYP CZĄSTECZKI: białko OPIS SEKWENCJI ID nr: 6:
Met 1 Ala Thr Val IIl 5 Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lls Lls 10 11
Ile Ile Leu Tyr IIes 20 Pro Gin Asn Tyr 22 Gin Tyr Asp Thr Glu GGl GGl 30
Asn Gly Leu Gln Asp 35 Leu Val Lys AAl 40 Ala Glu Glu Leu Gly IIl GGl 45
Vil Gln Arg Glu GGl 50 Arg Asn Asn Ile 55 Ali Thr AAa Gin Thr S^er Lue 60
Gly 65 Thr Ile Gin Thr Ala IIl Gly Leu 70 Thr Glu Arg Gly Ile Vvl Lue 77 88
Ser Ala Pro Gin IIl 85 Asp Lyb Leu Leu Gin Lys Thr Lys Al^^ Gly Gin 90 99
Ala Leu G1g Ser bAl 100 Glu Ser He Vvl 105 Gin Asn Ali Asn Lys Ala Lys 110
Thr Val Leu uee bly 115 Ile Gln Ser IIl 110 Leu Gly Ser Val Leu Ala GGl 1^^
Met Asp Leu Asp Glu 130 Ala Luu Gln Asn 115 Asn Ser Asn Gln His Ala Luu 114)
Ala 145 Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn ISO Ser Leu IIl Glu Asn II^^ Ala 1^^ 116)
Asn Ser Val Lys Thr 165 Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln Ile Ser Gin PPh 170 117
Gly Ser Lyss slu bln 180 Asn Ile Lyb GGy 115 Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lus 190
Leu Lys Asn IIl bly 195 Gly Leu Asp Lls 200 Ali Gly Leu Gly Leu Asp Val 205
Ile Ser Gly Leu Leu 210 Ser Gly Ali Thr 215 Ala Ala Leu Vil Leu Ala Asp 222
184 825
Lys Asn 225 Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 240
230 235
Asn Gln Val Val Gly Asn Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu
245 250 255
Ala Gln .Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Se r Thr Gly Pro VaS Ala Ala
260 265 270
Leu Ile Ala Ser Thr VaS Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala
275 220 285
Gly Ile Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala
290 2^^ 300
Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu
305 310 315 320
Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Ala Ile Asn
325 330 335
Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Gly Gly Val Ser Ąla Ala Ala Ala Gly
340 345 350
Ser Val Ile Ala Ser Pro I ^e Ala Leu Leu Val Ser Gly Ile Thr Gly
355 330 365
Val Ile Ser Thr Ile Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu HiS
370 377 380
Val Ala Asn Lys Ile His Asn Lys He VaL Glu Trp Glu Lys Asn Asn
385 390 335 400
His Gly LyS Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala
405 410 415
Asn Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn Lys Glu Leu
420 425 430
Gln Ala Glu Arg Val Ile Ala 11 e Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn
435 444 445
Ile Gly Asp Leu Ala Gly IIe Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser
450 445 460
Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Lys His Ile LyS Ala
465 470 445 480
Asp Lys Leu Val Gln Leu Asp Ser A AL a Asn Gly IIe Ile Asp Val Ser
485 440 495
Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gln His IIe Leu Phe Arg Thr Pro Leu
500 505 550
Leu Thr Pro Gly Thr Glu Arg Gl u Arg Val Gln Thr Gly Lys Tyr
515 550 555
Glu Tyr 11 e Thr Lys Leu As n 11 e Asn Arg Val Asp Ser Trp Lys Ile
530 553 550
Thr Asp Gly Ala Ala Ser Sse Thr Phe Asp Leu Thr Asn Val Val Gln
545 550 555 560
184 825
Arg Ile Gly Ile Glu Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lys Thr 555 Lys
565 570
Glu Thr Lys Ile Ile Ala Lys Leu Gly Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe
580 585 590
Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu Ile Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg
595 600 605
Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Ala Thr
610 615 620
Lys Glu Thr Glu Gin Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr
625 630 635 640
Gly Lys Ala Leu His Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly
645 650 665 55
Asn Arg Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Hs n er n Asn Asn Gln Hi^ss His
660 665 670
Ala Gly Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lyn Ala Val GGu Glu Ile Ile
675 680 685
Gly Thr Ser His Asn Asp He Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala
690 695 700
Phe Asn Gly Gly Asp Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asn
705 710 715 770
Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp Ile Leu Asp Gly Gly Asn
725 730 775
Gly Asp Asp Phe He Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly
740 745 750
Gly Lys Gly Asp Asp Ile Phe Val His Arg Lyn Gly Asp Gly Asn Asp
755 760 765
Ile Ile Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lyn Leu Ser Phe Ser Asp Ser
770 775 780
Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu LyS Val Lys His Asn Leu Val Ile
785 790 795 800
Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr Ile Gin Asn Trp Phe Arg Glu
805 810 815
Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu
820 825 830
Lys Ile Glu Glu Ile Ile Gly Gin Asn Gly Glu Arg Ile Thr Ser Lys
835 840 845
Gln Val Asp Asp Leu Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile Thr Gln Asp
850 855 860
Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys
865 8-70 875 880
Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val Ser Ala Phe
885 890 895
184 825
Thr Sur SeS Α sn 900 Α Sp S er Arg Asn Val 905 Leu VlU Ala Pnz TTn 910
Leu Asp Gin n eu beu S er Ser Leu G ln Phe Ala α rg Gly Ssr
915 92Q 925
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2934 pir zisid (b) TYP: kwis nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedni (d) TOPOLOGIA: liniowi (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowi) (ix) CECHA:
(Α) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1...5230 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 7:
ATG GCT ACT Thr GGT V vl CTA GAT Ile Asp 5 CTA AGC TTC CU ZAA Lus ACT TTh .GG bGn GCA Ala AAA Lys 11 ZCCl Lys 48
Mut 1 Ali Leu Seu Phe Prr 10
ATT CTC CTC TTG ATT CCC CGGZ AAA TAC CCC TAT GAT AGC GJCG CCCA GGT 96
Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Gin Am Tyr GG^ Tyr As^fi TTh Glu Gin GGy
20 25 3(0
GCT GGT TTA CCA GCT ΤΤΑ GTC ACC GCG GGC GJAa GG^G ATT GGG ATT GAG 144
Asn Gly Leu G Gn Ass Alu Av1 Als Ala AAl bGn GGn luu Gly Ile GGu
35 44 455
GTC CGC AGA GGA GCC CGC GCTT JAT ATT GGC ACA GGU CCC ACC AGT TTA 192
Vil Gln Arg G Gn Glu Arg Asn Am lin AAl Thr ATn GGn Thr Ser Luu
50 55 66
GGC Am ATT CCA ACC GCT ATT GGC TTA AGC GAG cm TOG ATT GTG 240
Gly Thr Ile G Gn Thr Ala Ilu GGn Leu TTh Alu As- bGn Zle Val Luu
65 70 77 88>
TCC GCT CCA CCA ATT GAT AGA TTT CTA CCG ZGAG ACT ZTC GCA GGC CCGl 288
Ser Ali Pro G Gn Ile Asp Ly s Llu Leu GGn Als TTh Lls Ala GSy Gin
85 90 95
TOC TTA GGT TTC WC GGA. AGC ATT GTA CCA ZAGT GCA ZAA ZGAG GCC JGGZ 336
Ali Leu Gly S eu Ali Glu Ser IIl Val GGn Asn AGa Asn Lys Ala Lys
100 H5 110
ACT GTA TTA TTC GGC ATT CGGZ TCT ATT TTA GGC TCA GTA TTG GCT GGA 384
Thr Vll Leu S ee Gly Ile Gin Seu Ile Llu Gly Ser Vvl Leu Ala Glv
115 110 125
ATG GCT TTA GGT GAG GCC TTA CCG AAT ZAA AGC GAC CCC CAT GCT CTT 432
Mut Asp Leu A AJ) ZGn Ala Leu Gin Ass A m Ser Asn GGn His Ala Leu
055 115 114
GCT AGA GCT GGG TTG GAG CTA ACA ZCAT TTC TT JA ATT GGA. ZCAT ATT GCT 480
Ali Lys Ala G Gn Leu Glu Leu TTr Asn See Leu IIe GGn Asn Ile Ala
145 110 115 110
184 825
GAT Asn TCA GTA A2GG ACA CTT Leu GAC G7GG Asp Glu TTT GGT GAG CAA Gln ATT Ile AGT Ser CAA Gln 175 TTT Phe 528
Sua Val Lys Thr 165 ' Phe Gly 170 Glu
GGT TCA AAA CTA CJAG AAT ATC GGC TAT GGG ACT TTA GGA GAC AGA 576
GGy Ser Lys Leu Gln Asn Ile Lys Gly Llu Gly Thr Leu Gly Asp Lys
180 115 190
CTC GAA AAT ATC GGT (GGA CTA? GAT iGGG GCT GGC CTT GGT TTA GAT GTT 6224
Leu Lys Asn Ile Gly Gly Leu Asd Lys AGa Gly Leu Gly Leu Asp Val
105 200 205
ATC ACG GGG CTA TTA TCG (g;c GCA ACA GCT GCA CTT GTA CTT GCA GAT 66^
Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp
210 2H 220
AAA GAT GCT TCA ACA GCT iAGA ugg\ G GG GGG C?i^G GGT TTT GiGG TTG GCiG 720
Lys Asn Ala Ser Thr A Al a Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu jHa
225 230 235 240
AAC CAA GTT GTT GGT AGT ATT ACC iGG\ GGC GTT TCT TCT TAC ATT TTA 7 68
Gsn Gln Val Val Gly Asn IIli Thr Lys AGi Val Ser Ser Tyr Ile Leu
205 250 255
GCC CAG CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT •u^.A ACT GGG CCT GTG GCT GCT 816
AGa Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu See Se ja Thr Gly Pro Val Ala Ala
260 225 270
TTA ATT GCT? TCT ACT GTT TCT CCT GCG ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC Ł&4
Leu Ile Ala Ser Thr Val Ser Llu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phu JHa
275 228 2Q5
GGT ATA GCC GAT TAAG TTT JAGT CCG GCA ?ugg AGT TTA GAG AGT TAT GCC 90^^
GGy Ile Ala Asp Lys Phe Asn HHi Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyu jHa
200 220 300
GAA CGC ttt TAGG TGAG TTA GGC TAT gac GGA GAT AAT TTA TTA GCA GAA 960
Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly T?! Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu
305 310 315 320
AAA CAG CGG GGA ACA GGG ACT ATT GAT GCA TCG GTT ACT GCA ATT ZGGT nos
Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr IIg Asp Ala Ser Val Thr Ale. Ile Asn
325 330 335
GCC GCA TTG GCC GCT ATT GCT GGT GGT utg TCT GCT GCT GCA GCC GGC 115 6
Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Glv Gly val Ser Ala Ala Ala Ala Gly
300 335 350
TCG GTT ATT GCT TCA CCG ATT GCC TTA TTA GTA TCT GGG ΆΤΤ ACC GGT 1104
Ser Val ll e Al a Ser Pro IIi Ala Llu Leu Val Ser Gly Ile Gly
355 366 365
GTA AAA TCT ACG ATT CTG CCGG TAT TCT AAA CAA GCA ATG TTT GAG CAC 115 22
VaG Ile Ser Thr Ile Leu Gln Tyr Sei· Lys Gln Ala Met Phe Glu His
370 337 380
GTT GCG AAT? ?AGG ATT CAT uGGC uggg ATT GTA GAA TGG GAA AAA AGT AAT 1200
Val Ala As U ys u Ile His Asn Lys Hi Val Glu Trp Glu Lys •Asn Asn
385 390 395 400
CGC GGT AAG JGGC TAC TTT GJA! iGGT GGG? TAC GAT GCC CGT TAT CTT GCG 1248
His Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Ty· Asp Ala Arg Tyr Leu Ala
005 410 415
184 825
AAT Asn TTA CJAA GAT Asp 420 AAT Asn ATG AAA TTC TTA Leu 425 CTG Leu TAAC Asn TTA ATC SCT GAG TTA Leu 1290
Leu Gln Met Lys Phe Leu Asn Lys 443 Glu
CAG GCA GAA CGT GTA ATC GCT ATT ACT CAG CAG CGCA TGG GAT STAĆ (ClC 1344
Gln Ala Glu Arg Wl Ile Ala Ile Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn
435 440 444
ATT GGT GAT TTA GCT GGT ATT AGC CGT TTA GGT GAT STCA GTC CTT AGT 1392
ILe Gly Asp Leu Ala Gly Ile Ser Arg Leu Gćy Glu LyS Val Leu Ser
450 455 440
GGT AAA GCC TAT GTG GAT GCG TTT GGAA GICA GGC (TC. CAC ATT STU GCC 1440
GLy Lys Ala Tyr Wl Asp Ala Phe Glu Glu de Lys Hii IIe Lys Ala
405 470 475 480
GAT AAA TTA GTA CAG TTG GAT TCG GCA JAAC GG^^ ATT ATT GAT gtg AGT 1488
Asp Lys Leu Wl Gln Leu Asp Ser Ala Asn de IIe IIe Asp Wl SSr
485 440 495
AAT TCG GGT TCGi GCG A.AA ACT CAG CAT ATC TTA TTC AGA ACG CCGa TTA 1536
Asn Ser Lly yy s Ala Lys Thr Gln His He Ler PPh Arg TTh Ppo Seu
500 55)5 551
TTG ACG CCG GGA ACA GAG CAT CGT GJTA CGC d' CAT ATC SGT vcc SAT 1584
Leu Thr Pro Gly Thr Glu His Arg Glu Arg Wl de (Th dl Syy (Ί
515 520 552
GAA TAT ATT ACC AAG CTC AAT ATT (TAC CCG d' SAT AGC TTG ACT (TT 1632
Glu Tyr Ile Thr Lys Leu Asn Ile Asn Arg Wl Ars Ser (Tp Syy SIe
530 535 554
ACA GAT GGT GCA GCA AGT TCT ACC ttt GAT TT' SCC AAG SGT SAh SAT 1680
Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr PPe Asp Leu TTh Sas Vv1 Wl dn
070 550 55 5 560
CGT ATT GGT ATT GJTA TTA GAC JTAT GCT GGA ACC dT AGC SCT ACG ATT 1728
Arg Ile Gly Ile Glu Leu Asp Asn Ala Gl| Ais Vv1 STh Syy SAh Syy
505 550 575
GAA ACA AJAi ATT ATT GCC TCTA CTT GGT GAC Gd SAT Sd AAC SGT STT 1776
GLu Thr Lys Ile He Ala Lys Leu Gly de de Sss Srs Sis Wl SPh
580 555 550
GTT GGT TCT GGT &CG ACG GJCA ATT GAT GGC Gd GGC SGG TTG SAG Sd 1824
Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu Ile Asp dy dy de dl (Ί sis Sep
505 600 600
GTT CAC TATA AGC CGT G(3 JA JTAC TAT GGT GCT TTT ACC SCT SM GCG SCC 1872
Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ale Ler STh SIe sis Sil STh
010 615 602
AAA GAG ACC CAA GGT AGT TAT ACC GGA AAC CCG TTT STA Sd SCC 1920
Lys Glu Thr Glu Gln Gly Ser Tyr Thr Wl Sas Sep SPh Vv1 de (Th
025 630 635 640
GGT AAA GCA CTA CAC GJTA GTG ACT TCA ACG CCT ATC ^g:a STT. (TT Sd 1168
GLy Lys Ala Leu His Glu Wl Thr SSr TTh Sii TTh Sil Ser Wl dn
045 605 655
AAC CGT GiGA GHA STCA ATA GGCA TAT CGG CAC sn AAT STC CAC cat SAT 2016
Asn Arg Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Hii SSr Sis Sis de Sii Sii
000 605 600
184 825
GCC GGG TAT TTT ACC HA GAT AAC Tot Tot Thr Lys Asp TTh TTG HA GCT GTT GM Glu 685 GMC Glu ATT Ile ATCC Ile 2064
Ala Gly Lls Lys Ala Val
675 680
GGG ACA TCA CAT MC GAT ATC TGT AAA. GGT AGT MG TTC MT GAT GCC 2112
Gly Ghr Ser H is Asn Asp Ile Phh Lyr Gly Ser LyS Phe Asn Asp Ala
690 695 700
TTT AAC GGT Gd GAT GGT GTC GAA ACT ATT GAC GGT MC GAC GGC MT 2160
hhe Asn Gly Gly Asp Gly Val Asp TTh Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asn
705 710 715, 720
GAC CGC TTA TGT GGT GGT AM GGC GAT GAT ATT CTC GAT GGT GGA MT 2208
Asp Arg Leu Phh Gly Gly Lys Gil· Ais Asp Ile Leu Asp Gly Gly Asn
725 730 7715,
GGG GAG GAT TGG ATC GAT GGC GGT AM GGC AAC GAC CTA TTA CAC GGT 2256
Gly Asp Asp P hh I]^<s As]? Gly Gil· Lyr Gly Asn Asp Leu Leu His Gly
700 745 750
GGC AAG GGC GGT GAT ATT TTC GGT CTT CGT AM GGC GAT GGT JAlT GAT 2004
Gly Lys Gly Asp Asp Ile Phe Val His AT<g Lys Gly Asp Gly Asn Asp
755 760 765
AGT AGG ACC GGT TCT GAC GGC MT GGT AM TTA TCA TTC TCT GAT TCG 2052
lle lle Thr Alp Ser Asp Gly Ais Ais) Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser
770 715, 780
AAC TGA AM GAT TTA ACA ttt GM AM GTT JAAl CAT MT CTT GTC ATC 2000
Asn Leu Lys Aas Leu Thr Phe dl Lyr Val Lys His Asn Leu Val Ile
785 790 795 800
ACG AAG AGC AH. AM GAG MA GGG ACC ATT CH MC TGG TTC CGA GAG 2048
Thr Asn Ser L ys Lys Glu Lys Val TGh Ile Gln Asn Trp Phe Arg Glu
805 810 815
GCT GAT TTT GCC AM GH GTG CCT AAT TAT AM GCA ACT MAC GAT GAG 2096
Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pho Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu
820 825 830
AAA ATC GAA GH ATC ATC GGT CH MT GGC GAG CGG ATC ACC TCA MAG 2504
Lys lle Glu dl Ile Ile Gly Gln Am Gly Glu Arg Ile Thr Ser Lys
805 840 845
CAA. GGG GAT GAT CTT ATC GCA MA GGG MC GGC AM ATT ACC CM GAT 2592
Gln Val Asp Asp Leu Ile Ala Lyr Gly Asn Gly Lys Ile Thr Gln Asp
850 855 860
GAG CTA TCA MA GTT GTT GAT MC TAT GM TTG CTC AAA CAT AGC AAA 2640
Glu Leu Sr t ys t Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys
865 870 875 880
AAT GGG ACA MC AGC TTA GAT AAG TTG ATC TCA TCT GTA AGT GCA TTT 2688
Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Lls He Ser Ser Val Ser Ala Phe
885 890 89 5
ACC TCG TCT AAT GAT TCG AGA MT GTA TTA GTG GCT CCA ACT TCA ATG 2736
Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn WI Leu Val Ala Pro Thr Ser Met
900 905 910
TGG GAG CH AGT TTA TCT TCT CTT CAA TTT GCT AGG GGA TCT CAG CAT 2784
Leu Asp llT er t Leu Ser Sfer Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser Gln His
915 920 925
184 825
TGG AGC Trp Ser ACn yyn GCn CTG CCG Arr CCT GGC AAG GGT TCT CWA Gln 940 GAT Asp TTG AGC TAC Tyr 2832
Hn Leu Pro 935 Gly Sss Gly Ser TTr Ser
930
GGC CTG GGn CGn GGT GGC TCT AGC CCA CAT TGG AGC TAC GGG CTG CGC 2880
Gly Leu rgn ron Gly GGg Ser Ser GGn His Trp Ser TTyr GGg Leu Arg
945 950 955 960
CCT GGC AGn GTn AGC CCA GAT TGG AAG TAC GGC CTG CGT CCC GGT GGA 2928
Pro Gly Srn •Hn Ser GGe Asp Trp Sss Tyr Gly Leu Arg PrQ Gly Gly
965 970 975
TCC TAG 2934
Ser
2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:8:
(H) CHARAKTERYSTYKA SEEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 977 aminokwasów (b) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:
(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 8:
Met Ala 1 Thr Val I Ig 5 Asp Leu Sss Phe Pro 11 Lys Thr GGn Ala Lys 11 Lls
