JPH11503603A - ＧｎＲＨ−ロイコトキシンキメラ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規の免疫学的担体系、それをコードするＤＮＡ、及びこれらの系の使用を開示する。担体系としては、本質的に少なくとも１つの反復ＧｎＲＨデカペプチド配列、又は選択されたＧｎＲＨ分子の少なくとも１つのエピトープに対応する配列の少なくとも１つの反復単位から成る選択されたＧｎＲＨ多量体と融合するロイコトキシンポリペプチドを包含するキメラタンパク質が挙げられる。本発明下では、選択されたＧｎＲＨ配列はすべて同一であるか、あるいは、ＧｎＲＨ配列が免疫反応を引出すことができさえすれば、ＧｎＲＨの異なる誘導体、類似体、変異体又はエピトープに対応する。ロイコトキシンはそれと融合するＧｎＲＨ多量体の免疫原性を増大するよう機能する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧｎＲＨ−ロイコトキシンキメラ 産業上の利用分野 本発明は、概して、免疫学的担体系に関する。特に、本発明は、ＧｎＲＨポリ ペプチド単独の免疫原性と比較して免疫原性増強を実証するＧｎＲＨポリペプチ ドの一つ以上のコピーを含めたロイコトキシン−ＧｎＲＨキメラに関する。 発明の背景 脊椎動物では、２つの性腺刺激ホルモン、即ち黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の合成及び放出は、ゴナドトロピン放出ホルモン（ ＧｎＲＨ）（以前はＬＨＲＨと呼ばれていた）と呼ばれるポリペプチドにより調 節される。したがって、動物集団における繁殖力制御のための一アプローチは、 例えば、ＬＨ及びＦＳＨのレベルの低減並びに発情周期及び精子形成の共働性崩 壊をもたらすＧｎＲＨに対する免疫感作により、ＧｎＲＨのレベルを低減するこ とである（例えば、Adams et al.，J．Anim．Sci．(1990)68:2793-2802参照）。 特に、ＧｎＲＨ分子の初期研究は、合成ＧｎＲＨペプチドの反復注入に反応し て抗血清を生じ得ることを示した（Arimura et al.,Endocrinology(1973)93(5): 1092-1103）。さらに、ＧｎＲＨに対する抗体が、ＧｎＲＨと適切な担体との化 学的複合と、適切なアジュバント中の複合体の投与により、多数の種に生じた（ Carelli et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（1982）79:5392-5395）。ＧｎＲＨ 又はＧｎＲＨ類似体を包含する組換え体融合タンパク質が、種々の 家畜化動物又は飼育動物の生殖機能の免疫学的去勢又は抑制に対するペプチドワ クチンの使用に関して記載されている（Meloen et al.，Vaccine（1994）12(8): 741-746; Hoslinson et al.，Aust．J.Biotechnol．（1990）4:166-170; 及びIn ternational Publication Nos．WO 92/19746（1992年11月12日公布）；WO 91/02 799（1991年３月７日公布）；WO 90/11298（1990年10月４日公布）及びWO 86/07 383（1986年12月18日公布））。 しかしながら、ＧｎＲＨペプチドの不十分な免疫原性のために、そして化学的 複合プロトコールは制御するのが難しいために、実質的に異種の且つ限定不十分 なＧｎＲＨ複合体となって、適切な免疫学的断種物質の提供にまで達した試みは ない。さらに、ＧｎＲＨを基礎にしたペプチドワクチンは、反復ワクチン接種後 でさえ個々の動物被験者に及ぼす均一作用を提供するに際してその成功は限られ ていた。これに関しては、従来のＧｎＲＨ構築物は、ＧｎＲＨが、普通は被験者 の免疫系によって認識されない小さな「自己」分子であって、免疫原性が不十分 な、且つ内生的ＧｎＲＨに対する有意の免疫反応を先天的に誘導できない分子で あるという事実のために、一様に成功を収める免疫学的断種ワクチン物質を提供 できなかった。 ウイルス抗原、小タンパク質又は内生的物質の免疫原性は、選択されるエピト ープの多数のコピーを包含する免疫原形態の分子を産生することにより有意に増 大し得る、と一般に認識される。これに関しては、単純疱疹ウイルス１型糖タン パク質Ｄペプチド９〜２１の２又は４つの反復（Ploeg et al.，J．Immuno．Met hods(1989)124:211-217）、熱帯熱マラリア原虫 Plasmodiumfalciparum の抗原 性サーカムスポロゾイトテトラペプチドＮＰＮＡの２〜６つの反復（Lowell et al.，Science(1988)240:800-802）、手足口病ウイル スのＶＰ１主要免疫原性部位の２又は４つのコピー（Broekhuijsen et al.，J． gen．Virol.(1987)68:3137-3143）、並びにＧｎＲＨ様ポリペプチドのタンデム 反復（Meloen et al.，Vaccine(1994)12(8):741-746）を基礎にした構築物は、 それらの分子の免疫原性を増大する場合に有効であることが示された。 さらに、小タンパク質又は内生的物質は、試験宿主中で有意の免疫反応を引き 出すために、適切な担体と複合される。適切な担体は一般に、ウイルス表面タン パク質のような感染物質由来のタンパク質の抗原性領域、又は担体ペプチド配列 を含むポリペプチドデアル。これえらの担体は、Ｔヘルパー細胞活性を非特異的 に刺激し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子に関連して細胞表面でのペプ チドのプロセッシング及び呈示のための抗原呈示細胞に対する直接抗原を補助す るのに役立つ。 いくつかの担体系は、このために開発された。例えば、小ペプチド抗原はしば しばタンパク質担体、例えば笠貝類 keyhole limpetのヘモシアニン（Bittle et al.，Nature(1982)298:30-33）、破傷風トキソイド（Muller et al.，Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A.(1982)79:569-573）、卵白アルブミン及びマッコウクジ ラミオグロビンと結合して、免疫反応を生じる。これらのカップリング反応は、 典型的には、担体タンパク質１モル当たり数モルのペプチド抗原の取込みを引き 起こす。多数のコピーにおけるペプチド抗原の呈示は一般に免疫原性を増強する が、しかし担体はペプチド抗原に関連しない強力な免疫性を引き出し、これが二 次免疫感作におけるペプチドワクチンに対する免疫反応を阻害する（Schutze et al.，J. Immun.(1985)135:2319-2322）。 抗原供給系は、粒子担体を基礎にしている。例えば、予備成形粒子を抗原を結 合し、取込むプラットホームとして用いる。プロテオ ソーム（Lowell et al.，Science(1988)240:800-802）、免疫刺激複合体（Morei n et al.，Nature(1984)308:457-460）、並びにウイルス粒子、例えばＨＢｓＡ ｇ（Neurath et al.，Mol．Immumol.(1989)26:53-62）及びロタウイルス内キャ プシドタンパク質（Redmond et al.，Mol．Immunol.（1991）28:269-278）を基 礎にした系が開発された。 担体系は、粒子に自己集合する組換え的に産生されたキメラタンパク質を用い て考え出された。例えば、酵母菌レトロトランスポゾン、Ｔｙは、ウイルス様粒 子に集合する一連のタンパク質をコードする（Ｔｙ−ＶＬＰｓ； Kingsman，S.M .,and A．J．Kingsman，Vacc.(1988)6:304-306）。外来遺伝子をＴｙＡ遺伝子中 に挿入し、融合タンパク質として酵母菌で発現させる。融合タンパク質は、均一 サイズの粒子に自己集合する能力を保有する。 その他のキメラタンパク質粒子、例えばＨＢｓＡｇ（Valenzuela et al.，Bio /Technol.（1985）3:323-326; 米国特許第4,722,840号; Delpeyroux et al.，Sc ience(1986)233:472-475）、Ｂ型肝炎コア抗原（Clarke et al.，Vaccines 88(E d．H．Ginsberg，et al.，1988)pp.127-131）、ポリオウイルス（Burke et al. ，Nature(1988)332: 81-82）及びタバコモザイクウイルス（Haynes et al., Bio /Technol.（1986）4:637-641）が調べられた。しかしながら、これらの担体は、 粒子集成を妨げることなく、構造タンパク質中に挿入される活性剤のサイズの限 定という点でその有用性が制限される。 最後に、キメラ系は、選定した抗原と融合するパスツレラ属のPasteurella h aemolyticaロイコトキシン（ＬＫＴ）ポリペプチドを用いて考え出された（例え ば、国際出願WO 93/08290（1993年4 月29日公布）及びWO 92/03558（1992年3 月 5 日公布）、並びに米国 特許第5,238,823 号及び第5,273,889 号参照）。ペプチド抗原キメラ中のＬＫＴ 担体部分の封入は、広範な種反応性を有するＴ細胞エピトープを提供し、それに より免疫化対象におけるＴ細胞依存性免疫反応を引き出すことによりキメラへの 免疫原性強化を供給する。これに関しては、特に抗原が内生的分子であるキメラ のペプチド抗原部分に対する免疫反応の発生には適切なＴ細胞ヘルプの誘導が不 可欠である。しかしながら、ＧｎＲＨペプチドの多機能エピトープと組合せたロ イコトキシンポリペプチド担体の使用は、これまで記載されていない。 本発明の開示 本発明は、パスツレラ属のPasteurella haemolyticaロイコトキシン遺伝子、 その変異体、及び多機能ＧｎＲＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列間 の新規の遺伝子融合体の構築を基礎にする。これらの構築物は、ＧｎＲＨ単独投 与により引き出される免疫学的反応と比較した場合、驚くほど強化された免疫原 性を示すキメラタンパク質を産生する。 したがって、一実施態様において、本発明は１つ以上の選択されたＧｎＲＨポ リペプチドで本質的に構成される多量体と融合したロイコトキシンポリペプチド を包含し、それによりキメラのロイコトキシン部分が作用してＧｎＲＨポリペプ チドの免疫原性を増大するキメラタンパク質に関する。さらに、ＧｎＲＨ多量体 は、選択されたＧｎＲＨポリペプチド又はエピトープの１つ以上のコピー、ある いは選択されたＧｎＲＨポリペプチド又はエピトープの多重タンデム反復に対応 する。さらに、ＧｎＲＨ多量体は、カルボキシル又はアミノ末端に、あるいはロ イコトキシンポリペプチドの内側の部位に位置する。ＧｎＲＨ多量体はさらに、 一般式ＧｎＲＨ−Ｘ−Ｇｎ ＲＨ（式中、Ｘはペプチド結合、アミノ酸スペーサー基及び〔ＧｎＲＨ〕_n'（こ こで、_nは１以上である）から成る群から選択され、「ＧｎＲＨ」はあらゆるＧ ｎＲＨポリペプチドを包含する）の分子に対応する。 さらに、キメラタンパク質及び製薬上許容可能なビヒクルを包含するワクチン 組成物、並びに選択されたＧｎＲＨ多量体を宿主対象に呈示するための方法であ って、有効量の本発明のワクチン組成物を投与することを包含する方法が開示さ れる。 別の実施態様では、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物に 関する。ＤＮＡ構築物は、ＧｎＲＨエピトープの１つ以上のコピーをコードする 二次ヌクレオチド配列と操作可能的に連結するロイコトキシンポリペプチドをコ ードする一次ヌクレオチド配列を包含する。 さらに別の実施態様では、本発明は、（ａ）上記のＤＮＡ構築物、並びに（ｂ ）構築物の転写を指示し、それにより構築物が宿主細胞中で転写及び翻訳される 制御配列から成る発現カセットに関する。 別の実施態様では、本発明はこれらの発現カセットにより形質転換される宿主 細胞に関する。 本発明の別の実施態様は、組換え体ポリペプチドの製造方法を提供する。本方 法は、（ａ）上記の宿主細胞の集団を提供し、そして（ｂ）発現カセットにより コードされるポリペプチドが発現される条件下で細胞集団を培養する工程から成 る。 本発明のこれらの及びその他の実施態様は、本明細書中の開示の点から見て、 当業者には容易に考えつく。 図面の簡単な説明 図１Ａ及び１Ｂは、キメラロイコトキシン−ＧｎＲＨポリペプチド遺伝子融合 体に用いられるＧｎＲＨ構築物のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。図 １Ａは、ＧｎＲＨデカペプチドの単一コピーを含むＧｎＲＨ−１を示す；図１Ｂ は、ＧｎＲＨデカペプチドの、ｎ＝１の場合には４個のコピー及びｎ＝２の場合 には８個のコピー・・・を含むＧｎＲＨ−２を示す。 図２は、プラスミドｐＡＡ３５２の構造を示す（図中で、ｔａｃは大腸菌から のハイブリッドｔｒｐ：：ｌａｃプロモーターであり；ｂｌａはβ−ラクタマー ゼ遺伝子（アンピシリン耐性）を示し；ｏｒｉは複製のＣｏｌＥ１ベースのプラ スミドオリジンであり；ｌｋｔＡはパスツレラ属のP．hamolytica ロイコトキシ ン構造遺伝子であり；ｌａｃ１は大腸菌ｌａｃオペロンリプレッサーである）。 ロイコトキシン遺伝子の転写／翻訳の方向を矢印で示す。各成分の大きさは一定 の比例で描かれてはいない。 図３−１〜３−９は、ロイコトキシン３５２（ＬＫＴ３５２）のヌクレオチド 配列及び予測アミノ酸配列を示す。ＬＫＴ３５２に関する構造遺伝子及び側面に 位置するベクター領域の配列を示す。 図４は、ロイコトキシン−ＧｎＲＨ（ＬＫＴ−ＧｎＲＨ）遺伝子融合を有する プラスミドｐＣＢ１１３の構造を示す。 図５−１〜５−８は、ｐＣＢ１１３からのＬＫＴ−ＧｎＲＨキメラタンパク質 のヌクレオチド配列及び予測アミノ酸配列を示す。ｐＣＢ１１２からのＬＫＴ− ＧｎＲＨキメラタンパク質のヌクレオチド配列及び予測アミノ酸配列は、ｐＣＢ １１３からのキメラタンパク質の配列と同一であるが、但し図４に関して上記し たように、多重コピーＧｎＲＨに関する配列が２回挿入されていた。 図６は、ロイコトキシン−ＧｎＲＨ（ＬＫＴ−ＧｎＲＨ）遺伝子融合を有する プラスミドｐＣＢ１１１の構造を示す。 図７−１〜７−５は、ｐＣＢ１１１からのＬＫＴ−ＧｎＲＨキメラタンパク質 のヌクレオチド配列及び予測アミノ酸配列を示す。ｐＣＢ１１４からのＬＫＴ− ＧｎＲＨキメラタンパク質のヌクレオチド配列及び予測アミノ酸配列は、ｐＣＢ １１１からのキメラタンパク質の配列と同一であるが、但し図６に関して上記し たように、多重コピーＧｎＲＨに関する配列が２回挿入されていた。 図８は、プラスミドｐＣＢ１１１の切断ロイコトキシン遺伝子の盲端融合点（ 図８−２）を示すが、この場合、制限酵素ＢｓｔＢ１及びＮａｅ１で消化して内 部ＤＮＡ断片（長さ約1300bp）をＬＫＴ３５２から除去した（図８−１）。 詳細な説明 本発明の実施には、別記しないかぎり、当業界で公知の分子生物学、微生物学 、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の慣用的技法を用いる。このような 技法は、文献に詳細に説明されている（例えば、Sambrook，Fritsch & Maniatis ，Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning，Vols．I and II(D. N．Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis(M.J．Gait ed.); Nucleic Acid H ybridization(B.D．Hames & S．J．Higgins eds.); Animal Cell Culture(R.K． Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes(IRL press); B．Perbal，A Pr actical Guide to Molecular Cloning; the series，Methods In Enzymology(S ．Colowick and N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.);及びHandbook of Expe rimental Immunology，Vols．I-IV(D.M．Weir and C.C．Blackwell eds.，Black well Scientific Publications)参照）。 Ａ．定義 本発明を説明するに際しては、以下の用語を用い、下記のように 定義されるものとする。 「ゴナドトロピン放出ホルモン」又は「ＧｎＲＨ」という用語は、脊椎動物に おける黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を制御 する視床下部により分泌されるデカペプチドを指す（Fink，G.，British Medica l Bulletin(1979)35:155-160）。ＧｎＲＨのアミノ酸配列は脊椎動物、特に哺乳 類では高度に保存される。これに関しては、ヒト、ウシ、ブタ及びヒツジＧｎＲ Ｈ（以前はＬＨＲＨと呼ばれていた）を含めた大半の哺乳類由来のＧｎＲＨはア ミノ酸配列ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有する（Murad et al.，Hormones and Hormone Antagonists, in The Pharmacological Basis of Therapeutics，Sixth Edition (1980)及びSeeburg et al.，Nature（1984）311:666-668）。 本明細書中で用いる場合、「ＧｎＲＨポリペプチド」は、本来のＧｎＲＨ配列 由来の分子、並びに組換えにより産生された又は化学的に合成された本来のＧｎ ＲＨと実質的に相同のアミノ酸配列を有し、下記のように依然として免疫原性で あるＧｎＲＨポリペプチドを含む。したがって、本用語は、ペプチドの内部にあ るいはアミノ又はカルボキシ末端に生じるあらゆる単一又は多重のアミノ酸の付 加、置換及び／又は欠失を含めたＧｎＲＨの誘導体及び類似体を包含する。した がって、本発明の下では、「ＧｎＲＨポリペプチド」は、本来の分子、図１Ａに 示したような分子（ピロＧｌｕ残基よりむしろＮ−末端Ｇｌｕ残基を有する）、 及び他のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失を有し、天然ＧｎＲＨと交差反応す る交代の形成を引き出す能力を保有する分子を含む。特に本明細書中で意図され るのは、図１Ｂに示したオリゴマーの場合のようなＧｎＲＨポリペプチドの反復 配列である（この場合、選択されたＧｎＲＨポリペプ チドの各々はＮ−末端Ｇｌｎ置換を包含し、さらに他のＧｎＲＨポリペプチドは すべて位置２にＡｓｐ残基置換を包含する）。さらにＧｎＲＨのエピトープは限 定により捕捉される。 「エピトープ」とは、特異的抗体分子が結合する抗原又はハプテン上の部位を 指す。ＧｎＲＨは非常に小さい分子であるため、抗体反応を引出し得るそのエピ トープの同定は、当業界で公知の技法を用いて容易に達成される（例えば、Geys en et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1984)81:3998-4002（既定の抗原の免 疫原性エピトープの位置を確定するためにペプチドを迅速に合成する一般的方法 ）；米国特許第4,708,871 号（抗原のエピトープを同定し、化学合成するための 手法）；及びGeysen et al.，Molecular Immunology(1986)23:709-715（既定抗 原に対して高親和性を有するペプチドを同定する技法）参照）。 本明細書中で用いる場合、「Ｔ細胞エピトープ」とは、ペプチド構造又は関連 ハプテンに対するＴ細胞性を誘導し得るペプチド構造の特徴を指す。これに関し ては、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ分子のペプチド結合裂溝内の延長配座と考え られる直鎖ペプチド決定基を包含する、と当業界では受け取られている（Unanue et al.，Science(1987)236:551-557）。ポリペプチドのＭＨＣクラスＩＩ関連 直鎖ペプチド決定基（一般に長さ5 〜14アミノ酸）への変換は、「抗原プロセッ シング」と呼ばれ、抗原呈示細胞（ＡＰＣ）により実行される。さらに、Ｔ細胞 エピトープは、短ペプチド構造の局部的特徴、例えば電荷及び疎水性を含めた一 次アミノ酸配列特性により、並びに全ポリペプチドの折り畳みに依らないある型 の二次構造、例えば螺旋性により定義される。 さらに、ヘルパーＴ細胞による認識が可能な短ペプチドは一般に、疎水性側（ ＭＨＣ分子との相互作用のための）と親水性側（Ｔ細 胞受容体と相互作用するための）を包含する両性構造であり（Margalit et al. ，Computer Prediction of T-cell Epitopes，New Generation Vaccines Marcel -Dekker，Inc.，ed．G.C．Woodrow et al.,(1990)pp.109-116）、さらに両性構 造はα−螺旋形状を有する（例えば、Spouge et al.，J．Immunol.(1986)136:24 98-2503 参照）と考えられる。 したがって、Ｔ細胞エピトープを含めたタンパク質のセグメントは、多数のコ ンピュータープログラムを用いて容易に予測し得る（例えば、Margalit et al. ，Computer Prediction of T-cell Epitopes，New Generation Vaccines Marcel -Dekker，Inc.，ed．G.C．Woodrow et al.,(1990)pp.109-116参照）。このよう なプログラムは一般に、ペプチドのアミノ酸配列をＴ細胞反応を誘導することが 公知の配列と比較し、Ｔ細胞エピトープに必要であると考えられるアミノ酸のパ ターンを探索する。 「免疫原性タンパク質」又は「免疫原性アミノ酸配列」は、それぞれ、それを 投与された対象において免疫学的反応を引き出すタンパク質又はアミノ酸配列で ある。本発明の下では、「ＧｎＲＨ免疫原」とは、宿主対象に導入した場合に、 免疫反応を刺激するＧｎＲＨ分子を示す。これに関しては、ＧｎＲＨ免疫原は、 １以上の選択されたＧｎＲＨポリペプチド配列に対応する多量体、特に選択Ｇｎ ＲＨポリペプチド配列の多重又はタンデム反復、選択されたＧｎＲＨエピトープ の多重又はタンデム反復を有する多量体、あるいはあらゆる考え得るその組合せ を含む。 