Ile Ile Leu T Tr He P ro Gln Asn Tyr GGs Tyr Asp Thr Glu Gln GGy
20 25 30
Ass Gly Leu G ln AAs Lsu Val ys s Gl n Ala Glu Glu Lls Gly Iln euu
35 44 44
Val Gln Arg G lu G Ge Arg Asn Am IGs Ala Thr Ala GGn Thr Ser Lls
50 555 60
Gly Thr Ile Gln Thr AGa He nGe nLS Thr Glu Anu Gln IGn nal Glu
65 70 27 88
Ser Ala Pro GGn He Asp Lyn Leu Leu GGn Lys Thr Lys Ala Gl y Gln
85 90 95
Ala Leu GGy S ss nla G lu Ses He nal GGs Asn Ala Asn Lys Ala LyT
100 113,5 110
Thr Val Leu S SS niy I le G1g Sss n le Lsu Gly Sen Val Leu Ala GGy
115 112 115
Met Asp Leu A sp G Ge Ala Lsu Gln Asn Asn Ser Asn GGn His Ala Leu
130 115 140
Ala Lys Ala Gly Leu GGu Lls nTh nm Ser Leu LSu Gln AGn He sSa
145 150 1155 1661
Ass Sso Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly GGu Gln Ile Ser Gln Phe
165 117) 115
GGy Ser 1s n Se n Gln Asn Ile Lys Gly Lsu Gly Thn Leu GGy Asp Lys
180 113,5 190
184 825
Leu Lys Am Ile Gly Gly Leu ssp Sst Ala Gly Leu 200 Gly 2(30 Leu Asp Val
095
Ile Ser GGl Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp
200 215 220
Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala
225 230 223 240
Asn Gln Val Val Gly Asn Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu
245 220 225
Ala Gln Aig Vil Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala
260 226 2270
Leu Ile Al^ Ser Thr Val Ser Leu Ali Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala
275 2230 228
Gly Ile AA^ Asp Lys Phe Asn Hś p li p Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala
290 299 330
Glu Arg PPh Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly As p As n Leu Leu Ala Glu
305 310 330 3^0
Tyr Gln Aig Gly Thr Gly Thr Ile Asp Ala See Vil Thr Ala Ile Asn
325 333 333
Thr Ali Lm pil. Ali l Ai e Ta G1a l Ty G^aS ler A la Ala Ala A la lii
340 334 335)
Ser Vil IIu Ala Ser Pro Ile Ala Leu Leu Val Ser Gly II^ Thr Gly
355 330 336
Vil Ile See: Thr Ile Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Ala MeT PPe Gil HiS
370 377 330
Val Ali Am Lys Ile His Asn Lys Ile Val GGl Trp Glu Lys Asn Asn
385 390 339 440
His Gly Lys Asn Tyr Plie Glu Asn Gly Tyr As p Al a Arg Tyr Leu Ala
405 440 440
Asn Leu GGl Asp Asn Met Lys Phe LLe Leu Asn Leu Asn Lys G1u Llu
420 442 443
Gln Ali GGl Arg Val Ile Ali Ile Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn
435 444 44S5
Ile Gly Ais Leu Ala Gly Ile Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser
450 455 440
Gly Lys AA^ Tyr Val Asp Ali Phe Glu Glu Gly Ly s His Ile Lys Ala
465 4-70 447 480
Asp Lys Lee Val Gln Leu Asp Ser Ala Asn GGy Ile Ile Asp Val Ser
485 440 449
Asn Ser GGl Lys Ala Lys Thr Gln HHi Ile Leu Phe Arg Thr Pro Leu
500 550 550
Leu Thr Pn Gly Thr Glu His Arg Glu Arg Val Gln Thr GGv Lys Tyr
505 520 55 25
184 825
Tlu Tyr 530 Ile TTh iss Lsu Asn 535 Ile Asn Arg ViG Asp 540 Ser Trp Lys Ile
Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr Phe Asp Leu Thr Asn VaA Val Gln
545 550 555 560
Arg Ile Gly 11 ii Tlu Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lyr Thr Lys
565 570 575
Tlu Thr Lys Ile Ile Ala Lyr Leu Gly Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe
580 585 590
Val Tly Ser Gly Thr Thr Glu Ile Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg
505 600 605
Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Ala Thr
610 615 620
Lys Tlu Thr Glu Gln Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr
605 630 665 640
Gly Lys Ala Leu His Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly
645 650 665
Asn Arg Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Hii Ser Asn Asn Gln His His
660 665 660
Ala Gly Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lls Ala Val Glu Glu I3^gu Ile
655 668 66^
Tly Thr Ser H ii AiP Aip Ile hhe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala
600 660 750
hhe Asn Gly Gly Asp Gly Val Asp Thr IIg Asp Tly Asn Asp G ly Asn
505 710 751 720
Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp IIg Leu Asp Gly Gly Asn
505 753 753
Tly Asp Asp Phe Ile Asp Gly Gly Lys Gly Ann Asp Leu Leu His Gly
540 745 755)
Tly Lys Gly Asp Asp Ile Phe Vv1 Hi-s Air Lyn Gly Asp Gly Asn Asp
555 756 756
Ile Ile Thr A ip Are Aip A1g Asn Asp Lls Leu Ser Phe Ser Asp Ser
550 755i 750
Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Tlu Lys Val Lsr His Asn Leu Val Ile
585 790 750 800
Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys ViG Thr IIg C-ln Ann Trp Phe Arg Glu
805 881 885
Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lyn Ala Thr Lys Asp Glu
800 825 883)
Lys Ile Glu Glu Ile He Gly Gln Asn Gly Tlu Arg IIg Thr Ser Lys
835 880 884
Tln Val Ps r pp r Leu Ile Ala Lys Gly Ann Gly Lls IIg Thr Gin Asp
850 855 886
184 825
Glu Lru SSr Lys Val. Wl Asp Asn Tyr Glu Leu Luu Lys His Sep Lys
805 870 88^ 880
Asn ViL Thr Asn Srr Leu Asp Lys Leu Ile Ser Sup Wl Ser Ali Phe
885 890 880
Thr Sro Srr Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu VeS Ala Pro Thr S^e Met
000 005 010
Leu Ais Sin Ger LeS Per Ler Lete G ln Phe Ala Arg Gny SPh Sin li s
015 020 025
Top Sro Typ Gly Lru Arg Pro Gly Sur Gly Sep Gln Asp Tpp Sep Typ
030 035 040
Gly Lru Aig Pro Gly Gly Sur Ser dn His Trp Se r Tyr Gly Luu Arg
045 950 95 5 960
Pro Gly SSr Gly SeS de Asp Trp Seo Tyr Gly Luu Arg Pro Gly Gly
005 970 907
Sep
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI : ID
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1570 pio zisid
(B) TYP: kwas nukleinowy
(A) ILOŚĆ NICI: jedni
(D) TOPOLOGIA: Liniowi
(ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(ix) GEGHT:
(A) NAZWA/KLUCZ: ADS
(B) LOKALIZACJA.: 1... .1632
(xi) OPIS SEKWENCJI ID no: 0:
ATG GAT ACA SGT TTA GAT GTA Ad TTC CCA HAT ATT GGG GCA AAA STCA 48
Met Ali TTih Val Ile Asp Leu Ssu Phe Pro Lys TTi Gly Ala Ly-y Lys
1 5 10 15
ATT ATC CAT TAT ATT CCC CAA ATT TAC C.CA TAT dA ACT GGAC CAA GGT 90
Ile Ile Leu Typ Ile Pro Gln Ain Typ Gln Tyr Ais Thr GGe GGe Gly
20 25 30
TTT HT TTA SAG GTT TTA GTA ATT GAG GCC GGAA GAG TTG GGG ATT GAG 144
Asn Gly Leu de Asp Leu ViL Lyy Ali Ali Glu de Leu Gly IIi Glu
35 40 45
GAC AAT Ad S^i. dA CGC AAT AAT ATT GCA ACA GCT Cd ACC ACT TTA 102
Val Gln Aip Glu Glu Arg Asn Ain ILe ALa Thr Ala Gln Thr S^r· Leu
50 55 00
GGA AAG ATT CCC ACC GCT AAT Gd TTT ACT GAG CCT GGC ATT GTG TTA 240
Gly Thr IIe Gln Thr Ali Ilu dn Lru Thr Glu Arg Gly Ile Wl Leu
05 00 75 80
184 825
TCC TOT CCA rrz CAA CTT: GAT ZGAG TTG CTA CCG AAA ACT ACA GCA GGC Lys Ala Gly 95 CCCA Gln 288
Sur Cli nn a Ilu Asp Lys 85 Leu Leu Gin 99 Lys Thr
TOC TTC GGT TCT GCC GJTG AGC ATT GTA CAA ZGAT GCA AAT AAA GCC ?TAA 336
Cli Luu Gly Ser Ali Glu Ser Ile Val Gin Asn Ala Asn Lys Ala Lys
100 1O 110
ACT GTC TTA TCT GTO ATT CJTG TCT ATT TTA GGC TCA GTA TTG GCT GGA 384
Thr Vll Leu Ser Gly Ile Gin Ser IIe Luu Gly Ser Val Leu Ala Gly
115 120 112 5
TTG GAT TTA GAT GAG GCC TTA CAG JGAT ZAC AGC AAC CAA CAT GCT CTT 432
Mut Gsp Luu Asp Glu Ala Leu Gin Asn Asn Ser Asn Gin His Ala Leu
130 135 140
TOT ACC GCT GGC TTG GAG CTA ACA JTAT TCA TTA ATT GAA JGAT ATT GCT 480
Cli Lys ATa Gly Luu Glu Leu Thr Asn Ser Leu IIn Glu Asn IUz Ala
145 150 155 5 160
CTT TCC GTA JTAG CCA CTT GAC GAA TTT GGT GAG CAA ATT AGT CJCA TTT 528
Csn Sur Val Lys Thr Leu Asp Glu phe Gin Glu Gln Ile Ser Gin Phe
165 11^ 118,
ΑΑT TCA A2TA ctn CTC AAT ATC JAGA GGC TTA GGG ACT TTA GGA GUC TCTA 576
Gly Sur Lys Leu Gln Asn Ile Lys Gly Lue Gly Thr Leu Gly Asp Lys
180 118 110
CTC AGA AAT ATC AAT GGA CTT GAT ZTCA GGC GGC CTT GGT TTA GAT GTT 624
Luu Lys Asn IlLni Gly Gly Leu Asp Lys ATn Gly Leu Gly Leu Asp Val
195 200 205
GTC TCA GGG CTTA TTA TCG GGC GCA ACA GCT GCA CCT GTA CTT GCA GAT 812
Ilu Sur Gly Ue a Uu a Ser Gly Ala Thr Ala Ala Luu Val Leu Ala Asp
210 215 220
TAT CAT GCT TCA GCT GCT iTCG ATGA GTG GGT GCG GGG ttt GAA TTG GCA 720
Lys Gsn Tli erz ho. Ala Lys Lys Val Gin? Ala GGn Phe Glu Le z Ala
200 230 235 240
ACC CTA GTT GTT GGT AAT ATT ACC ATT! GCC GTT TCT TCT TAC ATT TTA 7 68
Asn Gln Val Val Gly Asn Ile Thr Lyr Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu
245 225 2 25 5
TOC CTC CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT TCA ACT GG^G CCT GTG GCT GCT 816
Tli Gln Ar 13 Val Ali Ala Gly Leu Ser Seu· Tl^ar GGy Pro Val Ala Ala
005 226 270
TTG CTT GCT TCT ACT GTT TCT CTT GCG ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC 864
Luu Ilu Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala IIn Ser Pro Leu Ala Phe Ala
275 280 218^
AAT ATT GCC GAT JGCG TTT AAT CAT GCA AGA AGT TTA GAG AGT TAT GCC 900
Gly Ilu Ala sp Α Ss z Phe Asn His Ala Lys Ser Lue Glu Ser Tyr Ala
020 295 300
GGA CTO TTT tATG JTCG TTA GGC TAT GAC GGA GAT AAT TTA TTA GCA G.As 960
Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gin? Asp Ass Leu Leu Ala Glu
305 310 315 320
TAT CGG CGG GGA ACA GGG ACT ATT GAT GCA TCG GGT ACT GCA ATT AAT 1008
Tyr Gln Ar 13 Gly Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Ala Ile Asn
000 330 335
184 825
ACC Thr GCA TTG GCC Ala 340 GCT Ala ATT GCC GGT GAG GTG GCT GCT GCT Ala GCA GCC AAC 1566
Ala Lls Ile Ala Gly Gly 345 Val Sir Ala Ala 350 Ala Asn
CCA Arr GAA TTA ACA TTT GAA JAA GTT AAA CAT JAT CTT GTC ATC ACG 1144
Leu Lys Ars Leu Thr Phe Alu Lys VaG Lys His Asn Leu Val IIe Thr
355 360 336
AAC AGC AAA JAA GAG MA GTG ACC ATT CJA AAC TGG TTC CCA GAG GCT 1522
Asn Ser Ly' Lys Glu Lys Val Thr Ile Gln Ass Trp Phh Arg GCe AAn
370 375 330
GAT CCC GGC yrAr GJA GTG CCC MT TAT JAA GCA ACT AAA iga GGA AAA 1200
Asp Phi AAn Lys Glei Val Poo Asn Tyr Lys AGa Thr Lyr Irs IGn lyy
385 390 39ij 400
ACC GAA GGA ATC ATC GGT CAA JAT GGC GAG CGG ATC ACC ICC AAA CCA 2488
IGs Glu GGe Ile Ile Gly Gls Asn Gly Glu Aog IIn TGh Iss lyy IGe
405 410 415
GCC GAT GAA CTT ATC GCA JAAA GGT AAC GGC Arr. ATT AAC ICA IAA IGA 1296
ViG Asp Ars Leu Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys IIe TGh IAg Irs ICe
420 425 443
CCA CCA AAA itt GTC GAT AAC TAT GJA TTG CTC JAA CCA IAG IAA nrr HL344
Leu Sso Lyy Val Val Asp Asn Tt' Glu Leu Liu Lyr Hii Iss lyy Irs
435 444 444
GCG ACA AAA AGC TTA GAT JAG TGG. ATC TCA GCT GGA IAG IGC icg IAC 1392
VaG Cho Am ner Leu Asp Lys Lls Ile Ser Sio Vv1 Iss IAg nhh ICh
450 455 446
GCG TCC JAA iat TCG AGA JAT GGA TTA GTG GCT CCC AAC ICC IAG ICC 1440
Seo Ser Am Asp Ser Arg Asn Vs1 Leu Val Ala Ppo TTr Iss lei Ils
465 440 447 430
GAC CAA AAA icg- TCT TCT CGT CCA TTT GCT agg GGA TCC ICA ICA IGG 14 88
Asp Gln Sss Leu Ser Ssr Leu GGe Phe Ala Aog GGe Iss IGn IHh Icy
485 440 495
AGC TAC GGA ITG CGC CCC GGC AAC GGT TCT CAA GAA icg IAG IGA IGA
Ser Gyo GGe Ieu Arg Ργο Gly Sss Gly Ser Gls Ars ncy Iss IG' IGe
500 505 551
CCG CGT CCC igt GGC TCT AGC CCA CAT TGG AGC TCA igg ICC ICG ICC
Leu Arg Pho Ily Gly Sss Ser GGe His Trp Sio TG' IAg Ils Iry Iho
515 552 552
GGC AGC GGA igc CJA GAT TGG AAC TAC GGC CGG CCA CCC IGA IGA ICC 1632
Gly Sir GGe ner Gln Asp Trp Ssr Tyr Gly Liu AAy Pho IGe ICn nsu
530 535 554
TAG 1635 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID so:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 544 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowi (D) TOPOLOGIA: liniowa
184 825 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS sekwencji ID nr: 00:
Met 0 Ala Thr VuT Ile 5 Asp Leu Ser Phe Prr 10 Lyr Thr Gly Ala Lys 1S Lys
Ile Ile Leu Tyr er e Pro GUn Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr du Gln GUy
20 225 30
Asn Gly Leu da Asp Lep VuV lys All Tll da GUu Leu USp ner Glu
35 40 415
VaU Gln Ar<g Glu Glu Arg Asn Asn UTt U1t hir AUl Gln Thg Ser Leu
50 55 60
Gly Thr Ile Gln Thr Ali Ile Gly Leu Thr GUu Arg GUy Ile Val Leu
65 70 75 80
Ser Ala Pro Gln Ile Asp Lys Leu Leu GUn Lys Thr Lys Ali Gly Gln
85 99 915
Ali Leu Gly Ser Al a GT u Ser Ile Val GUn Asn Ala Asn Lys Ala Lys
000 100 110
Thr Val Leu Ser Gly Ile Gln Sit i:t Lut GSp Ser Val Leu Ala Gly
005 120 105
Met Asp Leu Asp Glu Ali Leu Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu
030 13S 140
Ala Lys Ala da Leu G1g uru TTr Asn Ser Leu 11 e Glu Asn Ile Ala
045 150 10 55 160
Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln Ile Ser Gln Phe
065 107 10 5
Gly Ser Lys Leu dl Asn Ile Lys Gly Leu dy Thr Leu GUy Asp Lys
080 108 190
Leu Lys Asn Ile dy Gly Leu Asp Lys Ala dy Leu Gly Leu Asp Val
095 220 20 5
Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala TTr AUa AUl Leu Val Leu Ala Asp
200 215 220
Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys ail dy Ala Gly PPie Glu Leu Ala
225 230 225 240
Asn Gln Val Val Gly Asn Ile Thr Lys AUa Val Ser Ser Tyr Ile Leu
245 255 2 25
Ala Gln hig Val All Ali GUy Leu Ser Sse Thr GUy Pro Vil Ala Ala
260 226 2-70
Leu Ile Ala. See Thr Val Ser Leu AUl Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala
275 280 28 5
Gly Ile Ali Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala
290 229 300
Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu
305 310 315 320
Tyr Gln Aig Gly Thr Gly Thr ITt Asp Ala Ser Val Thr Ala Ile Asn
325 333 335
184 825
Thr Ala luu Aau Aau llu Ala Gly Gly 345 Val Ser Alu Alu Ala 350 Ala Asn
300
Liu Lys ss u luu TAu hlT u lL sil Vyl Lys His Asn Leu Val Ile Thr
355 360 365
Asn SlA Lys Lys guu Lys viu Thr Ile Tin Asn Trp Phe Arg Glu Ala
370 375 380
Gsp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyi- Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys
385 390 395 400
Ile Tlu Glu Ile Ile Gly Gln Gsn dy Glu Arg Ile Thr Ser Lys Gln
005 010 415
ViG Gsp Ags Leu I1l Ali Lys Gly Asn GAly Ly s He ASl GIi usp TAu
020 425 400
Leu Ser Lys Val Val Asp A?n Asn du Le u Leu Lyu Ssu SHr ej· Asn
035 440 445,
Val Thr Asn Ser Leu Asp Lyu Leu He Sir Ser Vau Ser Ala’ Phe Thr
050 055 400
Sua Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val luu li u Ala Pro Thr ir u Mtu Leu
065 470 475 480
Gsp Gln Ser Leu S^i· Ser Llu Gin Phe Ala Arg Gly Ser Gln His Ti^jo
085 000 495
Sua Tyr ai u leu Aru Prr Gly Ser dy Ser Gln Asp Trp Ser Τ?!· Gly
500 505 550
Leu Grg Ppa Gly G1g Sta Sei ein His Tr p Ser TyA SAu Ltg yiu PrP
515 520 555
Tly SlA Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pico Gly Gly Ser
530 535 550
(2) INFOJRMGCJA O SEKWENCJI IID nr: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(G) DŁUGOŚĆ: 52 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwii (D) TOPOLOG IG: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNG (genrmrwy) (ix) CECHG:
(A) NGZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1....52 (ci) OPIS SEKWENCJI ID nr: 11:
GCT TCG TCC TGC TCG GTA GAT TTC TCT GGT TCG GAC AAA GGG Gla Ala Gla Gly Sua Val Ili Phe Ser Asp Sua Gsn Leu Lys
10
184 825 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowi (D) TOPOLOGIA: Liniowi (ii) TYP cząsteczki: białko (xi) OPlt SEKWENCJI ID nr: 12:
Ali Ali Ali Gly ter Vil Ile Phe ter Asp ter Asn Leu Lys 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID μ:13:
(1) AHCRAKTERYtTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 pir zisid (B) TYP: kwis nukleinowy (A) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) TYP cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: ADt (B) LOKALIZACJA: 1....18 (xi) OPlt SEKWENCJI ID nr: 13:
GAT GGA GAG TTG TTT AGA
Ali Ali Ali Asn Leu Lys 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID ^:14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 0 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowi (D) TOPOLOGIA: Liniowi (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPlt SEKWENCJI ID nrs 1/1:
Ali Ali Ali Asn Leu Lys 1 5
184 825 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce modyfikowane (B) LOKALIZACJA: 3 (D) INNE INFORMACJE: (uwaga! Aminokwasem w tej pozycji może być Lys, Asp, Val albo Asn).
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce modyfikowane (B) LOKALIZACJA: 5 (D) INNE INFORMACJE: (uwaga! Aminokwasem w tej pozycji może być Lys, Asp, Val albo Asn).
(xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 15:
Gly Gly Xaa Gly Xaa Asp 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 16:
Gly Thr Ile Asp 1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna
184 825 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 17:
Gly Ile Thr Gly (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 18:
Gly Val Ile Ser (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 19:
His Val Ala Asn (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd
184 825 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 00:
Lys IGu ViG CGu 1 (Σ) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: Σ1:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: lminokwlsowl (C) ILOŚĆ NICI: judna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: puptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 01:
Asp Luu Ala GGy 1 (Σ) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: 00:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: lminokwlsowl (C) ILOŚĆ NICI: judna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: puptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 00:
Lys VaG Luu Sur 1 (Σ) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: 03:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) TYP: lminokwlsowl (C) ILOŚĆ NICI: judna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: puptyd (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: Σ3:
Asp AGa Phu GGu 1
184 825 (2) informacja O sekwencji lD ιο:20:
(S) AiARAKGERYeGYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 0 aminokwasy (B) GYP: aminokwascMa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) Topologia: ISiScwi (SS) GYP CZĄSTECZKI: peptyd (ci) OPIS SEKWENCJI ID no: 20:
Lys Lsu Vi1 Gln (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID io: 25:
(S) AiARAKGERYeGYKA SEKWENCJI:
(T) DŁUGOŚĆ: 0 lmSlckwlyr (B) GYP: lmSlckwlycwl (A) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: ISiScwi (SS) GYP CZĄSTECZKI: peptyd (cS) OPIS SEKWENCJI ID io: 25:
lly Ile Ile Asp (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID io: 26:
(S) AiARAKGERYeGYKA SEKWENCJI:
Cl) DŁUGOŚĆ: 5 lmSlckwlyów (B) GYP: lmSlckwlycwl (A) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: ISiScwi (SS) GYP CZĄSTECZKI: peptyd (xS) OPIS SEKWENCJI ID no: 26:
Aog Gyo Leu Ala Asn 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID no: 27:
(S) AiARAKGERYeGYKA SEKWENCJI:
184 825 (A) DŁUGOŚĆ: 5 lminokwlnów (B) TYP: aminokwasowi (A) ILOŚĆ NIAl: jedni (D) TOPOLOGIA: Liniowi (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIt SEKWENCJI ID nr: 27:
Lys Phe Leu Leu Asn 1 5
2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: 28:
(i) GHARAKTERYtTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowi (A) ILOŚĆ NlGI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIt SEKWENCJI ID nr: 28:
Lys Ali Tyr Vil Asp 1 5
184 825
184 825
C) O O O < £-i te 0 U c
Eh
Q to — q (N —4 — 0
O Cl
Eh <
E-ι < in <J Eh H CJ 0 < H «J E-i Cl Cl
O CJ CJ CJ CJ
CJ CJ Eh < CJ CJ >100 —4
O
Jh >
O te b
Jh □
U)
A >
—4
Jh >
O 0 o o O Cl
Eh < CJ u Cl u o o u o 0 u o u E-ι < Cl u o u u o U Cl
Cl o < H
Eh <
u u (J Cl < Eh o
LL.
o O Cl
Jh
E-i
W
Ή te
Cl Cl o o < Eh CJ 0 te c
Jh Eh < 01 CJ U te Eh <
REh < -4 O O O U Cl k(J 0
OJ Cl CJ te. < Eh o
o c
te
Cr c
CJ O O CJ CJ H CJ CJ
Eh <
CJ U CJ u
CJ c,
CJ Cl cj 0
O Cl Eh < cj ci >00 CJ o CJ CJ
Cl c
>
0 in < EH eh <
U Cl CJ Cl < Eh
Q CJ CJ •o
O CJ
Eh <
Eh <
< Eh
Cl CJ
U U < Eh
U CJ
OJ i
c
0) te
Q c
d to •H te — q η .-π — O
O CJ CJ CJ
CJ o < Eh Eh <
0 O 0 0 n < Eh
O O O CJ Eh <
Eh <
< Eh
Cl CJ
CJ CJ < Eh
CJ CJ >| Eh < σι
0 0 0
0 0 0 0 0
Eh <
0 0 0
0
Eh <
U 0 O 0 in
0 H? 0 0 0 0 > < Eh ‘ Eh <
I4U 0 OJ CJ CJ te < Eh
Sh Eh < tn OJ CJ O (N te EH <
isCJ U -4 O CJ CJ CJ CJ
Eh <
U U 0 CJ
0 0 0 0 0
Eh <
0 0 0
0 o Eh < cm 0 0 >00 0 0 0 0
0 > < Eh ' Eh <
0 0 0 < Eh te Eh
W < Eh
0 — q
HT Ή — 0 < Eh < Eh
O 0
C| U 0 0) 0 0 te < Eh >i Eh <
-4 0 0 0 0 0
Jh O 0 0) 0 0 te < Eh >10 0 0 0 0 0 £h < in 0 0 m O 0
184 825
IktA pAA352 '7330 par zasad
FIG. 2
184 825 /\S\
Οβ <Cł— 3 I CT* <Η-· I
LOOtO I tOO«C ο· οο (Ο
LJ
0(0(0 • Ud l_ <H >> H <xł—
O· <Η< I rs o «ΧΗ- C I
OtOtO oto o • L->(O l—
OtOQ_ h—<C OJ ł—-ΧΟ* to
O* in
L>
OtO O I ł— <c oj >; OLO—J O +J
0(0 OJ o H-<C — Λ4 >1 «ΧΗ— 3 3 φ >1 ł—<QJH «1 : co too>
o* xr
o* tooto ΝΊ —i «orf— o <a;r—— tOOtO oto co • oto— too<c too co
OtO — too«t σ· <H (/)
O* <CJ— o m oto u. 0(00-
_ . -OLOtO- ł
1 o· too c 1
1 <CI--- I
l CS OtOLO 1
to o
1 1 <H O l h-<c oj >
1 « OLO—ł 1
o o
t 1 tOO Z3 | H <C OJ l
<o LJ
ł <CI— (Λ 1
1 O* <H >> 1
1 LO <H--I 1
to CS to
ł ł 1 η-<χ o. i <CH co i cooo: i
to to
1 « H*<C OJ l
1
1 <CJ—— l
L_> to
1 1 <Xl— c 1 1
1 o* ototo l
tj LTł u
ł l ł CS «Cf— O 1 Oto L_ I O to CL. 1
<o to
1 H-<C CO 1
t 1 • oto— 1 tOO<C l
to to
1 t J Oto L_ 1 0(0 u 1 ł—«SCO 1
(O (O
ł o* <1- O l
l c H-<C OJ 1
1 CS 1
u (O
1 (O o— X
X H <C CO 4£
o • too> 0
+J +J
0 H- <=C OJ o
λ; >i ł— <c—* 44
3 C <C H-«—· 3 3
Φ >1 Φ >,
μ ω oto >» m
T3 o* tOO — rri
m tooto
>1 CS
O H-«t O)
Cm too U.- H
Φ OtO«C
• too o „
«=tl—— -7
c (OOLO C
•π •n
>t H <C L- >«
O otoxx 2
rti o* <tl·—ł— 2
C CS c
H CS «XI— o
O i—-=c ω ·£
ε h«x-j ε
0 0
44 oto >» «X
Φ » φ
• H OOtO M
1 1 1— < OJ 1 <H — 1
LJ U
1 o* 1—< CO ł
t f—I toto— t
1 CS (00«X 1
(O (_>
t 0(0 t_ t OtO£C i
i «
(O u
l 1 t <H- C ' «XI--- 0(0(0 l
LJ α
1 1— < OJ 1
1 o* >— <£— |
t o <Xb-— 1
LJ CS u
j <00 L_ t o tor: » «XI—1— 1
(O (O
t t 1 « oto >. I too— 1 (00(0 1
LJ <o
1 1 <Xł— O i 1—«X OJ »
1 o* t—<X-j i
to OD (O
! ł—<X u. ł too OJ 1 <cł— co i
(O (O
I 0(0 t- i
! • otor: i <XFH 1
LJ co
«XI— c 1 «XI—— 1
UtOtC- r <
co d
184 825
Ο« uri bri
Ο* bri bri ο«
CM bri
Ο«
Kri σ· ο
bri ο· ο·
LO bri
ZXZ\ z\/\ zK./\ /\/\
b—< L- t Oo ωα zo s O« <Η Z3 1 O· <b“ L- 1
COCO dl 1 Uri <b—- i ΖΓ b-< dl 1 bri UO dl i
ł—<oo 1 4T cocoto I LT\ LOLO-J 1 LO 1—<CO0 1
u> to U Ul
<b- C i (jo ZJ ł <Cb- CG | colo d> i
<Xb- 1 b—< dl 1 <H Οκ 1 h—< — 1
LOLOtO 1 e )—— <^ 1 9 <b——j i « <b~ i
o u u Ul
b- <c di i UO OK l <H U. 1 b-< — l
b- <c— 1 COUl —» 1 LOLO dl 1 b-< co 1
<b~ — l CO LOLO 1 1—<00 1 LOCO> I
o U O Ul
COLO Ok 1 b—< CO ł b-< Ok i b-·< CL 1
LOLO — 1 O· toto— 1 o« LOLO— 1 O· <alb“ tn i
OUO 1 zr OU< 1 bri COUICO 1 CM LDU>< 1
b— <C/0 I
ο· er bri h-<C ?Κ I
ł—<c <u 1 LO LO- 1 <b-— 1 LO LO- 1
b- C —i 1 CO CO < 1 to COLO 1 CO LOLO 1
U) ui CJ Ul
<1-- 1 b-< O 1 h- < u 1 b-< ZJ 1
J—< CO 1 b-< di 1 toto di 1 b-< dl 1
ou> l oo COLO—1 1 o· <b-C0 1 o· COCO—1 1
Ul bri Ul 04 Ul Ul
b-< u. 1 er b- < <O I en b «I dl 1 UD COLO Ok 1
LOLO-C 1 CO CO- 1 b- < — i LO LO- 1
<Xb—b“ 1 LO CO < 1 <b-— 1 CO COCO 1
ui Ul Ul Ul
<ł— CO 1 1—< <n 1 <b c 1 b- < CO 1
<b- Ok 1 • <b- 1 9 <b-- 1 9 LOLO— 1
<CH— i 1 UOX 1 O COLO 1 uu< 1
Ul Ul Ul Ul
LOCO CO 1 Cł— c 1 LOCO CJ t <b tn 1
1 O« COLO C 1 O· b-C Ok 1 O· b-< CL 1
1 CM <b- tn 1 i—I LOLO— l O <b tn <
1 er <b-«C 1 in <O U1LD 1 LO lococ 1
o U) Ul CO
)l COCO u 1 b-< dl 1 1—< ZJ 1
44 coco d> A.' L—r~ 44 ł—< dl' Λ
o 9 <b~LO c 9 (—<Q_ O 9 LOCO —1 0
4-1 o 4-1 4-1
0 coco c c <1— u o <b- Ok 0
A! >1 <Cb~ CO -44 Ok <b~ AJ Ok LO LO- X Ok
0 C <b-< 0 C COLO CO 3 z CO COLO 3 Z
Φ Ok e Ok Φ Ok Φ Ok
rb en b~< c rb 01 COCO o. »b to b“< >> <—1 W
O· <b en O· <b- CO 09 LOCO—
Ό <b< Ό o uu< Ό en LO Ul co Ό
Ok er Ok Uri Ok Uri >·»
o colo c: 4J b—< ZJ O LOCO 01 4-» I
Ο» <b- — Oh >—<1 dl Ot b-< — CL|
φ CO LOCO Φ COLO—1 01 <b— Φ (
Λ Pł
9 «^|_ 9 ^b— U. 9 b-< cz
Ok b- < dJ Ok <OtO.CZ Ok <b- tn 0-ł
c b- <C—4 e <b—b— Z <b- < c
•n -i—. •n •ΓΚ 4
Ok COCO CO Ϊ , <1— 00· Ok <J— 00 5i \
L) CO LO- 0 <U Dk υ <1— >· □
<0 O« CO Ul < <L O· <b_1 nj 09 ------ <Tł
CO
LOCO ΙΟ» di
•b er coco O ·* er «ci—— -b Uri coco 3
£ <b- — £ »—< co -Q b-< d>
ε o couico E lou» ε COlO—4
44 b-<C O AJ U 5 <1— to
O • <ci— LO Φ • ul LD 01' φ * <b >s
b toco«z b i—<00 b <b~—J
ο» cn
lolo co colo— ωυ<
b-< Dk CO LOCO COLO
<b- o 1 1 1 b-< C 1 LOCO Ck
1—< dl 1 <b~ 00 1 <b- tn
b—<—1 t <b-< 1 LOLO*C
J ui Ul to
o« b-«z CL 1 o* 1—<03 1 Oe <h— >k
o <b- LO 1 co LOCO— 1 COCO—
Nri coco«s: 1 er coto< 1 Uri CO LOCO
J Ul Ul U>
COU>t-J 1 b- < di i <b =>
b-< dl 1 b-<— i b-< di
• <b-s: 1 9 <b~ 1 9 1—<—1
J Ul Ul to
<b- >K 1 b-< c 1 b-C L-
CO LU — 1 <b- on i LOLOO
COUICO 1 <b-< i <ł—b-
LO Ul Ul
ł— < CO 1 <b- ZJ 1 COLO >»
o* co co- 1 09 <1—— 1 o· tO LO-
00 co u< 1 N tOCOCO ł LO CO LOLO
bri co er CO uri CO
coco o 1 i—< di i <tb- ZJ
h—< dl l b-<— 1 b-< dl
b-<C—j l <1—— 1 b-<—1
co Ul Ul
a <b- — 1 9 <b- O l 9 LOLO >*
►— < flj 1 b—< dl 1 COLO—
LOU1> 1 b—<—J 1 CO COLO
u Ul CO
<1— L_ 1 <b- U 1 <ł— en
LOCO dl 1 COCO dl 1 <b- >k
o· b-<CZ) 1 O* b<C/l 1 o· <b-—1
J r*K to LO Ul LT\ CJ
bri COLO >» 1 er b-< C » Uri LOCO dl
CO LO- t <b- en i b- <—
CO COLO 1 <b-< i <1--
J Ul u> Ul
<b- ZJ 1 <b- U t b—<! C
9 b-< di 1 9 LOtOZZ 1 9 <b- tn
b- <—4 1 ^Cb-b- < <ł—*c
J to Ul CJ
b~< dl 1 <b- O 1 <b- c
b-< — l ł—< d> 1 <b—
<b- —· 1 COCO—J 1 UltOLO
184 825
z\y\ /\/-c
ο* XI— CO 1 O· COCJ— l 0· XI— ZJ 1
CN UO— 1 •—1 1—X (O 1 0 ł— X OJ 1
C9CJX 1 CO COCJ> I cn |—X—J 1
o CJ CJ
ωυ z: i 1—X O i 1—X C- 1
ł— QJ l UJ CO u. 1 COCJ CD 1
a μ—X—J 1 « CJ CO CU 1 « XI—CO 1
u CJ CJ
xi— rs i COCJ >> i XI— CO 1
XI— — 1 couj— t Xh- 1
OU(J i COCJCO 1
u CJ CJ
1— x <u i Η—X L_ | XI— CO
ο- h<x: i O* CJCOJZ 1 0» CJ CO- 1
Γ—ł 1—XCU 1 o XI—1— l cn CO CJ<C 1
CJ co CJ 00 CJ
> Ł ł μ^ U ι ł— X CO 1
CO UJ — i CJCO OJ l XI— — 1
COCJCO 1 1—ΧΟΟ 1 CJCOZC l
CJ CJ CJ
a COCJ CO 1 e 1—X c- 1 • F“«X CT
cjco— i CJCO QJ 1 CO 1
COC_>X 1 1—ΧΟ0 l l
cj CJ CJ
1—X >« 1 XI— 3 1 1—«X OJ
COCJ — i 1—X OJ I μ- xxz 1
Ο« COCJCO 1 O· 1—X—1 1 0« 1—XCU !