抗原又はワクチンに対する「免疫学的反応」とは、当該組成物又はワクチンに 対する細胞性及び／又は抗体介在性免疫反応の宿主における発現である。通常、 このような反応としては、１つ又はそれ以上の下記の作用；抗原あるいは当該組 成物又はワクチンに含まれ る抗原に特異的に向けられる抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細 胞及び／又は細胞毒性Ｔ細胞及び／又はγδＴ細胞の産生が挙げられるが、これ らに限定されない。免疫学的反応は、当業界で公知のいくつかのイムノアッセイ のいずれかを用いて検出し得る。 「ロイコトキシンポリペプチド」又は「ＬＫＴポリペプチド」とは、少なくと も１つのＴ細胞エピトープを含み、カルボキシ末端共感性アミノ酸配列Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ａｓｐ（Highlander et al.，DNA(1989)8:15-28）（ 式中、ＸはＬｙｓ、Ａｓｐ、Ｖａｌ又はＡｓｎである）を特徴とする分子の一族 に属するタンパク質に由来するポリペプチドを意図する。このようなタンパク質 としては、特に、パスツレラ属のPasteurella haemolytica 及びアクチノバチ ルス属の Actinobacillus pleuropneumoniae由来のロイコトキシン、並びに大腸 菌α溶血素（Strathdee et al.，Infect．Immun.（1987）55:3233-3236; Lo，Ca n．J．Vet．Res．(1990)54:S33-S35; Welch，Mol．Microbiol．(1991)5:521-528 ）が挙げられる。この族の毒素は、「ＲＴＸ」族の毒素として公知である（Lo， Can．J．Vet．Res．(1990)54:S33-S35）。さらに、「ロイコトキシンポリペプチ ド」とは、化学的に合成された、それを発現する生物から分離された、又は組換 え的に産生されたロイコトキシンポリペプチドを指す。さらに本用語は、特定の 本来のロイコトキシン分子中に認められる連続したアミノ酸配列と実質的に相同 のアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質を意図する。したがって、本用語は 、全長及び部分配列、並びに類似体を含む。本来の全長ロイコトキシンは白血球 毒性活性を示すが、しかし「ロイコトキシン」という用語はさらに、本来の炉と の細胞毒性特徴を欠いてもなお免疫原性を有する分子を意図する。いくつかのロ イコトキシンに関する分子 配列及び対応するアミノ酸配列が公知である（例えば、米国特許第4,957,739 号 及び第5,055,400 号；Lo et al.，Infect．Immun.(1985)50:667-67; Lo et al. ，Infect．Immun.(1987)55:1987-1996;Strathdee et al.，Infect．Immun.（198 7）55:3233-3236; Highlander et al.，DNA(1989)8:15-28; Welch，Mol．Microb iol．(1991)5:521-528 参照）。本発明により産生されるキメラにおいては、選 択されたロイコトキシンポリペプチド配列は、特にＴヘルパー細胞に対する呈示 及びその活性化のためにＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成し得る長さ5 〜14 の範囲のアミノ酸の小ペプチドセグメントを包含するＴ細胞エピトープを提供す ることにより、融合ＧｎＲＨ多量体に免疫原性増強を付与する。下記でさらに考 察するように、これらのＴ細胞エピトープはロイコトキシン分子全体に生じ、ロ イコトキシンのＮ末端部分、即ちアミノ酸残基１〜１９９に濃縮されると考えら れる。 本明細書中で用いる場合、「白血球毒性活性を欠いた」ロイコトキシンポリペ プチドとは、本来の全長ロイコトキシン（例えば米国特許第5,055,400 号及び第 4,957,739 号に記載の全長パスツレラ属Pasteurella haemolyticaロイコトキシ ン）と比較した場合に有意の細胞毒性を欠いているが、依然として免疫原性及び 少なくとも１つのＴ細胞エピトープを保有する上記のロイコトキシンペプチドを 指す。ロイコトキシンポリペプチドは、Korzeniewski et al.，Journal of Immu nological Methods 64:313-320に記載のラクテートデヒドロゲナーゼ放出検定の ようないくつかの公知の検定のいずれかを用いて、白血球毒性活性に関して試験 し得るが、この場合、ウシ好中球からのラクテートデヒドロゲナーゼの放出によ り、細胞毒性を測定する。分子は、対照非白血球毒性分子と比較した場合に、統 計学的に有意のラクテートデヒドロゲナーゼ放出を引き起こせば、 白血球毒性と同定される。 本発明下では、白血球毒性活性を欠いたロイコトキシンポリペプチドを包含す るＬＫＴ−ＧｎＲＨキメラの構築は、いくつかの重要な利点を提供する。先ず、 被験者への活性毒素の注入が限局性細胞死（ＰＭＮ及びマクロファージ）を引き 起こし、次いで感染部位の重度の炎症反応及び膿瘍を引き起こし得るため、白血 球毒性活性を欠いたロイコトキシンポリペプチドは望ましい。これに関しては、 マクロファージ殺しを引き起こす白血球毒性活性は、抗原呈示を低減させ、した がって最適以下の免疫反応を起こし得る。本発明の融合タンパク質の産生に用い た非白血球毒性ＬＫＴポリペプチド中に認められたような細胞毒性部分を除去す ると、全長ＬＫＴより高レベルで発現され得る切断ＬＫＴ遺伝子を生じる。さら に、十分なＴ細胞抗原性を保有する本発明の下で構築される融合体に非白血球毒 性ＬＫＴポリペプチドを使用すると、選択されたＧｎＲＨポリペプチドに対して 十分なＢ細胞を産生するために宿主対象に投与する必要があるロイコトキシン− ＧｎＲＨ抗原の全体量が低減される。白血球毒性活性を欠いた免疫原性白血球毒 性ポリペプチドの特定の例としては、下記に詳述するようなＬＫＴ３５２及びＬ ＫＴ１１１が挙げられる。 「ＬＫＴ３５２」とは、プラスミドｐＡＡ３５２（図２。ＡＴＣＣ寄託番号 6 8283）中に存在する１ｋｔＡ遺伝子由来のタンパク質を意味する。この遺伝子の ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は、国際出願WO 91/15237 に記載さ れ、図３に示される。この遺伝子は、９３１個のアミノ酸を有し、概算分子量約 99 kDaの切断ロイコトキシンをコードし、この分子の細胞毒性部分を欠いている 。したがって、産生された切断遺伝子は、全長分子よりはるかに高レベルで発現 され（総細胞タンパク質の40％以上。これに対して全 長形態では総細胞タンパク質の１％未満）、容易に精製される。本発明下では、 得られるＬＫＴ３５２は、必ずしもプラスミドｐＡＡ３５２中に存在する配列か ら物理的に得られるわけではない。むしろ、それは、例えば化学的合成又は組換 え体産生を含めたあらゆる方法で生成され得る。さらに、本タンパク質のアミノ 酸配列は、図示した配列と実質的に相同であることだけが必要である。したがっ て、ＬＫＴポリペプチドが、それが関連する抗原の免疫原性を増強するよう機能 し、しかも依然として白血球毒性活性を欠くかぎり、配列変異が存在し得る。 「ＬＫＴ１１１」とは、プラスミドｐＣＢ１１１（図６。ＡＴＣＣ寄託番号 6 9748）中に存在する遺伝子由来のロイコトキシンポリペプチドを意味する。この 遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は、図７に示される。この 遺伝子は、長さ約1300bpの内部ＤＮＡ断片の除去により、プラスミドｐＡＡ３５ ２（図２。ＡＴＣＣ寄託番号 68283）中に存在する組換え体ロイコトキシン遺伝 子から発現されたロイコトキシンの短縮バージョンをコードする。ＬＫＴ１１１ ポリペプチドは概算分子量 52 kDa（ＬＫＴ３５２ポリペプチドは99 kDa）であ るが、十分なＴ細胞免疫原性に必要なＴ細胞エピトープを含有するＬＫＴ３５２ からのＮ末端の部分、及び本発明の融合タンパク質の産生に用いるのに便利な制 限部位を含有するＬＫＴ３５２からのＣ末端からの部分を保有する。本発明下で は、ＬＫＴ１１１ロイコトキシンペプチドは、必ずしもプラスミドｐＣＢ１１１ 中に存在する配列から物理的に得られるわけではない。むしろ、それは、例えば 化学的合成又は組換え体産生を含めたあらゆる方法で生成され得る。さらに、本 タンパク質のアミノ酸配列は、図示した配列と実質的に相同であることだけが必 要である。したがって、ＬＫＴポリペプチドがそれが関連する抗原の免疫原性を 増強するよう機能し、且つ白血球毒性活性を欠いているかぎり、配列変異が存在 し得る。 ロイコトキシン−ＧｎＲＨポリペプチドキメラは、対応するＧｎＲＨ多量体単 独より大きな免疫反応を引き出す能力を有する場合には、「免疫原性増大」を示 す。このような免疫原性増大は、特定のロイコトキシン−ＧｎＲＨポリペプチド 及びＧｎＲＨ多量体対照ヲ動物に投与して、２つに対する抗体力価を、当業界で 公知の、例えばラジオイムノアッセイ及びＥＬＩＳＡといった標準検定を用いて 比較することにより、確定し得る。 「組換え体」タンパク質又はポリペプチドとは、組換えＤＮＡ法により産生さ れる、即ち所望のポリペプチドをコードする外生的ＤＮＡ構築物により形質転換 された細胞から産生されるポリペプチドを指す。「合成」タンパク質又はポリペ プチドとは、化学合成により調製されたものである。 ＤＮＡ「コード配列」又は特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列 」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、in vivo 又はin vitroで転 写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５ ’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終結コドンに より確定される。コード配列としては、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからの ｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ、並びに合成Ｄ ＮＡ配列も挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常コード 配列に対して３’方向に位置する。 ＤＮＡ「制御配列」とは、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位 、ポリアデニール化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサー 等を指しており、集合的に、宿主細胞におけるコード配列の転写及び翻訳を提供 する。 コード配列は、ポリメラーゼがｍＲＮＡに２つのコード配列を転写する場合、 別のコード配列に「操作可能的に連結」され、次いでこれは２つのコード配列に よりコードされるキメラポリペプチドに翻訳される。コード配列は、転写された 配列が最後にはプロセッシングされて所望のキメラタンパク質を産生しさえすれ ば、互いに連続している必要はない。