Ο CJ cn CJ 00 CJ
f-s. COCJ — 1 r\ U-X >> i 00 «XI— co 1
1—X <0 1 COCJ— 1 XI— x 1
OCJD> l COCJCO 1 f
CJ CJ CJ
XI— tn i xi— co i Η-«X 0 ł
« XI— X 1 a cjco— i « XI— tn l
XI—-J 1 COCJX 1 COCJX 1
CJ CJ CJ
xi— cn ł XI— CO 1 cjco co 1
XI— >, i CJCO — 1 CJ CO- |
XI—-J 1 C0CJX i CO CJ«C 1
CJ CJ CJ
Ο· ł— X CO 1 O* 1—X — ( O* 1—X <D
cn CJCO — 1 CO l—x co i r-s. 1—X —
UD C0CJX 1 Γχ. COCJ> l co XI— —
ł—<c cn^ 1—«X >» 'Ί
CJCOJZ COCJ c_ o: COCJ —
• <C1_μ- o a CJCOX U β COCJCO 2
Λί
0)
XI— ι_ (_>CO Qj Η-ΧζΖ) ο* co ud oS—
COCJX
Ό >«
-Ρ ο
&
>ι
C >ι ω
«XI— C c CJCO co
«XI— — CJ CO-
cjco co 0 u Φ > CO CJ«X
CJCO co <-H 0) 1—«« OJ
0· CJ co- rrt O· 1— <D
Γ*» co CJX Ό CD l·— X Ο-
rx. OO
«XI— =D +J O. ΧΙ— co
I—X OJ Ui< UJ CO-
1—X —J Qi CO CJ«X
τ>
>
+J
Οι ο
>1 β
8.
• XI— 00 . • μ—<x oj >Ί • «XI— D
«XI— >v 1— x— c μ—« <d c
«XI—— •π 1— «X—J μ •n
1—«χ a £· «1— co CJCO c- >1 υ (TJ c •H «XI— 0
CJCO t- (TJ q •H
0· UD COCJX g «XI— CO d CO- CO Γχ. l·— «X C- 0« u*\ co CJCOCU CJCO t_
cjco— -y CJCO CD «y COCJ CD i
ε 1—XC0 0 «XI—00 c 0
μ-χ zj «* 1—«X ł— J4 G) y—^-r QJ J4 d)
a 1—«X CD ® • CJCO CD a μ-«χ —
CJCO-J M 1—XCO Cl «XI— — u
«XI—— ! I— «X — 1 COCJ co 1
μ—<c co » μ-χ co 1 CJCO—· t
COCJZ> 1 cocj> 1 C0CJ«X 1
CJ CJ CJ
0» 1—«X ZJ 1 o* CJCO co 1 oa Η- «X 3 1
UD μ—χ <D 1 in CJ CO- 1 3Γ 1—«X CD 1
CD CJCO—J i Γ-Χ CO CO «X 1 00 CJCO—J 1
CJ (O CJ
«XI— co 1 1 1—«X c- t
CJCO— 1 «XI— >. 1 COCO OJ 1
• cocj«x 1 a <H-l 1 a μ-«χ<ζ> 1
CJ CJ CJ
μ-χ co » CJCO c- 1 1—«X — 1
CJCO— 1 CJCOXZ 1 Η-«X CO (
C0CJX 1 <HH 1 C0CJ> t
CJ CJ CJ
«XI— C_ 1 1— «X <D 1 1—«X c_ 1
O* CJCOJZ 1 o- 1—«X — 1 o- CJCO JZ 1
m «XI— 1— 1 -3· <h— 1 xi—μ— 1
UD CJ Γ*χ. CJ 00 CJ
«XI— co 1 μ-«χ c 1 μ-χ u. 1
CJCO— 1 <xi— cn 1 CJCO OJ 1
COCJX 1 <CI— «X l μ-χοο I
UJ CJ CJ
* cjco » a ł— «X >» J a 1—X co 1
COCJ— « COCJ — 1 oco — 1
COCJCO 1 COCJCO 1 COCJX 1
CJ CJ CJ
COCJ c. 1 1—«X — 1 1—X <D 1
COCO OJ 1 1—«X co 1 μ-x — 1
0« 1—XCZ) t o- COCO> 1 0· XI— — 1
^T CJ CJ CN CJ
CD <Xł— Z) l ΓΧ 1—«X — 1 co XI— Σ3 1
1—X QJ 1 1—«X CO 1 1—X CD 1
1—X_J 1 COCJ> 1 1—X_1 1
CJ CJ CJ
•SCI— D 1 «XI— c 1 1—X co 1
a ι— «χ aj 1 a <H— i a CJ CO- 1
CJCOCO 1 CO CJ< 1
CJ CJ CJ
COCO >> < CJCO c 1 μ-χ <0 1
1 «XI— tn 1 CJCO—· 1
COCJCO 1 «χμ- «χ 1 COCJ< 1
184 825 ο·
CD
CD ο« en ο*
Γμ en
Ου en gjgo—
ΟΟ<
<Η 3 >—χ cu
Ο*
UN
CP
Ο* <Γ en
XI— >> uo— UUU
ΛΛ ΛΛ
o« UO CO / o« Η-Χ to J O«
co UO — r-^ XI— — UJ
o ΟΟΧ .—1 OUX CM
r—( ł—< <u Ul 1—X OJ GJ ·—Ί
1—«X—« 1 1—X —
0 «XI— — 1 U 0 XI— — UJ 0
UU o xl— CO
UJ UJ u
UUCL. UJ XH- —1 GJ
«XI— U 1—X u
O· UU <D o* XI— co O*
Γχ. 1—«X oo u XI—X LO
O Ul —1 UJ CM
«—< h—<C CO 1 XI— co ·—1
U) GO- OU —
UD U> «X U) uux UJ
0 I— «X <13 « I— X — 0
1—«X — 1—X co
XI—— UJ UU> UJ
1—X — UJU oo
Η-«X co XI— —
o« oo> O0 UOT O0
U UJ tn UJ <r
o UJ UJ u f—t OU ZZ CM
f—I UU <u «—ł XI— — >—1
i— <ω UJ UUJ GO GJ
uu >» V—X OJ 1
0 U U — U) UJ UJ GJ 0 I 1 UJ 0
U) UJ co UU +-* ł
UU — t— x <d 1
UUX UJ <ΗΣΞ 1 UJ
o« «XI— co o· XI— co 1 O*
m UU — — UU — 1 rc
o UUX UUX 1 CM
i—ł UJ »—1 GJ, >—t
Η-Χ CO xj— cz
UU — XI— —
0 UUX 44 o 0 UUO 0 4-1 0
1—«X <0 +J XI— 00 0 44
uu— 0 XI— >> >1
UUX 44 0 >1 c XI——J 0 GJ >,
h-X u aj >i ω j_ x i—t W
o« UJUJ OJ 'ł o· GJU U Ό +J ft G) ft O·
•sr O H<O ou— Ό >1 Γ*Λ Η<ω CM CM
Η-X co ft 0) χί >>
ou Z> 1—XI—
0 1—X >> ft 0 XI— cz «
UJUJ — >1 c XI— —
U) UJ UJ GJUU •ΓΊ
1—X >> Tl OU OJ
UU> — Zl l·—X U <0
O· uuo <0 o* U GO—1 O*
CM
O 1—X co i—x aj u CM
UU — o —•ł 1—X — £ r—
ou< •2 XI— — U 0
I—X CD o ou u 44 GJ
0 1—X — 44 <P « uu zz «
XI-- <1-1- 1
/\Z\ ι—χ o t <ci— to i OU< 1 GJ
XV— C l XI- — 1
UUU I
UJ h— x aj ►—x c: <1- to XV—X
OU CO UU — UUX
GJ i— χ <u UU_I u
UUX
UU 03 UU— UUX
Η-X O. XH- ¢0 UUX
UU G_ <H >>
>—X >» uu— uuo o
4-J
X a
a, «XI-UUU
I—X OJ H<r i— «χ ΟUJ O G_ «XI— >>
uU C XI— to uu CO XI— >> «XI— —J
I—«X >» UU — UUU ο« en
XI— >S
XI— >
Ο»
CM
CD uu en ωυ uO· <X>
UO CO UO— ΟΟΧ <
ł— X G. <H >>
<
I—X u UU CD XI— U (
UU Z UUGO
1—X <O u GO—· UGJX 1 1 1 GJ ugo oj I—xu 1 1 1 UJ
O0 UJU co 1 o· 1— X <3J 1 O*
CM u GO—> 1 ł—X — 1 o
O oux 1 r—i XI— — 1 CM
I--1 UJ 1—1 U) «—ł
UGU Z3 1 XI— — 1
i—x <υ 1 I—X <o 1
0 1—X—I 1 « ou> l 0
o U’
x>— co ł J— X I
UJ GO—1 ł UvU — 1
UGUX ł UGU GO 1
UJ GJ
GUGO U 1 UGO u 1
o« UG0XZ 1 o« U GO UZ 1 o«
XI—H— 1 o XI—h— 1 en
o U) 1—4 GJ —i
I—X C ł ·—< 1—X OJ 1 «—1
XI— 00 t 1—X — 1
XI—X 1 XI— — 1
GJ GJ
0 i— x aj 1 « UGU >. 1 *
1—X — 1 uu— 1
XI— — 1 uuu 1
GJ GJ
XI— co 1 1—X G. 1
GJU — 1 ugo oj 1
o* UUJX J o« 1—XCZ) t o·
o GJ en GJ CO
o 1—X u 1 o XI— — 1 —»
υοο 1 i—x ca 1 —H
XI—1— 1 uu> 1
UJ GJ
1— x — 1 XI— ZJ 1
0 ł—X CO 1 0 I—X CD 1 «
ou> 1 1— X—1 1
UJ GJ
UGU U 1 <H l
uo a? 1 1—X <D 1
1— <CO - i •1—X—J t
uu <S> XI— — uoi ι—x c
I—«X c «XI— CO >1
C >1
CO τι >1
4J ft ft >1 c
>1 □
«3
C ·§ o
λ:
o u
UJ <H <si «XI— >>
UJ «XI— =3 XI— — UUU
UU O. UU U I—«XI— «XI— Σ3 «XI— — O UJ o
GJ
UJ
UJ
UJ
I—«X CO I UU> i
UJ
XI— — «XI— (D «XI— >» XI—U
UJ
UU cz «XI— <O <H<
Q
CO d
LL
184 825
O* zxzs o« ujuj ra7^ o· z\ OUJ u-
LC\ OUJ — 1 4Γ OO— l m UJO-CZ
Γ*Λ OUJO 1 OUJ«X 1 LCi «XI—1—
i-H U4 04 ·—| CJ
1—«X 04 1 «ΧΗ- tO l «XI— CT
1—«X — | >% I OUJ «-
« «XI— — 1 • XI—_J 1 « «XI—«X
O 04 04
UJO c i 1—«X 04 1 UJO OJ
«XI— tO 1 h-«χ— 1
«XI— «X i «XI—~ ł
u 04 04
UJO C l UJO to 1 «XI— ra
O* «XI— CO i o· «XI—— 1 o· 1—«X 04
-=r «XI— «X « uux i CM 1— «X—J
N~\ UJ 04 on 04
r—ł i—«χ d i <—» «XI— to i UJO tu
«XI— to ( «XI— >> 1 1—«X —
OUJ«X 1 «XI——J 1 «XI--
u 04 04
« OUJ O « • OJO >* 1 « 1—«X <o
OUJ <— 1 OUJ— 1 «XI— —
I—«XI— 1 OUJO ł UJOZZ
o UJ 04
«XI— C 1 «XI— ZJ t OUJ c
«XI— —· 1 i t «ΧΙ-
O* UJOO l o* I o· UJOO
Ki U) CM 04 04
K\ OUJ C l X <xi— ra i Ln 1—«X u-
,—1 «XI— — 1 <—1 «XI— — 1 <— ujoiz
UJOO 1 OUJO l «XI— 1—
UJ 04 04
OUJ C l 1—«X 04 1 «XI— CO
β <xł— —· I « h— <Cd ł « «XI— >»
UJOO 1 H“ «XD_ l «XI——J
04 04 04
1—«X 0- 1 ouj ra i ouj ra
ujuDd i UJO— 1 UJO —
<XF~ I— l OUJ«X 1 OUJ«X
u 04 04
O· 1—«X 04 l o· 1— «X Q 1 O· «XI— to 1
CM 1— «X— 1 —t «XI— to 1 O «XI— >> 1
ΚΛ «XI--i -=Τ OUJ«X l on «XI—-J t
r-ł 04, ·—ł OJ, <—1 OJ ,
i—«χ ra p. OUJ— l’ 1—>* 1 1
UJO — * i—< ra £ OUJ — 44
• O0J«X 0 * OUJ> 0 • OUJO 0 4J
U4O 04 H<u 0 OUJ V- 0
1—«X — «XI— >\ 44 UJO 04 44
«XI— —— £ 1— «XI— £ £ 1— <XtZ) £
Φ > Φ > Φ
r-ł W r-ł «
OJO — O· h-«X Π3 <—i OUJZ>
ι—«χ ct ouj UUJO«X
T3 >1
4J
Oł φ
Λ ujo co O· UJO— o ou<
«ΧΗ- >> <Xł—-J
OUJO >1 £
I—«X >» OOJ— OUJO +4
O
A
O* cn ι—«χ c <cj— to <c>— <x
UU OJ «XI— o ł— «X ra ωυ>
O· o
m
Ocn
CM
UJO — OUJ«X
OUJ <Z
UJOO «XI— Z3
I—«X—I
OUJ Z3
OUJO «XI— to XH >* o
cn »— «χι- ·7 O UJ OJ 0> «XI—oo
UO C o· co
CM ujo c «ΧΗ— tO «X!—«X
OUJ Σ3 ł— «X 04 UJO-J
O*
Γ*CM
UO 04 i—«xd ooj·^» (—> <x <&
c >1 tn
Ό >,
-U a
Φ a
>1
C
O
0)
P ł— «X ZJ ł— <C OJ UJO —J
UJO — I—«X (O ouj>
o ω
u «XI— to O· OUJ«X OO — I—«X 04 — ł—«X—.