制御配列は、それがコード配列の転写を制 御する場合は、コード配列に「操作可能的に連結され」る。 制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合してコード配列を ｍＲＮＡに転写し、次いでこれがコード配列にコードされたポリペプチドに翻訳 される場合に、細胞中のコード配列の「転写を指示する」。 「宿主細胞」は、外生的ＤＮＡ配列により形質転換された、又は形質転換され 得る細胞である。 細胞は、外生的ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、このような外生的Ｄ ＮＡにより「形質転換」される。外生的ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色 体ＤＮＡと一体化する（共有結合）こともある。例えば、原核生物及び酵母菌に おいては、外生的ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム的素子に保持される。 真核細胞に関しては、安定した形質転換細胞は、染色体複製を通じてそれが娘細 胞に継承されるように、外生的ＤＮＡが染色体と一体化したものである。この安 定性は、外生的ＤＮＡを含有する娘細胞集団から成る細胞株又はクローンを確立 する真核細胞の能力により実証される。 少なくとも約80％（好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも 約95％）のヌクレオチド又はアミノ酸が限定長の分子と整合する場合、２つのＤ ＮＡ又はポリペプチド配列は「実質的に相同」である。実質的に相同であるＤＮ Ａ配列は、例えば、特定の系に関して限定されるような、厳しい条件下でのサザ ーンハイブリ ダイゼーション実験で確認し得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は 、当業界で公知である（例えば、Sambrook et al.,上記；DNA Cloning，Vols I & II，上記；Nucleic Acid Hybridization，上記。参照）。 ＤＮＡ構築物の「非対応」領域は、天然では他の分子に関連して認められない 別のＤＮＡ分子内の又はそれに付着したＤＮＡの同定可能なセグメントである。 したがって、非対応領域が細菌遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常は、 供給源細菌のゲノム中の細菌遺伝子とは側面を接しないＤＮＡにより側面を接し て位置される。非対応コード配列の別の例は、コード配列それ自体が天然には見 出されない（例えば本来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物で ある。対立変異又は天然突然変異が、本明細書に用いたようなＤＮＡの非対応領 域を生じるわけではない。 「脊椎動物対象」とは、脊椎動物亜門のあらゆる成員を意味し、その例として は哺乳類、例えば齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ及びヒト；イヌ及び ネコのようなペット；ペット鳥、野性の鳥及び狩猟鳥を含めた鳥、例えばニワト リ、七面鳥、その他の家禽の雄鳥及び雌鳥が挙げられるが、これらに限定されな い。本用語は、特定の年齢を指示しない。したがって、成体も新生児も含めるも のとする。 Ｂ．一般的方法 本発明の中心は、ロイコトキシンポリペプチドは、選択されたＧｎＲＨポリペ プチド反復体（又は多量体）と結合した場合、関連のＧｎＲＨ部分に優れた免疫 原性を付与し得るという発見である。これに関しては、ロイコトキシンポリペプ チドは、高度免疫原性形態で対象の免疫系に選択されたＧｎＲＨ多量体を呈示す る担体タンパク質として作用する。したがって、本発明下で構築されるキメラタ ンパク質を、それにより呈示されるＧｎＲＨポリペプチドに免疫原性増強を提供 するワクチン組成物中に処方し得る。ロイコトキシン遺伝子と選択ＧｎＲＨポリ ペプチドとの融合は、それを発現する細胞からのキメラタンパク質の精製を容易 にする。 したがって、１つ以上のＧｎＲＨペプチド配列と融合したロイコトキシンを含 むロイコトキシンキメラを本明細書中で例示する。特に、本発明の意図する実施 態様としては、ＧｎＲＨ多量体と融合したロイコトキシンポリペプチドを包含す るキメラが挙げられるが、この場合、上記の多量体は本質的には、少なくとも１ つの反復ＧｎＲＨデカペプチド配列、又は選択されるＧｎＲＨ分子の少なくとも １つのエピトープに対応する配列の少なくとも１つの反復単位から成る。さらに 、選択されるＧｎＲＨペプチド配列は、すべて同一であるか、あるいは免疫反応 を引き出す能力を有していさえすれば、ＧｎＲＨの異なる誘導体、類似体、変異 体又はエピトープに対応し得る。ＧｎＲＨデカペプチドの代表的ヌクレオチド配 列を図１Ａに示す。本発明のＧｎＲＨは、本来の配列中に認められるピログルタ ミン酸に代えて、Ｎ末端でのグルタミン残基の置換により修飾される。この特定 の置換は、本来のグルタミン酸構造を有するが、ピログルタミン酸塩の不変の構 造も保存する分子にする。したがって、その結果生じるペプチドはグルタミン酸 残基の環化を必要とせず、環化を実行するのに必要な条件の非存在下で産生され る。 ＧｎＲＨ配列は相対的に短いため、下記に詳述するような合成法を用いて容易 にそれを生成し得る。本発明下では、脊椎動物における内生的ＧｎＲＨに対する 適切な免疫反応を引き出し易くするために、ロイコトキシンポリペプチド配列を 用いて、関連するＧｎＲＨポリペプチドに免疫原性を付与する（担体タンパク質 として）。この方法で、ＧｎＲＨによる免疫感作は、発情周期又は精子形成の崩 壊によりワクチン接種対象における受精能を調節し得る。ＧｎＲＨの詳細な考察 は、米国特許第4,975,420 号に示されている。 さらに、本明細書中で特に意図したことは、家畜及び飼育動物管理において広 く実行されている侵襲性不妊法、例えば外科的去勢術、外科的卵巣子宮摘出術等 に代わる信頼できる且つ有効な方法を提供することである。本発明により構築さ れたロイコトキシン−ＧｎＲＨキメラを用いた脊椎動物対象における生殖活性の 免疫抑制は、本構築物が免疫化動物における生殖活性の均一な不活性化をもたら す有効な代替物を提供する。これに関しては、適切な不妊ワクチン製品は、外科 的手法にうまく代わるものを提供するために、最小限のワクチン接種によって個 々の動物の生殖能力を均一に不活性化するのに役立つに違いない。この特徴は群 れ動物の免疫感作に特に重要であって、特にこの場合、雄仔ブタを免疫去勢して 、雄仔ブタの正常に機能中の精巣中での性ステロイドの合成により生じる「去勢 しない雄ブタの弊害」を防止するのが望ましい（例えば、Meloen et al.，Vacci ne(1994)12(8):741-746 参照）。このような物質を開発するに際しての従来の試 みは、ＧｎＲＨペプチド及び／又は関連の担体系の免疫原性が不十分であったた めに、均一な結果が得られず、その結果、種々の従来のＧｎＲＨベースのワクチ ンは内生的ＧｎＲＨに対する十分な免疫反応を誘導することができなかった。 したがって、より高い免疫原性ＧｎＲＨペプチド抗原にするために、本明細書 で意図するロイコトキシン−ＧｎＲＨポリペプチドキメラは、１つ以上の選択さ れるＧｎＲＨポリペプチド配列に対応するＧｎＲＨ部分を包含する。この特徴は 、上記に詳述したように、内生的タンパク質は概して、それらのエピトープの多 量体化により有効な自己抗原たらしめるという認識に基づいている。さらに、本 明細書で意図する新規のキメラのＧｎＲＨ部分は、選択されたＧｎ ＲＨ配列の多重又はタンデム反復、選択されたＧｎＲＨエピトープの多重又はタ ンデム反復、あるいはその考え得るあらゆる組合せを包含し得る。これに関して は、上で詳述した技法を用いてＧｎＲＨエピトープを確認し得るし、あるいは全 ポリペプチドの代わりに組成物中に用いる免疫原性及び活性断片に関してＧｎＲ Ｈタンパク質の断片を試験し得る。本発明下で特に意図したＧｎＲＨ部分の配列 を図１Ｂに示す。この場合、それぞれ（１）、（２）、（３）及び（４）に示し た４つのＧｎＲＨ配列は、セリン及びグリシン残基の種々の組合せから成るトリ プレットアミノ酸スペーサー配列により分離される。本発明のオリゴマーにおい ては、他の全てのＧｎＲＨ配列（それぞれ（２）及び（４）で示したもの）が、 本来のＧｎＲＨ配列に認められるＨｉｓ残基の代わりにＡｓｐ残基を包含するＧ ｎＲＨデカペプチドの第二部分での非保存性アミノ酸置換を含有する。このよう にして生成された代替的ＧｎＲＨ多量体配列は、本発明の融合タンパク質中に用 いるための高度免疫原性ＧｎＲＨ抗原ペプチドたりうる。あらゆる単一又は多重 アミノ酸付加、置換及び／又は欠失に対応するその他のＧｎＲＨ類似体がさらに 、反復又は代替的多量体配列に用いるために、本明細書中で特に意図される。 さらに、図１Ｂに示した特定のＧｎＲＨ部分は、ＧｎＲＨ部分の間のスペーサ ー配列を含有する。本発明は、本発明の構築物に免疫原性増大を付与するために 、選択されたＧｎＲＨポリペプチド間の種々のスペーサー配列の戦略的使用を特 に意図する。したがって、本発明下では、選択されるスペーサー配列は１又はそ れ以上のアミノ酸長の広範な部分をコードし得る。選択されるスペーサー群は、 好ましくは、発現キメラがin vivo でタンパク質分解酵素により（ＡＰＣ等によ り）プロセッシングされて多数のペプチド−これらの各々は少なくとも１つの担 体部分（ロイコトキシン部分）由来の細 胞エピトープを含有する−を産生し、好ましくは実質的に完全なＧｎＲＨポリペ プチド配列に融合される。さらに、スペーサー群は、選択されたＧｎＲＨ部分間 の接合領域が免疫化対象に対して明白な外来配列を包含し、それにより関連Ｇｎ ＲＨペプチドに免疫原性増強を付与するように構築される。さらに、スペーサー 配列は、当業界で免疫原性ヘルパーＴ細胞エピトープを提供すると一般に見なさ れている両性及び／又はα螺旋ペプチド配列をコードする配列のように、Ｔ細胞 抗原性を提供するように構築される。これに関しては、このようなスペーサー配 列により提供される特定のＴ細胞エピトープの選択は、ワクチン接種される特定 の脊椎動物種に依って変化し得る。スペーサー配列を含む特定のＧｎＲＨ部分が 例示されるが、直接的に隣接するＧｎＲＨ配列（スペーサー配列の介在なしに） を包含するＧｎＲＨ多量体を提供することも本明細書では意図される。 ロイコトキシン−ＧｎＲＨポリペプチド複合体は、キメラタンパク質として組 換えにより産生するのが便利である。キメラのＧｎＲＨ部分は、本分子のロイコ トキシン部分に対して５’又は３’に融合し得るし、あるいはＧｎＲＨ部分をロ イコトキシン分子の内部の部位に位置させ得る。全長パスツレラ属 Pasteurell a haemolytica Ａ１ロイコトキシンをコードするヌクレオチド配列が確定され ている（例えば、Lo，Infect．Immun.（1987）55:1987-1996; 米国特許第5,055, 400 号参照）。さらに、いくつかの変異体ロイコトキシン遺伝子配列が、本明細 書中に開示される。 同様に、ブタ、ウシ及びヒツジＧｎＲＨに関するコード配列が確定されており （Murad et al.，Hormones and Hormone Antagonists，in The Pharmacological Basis of Therapeutics，Sixth Edition(1980)）、ヒトＧｎＲＨに関するｃＤ ＮＡがクローニングされ、 その配列が十分確定されている（Seeburg et al.