«XI— —
I—«X 04 β (—<c — «XI— — >1
U <0
| ( ł «XI— to i 1—«X >S 1
«XI— > ł OUJ— l
«XI——J J OUJO 1
4 U4 04
O· «XI— ra ł O· OJO cz »
CO «XI-- 1 ru. «XI— to ł
m OUJO 1 sr «XI—«X ł
4 rH U4 —i 04
1—«X >» r «xf— ra t
OUJ — 1 UJO— 1
• OUJO 1 « OUJ«X 1
4 UJ U4
«XI— ra 1 ouj t- i
1—«X OJ ł UJO 04 l
1— «X—J 1 1— -ΧΟΟ 1
4 04 04
1—«X CT 1 i—«χ α i
o* ouj <- 1 O* <Η to i
UJO«X l o OUJ«X l
4 m 04 xr 04
r—1 UJO 1 —t ouj ra t
OUJ 04 J 1—«X 04 1
«XI—co ł F“-«X^J 1
4 OJ 04
• 1— «X 04 1 « ouj c: i
1—«X — 1 «XI—— 1
«XI— — 1 UJOO l
4 04 U4
1 «XI— 1
ouj— ł i—«X ra i
O· OUJO 1 O· OUJ> 1
4 OD 04 on 04
m i—«χ ra 1 «XI— ra i
r-H UJO — OUJ«X 1 1 1—«X 04 1
4 OJ 04
<xi— ra ł «XI— to ł
« 1—«X 04 1 « «XI— >> 1
1— «X—J ł <H-_J l
J 04 04
1—«X o. ł <C Q l
«X!— to 1 <XI— (O 1
oo«x OUJ«X ł
i
O
Λί φ
ρ
UJ co o
lL
184 825
o· F-X o 1 Ο» O >X » o* Ρ-Χ OJ 1 o·
CM XI— CO 1 «—< too— 1 o 1— X— 1 en
tO tOOX 1 Γ-Χ (00(0 1 co XI—— 1 00
(U »—ł o (U F—1
<f~ 1 p- «X CO t XI— o 1
I—X CO 1 0(0— 1 XI——« 1
« oo> 1 « <oox l « tooto 1 •
<u (U tu
i—χ σι 1 F- X CZ i <00 F 1
too f 1 «XI— tO 1 OtOJZ I
OtOX 1 «XI—«X 1 XI—p- 1
CJ <u (U
OtO c 1 oto CL 1 too F 1
O* <h- CO 1 o* «XI— co i O« OtOJZ J o«
<~ł <xł-— «χ 1 o <oox 1 en XI— f— 1 co
tO (U r\ (U r\ (U OO
«—1 H~<C GJ 1 r—ł XI— O 1 r—, 1—X X 1 •—t
F-x — 1 1—«X OJ 1 too—« 1
<3^^—i— 1 Ρ-Χ—J 1 tooto 1
<u o (U
o 1—«X C 1 e «XI— O 1 a 1—X F 1 «
CF CO 1 XI— — 1 0(0 aj 1
XFX 1 tooto 1 PXCO 1
tu tu (U
OtO O 1 ł—«X 0) t 1—X >V 1
p- x <u 1 F- X — 1 (OO — 1
o· 0<0-J 1 O* «XI—— I o· (00(0 1 o·
o u en tu 00 (U l\
tO tOO CO 1 to i—«x >» i im. I—X — I oo
ł 1 »—-t too— i <—1 1—X co 1 »—t
1 tooto i too> 1
tu (U (U
0(0 F 1 i—«x <v i 1—X OJ 1
• oto o: 1 * F-«X—« 1 • <3~ f~ 1 a
g^P t 1 1 «XI— — 1 t—<=rn 1
u CU tu
1— X <3J 1 1—«X CT i XI—— 1
I—«X—· 1 (OO t_ i ^x co 1
cXI - 1 0<0< 1 <oo> 1
u tu u
o· Ρ-Χ F t o« too C l o« 0(0 c 1 o*
Ol 1 00 XI— — 1 rx. XI— CO 1 to
un I to OtOtO l XI—X 1 oo
r—ł tu, <—» <U, <U| «-Η
XI— o i Ρ-Χ — 6 OtO Cl ^4 XI— o 04
o 1— X co XI— CO o 1— X OJ o
« tooto o a (00> u « (ΟΟΧ o • 1—X_J o
1—X F 0 44 1—X — c >, 1—X CL 0 44 >1 i—x co 0 44 >1
XF- >» 3 c F-X CO 3 β XI— to 3 c oto—· 3 fi
Ρ-ΧΡ- Φ >1 <oo> <r (ΟΟΧ <11 >1 (ΟΟΧ Φ >1
^4 co >-< (0 i—l α ł—< Cfl
XI— (O 0(0 c: 1—X ZM 1—X >»
o· XI— >» <TJ o« XI— CO Ό o· (OO— •Ό o· too— Ό
co XI— —J rx. XI—X to <00(0 o (00(0 >1
m 4?1 to I? o oo +J
Ρ- X >> Cj »—t 1—X F Cł «—* XI— o ft —* 1—X <— ft
too— q) ocojz tu XI— Φ XI— >» <u
(OOtO Ci XI—1— ft (00(0 ft i—χι- ft
« XI— F >Ί « XI— Z3 >1 • 1—X >> ? < « oto c >1
o<oxz 1—X u fi (OO— fi XI— ω fi
XF'P •n 1— X—J •ri tooto •ro XI—X •ro
XI— c Q 1—X CL □ 1—X o >1 o XI— >» >1 o
XI— flj XI— VI (0 1— X CL· <0 (OO — <e
o· OtOtO c o* toox c o· UO_J c o· tooto fi
LL co
O
LT>
<F (/> rj —· <F >· g
XI— —l §
UO <0 Φ • OtO — u ωυ<
too—
(OOtO
(U
« (OO o
oto «—
Oto o.
(U
(OO (-
0(0 JZ
o· Xh“F“
O· (U
(OO Z3
Μ-X tu
1 X-J tu
XF O
• i—x <υ
1—X_u
tu
XF- O
oto t-
0(00-
1—X t_ 1 Η-X OJ 1 1 1—X F
oto OJ 1 F-X — 1 XF- >>
1—ΧΟΟ 1 XF~ 1 I—χι-
(U (U tJ
o· 1—X 1- 1 o· 1—X QJ 1 o* oto to
LT\ (OO OJ 1 ST 1—X — 1 rA XF—
to XI—<Z) 1 r-s. XF-— 1 co Oto ze
J »“1 tu —1 <u '“Η CJ
XF— CO 1 XI— to 1 F«X—·
oto— 1 XI— >> l 1—X co
# toox 1 • <F_J 1 « <oo>
? o tu F
XI— co 1 «ad— t_ 1 xt— σ>
Oto — 1 OtOJZ 1 (OO F
(ΟΟΧ 1 XF-F- 1 ΟίΟΧ
J (U tu tu
I—X > 1 XI— Z3 1 0(0 Cl
Ο» too— I o· XI-- I o* <F to
^r tooto 1 tooto 1 CM (ΟΟΧ
J to (-J Γ-Χ tu co tu
1—X o. 1 —1 XF- to 1 —< 0(0 F
XI— (Λ 1 <F >* 1 XI—
toox 1 XF- —i 1 F<CF
(U (U <u
« XI— <- l « 0(0 F ł a t—X >»
OtOZZ l 0(0 JZ 1 oo—
XI—1— 1 <FF 1 <00(0
J (U tu o
1— X OJ i XI— to 1 XI— ZJ
1—X — 1 XI— 1 XF-—
o· XI-- 1 o* xi—-U 1 o· (00(0
J r*N tu CM tu —1 (_>
to XI— to 1 ΓΜ. 1—X t— J oo F-X >%
XI— >< 1 otorz 1 ·—Ί too—
XI— —I I XH—h— 1 <00(0
_) (U (U tu
(OO Cl 1 XI—— 1 0(0
a (OO t_ 1 1—X co 1 « too—
I—χι- 1 (00> 1 <00(0
(U (U t_J
oto t- 1 1— X c 1 1—X c
<00 OJ 1 <F (Λ 1 xi— co
XI— CZ3 1 XI— < 1 (ΟΟΧ
184 825
ο· ✓S/M CH- X i O0 Z\/M /\ZM ł—C c t
Cł— — 1 o·
CO «XI—— i CJCSJZ 1 CO C— to 1
CT· CS CJCS · o Cl—H- · — C»—C 1
'J 'N CJ CM CJ
<t~ x i H— C > < CJCS >s t
CH- — ł cs'_,— i CSCJ— 1
« CSCJCS 1 β CSCS ’ « CSCJO r
CJ CJ CJ
t—< cn i CJ'J -u > cjcs α i
CSCJ ł- 1 ł—C — 1 C I— to i
ud< l Ct—— i CSCJC 1
CJ CJ o
cjcs z i 1—c Ί-» 1 CJ'X x .
ο· <1— CO ł o· ►— C— 1 o· C I— Ό 1
η-. <Zh-<C > CS C^- — ) (-Λ Cl—c 1
cn CJ o CJ
CJCS >* 1 CM Cł— x i Cn >—C > i
CSCJ — l c»—— i — 1
CSCJCS 1 CSCJCS 1 CSCJC3 1
u ł_> CJ
• cscj — i « ch- z i • CJCS Ci <
H-C X l C>—— t C r— CO i
cscj> i CSCJCS 1 CSCJC i
CJ CJ
Cl— ~ l J—C— l l— C <D i
t—C OJ l H— C X 1 t—C— i
O· H-C —J 1 o· CSCJS» 1 CS· C—— i
co CJ cn o CJ
cn <1— X 1 o H-C X t h-C c. i
CJCS — « CM CJtS— 1 CM cjcs z; i
CSCJC ’ cscjc » C— I— i
c> CJ
CJCS · Cl— to i '—CC. i
cjcssz i α Cł— >4 1 • C — to i
ci—h- i Ci—_i 1 CSCJC i
u c- CJ
}— C CO j CSCJ X » cjcS—» i
CH-- 1 t—c aj » — C X i
CJCSZZ 1 h— c—: t CSC-> i
CJ o c.
o« CJCS t_ ’ o· CJtS <- 1 β ł— C > i
cn OCS — ’ — cjcs-Z i f-o CSCJ— i
cn Cł—ł— i o C ł— H— 1 CSCJhS 1
f—t CJ CM CJ CM Ch
CH- t- ł| 1— c O. I| *- c c. 1
CJCS <D Jd <1— co ;x Cl— to X
• ł— COO 0 • CSCJC 0 • CSCJC o
4J 4J 4J
H-C t- 0 Cl— CO 0 HO. 0
CJCS-C .X >1 Ct— >x X >1 CSCJ— X >,
<£HH □ fi Ct—_i 3 fi CS CJCS fi fi
Φ > Φ >1 <u >»
CSCJ— rH Cl CJtS c- n ł— C >« HO)
O· H-C X o· CJcSJZ c· CSCJ —
•=r CSCJ3> χ •O Cl—ł— χ CM CS CJCS X
cn o >, — >1
CH- 3 4J Cm CJtS c- J Cm CJCS X +J
Cl--- CU c *— >. CU Ci— to CU
CSCJCS <D ł—CH- Φ <H C 0)
CU CU CU
• CJCS <O • ł—C U- a ł-c oj
Cl-->, <H- >> >, ·—cx >,
OtS — C H<H fi ł— CtZ. fi
-n TO •m
<H X >, *—< >1 CJCS X >1
H-C OJ 0 CSCJ— o CJCS— O
o· CJCS—J <TJ o· CSCJCS flj o· cScjc «3
fi CM fi — fi
cn Cl— X -H o cjcs x -h —H 1—C X -H
CJCS — Λ CM cJcS— Λ CM Cl— to S
tSCJC Ε, CSCJC £Ś CSCJC g
O 0 0
Cl— CO X 1—C CO X >— c x Λί
• Cf— © * C·—— <ΰ • <f— to <ł>
Ci— -j L CJCSZS H Cl—C . M
H-C >> 1 CJCS co i CJCS Oj i
cscj— i Ct—— 1 H«tX l
cscjts i CJCS= 1 ł—CQ_ 1
CJ (-> CJ
o· CJCS <- i o· CSCJ C » o· CSCJ to 1
CMI cjcSJZ 1 — ci--i Cł— >> i
cn CHH ' o CJCSCS « — Cr— __j 1
CJ CM CJ CM CJ
Cł— X 1 MJCS C 1 1—C t_ t
Cł— — 1 Cł— to i CSCJ Qj i
« CSOCD I « Cl—C 1 a <H(/1 |
CJ CJ tj
CH- — 1 1—C X 1 t— C 1
H-C CU 1 CH— to l CSCJ— i
cscj> i Cl—C l CS CJCS l
CJ CJ CJ
CJCS OJ 1 CJcS *— i Cl— to 1
O* [_r~ i σ· CSCJ H) i o- Cl— >> l
ł—CO- > o Cł—CO 1 c~* Cl— —1 1
cn CJ o CJ o CJ
h- c cn i CM 1—c CO ł CM ł—C OJ i
CSCJ c_ 1 C!--l 1—C JZ i
U(J<X l cjcs:c i ł— CCC l
CJ CJ CJ
« h- c c i • i—c cn i • CJCS CD 1
ct— co ł CfiCJ ł— i 1—C— ł
<H< ‘ CJcSC J Cł—— l
CJ CJ CJ
Cl— — 1 1—c <— i H- c Q 1
t— c CO i Cł— >> 1 Cł— <O 1
o* CSCJ> 1 o· 1— CH i o· CSCJC 1
o CJ cn CJ co CJ
cn cjcS >- i cn Cł— Z! ł o OCS c i
CJCS.C 1 —H ci--- i CM cł— to 1
CS CJCS 1 Cł—C l
CJ CJ CJ
1—C C- 1 Cł— OJ i ł—C to l
* CH- > 1 • I-C— l « Cł— — 1
H- Cł— i Cł—— l CJCSZC 1
CJ CJ CJ
1— C »- 1 Cł— to i CH- c- l
CSCJ CJ ’ Cl— >» i CJCS OJ 1
<r>—cx> i Cł—_t 1 ł—cco .
ω
Ο
LL
184 825
Χ\/Ν *CF- t- « OtO GJ ł <F O F— <X GJ
t_> LJ LJ LJ
OLO CL t <F <O 1 LOO — 1 oto GJ 1
«XI— to 1 «Cl— >> · F- «X CO | F— «X — »
LOO«C 1 «Cl·—-J 1 LOO> t <F- 1
LJ LJ LJ t_)
OLO C 1 F-«C CL 1 <XF- <O ł oto OJ 1
o· <Xh— ŁO 1 O· <XF— CO I o· <F >, 1 o· 1—«X — l
«Cl·—«X | ΙΆ LOO«X » CS «XI— —1 1 ·—» <Cl·— — 1
CS LJ FA LJ ZT LJ la LJ
CS oto >» 1 CS F- «X C 1 CS LOO O 1 CS <F O 1
LOO — 1 «XI— to 1 «CF- — 1 <C|— 1
LOOtO 1 <TF*X 1 tooto | tooto 1
LJ LJ LJ LJ
• <tF (O 1 « OtO >» l • «XF tO l α «CF- =3 1
«XI— >> 1 LOO— 1 «Cl— >s | «CF-— 1
1 1 LOOtO l <FF 1 LOOLO 1
LJ LJ LJ LJ
F-«X >> 1 oto Ci 1 *CF tO I oto <u 1
too— 1 «XI— to 1 «CF- >> | F-«X—« |
o· LOOtO 1 O· too«x I o« «Cl— —1 t O· <XF~ 1
FD LJ CS LJ r—Ϊ LJ O LJ
CS OtO > 1 FD 1—«X L_ l — oto L_ 1 LA «CF- <O 1
CS LOO— ł CS OLO CU 1 CS too «υ 1 CS «CF- >. 1
tooto 1 F—<CLO 1 «CF-CO 1 «XF-—J 1
LJ LJ tj o
F—«X O 1—«X CL 1 F— «X C 1 too O 1
« «XI— to | « <F tO 1 • «XI— to 1 • <CF~ 1
LOO«X I too«x i <F< 1 tooto 1
LJ LJ LJ LJ
OLO GJ 1 OLO L_ 1 LOO t_ 1 F— «X CL 1
F-^X — t otocz i OtOJC 1 <gTj_ tO 1
«CF-— 1 «XI—F- 1 «XI—I— 1 LOO<X 1
LJ LJ LJ LJ
o· F—«X (V l O· 1—«X tu 1 co· oto OJ I o· «CF- tO 1
CS I -—1 1—«X— 1 o F- «X — 1 σ «Cl·— >. 1
CS F-«CO- 1 FD <F~ l <CF —· 1 o- «CF-—J 1
O* o
: o.
• tO too«x
F-«x cl «ci— to ou<
F-«X >» too— LOOtO ł—«X c «CF- to <CF-«C «CF— >> too— LOOLO
F—«C >. too— tooto
F-<£ CL <CF— cn loo«c oto o F~«X GJ OtO—J
I
X o
+J
O
Λ4 5s □ 3 Φ >i
T3 >1
CU
O· σ
F- «X CL <CF- to too«c t
F-<C O <CF tO LOO«C t
oto >» LOO — LOOtO o· o
FD ł— «X > too— tooto
O· σ
CS
CS oto >» too — tooto
F-«X O too tOtO«C
TJ >1
4->
CU φ
CU >, c
•f—ł >1 υ
flj •F o
ε o
Φ >1 c
>1 w Ol σ> FD CS oto — I—<C (U too>
F-«C O I—«C GJ OtO—J
F— «X C «XI— to «CF-«X
F- «X LO «CF- — OLO OZ <CI— (O <F >,
F-«C — F-«C CU too>
«XI— to «CF- >s «CF—J <CF- O <CF — tooto i
o >.
3 Φ >1 <—I W
TJ >.