，Nature（1984）311:666-668 ）。公知の配列を有するさらに別のＧｎＲＨポリペプチド、例えばサケ及びニワ トリのＧｎＲＨ分子が開示されている（国際出願 WO 86/07383 （1986年12月18 日公布））。これに関しては、脊椎動物、特に哺乳類では、ＧｎＲＨが高度に保 存される；さらにブタ、ウシ、ヒツジ及びヒトＧｎＲＨ配列は互いに同一である 、ということは注目すべきである。当業界で一般に公知の組換え技術を用いて、 所望のロイコトキシン及びＧｎＲＨ遺伝子をクローニングし、単離して、一緒に 結紮し得る（例えば、Sambrook et al.,上記参照）。 あるいは、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローニングよりむ しろ合成により調製し得る。特定アミノ酸配列に対する適切なコドンを有するＤ ＮＡ配列を設計し得る。概して、発現のために配列を用いる場合には、意図され る宿主に対する好ましいコドンを選択する。完全配列は、標準法により調製した 重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全コドン配列に組み立てら れる（例えば、Edge，Nature(1981)292:756; Nambair et al.，Science(1984)22 3:1299; Jay et al.，J．Biol．Chem．(1984)259:6311 参照）。 キメラタンパク質に関するコード配列が調製又は単離されれば、あらゆる適切 なベクター又はレプリコン中にそれらをクローニングし得る。多数のクローニン グベクターが当業者には公知であって、適切なクローニングベクターの選択はも ちろんのことである。クローニングの溜の組換え体ＤＮＡベクター及びそれらが 形質転換し得る宿主細胞の例としては、バクテリオファージラムダ（大腸菌）、 ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム 陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡ ＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非大腸菌−グラム陰性菌）、ｐＨＶ１ ４（大腸菌及び枯草菌 Bacillus subtilis）、ｐＢＤ９（バチルス属）、ｐＩＪ ６１（ストレプトミセス属）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス属）、ＹＩｐ５（サ ッカロミセス属）、ＹＣｐ１９（サッカロミセス属）及びウシ乳頭腫ウイルス（ 哺乳類細胞）が挙げられる（一般に、DNA Cloning: Vols．I & II 上記；T．Man iatis et al.，上記； B．Perbal 上記参照）。 融合遺伝子は、この発現遺伝子構築物を含有するベクターにより形質転換され る宿主細胞内のＲＮＡにキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を転写させる ために、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）、及び任意にオペレ ーター（集合的に、本明細書中では「制御」素子と呼ぶ）の制御下に置かれる。 コード配列は、シグナルペプチド又はリーダー配列を含有することもある。本発 明のキメラタンパク質は、例えば本来のパスツレラ属 Pasteurella haemolyti ca プロモーター、大腸菌ｔａｃプロモーター又はプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ ）プロモーター及びシグナル配列を用いて発現される。リーダー配列は、翻訳後 プロセッシングで細菌宿主により除去される（例えば、米国特許第4,431,739 号 、第4,425,437 号、第4,338,397 号参照）。 制御配列の他に、宿主細胞の成長に比例してタンパク質配列の発現の調節を考 慮に入れる調節配列を付加するのが望ましい。調節配列は当業者には公知であっ て、その例としては、調節化合物の存在を含めて、化学的又は物理的刺激に反応 して遺伝子の発現を点滅させるものが挙げられる。他の種類の調節素子、例えば エンハンサー配列もベクター中に存在し得る。 発現ベクターは、特定の融合コード配列が適切な調節配列とともにベクター中 に位置するよう構築され、制御配列に関するコード配 列の位置調節及び配向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写される（即 ち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写す る）ような位置及び配向である。当該の特定のキメラタンパク質をコードする配 列の修飾は、この末端で成し遂げるのが望ましい。例えば、いくつかの場合には 、それが適切な配向で制御配列に付着されるように修飾する、即ち読取り枠を保 持する必要がある。制御配列及びその他の調節配列をコード配列と結紮した後、 ベクター、例えば上記のクローニングベクター中に挿入し得る。あるいは、既に 制御配列及び適切な制限部位を含有する発現ベクター中に直接、コード配列をク ローニングし得る。 いくつかの場合には、宿主生物からポリペプチドの分泌を引き起こす配列を付 加し、その後分泌シグナルを切断するのが望ましい。さらに、当該キメラタンパ ク質の突然変異体又は類似体を産生するのも望ましい。突然変異体又は類似体は 、タンパク質をコードする配列の一部分を欠失させることにより、配列を挿入す ることにより、及び／又は配列内の１つ又はそれ以上のヌクレオチトの置換によ り、調製し得る。ヌクレオチド配列の修飾方法、例えば特定部位の突然変異誘発 は、当業者には十分公知である（例えば、T．Maniatis et al.，上記；DNA Clon ging，Vols．I & II，上記；Nucleic Acid Hybridization，上記参照）。 多数の原核生物発現ベクターが、当業界で公知である（例えば、米国特許第4, 440,859 号、第4,436,815 号、第4,431,740 号、第4,431,739 号、第4,428,941 号、第4,425,437 号、第4,418,149 号、第4,411,994 号、第4,366,246 号、第4, 342,832 号；及び英国特許出願ＧＢ2,121,054、ＧＢ2,008,123、ＧＢ2,007,675 ；並びに欧州特許出願第103,395 号参照）。酵母菌発現ベクターも、当業界で公 知である（例えば、米国特許第4,446,235 号、第4,443,539号、 第4,430,428号；欧州特許出願第103,409号、第100,561号、第96,491号参照）。 選択される発現系及び宿主によって、本発明のタンパク質は、当該タンパク質 が発現される条件下で上記の発現ベクターにより形質転換された増殖中の宿主細 胞により産生される。次に、キメラタンパク質を宿主細胞から単離し、精製する 。発現系が増殖培地中にタンパク質を分泌する場合には、培地から直接タンパク 質を精製し得る。タンパク質が分泌されない場合は、細胞溶解物から単離する。 適切な増殖条件及び回収方法の選択も、当業界では公知である。 本発明のキメラタンパク質は、化学合成、例えば確定されたアミノ酸配列を基 礎にした固相ペプチド合成によっても産生し得る。このような方法は、当業者に は公知である（例えば、J．M．Stewart and J.D．Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984)；及びG．Bara y and R.B．Merrifield，The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology，edito rs E.Gross and J．Meienhofer，Vol．2，Academic Press，New York,(1980)pp. 3-254,for solid phase peptide synthesis techniques；及び M．Bodansky，Pr inciples of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin(1984); 及び E．Gr oss and J．Meinhofer，Eds.，The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology 上記 Vol.1，for classical solution synthesis参照）。 本発明により構築したキメラタンパク質を含むワクチン組成物の投与により、 上記タンパク質で対象を免疫化し得る。免疫感作前に、特定のキメラタンパク質 の免疫原性をさらに増大するのが望ましい。これは、当業者に公知のいくつかの 方法のいすれかで成し遂げ得る。例えば、二次担体と結合させたロイコトキシン −ＧｎＲＨポリペプチド融合タンパク質を投与し得る。適切な担体は、典型的に は、大型で、徐々に代謝される高分子、例えばタンパク質；多糖類、例えばセフ ァロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ等；高分子量アミノ酸、 例えばポリグルタミン酸、ポリリシン等；アミノ酸コポリマー；及び不活性ウイ ルス粒子である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、笠貝類ヘモシ アニン、イムノグロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、並びに当業 者には十分公知のその他のタンパク質である。 タンパク質基質は本来の形態で用い得るし、あるいはそれらの官能基含有物を 、例えばリシン残基のスクシニル化により、又はＣｙｓ−チオラクトンとの反応 により修飾し得る。スルフヒドリル基を、例えばアミノ官能基を２−イミノチオ ランと又は３−（４−ジチオピリジル）プロピオネートのＮ−ヒドロキシスクシ ンイミドと反応させて、担体（又は選択されたＧｎＲＨポリペプチド）中に取込 み得る。適切な担体を修飾して、ペプチドの付着のためのスペーサーアーム（例 えばヘキサメチレンジアミン又は同様のサイズのその他の二官能分子）を取込み 得る。 本発明のキメラタンパク質に適したその他の担体としては、米国特許第5,071, 651 号に開示されているようなロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、又はその機 能性断片が挙げられる。さらに有用なのは、ウイルスタンパク質とロイコトキシ ン−ＧｎＲＨ免疫原の融合物質である。この場合、融合物質は米国特許第4,722, 840 号に開示された方法により製造する。さらにその他の適切な担体としては、 この形態での呈示は対象における呈示の自然様式に似ていて、免疫化状態を生じ るため、リンパ球のような細胞が挙げられる。あるいは、本発明の融合タンパク 質を赤血球、好ましくは対象自身の赤血球と結合させる。ペプチドをタンパク質 又は細胞と結合させる方法は、当業者には公知である。 本発明の新規のキメラタンパク質は、それを発現する担体ウイルスを介して投 与し得る。