4->
CU
Φ
CU >1 •m □
ttJ •F £
o
Φ
F
z co
LL
W 1 M OLO to I F-«X GJ 1 1
«X!—— 1 F-«XJZ 1 <F >»
OL03Z 1 F-«CCL 1 <XF— _J
J LJ LJ LJ
O« 1—«X— ι O· «XI— t— 1 o* F-«C CU
00 F-«X CU l N otoxz to OLO—
CS too> l FD g^F- F— 1 •C7 too<c
J CS LJ CS LJ CS LJ
OLO OJ 1 «XI— O 1 l·—«X GJ
f—<CXC I F-«C GJ 1 F<r
• l·—l « F<-J 1 « l·—<C(X
J LJ LJ LJ
1—«χ GJ i F-«X CL 1 F- «X CL
1—«X— 1 «Cl— to 1 «CF- tO
«Cl·—— ι too«c 1 tOO«C
J LJ LJ LJ
1— «X Ci l <F to 1 h— «X <U
o· «CF- tO 1 O· <CF- >> 1 o· OLO —
rs. too<c 1 LO «Cl·—-J 1 LA too«c
J CS LJ FD LJ -3 LJ
CS f— «X O 1 CS «CF- O 1 CS too o
«Cl— to 1 F-«X OJ ł «XF- —
tOO«C 1 F-«C_I 1 (OOL3
J LJ LJ LJ
« OtO >< i * oto C t α «cf- σ
too— 1 «Cl·— to I too L-
tooto l «Cl·—«X 1 OL3«X
J LJ LJ LJ
tOO (O i LOO »— 1 oto GJ
«Cl— >» l OtO OJ 1 H«X-C
o· <F—J i O* F“«XC0 1 O· F-«XO·
J to LJ LA LJ -3 LJ
CS OLD >» ł FD F-«t CL 1 ZT tOO Cl
CS too— l CS ζ/) 1 CS too t-
(OOtO l LOO«C l F-«ΧΙ-
J LJ LJ LJ
F*<X >*< 1 F-«C L. 1 Ο LO cz
« <00— l • OLO GJ 1 • «XI— (O
tooto l F-<Xt/> 1 <F<
J LJ LJ LJ
OLO tO l OLO GJ 1 «CF- C
«XI--l F- <XC ł «CF-—
O tO 3= 1 F-«XCL. 1 ototo
184 825
/\/% H- C
oe H-C— i o· 1 Cł—
«—1 1— C X 1 o Cl·- to 1 CJCS
uO tSCJ> 1 Cl·— 1 O O CJtS
CM u CM (J cn CSCJ
H-C— l l·— c c_ l ΓΝ. cl·—
1—C X 1 CJCD OJ 1 CM 1—c
β tscj> 1 a h~ <ω 1 CJCS
CJ CJ « CSCJ
Cl·- tO 1 CSCJ l_ 1 Cl·—
Cl— >» 1 CJCS OJ 1 1—c
CHH » H<CO 1 cjcs
CJ CJ
CH- c_ 1 CJtS C_ | CS CJTS
O· CJCS OJ 1 o« CJCS4Z | o·
o l·- CCS 1 cn Cl·-1— | oo l·-CLU
to CJ to CJ fx
CM Cł— X 1 CM 1—C OJ 1 CM CJCS C_
1—C OJ 1 H- <z 1 OCS OJ
CJtO-J 1 H-CO- J H- COS
CJ CJ
β CSCJ X 1 « CH- X 1 • CH- >
Cl·-— i CJCS — 1 CSCJ —
CSCJCS l CSCJC I CSCJCS
CJ CJ
h-c α i H-C 1- 1 cscj cn
Cl·- to 1 CSCJ OJ 1 CSCJ c_
o« CSCJC 1 Oe CH- CO 1 o· CH C
cn CJ 00 u hs. 1
in Cl— C 1 to Cl— 1 Hs. I— C X
CM Cl·—— 1 CM H-C X 1 CM CJCS—
CJCS CS i tSCJ> 1 cscjc
CJ CJ 1
CJCS C_ | H-C c_ | H-C OJ
• cjcs z: i • CJCS OJ 1 • H<z
Cb— Η- 1 1— CCS 1 H-C CL·
CJ CJ 1
1— C OJ l Cl— c_ 1 CH- C
I-C— 1 CJCS OJ l Cl·— —
Cl—— 1 l·—^CCZ) ł CJCS CS
<j CJ 1
O· Cl— to 1 o· CJCS OJ 1 o· 1—C X
00 Cl— > 1 fN. H-C — 1 to I—C OJ
tn Cl·— —J 1 to CH- — 1 CJtS—J
CM o. CM CJ CM 1
CJCS >» ιλ Cl— X 1 1 1—c u.
CSCJ— * H-C OJ' 44 CJCS OJ
* CSCJCS 2 * H-C_1 0 u « H-CCS
<0 ni
•n 3
o o
c H
0) 0
$ 4J
44 44
OJ 0)
Ul
• CH- X * CJtS t- o CH- C
CJCS— tscj OJ CH—
tSCJC -o CH—CS c •n CJCS CS
CJtS OJ >1 CJCS c >1 1—c o.
h-c— Cl·— to P CH- to
o« CH- — •w r· o· Cl—c 5 o« tSCJC
to tn ZT
tn I—C X to CH- c. Iz ΓΝ CSCJ X
CM OJ a CM cjcs z: a CM H-C OJ
CJCS—J K 0 Cl—i— 0 ł—C—J
H-C O. 44 CSCJ — 44 CSCJ Η»
« CH- to OJ • H-C X ? • H-C OJ
CSCJC H CSCJ> Cł—ΣΞ
1—c o. 1 H-C C 1 Cl·- c.
CH- tO 1 Cl— to t CJCS OJ
tSCJC 1 CH-C l H-CCS
tcu( co
ο·
Co ci— to ci— >> Cl·——J <
CJtS t~ CSCJ oj Cl—co
CSCJ to ł H-C tO t l—C X 1
Cl·- >» I CH-— « CJCS— 1
CH- _J 1 cJtszrz i CSCJC l
CJ CJ CJ
CH- U- 1 Cl— to 1 CSCJ— i
o« CJtS OJ 1 o· CH- >» l o· H-C X I
zy t—cos 1 m Cl·——J l CM CSCJ> 1
tn CJ co CJ r\ CJ
CM CJtS *— 1 CM CJCS X 1 CM CH- X l
CJCS-Z 1 l—C OJ 1 H-C OJ l
f CJCS—1 J >—<X_J 1
CJ CJ CJ
« CJCS OJ 1 • cscj x « • CH-— l
1—c — H-C OJ 1 H-C X (
<CH— 1 ł—C—J l cscj> i
CJ CJ CJ
CSCJ OT cn- x i H-C C l
CSCJ c- 1 X|— —* 1 CH- to i
o· CJCSC 1 o· CSCJCS 1 o· CH-C 1
CJ CM CJ ·—» CJ
tn CSCJ X 1 to H-C c_ / Cł—OT 1
CM <H— 1 CM ct— >» i CM CSCJ c- t
CSCJCS 1 H<CH 1 CH—C 1
CJ CJ CJ
CJCS >» 1 cjcs c i CSCJ t- J
• CSCJ— 1 • «XI— to ( • CJCS OJ ł
cscjts 1 CH-,C 1 H-CCO l
CJ CJ CJ
H-C c 1 H-C O. i h-c α i
Cl·— to 1 Cl— to l Cl— to i
r CSCJC | CSCJC—J
184 825
FIG. 4
184 825
ATG GCT 10 1 20 30 40
ACT GTT ATA CAT CTA ACC TTC CCA AAA ACT GGC GCA AAA
MET Ala Thr Val Ile Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys
50 1 60 70 1 80 1 90
AAA ATT ATC CTC TAT ATT CCC CAA AAT TAC CAA TAT CAT ACT GAA
Lys Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Cln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu
100 110 120 1 130
CAA CCT AAT GGT TTA CAC CAT TTA GTC AAA CCC GCC GAA GAG TTG
Gln Gly Asn Gly Leu Cln Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Clu Leu
140 150 1 IGO 170 180
CGG ATT CAG GTA CAA ACA GAA GAA CCC AAT AAT ATT GCA ACA GCT
Gly Ile Glu Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn Ile Ala Thr Ala
190 1 200 1 210 220 (
CAA ACC AGT TTA GGC ACG ATT CAA ACC GCT ATT GCC TTA ACT GAG
Gln Thr Ser Leu Gly Thr Ile Cln Thr Ala Ile Cly Leu Thr Clu
230 1 240 2S0 260 1 270
CGT CCC ATT GTG TTA TCC CCT CCA CAA ATT GAT AAA TTC CTA CAC
Arg Gly Ile Val Leu Ser Ala Pro Cln Ile Asp Lys Leu Leu Gln
2Θ0 290 300 310
AAA ACT AAA GCA GCC CAA GCA TTA CCT TCT CCC GAA AGC ATT CTA
Lys Thr Lys Ala Gly Cln Ala Leu Cly Ser Ala Glu Ser Ile Val
320 330 340 1 350 1 360
CAA AAT GCA AAT AAA GCC AAA ACT GTA TTA TCT GGC ATT CAA TCT
Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly Ile Gln Ser
370 3Θ0 1 390 1 400 (
ATT TTA CCC TCA CTA TTG GCT GGA ATC CAT TTA GAT GAG GCC TTA
Ile Leu Cly Ser Val Leu Ala Cly MET Asp Leu ASp Glu Ala Leu
FIG . 5A
184 825
410 1 420 430 1 440 1 450
CAG AAT AAC AGC AAC CAA CAT CCT CTT CCT AAA GCT CGC TTG GAG
Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Glu
460 1 470 480 1 1 490 1
CTA ACA AAT TCA TTA ATT GAA AAT ATT GCT AAT TCA GTA AAA ACA
Leu Thr Asn Ser Leu Ile Clu Asri Ile Ala Asn Ser Val Lys Thr
500 1 510 1 520 530 1 540
CTT GAC GAA TTT GGT GAG CAA ATT AGT CAA TTT CCT TCA AAA CTA
Leu Asp Glu Phe Gly Clu Gln Ile Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu
550 560 570 1 ' 580 t
CAA AAT ATC AAA GGC TTA GCG ACT TTA GGA CAC AAA CTC AAA AAT
Gln Asn Ile Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn
590 600 610 620 1 630 ł
ATC GGT GGA CTT GAT AAA CCT CGC CTT CCT TTA CAT GTT ATC TCA
Ile Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val Ile Ser
640 650 660 670
GGG CTA TTA TCG CGC GCA ι 1 ACA CCT CCA CTT GTA CTT GCA GAT AAA
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys
680 690 700 710 t 720
AAT CCT TCA ACA GCT AAA AAA GTG GGT GCG GGT TTT GAA TTC CCA
Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Cly Ala Gly Phe Glu Leu Ala
730 1 740 750 1 > 7G0
AAC CAA CTT GTT CGT AAT A7T ACC AAA CCC 1 GTT TCT TCT TAC ATT
Asn Gln Val Val Gly Asn Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile
770 1 780 790 1 800 1 810
TTA GCC CAA CCT CTT GCA CCA GCT TTA TCT TCA ACT GGG CCT GTG
Leu Ala Gln Arg Val Ala Ala Cly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val
FIG. 5B
184 825
820 1 830 1 840 1 850 1
GCT GCT TTA ATT CCT TCT ACT CTT TCT CTT CCC ATT AGC CCA TTA
Ala Ala Leu Ile Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu
360 1 870 880 890 900 1 1
CCA TTT CCC CGT A'PT GCC CAT AAA TTT AAT CAT GCA AAA ACT TTA
Ala Phe Ala Cly Ile Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu
910 920 930 1 940 1
GAC t AGT TAT CCC CAA CCC TTT AAA AAA TTA ccc TAT CAC GCA GAT
Glu Ser Tyr Ala Clu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp
950 960 970 980 990
AAT TTA TTA CCA GAA TAT CAC CCC CGA ACA CCC ACT ATT GAT GCA
Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Cly Thr Gly Thr ILe Asp Ala
1000 1010 . 1 1020 1030 1
TCC GTT ACT GCA ATT AAT ACC CCA TTC CCC CCT ATT CCT CCT GCT
Ser Val Thr Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Gly Cly
1040 1050 1060 1 ‘ 1070 1080 i i
CTG TCT GCT CCT 1 * CCA CCC CCC TCC CTT ATT CCT TCA CCC ATT GCC
Val Ser Ala Ala Ala Ala Cly Ser Val Ile Ala Ser Pro Ile Ala
1U90 1100 1110 1120
TTA TTA GTA TCT CCC ATT ACC CGT GTA 1 ATT TCT ACG ATT CTG CAA
Leu Leu Val Ser Gly ile Thr Cly Val Ile Ser Thr Ile Leu Gln
1130 1140 1150 1160 1170 t 1
TAT TCT AAA CAA CCA ATG TTT GAG CAC CTT CCA AAT AAA ATT CAT
Tyr Ser Lys Gln Ala MET Phe Clu His Val Ala Asn Lys Ile His
1180 1190 1200 1210
AAC AAA ATT CTA GAA TCG CAA AAA AAT AAT CAC GGT AAC AAC TAC
Asn Lys Ile Val Glu Trp Glu Lys Asn Asn His Cly Lys Asn Tyr
FIG. 5C
184 825
1220 1 1230 ł 12 40 1 250 1260
TTT CAA AAT CCT TAC GAT CCC CGT TAT CTT GCG AAT TTA CAA GAT
Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala Asn Leu Gln Asp
1270 1280 1290 1 1300
AAT ATG AAA TTC TTA CTG AAC TTA AAC AAA GAC TTA CAG GCA GAA
Asn HET Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn Lys Clu Leu Gln Ala Glu
1310 1320 1330 1340 1350
CGT GTC ATC CCT ATT ACT CAG CAG CAA TCG GAT AAC AAC ATT CGT
Arg Val 1Le Ala Ile Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn Ile Gly
1360 1370 1 1 1380 1 1390
GAT TTA GCT CCT ATT AGC CGT TTA CGT GAA AAA CTC CTT AGT GGT
Asp Leu Ala Cly Ile Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser Cly
1400 1410 1420 1430 1440 1
AAA CCC TAT CTC CAT CCC TTT GAA GAA GGC AAA CAC ATT AAA GCC
Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Clu Clu Gly Lys His Ile Lys Ala
1450 1460 ι 1 1470 1480
CAT AAA TTA CTA CAC TTG CAT TCG GCA AAC CGT ATT ATT CAT CTG
Asp Lys Leu Val Cln Leu Asp Ser Ala Asn Gly Ile Ile Asp Val
1490 1500 1 1510 1520 1530
AGT AAT TCG GCT AAA CCG AAA ACT CAG CAT ATC TTA TTC AGA acg
Ser Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gln His Ile Leu Phe Arg Thr
1540 1550 1560 1570
CCA TTA TTC ACG CCC GGA ACA CAG CAT CGT GAA CCC GTA CAA ACA
Pro Leu Leu Thr Pro Gly Thr Clu His Arg Glu Arg Val Gln Thr
1580 1590 1600 1610 1 1620
GGT AAA TAT CAA TAT ATT ACC AAG CTC AAT ATT AAC CGT GTA GAT
Gly Lys Tyr Clu Tyr Ile Thr Lys Leu Asn Ile Asn Arg Val Asp
FIG. 5D
184 825
1630 « 1640 1650 1 1660
AGC TGG AAA ATT ACA GAT GGT GCA CCA AGT TCT ACC TTT GAT TTA
Ser Trp Lys Ile Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr Phe Asp Leu
1670 1680 1690 t , 1700 1710
ACT AAC GTT GTT CAG CGT ATT GGT ATT GAA TTA GAC AAT GCT GGA
Thr Asn Val Val Gln Arg Ile Gly Ile Glu Leu Asp Asn Ala Gly
1720 1730 1 1740 1 1750 1
AAT GTA ACT AAA ACC AAA GAA ACA AAA ATT ATT CCC AAA CTT GGT
Asn Val Thr Lys Thr Lys Glu Thr Lys Ile Ile Ala Lys Leu Gly
1760 1 1770 1780 1790 1800 1 i
CAA GGT GAT GAC AAC GTA TTT GTT GGT TCT CGT ACG ACG GAA ATT
Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu Ile
1810 1 1620 1830 1840 1
GAT CGC CGT GAA GCT TAC GAC CGA GTT CAC TAT ł AGC CCT GGA AAC
Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg Val His Tyr Ser Arg Gly Asn
1850 1860 1870 1880 1890 ( «
TAT CGT CCT TTA ACT ATI' GAT GCA ACC AAA CAG ACC GAG CAA CGT
Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Ala Thr Lys Glu Thr Glu Gln Gly
1900 1910 1920 1930 1
AGT TAT ACC CTA AAT CGT TTC GTA GAA ACC CGT AAA GCA CTA CAC
Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr Gly Lys Ala Leu His
1940 1950 1960 1 < 1970 1980 1 1
CAA GTC ACT TCA ACC CAT ACC GCA TTA GTG GGC AAC CCT GAA GAA
Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Vai Gly Asn Arg Glu Glu
1990 2000 : 2010 2020 1
ΛΛΛ ATA CAA TAT CCT CAT AGC AAT AAC CAG CAC CAT GCC GGT TAT
Lys Ile Clu Tyr Arg His Ser Asn Asn Gln His His Ala Gly Tyr
FIG. 5E
184 825
2030 2040 1 2050 ł 2060 2070
TAC ACC AAA GAT ACC TTG AAA CCT CTT CAA GAA ATT ATC GGT ACA
Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lys Ala Val Glu Glu Ile Ile Gly Thr
2080 2090 2100 l 1 i 2110
TCA CAT AAC GAT ATC TTT AAA GCT ACT AAG TTC AAT GAT CCC TTT
Ser His Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala Phe
2120 1 2130 2140 2150 : 2160
AAC CCT GCT CAT GGT GTC GAT ACT ATT GAC GCT AAC GAC GGC AAT
Asn Gly Gly Asp Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asn
2170 2180 2190 1 1 1 2200
CAC CCC TTA TTT GGT GCT AAA GCC CAT CAT ATT CTC CAT GGT GGA
Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Cly Asp Asp Ile Leu Asp Cly Cly
2210 2220 2230 2240 2250
AAT CGT GAT GAT TTT ATC CAT GCC GCT AAA GCC AAC CAC CTA TTA
Asn Cly Asp Asp Phe Ile Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu
22GO 2270 2280 2290
CAC CCT GCC AAC CCC GAT CAT ATT TTC GTT CAC CGT AAA CCC CAT
His Cly Gly Lys Cly Asp Asp Ile Phe Val His Arg Lys Gly Asp
2300 2310 1 2320 2330 2340
GGT AAT CAT ATT ATT ACC CAT TCT GAC GCC AAT CAT AAA TTA TCA
Gly Asn Asp Ile Ile Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser
2350 2360 2370 2380
TTC TCT CAT TCC AAC TTA t ł ΑΑΛ CAT TTA ACA TTT CAA AAA CTT AAA
Phe Ser Asp Ser Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Clu Lys Val Lys
2390 2400 2410 ł 2420 2430 1
CAT AAT CTT CTC ATC ACG AAT ACC AAA AAA CAC AAA GTG ACC ATT
His Asn Leu Val Ile Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr Ile
FIG. 5F
184 825
2440
2450
2460
2470
CAA AAC TGG TTC CCA GAG GCT GAT TTT GCT AAA GAA GTC CCT AAT
Gln Asn Trp Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn
2480 1 2490 1 2500 2510 1 2520
TAT AAA CCA ACT AAA GAT GAC AAA ATC GAA GAA ATC ATC GGT CAA
Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile Cly Gln
2530 2540 2550 2560 1
AAT GGC CAC CCC ATC ACC TCA AAG CAA GTT GAT GAT CTT ATC GCA
Asn Gly Clu Arg Ile Thr Ser Lys Gin Val Asp Asp Leu Ile Ala
2570 2580 2590 2600 1 2610
AAA CGT AAC CCC AAA ATT ACC CAA GAT CAC CTA TCA AAA CTT CTT
Lys Cly Asn Cly Lys I le Thr Gln Asp Clu Leu Ser Lys Vai Val
2620 2630 2640 2650
GAT AAC TAT GAA TTC CTC AAA CAT AGC AAA AAT GTG ACA AAC AGC
Asp Asn Tyr Clu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn Val Thr Asn Ser
2660 2670 2680 2690 2700
TTA GAT AAC TTA ATC TCA TCT CTA AGT GCA TTT ACC TCC TCT AAT
Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn
2710 2720 2730 2740
GAT TCG AGA AAT CTA TTA GTC GCT CCA ACT TCA ATG TTC GAT CAA
ASp Se r Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser MET Leu Asp Gln
2750 2760 2770 2780 2790
AGT TTA TCT TCT CTT CAA TTT CCT ACC CCA TCT CAC CAT TCC AGC
Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Cly Ser Gln His Trp Ser
2300 2810 2820 2830 1
TAC CCC CTC CCC CCT CCC AGC CCT TCT CAA GAT TCG AGC TAC GCC
Tyr Cly Leu Arg Pro Cly Ser Cly Ser Gln Asp T rp Se r Tyr Cly
FIG. 5G
184 825
2840 1 2850 2860 2870 1 2880 1
CTG CGT CCG GGT CGC TCT AGC CAC CAT TCG ACC TAC GGC CTG CGC
Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg
2890 2900 ł t 2910 1 2920
CCT GGC AGC GGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC CGC CTG CGT CCG GGT
Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
2930
GGA TCC TAG
Gly Ser --FIG. 5H
EcoRI
FIG. 6
184 825
ATG GCT 10 1 20 30 CCA AAA ACT 40
ACT GTT ΛΤΛ CAT CTA AGC TTC GGG GCA AAA
MET Ala Thr Val Ile Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys
50 1 60 1 70 80 1 90
AAA ATT ATC CTC TAT ATT CCC CAA AAT TAC CAA TAT GAT ACT GAA
Lys Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Asn Tyr Cln Tyr Asp Thr Glu
100 1 110 1 120 130
CAA CGT AAT GGT TTA CAC CAT TTA CTC AAA GCC GCC GAA GAC TTC
Gln Gly Asn Gly Leu Gin ASP Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu
140 150 1 160 t 170 180 1
CGG ATT GAG GTA CAA AGA CAA CAA CCC AAT AAT ATT CCA ACA GCT
Gly Ile Glu Val Gin Arg Cłu Glu Arg Asn Asn Ile Ala Thr Ala
190 200 I 210 220
CAA ACC AGT TTA CCC ACG ATT CAA ACC CCT ATT GCC ΤΓΑ ACT GAG
Gln Thr Ser Leu Cly Thr Ile Gin Thr Ala Ile Gly Leu Thr Glu
230 240 250 260 270
CGT GGC ATT GTG TTA TCC CCT CCA CAA ATT CAT AAA TTC CTA CAG
Arg Gly 1 le Val Leu Ser Ala Pro Cln Ile Asp Lys Leu Leu Gln
280 290 300 310
AAA ACT AAA GCA GGC CAA CCA TTA CCT TCT GCC GAA ACC ATT GTA
Lys Thr Lys Ala Gly CIn Ala Leu Cly Ser Ala Glu Se r Ile Val
320 330 340 350 1 360
CAA AAT CCA AAT AAA CCC AAA ACT CTA TTA TCT GGC ATT CAA TCT
Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Se r Cly Ile Gln Ser
370 3Θ0 390 1 400
ATT TTA CGC TCA GTA TTG GCT GGA ATG GAT TTA GAT GAG GCC TTA
Ile Leu Cly Ser Val Leu Ala Gly MET Asp Leu Asp Glu Ala Leu
FIG. 7A
184 825
410 1 420 430 1 440 1 450
CAG AAT AAC AGC AAC CAA CAT GCT CTT CCT AAA CCT CGC TTG GAG
Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Glu
460 1 470 480 t 1 490
CTA ACA AAT TCA TTA ATT GAA AAT ATT CCT AAT TCA GTA AAA ACA
Leu Thr Asn Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala Asn Ser Val Lys Thr
500 1 510 1 520 f 530 540
CTT GAC CAA TTT CGT CAC CAA ATT AGT CAA TTT CCT TCA AAA CTA
Leu Asp Glu Phe Cly Clu Gln Ile Ser Gln Phe Cly Ser Lys Leu
550 ! 560 570 1 1 560
CAA AAT ATC AAA GGC TTA GGG ACT TTA GCA GAC AAA CTC AAA AAT
Gin Asn Ile Lys Cly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn
590 600 G10 i 520 630 ł
ATC GCT GGA CTT CAT AAA CCT CCC CTT CGT TTA GAT GTT ATC TCA
Ile Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Cly Leu Asp Val Ile Ser
640 650 660 1 » ' 670
GGG CTA TTA TCC CCC CCA ACA CCT CCA CTT CTA CTT CCA GAT AAA
Gly Leu Leu Ser Cly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys
660 1 690 I 700 710 720 1
AAT CCT TCA ACA CCT AAA AAA CTC CGT CCG CCT TTT GAA TTG GCA
Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala
730 740 750 760
AAC CAA CTT CTT CCT AAT ATT ACC AAA CCC CTT TCT TCT TAC ATT
Asn Cln Val Val Gly Asn Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile
FIG. 7B
184 825
770 1 780 1 790 800 1 810
TTA GCC CAA CGT CTT GCA GCA CCT TTA TCT TCA ACT GGG CCT GTC
Leu Ala Cln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val
820 830 840 1 850
GCT GCT TTA ATT CCT TCT ACT CTT TCT CTT' CCG ATT AGC CCA TTA
Alu Ala Leu Ile Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu
860 ł 870 ( 880 ł 890 900
CCA TTT GCC CGT ATT GCC GAT AAA TTT AAT CAT CCA AAA AGT TTA
Ala Phe Ala Gly Ile Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu
910 1 920 930 1 940
GAG AGT TAT CCC GAA CCC TTT AAA AAA TTA CGC TAT CAC GGA GAT
Clu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp
950 960 1 970 1 980 1 990
AAT TTA TTA GCA GAA TA Γ CAU Cbb LibA ACA GGG AgT ATT CAT CCA
Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr Ile Asp Ala
1000 1010 1020 1030
TCG GTT ACT GCA ATT AAT ACC GCA TTG CCC CCT ATT CCT GGT CGT
Ser Val Thr Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Gly Gly
1040 1050 l 1 1060 1070 1080
1 CTC TCT CCT CCT CCA CCC AAC TTA AAA GAT TTA ACA TTT GAA AAA
Val Ser Ala Ala Ala Ala Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys
1090 1100 1110 1 1120 1
CTT AAA CAT AAT CTT CTC ATC ACG AAT AGC AAA AAA GAG AAA GTG
Val Lys His Asn Leu Val Ile Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val
1130 1140 1 1150 1160 1170 t
ACC ATT CAA AAC TGG TTC CCA GAG GCT GAT TTT GCT AAA GAA GTG
Thr Ile Cln Asn Trp Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val
FIG. 7C
184 825
1180 1 1190 1 1200 1 1210
CCT AAT TAT AAA CCA ACT AAA CAT CAG AAA ATC GAA GAA ATC ATC
Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile
1220 1230 1240 1250 1260 I 1 <
CGT CAA AAT CGC GAG CGG ATC ACC TCA AAG CAA GTT GAT GAT CTT
Gly Gln Asn Gly Clu Arg Ile Thr Ser Lys Gln Val Asp Asp Leu
1270 1280 1 1290 1300
ATC GCA AAA GGT AAC CCC AAA ATT ACC CAA CAT CAC CTA TCA AAA
Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile Thr Cln Asp Glu Leu Ser Lys
1310 1320 1330 1340 1350
GTT GTT GAT AAC TAT CAA TTC CTC AAA CAT ACC AAA AAT CTC ACA
Val Val Asp Asn Tyr Clu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn Val Thr
1360 ł 1370 1380 1390
AAC ACC TTA GAT AAC TTA ATC TCA TCT GTA AGT CCA TTT ACC TCC
Asn Ser .Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr Ser
1400 1 14 10 1420 1430 1440
TCT AAT GAT TCC AGA AAT CTA TTA CTC GCT CCA ACT TCA ATC TTG
Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser MET Leu
14 50 1460 1 14-70 1480
GAT CAA AGT TTA TCT TCT CTT CAA TTT GCT ACC CCA TCT CAG CAT
Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser Gln His
1490 1500 1510 1520 1530 i l 1
TCG ACC TAC CCC CTG CCC CCT GCC ACC GGT TCT CAA GAT TGG AGC
Trp Ser Tyr Cly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser
FIG . 7D
184 825
1540 1550 1 1560 1 1570 1
TAC GGC CTG CGT CCG GGT GCC TCT ACC CAG CAT TGG ACC TAC GGC
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly
1580 ł 1590 1600 1610 i ł 1620 1
CTC CGC CCT GCC AGC CGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT
Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg
1630
I
CCG CCT CCA TCC TAC
Pro Gly Gly Ser --FIG. 7E [Wael] [BstBl]
...GCT GCA GCCJGGC TCG GTT ATT.....TTC TCT GAT TCG[AAC TTA AAA..
...CGA CGT CGG ! CCG AGC CAA TAA...AAG AGA CTA AGC! TTG AAT TTT...
..Ala Ala AlajGly Ser Val Ile....Phe Ser Asp SerjAsn Leu Lys...
351 785
FIG. 8A
.GCT GCA GCC AAC TTA AAA
.CGA CGT CGG TTG AAT TTT.
Ala Ala Ala Asn Leu Lys.
351 705
FIG. 8B
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz
Cena 6,00 zł.

Claims (45)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony zmultimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  2. 2. Białko chimeryczne według zastrz. 1, znamienne tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  3. 3. Białko chimeryczne według zastrz. 2, znamienne tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352.
  4. 4. Białko chimeryczne według zastrz. 2, znamienne tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 111.
  5. 5. Białko chimeryczne według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  6. 6. Białko chimeryczne według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  7. 7. Białko chimeryczne według zastrz. 1, znamienne tym, że multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny.
  8. 8. Białko chimeryczne według zastrz. 1, znamienne tym, że multimer GnRH jest przyłączony do C-końca polipeptydu leukotoksyny.
  9. 9. Białko chimeryczne według zastrz. 1, znamienne tym, że multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
  10. 10. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  12. 12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111.
  13. 13. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że białko chimeryczne zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  14. 14. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera białko chimeryczne, w którym multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydu leukotoksyny.
  15. 15. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera białko chimeryczne, w którym multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
  16. 16. Zastosowanie białka chimerycznego do produkowania kompozycji szczepionki do prezentowania wyodrębnionego multimeru GnRH organizmowi pacjenta, przy czym białko chimeryczne zawiera polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera
    184 825 sekwencję aminokwasową pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  18. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111.
  19. 19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że białko chimeryczne zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  20. 20. Zastosowanie według zastrz. 16, że stosuje się białko chimeryczne, w którym multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydy leukotoksyny.
  21. 21. Zastosowanie według zastrz. 16, że stosuje się białko chimeryczne, w którym multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
  22. 22. Konstrukcja dNa kodująca białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  23. 23. Konstrukcja DNA według zastrz. 22, znamienna tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  24. 24. Konstrukcja DNA według zastrz. 23, znamienna tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111.
  25. 25. Konstrukcja DNA według zastrz. 22, znamienna tym, że białko chimeryczne zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  26. 26. Konstrukcja DNA według zastrz. 22, znamienna tym, że koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydu leukotoksyny.
  27. 27. Konstrukcja DNA według zastrz. 22, znamienna tym, że koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
  28. 28. Kaseta ekspresyjna składająca się z:
    (a) konstrukcji DNA kodującej białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadająca przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji, i (b) sekwencji kontrolnych kierujących transkrypcją tego konstruktu, dzięki czemu, konstrukcja ta może podlegać transkrypcji i translacji w komórce gospodarza.
  29. 29. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  30. 30. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 29, znamienna tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111.
  31. 31. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 28, znamienna tym, że białko chimeryczne zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
    184 825
  32. 32. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 28, znamienna tym, że koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydu leukotoksyny.
  33. 33. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 28, znamienna tym, że koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
  34. 34. Komórka gospodarza transformowana kasetą ekspresyjną składającą się z:
    (a) konstrukcji DNA kodującej białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji, i (b) sekwencji kontrolnych kierujących transkrypcją tego konstruktu, dzięki czemu, konstrukcja ta może podlegać transkrypcji i translacji w komórce gospodarza.
  35. 35. Komórka gospodarza według zastrz. 34, znamienna tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  36. 36. Komórka gospodarza według zastrz. 35, znamienna tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111.
  37. 37. Komórka gospodarza według zastrz. 34, znamienna tym, że białko chimeryczne zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  38. 38. Komórka gospodarza według -zastrz. 34, znamienna tym, że konstrukcja DNA koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydu leukotoksyny.
  39. 39. Komórka gospodarza według zastrz. 34, znamienna tym, że konstrukcja DNA koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
  40. 40. Sposób wytwarzania polipeptydu rekombinantowego, znamienny tym, że:
    (a) przygotowuje się populację komórek gospodarza transformowanych kasetą ekspresyjną składającą się z:
    (i) konstrukcji DNA kodującej białko chimeryczne zawierające polipeptyd leukotoksyny połączony z multimerem złożonym z czterech lub ośmiu kopii wyodrębnionych polipeptydów GnRH, przy czym multimer GnRH zawiera sekwencję aminokwasową. pokazaną na figurze 1A lub 1B, lub sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji, i (ii) sekwencji kontrolnych kierujących transkrypcją tego konstruktu, dzięki czemu, konstrukcja ta może podlegać transkrypcji i translacji w komórce gospodarza, i (b) prowadzi się hodowlę tych komórek w warunkach, w których przebiega wytwarzanie polipeptydu kodowanego przez tą kasetę ekspresyjną.
  41. 41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że polipeptyd leukotoksyny nie wykazuje aktywności leukotoksycznej.
  42. 42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że jako leukotoksyna występuje LKT 352 albo LKT 111.
  43. 43. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że białko chimeryczne zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 5 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji albo sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 7 albo sekwencję aminokwasową posiadającą przynajmniej 90% identyczności wobec tej sekwencji.
  44. 44. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że konstrukcja DNA koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH jest przyłączony do N-końca polipeptydu leukotoksyny albo do C-końca polipeptydu leukotoksyny.
    184 825
  45. 45. Sposób według edłstrz.40, znamienny enny że konetndnja DNA koduje białko chimeryczne, w którym multimer GnRH zawiera przynajmniej osiem wyodrębnionych polipeptydów GnRH.
    Dziedziną wynalazku są immunologiczne układy nośnikowe. Wynalazek dotyczy zwłaszcza chimer GnRH-leukotoksena, zawierających więcej niż jedną kopię polipeptydu GnRH. Chimery takie wykazuuą wzmocnioną immunogenność w porównaniu z immunogennością samych polipeptydów GnRH.
    W organizmach zwierząt kręgowych syntezę i uwalnianie dwu hormonów gonadotropowych: hormonu lateinizałąckgo (LH) i hormonu stymulującego pęcherzyk (FbH) reguluje polipeptyd zwany hormonem uwalniającym gonadotropinę (GnRH), uprzednio zwany hormonem LHRH. Jednym ze sposobów regulowania płodności w populacjach zwierzęcych jest zatem obniżanie poziomu GnRH na drodze immunizacji przeciw GnRH, co powoduje spadek poziomów LH i FbH z towarzyszącym przerwaniem cykli rui i spermatogenezy (patrz np. Adams i wsp., J. Anim. bci. 1990, 68,2793-2802).
    Wczesne badania cząsteczki GnRH wykazały, że istnieje możliwość wytworzenia antysurowicy w odpowiedzi na wielokrotnie powtarzane iniekcje syntetycznych peptydów GnRH (Arimura i wsp., Endocrinology, 1973, 93 (5), 1092-1103). Ponadto, wytworzono przeciwciała przeciw GnRH u wielu gatunków zwierząt przez chemiczną koniugację GnRH z odpowiednim nośnikiem i podanie koniugatu w odpowiednio dobranym adiuwancie (Carelli i wsp., (Proc. Natl. Acad. bci. 1992, 79, 5392-5395). Opisano również rekombinacyjne białka fuzyjne zawierające GnRH bądź analogi GnRH, użyte w szczepionkach peptydowych do celów immunologicznej kastracji lub tłumienia funkcji reprodukcyjnych u różnych zwierząt domowych i hodowlanych (Meloen i wsp., Vaccine, 1994, 12 (8), 741-746; Hoskinson i wsp., Aust. J. Biotechnol. 1990, 4, 166-170; opis patentowy światowy WO 92/19746 opublikowany 12 listopada 1992; opis patentowy światowy WO 91/02799 opublikowany 7 marca 1991; opis patentowy światowy WO 90/11298 opublikowany 4 października 1990 i opis patentowy światowy WO 86/07383 opublikowany 18 grudnia 1986 roku).