本発明での使用が見いだされる担体ウイルスとしては、ワクシニア及 びその他のポックスウイルス、アデノウイスル及びヘルペスウイルスが挙げられ るが、これらに限定されない。実施例により、新規のキメラタンパク質を発現す るワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築し得る。特定のロイコトキ シン−ＧｎＲＨキメラタンパク質をコードするＤＮＡを、ワクシニアプロモータ ーに隣接し、ワクシニアＤＮＡ配列、例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコード する配列と側面を接するように、先ず適切なベクター中に挿入する。次にこのベ クターを用いて細胞をトランスフェクトし、同時にワクシニアに感染させる。相 同組換えはワクシニアプロモーター＋本発明のキメラタンパク質をコードする遺 伝子をウイルスゲノム中に挿入するのに役立つ。その結果生じたＴＫ−組換え体 を、５−ブロモでオキシウリジンの存在下で細胞を培養して、それに耐性のウイ ルスプラークを採集することにより、選択し得る。 さらに、単独投与で、又は製薬上許容可能なビヒクル又は賦形剤と混合して、 本発明により産生したキメラタンパク質で対象を免疫化することが可能である。 典型的には、注入可能な液体溶液又は懸濁液としてワクチンを調製し得る；液体 ビヒクル中に用いるのに適した固体形態を調製し、注入前に溶液又は懸濁液とし て投与してもよい。製剤は、乳濁しても、あるいはリポソームビヒクル中に活性 成分をカプセル封入してもよい。活性免疫原性成分は、しばしば、製薬上許容可 能な且つ活性成分と相溶性の賦形剤を含有するビヒクルと混合される。適切なビ ヒクルとしては、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー ル等、並びにその組合せが挙げられる。さらに、所望により、ビヒクルは少量の 補助物質、例 えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、あるいはワクチンの効率を増強するアジュバ ントを含有し得る。アジュバントとしては、例えばムラミルジペプチド、アブリ ジン、水酸化アルミニウム、油、サポニン、及び当業界で公知のその他の物質が 挙げられる。このような投与形態を調製する実際の方法は、当業者には公知であ るか、あるいは明らかになる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，Easton，Pensylvania，18th edition, 1990 参照） 。投与される処方物の組成は、いかなる場合にも、処置を受けている対象におけ る望ましい免疫化状態を達成するのに適した量のタンパク質を含有する。 その他の投与方式に適した別のワクチン処方物としては、座薬、そしていくつ かの場合には、エーロゾル、鼻腔内又は経口処方物、持続性放出性処方物が挙げ られる。座薬に関しては、ビヒクル組成物としては、伝統的結合剤及び担体、例 えばポリアルカリ性グリコール又はトリグリセリドがあげられる。このような座 薬は、約0.5％〜約10％（w/w）、好ましくは約 1％〜約 2％の範囲で活性成分を 含有する混合物から生成し得る。経口ビヒクルとしては、普通に用いられる賦形 剤、例えば製剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ ネシウム、ナトリウムサッカリンセルロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる 。これらの経口ワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続 性放出性処方物、又は粉末の形態で摂取され、約1 ％〜約30％、好ましくは約2 ％〜約20％の活性成分を含有する。 鼻腔内処方物は通常、鼻腔粘膜に刺激を引き起こさないか、又は粘膜毛様体機 能を有意に妨げないビヒクルを含む。希釈剤、例えば水、食塩水又はその他の公 知の物質は、本発明に用い得る。鼻腔内処方物はさらに、防腐剤、例えばクロロ ブタノール及び塩化ベンズ アルコニウムを含有し得るが、これらに限定されない。鼻粘膜による本発明のタ ンパク質の吸収を増強するために、界面活性剤を含入してもよい。 担体又はビヒクル、例えばリポソーム、非再吸収性不透過性ポリ ポリマー、膨張性ポリマー、例えばヒドロゲル、あるいは再吸収性ポリマー、、 例えばコラーゲン及びある種の多価酸又はポリエステル、例えば再吸収性縫合糸 を作るのに用いられるものの中に、キメラタンパク質を組入れることにより、制 御又は持続性放出性処方物を製造し得る。キメラタンパク質はさらに、当業界で 十分公知の埋込み式ミニポンプを用いて含入し得る。 さらに、キメラタンパク質（又はその複合体）は、中性又は塩形態でワクチン 組成物中に処方し得る。製薬上許容可能な塩としては、酸付加塩（活性ポリペプ チドの遊離アミノ基を用いて生成）が挙げられるが、これは無機酸、例えば塩酸 、リン酸を用いて、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等 を用いて生成される。遊離カルボキシル基から生成される塩は、無機塩基、例え ば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄、並びに 有機塩基例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタ ノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導し得る。 対象を免疫化するには、選択されたＧｎＲＨ−ロイコトキシンキメラを非経口 的に、通常は適切なビヒクル中での筋肉注射により、投与する。しかしながら、 その他の投与方式、例えば皮下注射、静脈注射、鼻腔内供給も許容可能である。 注射用ワクチン処方物は、ビヒクル中に有効量の活性成分を含有し、当業者には 正確な量は容易に確定される。活性成分は、典型的には組成物の約1 ％〜約95％ （w/w）で、適切な場合にはそれより高くても低くてもよい。投与される量は、 処置を受ける動物、抗体を合成する動物の免疫系の能力、所望の防御程度に依っ ている。 本発明のワクチン処方物に関しては、注射溶液 1 ml 当たり約1μg 〜1 mg、 一般的には5 μg 〜200 μg のＧｎＲＨポリペプチドが、投与した場合に免疫反 応を生じさせるのに適している。これに関しては、本発明のワクチン処方物のロ イコトキシン−ＧｎＲＨ抗原中のＧｎＲＨ対ロイコトキシンの比率は、その分子 を構築するのに選択された特定のロイコトキシン及びＧｎＲＨ部分に基づいて、 変化する。さらに、本発明下でワクチン処方物を製造するのに用いたロイコトキ シン−ＧｎＲＨポリペプチド中には、融合分子当たり約1 〜25％のＧｎＲＨ、好 ましくは約3 〜20％、さらに好ましくは約7 〜17％のＧｎＲＨポリペプチドが存 在する。ＬＫＴ−ＧｎＲＨ抗原中に存在するＧｎＲＨのパーセンテージを増大す ると、ＧｎＲＨに対する有効Ｂ細胞反応を引き出すために対象に投与しなければ ならない総抗原量は低減する。有効投与量は、反応曲線を確定するルーチン試験 により、当業者は容易に確定し得る。少なくとも１用量での、好ましくは２用量 での、特定のロイコトキシン−ＧｎＲＨポリペプチドの投与により、対象は免疫 化される。さらに、免疫状態を維持するのに必要な多数回用量で動物に投与し得 る。 以下に本発明を実施するための特定の実施態様の実施例を示す。実施例は本発 明を説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。 Ｃ．実験 材料及び方法 酵素は市販供給元から購入し、メーカーの指示に従って用いた。放射性ヌクレ オチド及びニトロセルロースフィルターも市販供給元 から購入した。 ＤＮＡ断片のクローニングに際しては、特に記載する場合を除いて、ＤＮＡ操 作はすべて、標準手法にしたがって行った（Sambrook et al., 上記参照）。制 限酵素、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ、大腸菌、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、 及びその他の生物学的試薬は市販供給元から購入し、メーカーの指示にしたがっ て用いた。二本鎖ＤＮＡ断片は、アガロースゲル上で分離した。 ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーは、それぞれｐＵＣ１３及びバクテリオファ ージラムダｇｔ１１で、標準技法により分離した（DNA Cloning: Vols．I & II, 上記 参照）。 肺炎性パスツレラ症により死亡した仔ウシの肺からパスツレラ属のPasteurell a haemolytica 次亜種Ａ型、血清型１（「Ａ１」）Ｂ１２２菌株を単離し、− 70℃で繊維素除去血液中に保存した。血液寒天プレート上で、又は5 ％（v/v） ウマ血清（Gibco Canada Ltd.，Burlington，Canada）を補充した脳心臓注入ブ ロス（DifcoLaboratories,Detroit，MI）中で、ルーチン増殖を実施した。培養 はすべて、37℃でインキュベートした。 実施例１ ロイコトキシン遺伝子を単離するために、標準技法を用いてパスツレラ属のP. haemolytica Ａ１（Ｂ１２２株）の遺伝子ライブラリーを構築した（Lo et al .，Infect．Immun.， 上記；DNA Cloning: Vols．I & II， 上記；及びSambrook et al.， 上記 参照）。ゲノムライブラリーをプラスミドベクターｐＵＣ１３ 中に、ＤＮＡライブラリーをバクテリオファージラムダｇｔ１１中に構築した。 その結果生じたクローンを用いて、大腸菌を形質転換し、個々のコロニーをプー ルして、P. haemolytica 感染を生き残った仔ウシか らの血清で、抗ロイコトキシン抗体レベルを増大するためにP. haemolytica の 濃縮培養上清で増強した血清との反応に関してスクリーニングした。陽性コロニ ーを、ウシ好中球とともに細胞溶解物をインキュベートし、その後ウシ好中球か らのラクターゼデヒドロゲナーゼの放出を測定することにより、ロイコトキシン を産生するそれらの能力に関してスクリーニングした。 いくつかの陽性コロニーを確認し、制限エンドヌクレアーゼマッピングにより これらの組換え体を分析した。あるクローンは、過去にクローン化されたロイコ トキシン遺伝子と同一であると思われた（Lo et al.，Infect．Immun.， 上記 参照）。これを確証するために、より小さな断片を再クローニングし、制限地図 を比較した。約 4キロ塩基対のＤＮＡがクローン化されたことが確定された。長 さ約8 kbの全長組換え体を単離するために、染色体ウォーキング（５’→３’方 向）を実施して、漸増的により大きなクローンを単離した。最終構築物をｐＡＡ １１４と名付けた。この構築物は全ロイコトキシン遺伝子配列を含有した。 全ロイコトキシン遺伝子配列を含有するｐＡＡ１１４からのＭａｅＩ制限エン ドヌクレアーゼ断片 １ｋｔＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片＋ヌク レオチドトリホスフェートで処理して、クローニングベクターｐＵＣ１３のＳｍ ａＩ部位に結紮した。このプラスミドをｐＡＡ１７９と名付けた。