    Wysiłki te jednak nie zaowocowały otrzymaniem produktów nadających się do skutecznej sterylizacji immunologicznej z powodu słabej immunogenności peptydów GnRH a także z tego powodu, że metody koniugacji chemicznej są trudne do kontroli a powstające w niej koniugaty GnRH są w zasadzie heterogenne i trudne do zdefiniowania. Ponadto, otrzymanie szczepionek peptydowych opartych na GnRH nie stało się sukcesem pod względem zapewnienia jednakowych skutków u poszczególnych zwierząt, nawet po wielokrotnych szczepieniach. W tym względzie, konstrukcje GnRH zawiodły nadzieje na uzyskanie jednorodnej, skutecznej szczepionki do sterylizacji immunologicznej z tego powodu, że GnRH jest małą cząsteczką „własną”, nie rozpoznawaną normalnie przez układ immunologiczny danego osobnika, co sprawia, iż cząsteczka ta jest słabo immunogenna i sama z siebie niezdolna do wywołania znaczącej odpowiedzi immunologicznej przeciw endogennemu GnRH.
    Ogólnie wiadomo, że immunogenność antygenów wirusowych, małych białek lub substancji endogennych można znacznie 5 zwiększyć przez wytworzenie takich form immunogennych tych cząsteczek, które zawierają wiele kopii wybranych epitopów. Okazało się, że konstrukcje oparte na dwóch albo czterech powtórzeniach peptydów 9-21 z glikoproteiny D wirusa herpes simplex typu 1 (Ploeg i wsp., J. Immun. Methods, 1989, 124, 211-217), na dwóch do sześciu powtórzeniach antygenowego tetrapeptydu NPNA z obwodowego sporozoitu z Plasmodium falciparum (Lowell i wsp., bcience, 1988, 240, 800-802), na dwóch albo czterech kopii głównego miejsca immunogennego VP1 z wirusa pryszczycy (Broekhuijsen i wsp., J. Gen. Virol., 1987, 68, 3137-3143) i na tandemowych powtórzeniach polipeptydu GnRH-podobnego (Maloen i wsp., Vaccine, 1994, 12 (8), 741-746) efektywnie zwiększają immunogenność tych cząsteczek.
    184 825
    Poza tym, w celu wzbudzenia znaczącej odpowiedzi w organizmie immunizowanego gospodarza, można również koniugować małe białka lub substancje endogenne z odpowiednim nośnikiem. Takimi odpowiednimi nośnikami są na ogół polipeptydy zawierające regiony antygenowe z białka pochodzącego z materiału zakażonego, takiego jak wirusowe białko powierzchniowe albo sekwencja peptydu nośnikowego. Takie nośniki służą do nieswoistej stymulacji aktywności komórek pomocniczych T i do ułatwiania procesów związanych z funkcjonowaniem komórek prezentujących bezpośrednio antygeny i z prezentacją danego peptydu na powierzchni komórki w powiązaniu z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC).
    Do tego celu opracowano wiele układów nośnikowych. Przykładowo, dla wywołania odpowiedzi immunologicznej często sprzęga się małe antygeny peptydowe z nośnikami białkowymi, takimi jak hemocyjanina pijawki (Bittle i wsp., Nature, 1982,298, 30-33, anatoksyna tężca (Muller i wsp., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79, 569-573), albumina jaja i mioglobina ze spermy wieloryba. Takie reakcje sprzęgania prowadzą na ogół do inkorporacji kilku moli peptydu antygenowego na mol białka nośnikowego. Jakkolwiek zasadniczo prezentacja takiego antygenu peptydowego występującego w wielu kopiach wzmaga immunogenność, to same nośniki mogą wykazywać silną immunogenność nie związaną z tym antygenem peptydowym, a to może hamować odpowiedź immunologiczną na szczepionkę peptydowąprzy drugiej immunizacji (Schutze i wsp., J. Immun. 1985,135,2319-2322).
    Układy dostarczania antygenu opierano również na nośnikach złożonych z oddzielnych cząstek. Przykładowo, użyto wstępnie ukształtowane cząstki jako platformy, na których mogą być sprzęgane i do których mogą być wbudowane antygeny. Opracowano układy oparte na proteosomach (Lowell i wsp., Science, 1988, 240, 800-802), kompleksy do stymulacji immunologicznej (Morein i wsp., Nature, 1984, 308, 457-460) i cząstki wirusowe, takie jak antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) (Neurath i wsp., Mol. Immunol., 1989, 26, 53-62) oraz białko wewnętrznego kapsydu rotawirusa (Redmond i wsp., Mol. Immunol., 1991, 28, 269-278).
    Konstruowano ponadto układy nośnikowe stosując wytworzone techniką rekombinacji białka chimerowe, które mają właściwości samokształtowania się, przyjmując formy oddzielnych cząstek. Przykładowo, drożdżowy retrotransposon Ty koduje serię białek, które kształtują się w cząstki wirusopodobne (Ty-VLP; Kingsman S. M., A. J. Kingsman, Vacc. 1988, 6, 304-306). Wbudowywano obce geny do genu TyA i dokonywano ich ekspresji w drożdżach w postaci białka ftizyjnego. Takie białko fuzyjne zachowuje zdolność samokształtowania w cząstki o jednorodnych rozmiarach.
    Badano również inne cząstki chimerowego białka, takie jak HBsAg (Valenzuela i wsp., Bio/Technol., 1985, 3, 323-326; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.722.840; Delpeyroux i wsp., Science, 1986, 233, 472-475), antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (Clarke i wsp., Vaccines 88 (pod red.: H. Ginsberga i wsp., 1988, str. 127-131), wirus polio (Burke i wsp., Nature, 1988, 332, 81-82) i wirus mozaiki tytoniowej (Haynes i wsp., Bio/Technol., 1986, 4, 637-641). Użyteczność takich nośników jest jednak ograniczona ze względu na ograniczoną wielkość środka aktywnego, jaki można wbudować do białka strukturalnego bez zaburzania struktury cząstek.
    Skonstruowano też układy chimerowe z użyciem polipeptydu leukotoksyny z Pasteurella haemolytica (LKT) połączonego przez fuzję z wybranym antygenem (patrz np. zgłoszenia patentowe światowe WO 93/08290, opublikowane 29 kwietnia 1993 i WO 92/03558, opublikowane 5 marca 1992 r. a także opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki 5.238.823 i 5.273.889. Wstawienie części nośnika LKT do chimery antygenu peptydowego nadaje wzmocnioną immunogenność tej chimerze dzięki dostarczeniu epitopów komórek T wykazujących reaktywność w wielu różnych gatunkach, a przez to wzbudzających zależną od komórek T odpowiedź immunologiczną u immunizowanych osobników. W tym względzie, indukowanie pomocy ze strony komórek T ma podstawowe znaczenie dla generowania odpowiedzi immunologicznej w stosunku do części antygenu peptydowego tej chimery, zwłaszcza w przypadkach, kiedy antygenem jest cząsteczka endogenna. Użycie jako nośnika polipeptydu
    184 825 leukotoksyny w kombinacji z wielokrotnymi epitopami peptydu GnRH nie zostało jednak dotychczas opisane.
PL96321704A 1995-02-10 1996-01-24 Białko chimeryczne, kompozycja szczepionki, zastosowanie białka chimerycznego, konstrukcja DNA, kaseta ekspresyjna, komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania polipeptydu zrekombinowanego PL184825B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/387,156 US5723129A (en) 1991-10-16 1995-02-10 GnRH-leukotoxin chimeras
PCT/CA1996/000049 WO1996024675A1 (en) 1995-02-10 1996-01-24 GnRH-LEUKOTOXIN CHIMERAS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL321704A1 PL321704A1 (en) 1997-12-22
PL184825B1 true PL184825B1 (pl) 2002-12-31

Family

ID=23528717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96321704A PL184825B1 (pl) 1995-02-10 1996-01-24 Białko chimeryczne, kompozycja szczepionki, zastosowanie białka chimerycznego, konstrukcja DNA, kaseta ekspresyjna, komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania polipeptydu zrekombinowanego

Country Status (11)

Country Link
US (2) US5723129A (pl)
EP (1) EP0808369A1 (pl)
JP (1) JPH11503603A (pl)
KR (1) KR19980702118A (pl)
BR (1) BR9607526A (pl)
CA (1) CA2212054A1 (pl)
HU (1) HU224612B1 (pl)
MX (1) MX9706009A (pl)
NZ (1) NZ300125A (pl)
PL (1) PL184825B1 (pl)
WO (1) WO1996024675A1 (pl)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723129A (en) * 1991-10-16 1998-03-03 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
US5837268A (en) * 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
US6797272B1 (en) 1991-10-16 2004-09-28 University Of Saskatchewan Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
US6037321A (en) * 1995-05-03 2000-03-14 Biostar Inc. Fusion proteins comprising vasoactive intestinal peptide or PACAP
WO1996034958A1 (en) * 1995-05-03 1996-11-07 Biostar Inc. Vasoactive intestinal peptide
US5885966A (en) * 1995-06-07 1999-03-23 Dlo Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone LHRH, and analogs of the LHRH tandem repeat peptide and their use as vaccine
US6761890B1 (en) * 1995-06-07 2004-07-13 Pepscan Systems B.V. Peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunize animals against the hormone LHRH, and analogs of the LHRH tandem repeat peptide and their use as vaccine
IL116436A (en) 1995-12-18 2006-12-31 Yissum Res Dev Co Fc?Á-PE CHIMERIC PROTEIN FOR TARGETED TREATMENT OF ALLERGY RESPONSES AND
IL118570A (en) * 1996-06-04 2007-06-17 Shai Yarkoni Use of a chimeric protein that includes Met – GnRH in the preparation of a pharmaceutical preparation for the treatment of adenocarcinoma or patocarcinoma
US6013770A (en) * 1997-07-21 2000-01-11 Washington State University Chimeric contraceptive vaccines
IL138214A0 (en) * 1998-03-09 2001-10-31 Zealand Pharmaceuticals As Pharmacolgically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
WO1999056771A2 (en) * 1998-05-05 1999-11-11 Biostar Inc. Methods of raising animals for meat production
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6656906B1 (en) * 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6838553B1 (en) * 1999-10-05 2005-01-04 Academia Sinica Peptide repeat immunogens
BR0109919A (pt) * 2000-04-07 2003-03-11 Univ Leeds Innovations Ltd Proteìna, partìcula, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, processo para produzir uma proteìna, composição farmacêutica, uso de uma proteìna, e, método de vacinação profilática ou terapêutica de um indivìduo
US6783761B2 (en) 2000-05-05 2004-08-31 Aphton Corporation Chimeric peptide immunogens
DE10054055A1 (de) * 2000-10-31 2002-05-23 Nmi Univ Tuebingen Verfahren zur Analyse von Proteinen
WO2002043770A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 Conforma Therapeutic Corporation Homing peptide multimers, their preparation and uses
DZ3205A1 (fr) * 2000-12-31 2005-04-20 Madani Belhafiane La pilule stérilisante.
AU2003262379A1 (en) * 2002-04-16 2003-11-03 Auburn University TRANSIENT AND/OR PERMANENT MODIFICATION OF SEXUAL BEHAVIOR AND/OR FERTILITY USING RECOMBINANT CHIMERIC GnRH
US7618788B2 (en) * 2002-05-10 2009-11-17 Millipore Corporation Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis
US20040038307A1 (en) * 2002-05-10 2004-02-26 Engeneos, Inc. Unique recognition sequences and methods of use thereof in protein analysis
US20060014212A1 (en) * 2002-05-10 2006-01-19 Epitome Biosystems, Inc. Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis
US7460960B2 (en) * 2002-05-10 2008-12-02 Epitome Biosystems, Inc. Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis
US7794734B2 (en) * 2002-10-30 2010-09-14 The Board Of Regents For Oklahoma State University Mannheimia haemolytica chimeric outer membrane protein PlpE and leukotoxin epitopes as a vaccine or vaccine component against shipping fever
US20050255491A1 (en) * 2003-11-13 2005-11-17 Lee Frank D Small molecule and peptide arrays and uses thereof
WO2005120552A1 (en) * 2004-06-11 2005-12-22 Ym Biosciences Inc. METHODS AND FORMULATIONS OF GnRH/LEUKOTOXIN CHIMERAS FOR TESTOSTERONE SUPPRESSION
US7855057B2 (en) * 2006-03-23 2010-12-21 Millipore Corporation Protein splice variant/isoform discrimination and quantitative measurements thereof
AU2009239651B2 (en) 2008-04-25 2013-12-12 University Of Saskatchewan Prion epitopes and methods of use thereof
US8734811B2 (en) 2009-04-06 2014-05-27 University Of Saskatchewan Methods and compositions for treating and preventing Shiga toxin-producing Escherichia coli infection
US9687591B2 (en) 2010-03-31 2017-06-27 Agency For Science, Technology And Research Building stratified biomimetic tissues and organs using crosslinked ultrashort peptide hydrogel membranes
KR101895245B1 (ko) 2010-03-31 2018-09-05 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 양친매성 선형 펩티드/펩토이드 및 이를 포함하는 히드로겔
US8999916B2 (en) 2010-03-31 2015-04-07 Agency For Science, Technology And Research Crosslinked peptide hydrogels
US9120841B2 (en) 2012-09-28 2015-09-01 Agency For Science, Technology And Research Amphiphilic linear peptidepeptoid and hydrogel comprising the same
US20180042998A1 (en) 2015-03-10 2018-02-15 University Of Massachusetts Targeting gdf6 and bmp signaling for anti-melanoma therapy
BR102018068504A2 (pt) * 2018-09-12 2021-11-16 Ouro Fino Saúde Animal Ltda Polipeptídeo quimérico antigênico, construção gênica e composição antigênica para imunocastração de mamíferos não humanos

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0191869A4 (en) * 1984-08-17 1988-06-27 Sagami Chem Res FISH CALCITONIN DERIVATIVE, PREPARATION METHOD THEREOF, AND RELATIVE GENE SYSTEM.
US4608251A (en) * 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4556555A (en) * 1985-01-25 1985-12-03 North Carolina State University Process for the immunological neutering of animals
EP0224574A4 (en) * 1985-06-04 1988-04-26 Biotech Res Partners Ltd SELF-ANTIGEN VACCINES.
US5374426A (en) * 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
US5028423A (en) * 1986-10-07 1991-07-02 Immunex Corporation Immunogenic conjugates comprising leukotoxin peptide fragments
US5055400A (en) * 1986-11-26 1991-10-08 University Of Guelph Leukotoxin gene of pasteurella haemolytica
US4975420A (en) * 1987-09-30 1990-12-04 University Of Saskatchewan Agents and procedures for provoking an immune response to GnRH and immuno sterilizing mammals
NL8900726A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Stichting Centr Diergeneeskund Peptide, immunogene samenstelling en vaccin- of geneesmiddelpreparaat; werkwijze voor het immuniseren van een zoogdier tegen lhrh, en werkwijze voor het verbeteren van de vleeskwaliteit van varkens.
CA2014033C (en) * 1989-04-07 1993-02-09 Stephen D. Acres Compositions and treatments for pneumonia in animals
EP0446313B1 (en) * 1989-08-25 1996-07-31 Biotechnology Australia Pty. Ltd. Fusion proteins comprising TraTp and at least one LHRH analogue
ES2108693T3 (es) * 1990-04-05 1998-01-01 Univ Saskatchewan Compuestos y tratamientos para la neumonia en animales.
US5238823A (en) * 1990-08-22 1993-08-24 Veterinary Infectious Disease Organization Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof
US5273889A (en) * 1990-08-22 1993-12-28 University Of Saskatchewan Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof
US5594107A (en) * 1990-08-22 1997-01-14 University Of Saskatchewan Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon
AU634379B2 (en) * 1991-04-29 1993-02-18 Csl Limited Recombinant immunocastration vaccine
US5422110A (en) * 1991-10-16 1995-06-06 University Of Saskatchewan Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras
WO1993008290A1 (en) * 1991-10-16 1993-04-29 University Of Saskatchewan Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras
US5723129A (en) * 1991-10-16 1998-03-03 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
CA2081950A1 (en) * 1991-11-01 1993-05-02 Reggie Y. C. Lo Vaccine for the prevention of infections caused by pasteurella haemolytica
US5238832A (en) * 1992-06-08 1993-08-24 Board Of Governors Of Wayne State University Aryl aliphatic acids
US5534256A (en) * 1992-07-02 1996-07-09 University Of Saskatchewan Haemophilus somnus outer membrane protein extract enriched with iron-regulated proteins

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996024675A1 (en) 1996-08-15
JPH11503603A (ja) 1999-03-30
EP0808369A1 (en) 1997-11-26
MX9706009A (es) 1997-11-29
BR9607526A (pt) 1997-12-30
AU4477796A (en) 1996-08-27
AU708534B2 (en) 1999-08-05
HUP9800299A2 (hu) 1998-06-29
HU224612B1 (hu) 2005-11-28
KR19980702118A (ko) 1998-07-15
NZ300125A (en) 1999-04-29
CA2212054A1 (en) 1996-08-15
US5723129A (en) 1998-03-03
PL321704A1 (en) 1997-12-22
HUP9800299A3 (en) 2001-01-29
US5969126A (en) 1999-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL184825B1 (pl) Białko chimeryczne, kompozycja szczepionki, zastosowanie białka chimerycznego, konstrukcja DNA, kaseta ekspresyjna, komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania polipeptydu zrekombinowanego
US6521746B1 (en) Polynucleotides encoding LKT 111
DK171602B1 (da) Sammensætning, der er i stand til at frembringe et immunologisk respons i et pattedyr på en udvalgt epitop, vaccinesammensætning som omfatter molekyler, der bærer den givne epitop, og fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen
ES2280115T3 (es) Composiciones inmunologicas para modular la miostatina en sujetos vertebrados.
US5708155A (en) Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras
US5422110A (en) Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras
JP3764476B2 (ja) 組合せポリペプチド抗原
US6797272B1 (en) Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras
AU728253B2 (en) GNRH-leukotoxin chimeras
AU708534C (en) Gnrh-leukotoxin chimeras
KR100711143B1 (ko) 면역 거세용 재조합 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 백신
CN1179181A (zh) GnRH－白细胞毒素嵌合体
MXPA99001249A (en) GnRH-LEUKOTOXIN CHIMERAS
NZ505045A (en) GnRH-leukotoxin chimeras
JP2787926B2 (ja) 融合タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080124