これから、２ つの発現構築物をｐｔａｃ−ベースのベクターｐＧＨ４３２中に作った：ｌａｃ ＩをＳｍａＩで消化した。一方のｐＡＡ３４２は１ｋｔＡ遺伝子の５’−Ａｈａ ＩＩＩ断片から成り、他方のｐＡＡ３４５は上記の全ＭａｅＩ断片を含有した。 クローンｐＡＡ３４２は高レベルで切断ロイコトキシンペプチドを発現し、一方 ｐＡＡ３４５は非常に低レベルで全長ロイコトキシンを発現した。したがって、 １ｋｔＡ遺伝 子（ｐＡＡ３４５らのＳｔｙｌ ＢａｍＨＩ断片）の３’末端をＳｔｙｌ Ｂａ ｍＨＩ消化ｐＡＡ３４２に結紮して、プラスミドｐＡＡ３５２を得た。ｐＡＡ３ ５２の構造を図２に示し、ｐＡＡ３５２構築物（以後、ＬＫＴ３５２と記す）か ら産生されたP. haemolytica ロイコトキシンのヌクレオチド配列及び予測アミ ノ酸配列を図３に示す。 実施例２ 代表的ＬＫＴ−ＧｎＲＨ融合体を以下のように構築した。単一コピーＧｎＲＨ 及び４つの多重反復体としてのＧｎＲＨに対応するオリゴヌクレオチドを、標準 ホスホラミダイト化学を用いてPharmacia Gene Assemblerで構築した。これらの オリゴヌクレオチドの配列を図１Ａ及び１Ｂに示す。本発明のオリゴヌクレオチ ドをアニーリングし、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化しておいたベク ターｐＡＡ３５２（ＡＴＣＣ寄託番号68283上記）に結紮した。このベクターは 、P. haemolytica ロイコトキシン遺伝子を含有した。結紮されたＤＮＡを用い て、大腸菌ＭＨ3000株を形質転換した。オリゴヌクレオチド挿入物を含有する形 質転換体を制限エンドヌクレアーゼマッピングにより同定した。 ４コピーＧｎＲＨオリゴヌクレオチドをアニーリングし、それらを制限エンド ヌクレアーゼＢａｍＨｌで消化しておいたベクター中に結紮して、８コピーＧｎ ＲＨタンデム反復配列を調製した。挿入した場合に上流ＢａｍＨｌ部位を無力に し、さらに別のコピーの挿入が適正な読取り枠に配向されたことを確証するよう 、オリゴマーを設計した。本発明のオリゴヌクレオチドの配列を図１Ｂに示す。 次に、大腸菌ＭＨ３０００菌株からのプラスミドＤＮＡを単離し、それを用いて 、ＪＭ１０５株を形質転換した。組換え体プラスミドをｐＣＢ１１３（ＬＫＴ３ ５２：４コピーＧｎＲＨ。ＡＴＣＣ寄託 番号69749）及びｐＣＢ１１２（ＬＫＴ３５２：８コピーＧｎＲＨ）と名付けた 。組換え体プラスミドｐＣＢ１１３を図４に示す。プラスミドｐＣＢ１１２は、 上記のように多重コピーＧｎＲＨ配列（図１Ｂのオリゴマーに対応する）を２回 挿入した以外は、ｐＣＢ１１３と同一である。ｐＣＢ１１３の組換え体ＬＫＴ− ＧｎＲＨ融合体のヌクレオチド配列を図５に示す。組換え体ＬＫＴ−ＧｎＲＨ融 合ｐＣＢ１１２のヌクレオチド配列は、多重コピーＧｎＲＨ配列を２回挿入した 以外は同一である。 実施例３ 短縮ＬＫＴ担体ペプチドの構築 プラスミドｐＡＡ３５２（上記）上に存在する組換え体遺伝子から、組換え体 ロイコトキシンペプチドの短縮バージョンを構築した。以下のように、組換え体 ＬＫＴ遺伝子から長さ約1300 bp の内部ＤＮＡ断片を欠失させることにより、短 縮ＬＫＴ遺伝子を産生した。 ＧｎＲＨポリペプチドの４つのコピーと融合したＬＫＴ５３２ポリペプチドを 含有するプラスミドｐＣＢ１１３（ＡＴＣＣ寄託番号69749）を、制限酵素Ｂｓ ｔＢ１（New England Biolabs）で消化した。その結果生じた線状化プラスミド を次に緑豆ヌクレアーゼ（Pharmacia）で消化して、ＢｓｔＢｌ消化により産生 された一本鎖突出端を除去した。次に盲端化ＤＮＡを制限酵素Ｎａｅ１（New En gland Biolabs）で消化して、消化ＤＮＡを1 ％アガロースゲル上に載せ、電気 泳動によりＤＮＡ断片を分離した。約6190bpの大型ＤＮＡ断片を単離し、Gene C lean キット（Bio 101）を用いてアガロースゲルから精製し、バクテリオファ ージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Pharmacia）を用いて精製断片をそれ自体に結紮した 。その結果生じた結紮混合体を用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０５細胞を形質 転換し、約 57 kDa の分子量を有する凝集タンパク質を産生するそれらの能力に より、陽性クローンを同定した。このように形成された組換え体プラスミドをｐ ＣＢ１１１（ＡＴＣＣ寄託番号69748）と呼ぶが、これはＧｎＲＨポリペプチド の４つのコピーと融合した短縮ロイコトキシンポリペプチド（以後、ＬＫＴ１１ １と呼ぶ）を生成する。ｐＣＢ１１１の構造を図６に示す。プラスミドｐＣＢ１ １４は、多重コピーＧｎＲＨ配列（図１Ｂのオリゴマーに対応する）を２回挿入 した以外はｐＣＢ１１１と同一である。ｐＣＢ１１１の組換え体ＬＫＴ−ＧｎＲ Ｈ融合体のヌクレオチド配列を図７に示す。ｐＣＢ１１４の組換え体ＬＫＴ−Ｇ ｎＲＨ融合体のヌクレオチド配列は、多重コピーＧｎＲＨ配列を２回挿入した以 外は同一である。 本発明のクローンの結紮融合点のヌクレオチド配列は、バクテリオファージＴ ７ポリメラーゼシーケンシングキット（Pharmacia）を用いてシーケンシングに より確証した。これらの融合点のヌクレオチド配列を、図８に示す。 実施例４ ＬＫＴ−抗原融合体の精製 実施例２及び３からの組換え体ＬＫＴ−ＧｎＲＨ融合体を、以下の手法を用い て精製した。各融合体に関しては、形質転換大腸菌株の５〜１０個のコロニーを 、100 mg/ml のアンピシリンを補充したＴＢブロス 10ml 中に接種し、Ｇ10振盪 器上で220 rpm で37℃で6時間、インキュベートした。この培養 4 ml を、400 m lのＴＢブロス＋アンピシリンを含入する２枚のそらせ板付きフェルンバッハフ ラスコ中で希釈した。Sorvall GS3 ローターを用いて、容量500 mlのポリエチレ ン瓶中で4,000rpmで10分間遠心分離して、細胞を収穫した。37度Ｃに予め熱して 置いたアンピシリン入りの等容量のＴＢ ブロス（即ち、2 x 400ml）中にペレットを再懸濁させて、上記のように細胞を 2 時間インキュベートした。 組換え体融合タンパク質の合成を誘導するために、3.2 mlのイソプロピル−Ｂ ，Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ，Gibco/BRL）（水中に500mM）（最終 濃度 4 mM）を各培養に付加した。培養を2 時間インキュベートした。上記のよ うに遠心分離により細胞を収穫し、30mlの50 mM のTris-HCl，25％（w/w）スク ロース，pH 8.0中に再懸濁し、−70℃で凍結させた。−70℃で60分後、凍結細胞 を室温で解凍し、リゾチーム（Sigma，250mMTris-HCI，pH 8.0中に 20mg/ml）5 mlを付加した。混合物を高速で10分間回転させた後、氷上に15分間放置した。次 いで細胞を1000mlビーカー中の500 ml溶解緩衝液に付加し、2 mlピペットで攪拌 しながら混合した。溶解細胞懸濁液を含入するビーカーを氷上に置き、全部で2. 5 分間（各々の間に1 分間の冷却時間を置いて5 〜30秒バースト）、大型プロー ブを備え、100 ワット馬力に設定したBraun 音波破砕器で音波処理した。等容量 の溶液をTeflon SS34 遠心分離管に入れて、Sorvall GS3 ローター中で10,000 r pmで20分間遠心分離した。高速で回転させて、遠心分離停止を繰り返して、総量 100ml の滅菌二重蒸留水中にペレットを再懸濁した。上清を棄て、ペレットを20 mlの10 mM Tris-HCl，150 mM ＮａＣｌ，pH 8.0（Tris- 緩衝食塩水）中に併合 して、懸濁液を−20℃で一夜凍結させた。 組換え体懸濁液を室温で解凍し、Tris- 緩衝食塩水中の8 M グアニジンＨＣｌ （Sigma）100 mlに付加し、激しく混合した。磁気攪拌棒を瓶の中に入れて、可 溶化標本を室温で30分間混合させた。溶液を2000mlエーレンマイヤーフラスコに 移して、Tris−緩衝食塩水 1200 mlを迅速に付加した。この混合物を室温でさら に2 時間攪拌した。500 mlアリコートを透析袋（Spectrum，直径 63.7 mm、カッ トオフ6,000 〜8,000 MW、#132670，Fisher Scientific）に入れて、これらを、 3,500 mlのTris- 緩衝食塩水＋0.5 M グアニジンＨＣｌを含入する4,000 mlビー カーに入れた。ビーカーを4 ℃の部屋の磁気攪拌器の上で一夜攪拌し、その後、 透析緩衝液をTris- 緩衝食塩水＋0.1 M グアニジンＨＣｌに取り換えて、12時間 透析を続けた。次に、緩衝液をTris- 緩衝食塩水＋0.05 MグアニジンＨＣｌに取 り換えて、一夜透析を続けた。緩衝液をTris- 緩衝食塩水（グアニジン無含有） に取り換えて、透析を12時間継続した。これを３回以上反復した。最終溶液を20 00mlプラスチック回転瓶（Corning）に注ぎ入れ、100 mM ＰＭＳＦ（エタノー ル中）13 mlを付加して、プロテアーゼ活性を阻害した。溶液を100 mlアリコー トで−20℃で保存した。 融合タンパク質が単離されたことを確証するために、各標本のアリコートを二 重蒸留水ちゅうで20倍に希釈し、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ標本緩衝液と混合し、 沸騰水浴中に5 分間入れて、12％ポリアクリルアミドゲルに通した。組換え体ロ イコトキシン対照も通した。 融合タンパク質はすべて、封入体として高レベルで発現された。融合タンパク 質のＤＮＡ配列に基づいた予測分子量は、104,869（ＬＫＴ３５２：：４コピー ＧｎＲＨ。ｐＣＢ１１３から）；10,392（ＬＫＴ３５２：：８コピーＧｎＲＨ。 ｐＣＢ１１２から）；57,542（ＬＫＴ１１１：：４コピーＧｎＲＨ。ｐＣＢ１１ １から）；及び63,241（ＬＫＴ１１１：：８コピーＧｎＲＨ。ｐＣＢ１１４から ）であった。組換え体ＬＫＴ３５２分子の予測分子量は99,338であり、組換え体 ＬＫＴ１１１分子の予測分子量は51,843であった。 実施例５ ＬＫＴ−ＧｎＲＨ融合体のin vivo 免疫学的活性 in vivo で抗ＧｎＲＨ免疫学的反応を誘導するＬＫＴ−ＧｎＲＨ融合体の能力 に関して試験し、この反応を他のＧｎＲＨ担体抱合体と比較するために、以下の ワクチン接種試験を実施した。特異的病原体を有していない約8 週齢の雄ブタ（ 35〜50 kg）を各々８匹ずつの３群を用いた。動物を最小疾患施設中に保持して 、試験 0日目及び21日目に以下の処方物を接種した： グループ１--ＤＤＡ 15 mgを含有するEmulsigen Plusアジュバント中に処方し た食塩水で構成されるプラセボ（2 ml）； グループ２--同一アジュバント中に処方したＬＫＴ３５２−ＧｎＲＨ（250 μ g ＬＫＴ。前実施例に記載したのと同様に調製）（2ml）； グループ３--同一アジュバント中に処方したＶＰ６−ＧｎＲＨ，0.5 μg ＶＰ ６及び5 μg ＧｎＲＨ（2 ml）。ＶＰ６製剤は、米国特許第5,071,651 号に記載 されたと同様に、そこに記載された結合ペプチドを用いて、生成した。 0 日目、21日目及び35日目に血液標本を採取して、凝固させ、1500g で遠心分 離して、血清を除去した。ＧｎＲＨに対する血清抗体力価を、Silversides et a l.，J．Reprod．Immunol.(1985)7:171-184 のＲＩＡ手法を用いて測定した。 この試験の結果は、ＬＫＴ３５２−ＧｎＲＨ処方物で免疫化した動物だけがＧ ｎＲＨに対する有意の力価を生じた（力価＞1 ：70）ことを示した。プラセボ群 もＶＰ６−ＧｎＲＨ群も、抗ＧｎＲＨ力価を生じなかった。従来は、抗ホルモン 力価を誘導するには、他の担体タンパク質と結合させた100 μg 以上の群理の投 与による多重ワクチン接種が必要であった。これらの結果は、ＬＫＴ−ＧｎＲＨ 担体系が従来の担体系より以上に改良された免疫原を提供することを示す。 実施例６ ＬＫＴに結紮された多重タンデムＧｎＲＨ反復体のin vivo 免疫原性作用 in vivo で抗ＧｎＲＨ免疫学的反応を誘導する、多重ＧｎＲＨポリペプチド反 復を含有する組換え体ＬＫＴ−ＧｎＲＨ融合タンパク質の能力に関して試験する ために、以下のワクチン接種試験を実施した。プラスミドｐＣＢ１１３及びｐＣ Ｂ１７５（それぞれＬＫＴ３５２に結紮されたＧｎＲＨの４及び８個のコピーを 有する）、並びにＬＫＴ３５２に結紮されたＧｎＲＨの１個のコピーを有するプ ラスミドを含有する大腸菌の培養を、上記と同様に調製した。上記の培養の各々 からのワクチンを、0.2 mlのEmulsigen Plus中に当量の5 μg のＧｎＲＨを含有 するように処方した。各群雌マウス10匹ずつの３群に２回の皮下注射を23日の間 隔で投与し、最初の注射から23日目、35日目及び44日目に、血液標本を採取した 。ＧｎＲＨに対する血清抗体力価を、標準ラジオイムノアッセイ法を用いて、1: 100 及び1:1000の最終希釈液中で測定した。5 ％未満のヨウ素化ＧｎＲＨが結合 した場合には、抗体は検出不可能とみなさえた。このようにして得られた抗体力 価を表１に要約する。 この試験の結果は、多重タンデム反復（４又は８コピーＧｎＲＨ）として存在 する等用量のＧｎＲＨは、単一コピーＧｎＲＨを上回る抗体産生の劇的改良を生 じた（ヨウ素化された本来のＧｎＲＨとの結合により測定）ことを示す。さらに 、上記の結果は、ＬＫＴ３５２に結紮された４コピーＧｎＲＨタンデム反復を包 含する融合タンパク質が、免疫原性は用量又は対象種により影響され得るが、し かし最適免疫原性ＧｎＲＨ抗原形態を表すことを示している。 実施例７ ＬＫＴ３５２：：ＧｎＲＨ及びＬＫＴ１１１：：ＧｎＲＨ融合体のin vivo 免 疫学的活性及び生物学的作用 抗ＧｎＲＨ免疫学的反応をin vivo で引出し、生物学的作用をin vivo で表現 するＧｎＲＨ（ＬＫＴ３５２又はＬＫＴ１１１に結紮）の多重タンデム反復を包 含する融合タンパク質の能力を調べるために、以下のワクチン接種試験を実施し た。プラスミドｐＣＢ１１３及びｐＣＢ１１１（それぞれＬＫＴ３５２又はＬＫ Ｔ１１１に結紮された４コピーＧｎＲＨ）を含有する大腸菌の培養を、上記のよ うに調製した。上記の各々の培養からのワクチンを、0.2 ml のＶＳＡ−３アジ ュバント（変法Emulsigen Plusアジュバント）中に当量の5 μg のＧｎＲＨを含 有するように処方し、0.2 mlのアジュバントを包含する対照ワクチンを調製した 。各群雄 Swissマウス 5匹ずつの３群に２回の皮下注射を21日の間隔で投与し、 最初の注射（0 日目）を生後5 〜6 週齢で投与した。49日目に、被験動物を屠殺 した。 1:1000の血清希釈で、標準的ラジオイムノアッセイ法を用いて、抗ＧｎＲＨ抗 体力価を測定することにより、被験動物ＧｎＲＨ−ＬＫＴ融合体の免疫学的活性 を検定した。ＧｎＲＨ−ＬＫＴ融合体の生物学的作用は、血清テストステロンレ ベルの標準ラジオイムノアッセイにより25 pg/mlの感度で定量し、精巣組織を計 量して、組織学的に検査した。この試験の結果を表２に要約する。 本試験では、ＧｎＲＨ：ＬＫＴ抗原を注射された全被験動物は容易に検出可能 な抗体レベルを有したが、しかしＬＫＴ １１１：：ＧｎＲＨ融合体（プラスミ ドｐＣＢ１１１から）は、反応及び力価の均一性により示されるように、優れた 免疫原性を示した。血清テストステロン（精巣ライディッヒ細胞により産生され る）は拍動的 に分泌され、したがって正常被験動物では、血清レベルは低く、非常に変わりや すいと予測される。試験中、対照群（0.2 mlアジュバントワクチン注射摂取）は 正常血清テストステロンレベルを示したが、一方両処置被験動物群は本質的に検 出不可能な血清テストステロン値を有した。 さらに試験下では、精巣組織の組織学的評価により、種々の程度のライディッ ヒ細胞萎縮、精細管直径の低減及び精子形成の妨害が処置被験動物において明示 された；しかしながら、精巣重量は処置群では、高抗ＧｎＲＨ抗体力価が認めら れる場合でも、依然として正常に近かったが、ＬＫＴ １１１：：４コピーＧｎ ＲＨ融合体を摂取中の被験動物 5匹のうち2 匹に、精巣退行の明白な証拠が認め られた。 したがって、これらの結果は、ＬＫＴ ３５２又はＬＫＴ １１１のいずれか に結紮されたＧｎＲＨの多重コピーが有効な免疫原を包含することを示し；さら に被験動物融合タンパク質のワクチン接種はin vivo で内生的ＧｎＲＨを中和し 得る抗体産生の引き金となり、共働性in vivo 生物学的作用がこのようなワクチ ン接種を受けている被験動物において認められることが示される。 実施例８ ブタ被験動物におけるＬＫＴ：：ＧｎＲＨ融合体のin vivo 免疫学的活性 ブタ被験動物におけるin vivo 抗ＧｎＲＨ免疫学的反応を引出すＧｎＲＨ（Ｌ ＫＴ３５２又はＬＫＴ１１１に結紮）の多重タンデム反復を包含する融合タンパ ク質の能力を調べるために、以下のワクチン接種試験を実施した。プラスミドｐ ＣＢ１１３、ｐＣＢ１１１、ｐＣＢ１７５及びｐＣＢ１１４（それぞれＬＫＴ３ ５２：：４コピーＧｎＲＨ、ＬＫＴ１１１：：４コピーＧｎＲＨ、ＬＫＴ３５２ ：：８コピーＧｎＲＨ、ＬＫＴ１１１：：８コピーＧｎＲＨ）を含有する大腸菌 の培養を、上記のように調製した。上記の各々の培養からのワクチンを、当量の 50μg のＧｎＲＨを含有し、0.2 ml のＶＳＡ−３アジュバント中で投与される ように処方した。各群雌雄各 5匹ずつの乳離れしたばかりのブタ、生後35日齢（ 0 日目）の4 群に、0 日目に注射し、21日の間隔で再注射した。0 日目、21日目 及び35日目に血液標本を採取し、抗ＧｎＲＨ抗体力価を、標準ラジオイムノアッ セイ法を用いて、1:1000の最終希釈で測定した。検定結果を表３に要約する。 試験下では、抗ＧｎＲＨ抗体は免疫感作前にはいかなる被験動物にも検出され なかったが、35日目までにはほとんどの被験動物で容易に検出された（処置群の 被験動物は、４匹が処理とは無関係の感染のために死亡した）。この試験の結果 は、ＬＫＴ３５２又はＬＫＴ １１１担体ポリペプチドのいずれかに結紮された 多重ＧｎＲＨ反復を包含する融合タンパク質がブタ被験動物において有用な免疫 原を生成することを示す。デカペプチドＧｎＲＨ（1,200）、ＬＫＴ１１１ポリ ペプチド（52,000）及びＬＫＴ ３５２ポリペプチド（100,000）の予測分子量 を基礎にして、ＬＫＴ−ＧｎＲＨ抗原融 合体中のＧｎＲＨのパーセンテージは以下の通りである： 4.9 ％（ＬＫＴ３５２：：４コピーＧｎＲＨ）；8.5 ％（ＬＫＴ１１１：：４コ ピーＧｎＲＨ）；9.3 ％（ＬＫＴ３５２：：８コピーＧｎＲＨ）及び15.7％（Ｌ ＫＴ１１１：：８コピーＧｎＲＨ）。したがって、このようにして得られた実際 の結果は、ＬＫＴ １１１ポリペプチド担体を包含するＬＫＴ−ＧｎＲＨ融合体 を用いることにより、被験動物に投与する抗原（ＬＫＴ−ＧｎＲＨ）の全体量は 、等価の抗ＧｎＲＨ反応を得るのに半分にし得る（ＬＫＴ ３５２担体ポリペプ チド系を用いたワクチン接種組成物と比較）。 実施例９ 組換え体ＬＫＴ ３５２及びＬＫＴ １１１分子におけるＴ細胞エピトープの 予測 本発明のＬＫＴ−ＧｎＲＨキメラに用いられるロイコトキシンポリペプチド配 列中の考えられるＴ細胞エピトープを予測するために、Margalit等（Margalit e t al.，J．Immunol.(1987)138:2213）が提唱した方法を、表４に示したようなＬ ＫＴ分子の１番〜１９９番に対応するアミノ酸配列に関して実行した。本方法下 で、ロイコトキシンポリペプチド配列のアミノ酸配列を、Ｔ細胞反応を誘導する ことが公知の他の配列と、並びにＴ細胞エピトープに必要であると考えられるア ミノ酸の型様式と比較した。比較結果を表４に示す。 このようにして得られた予測結果から分かるように、Margalit等（上記）が示 唆した判定基準を用いてＴ細胞エピトープと考えられると同定されるロイコトキ シンペプチド中にいくつかの短い配列が存在する。さらに、９つの配列が（荷電 ／Ｇｌｙ−疎水性−疎水性−極性／Ｇｌｙ）配列（表４中でパターン「１」とし て示される）を有すると確認され、３つの配列が（荷電／Ｇｌｙ−疎水性−疎水 性−疎水性／Ｐｒｏ−極性／Ｇｌｙ）配列（表４中でパターン「２」として示さ れる）を有すると確認された。これらのデータを上記の実施例７及び８における ＬＫＴ ３５２及びＬＫＴ １１１担体系により生成されたin vivo 抗ＧｎＲＨ 活性と結びつけることにより、決定的なＴ細胞エピトープが短縮ＬＫＴ １１１ 分子中に保持され、そのエピトープは同様にＬＫＴ ３５２及びＬＫＴ １１１ 分子のＮ末端部分内に含有されることが示された。 Ｄ．産業的適用可能性 本発明のロイコトキシン−ＧｎＲＨキメラは、脊椎動物宿主に投与した場合に 、内生的ＧｎＲＨに対して宿主を免疫化し、次いで生殖機能又は宿主の能力を阻 害するよう作用するのに役立つ免疫原を提供するのに用いるものである。 本明細書中で例示した特定の用途にもかかわらず、本明細書中で開示した新規 のキメラ分子は、多重又はタンデム反復で生じ、分子 のロイコトキシンポリペプチド部分により（そしていくつかの場合には選択され たＧｎＲＨ配列間に生じるスペーサーペプチド配列により）供給される免疫原性 エピトープと融合する、１つ以上のＧｎＲＨペプチド配列を包含する融合タンパ ク質を提供するための手段を示唆する。本発明下で構築される本発明のキメラタ ンパク質は、融合ＧｎＲＨペプチド配列に免疫原性増強を提供し、免疫化脊椎動 物宿主に内生的ＧｎＲＨに対する有効な免疫反応を起こさせて、２つの性腺刺激 ホルモン、即ち黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の合 成及び放出を妨害を実行し、宿主を一時的に不妊にさせる。このように、新規の ロイコトキシン−ＧｎＲＨ構築物を免疫不妊化ワクチンに用いて、家畜化動物及 び飼育動物管理に広く実施されている侵襲性不妊法に代わるものを提供し得る。 本発明の融合分子のその他の意図される使用としては、人口抑制、例えば野性 齧歯類集団における生殖能力の抑制が挙げられる。これに関しては、ＬＫＴ−Ｇ ｎＲＨ融合タンパク質は、毒物等のような広く実施されている人口制御手段に代 わるものとして用い得る。本発明の融合物質は、緩徐及び迅速放出成分の両方を 有する構築物中に投与し得る。このように、多重ワクチン接種の必要性は回避し 得る。さらに、ＧｎＲＨのアミノ酸配列は種内で高度に保存されるため、広範な 種間有効性を示す単一ロイコトキシン−ＧｎＲＨ融合ワクチン物質を生成し得る 。 このように、選択されたＧｎＲＨポリペプチドと融合されるロイコトキシンを 包含する種々のキメラタンパク質が開示されている。本発明の好ましい実施態様 をある程度詳細に記載したが、添付の請求の範囲により限定される本発明の精神 及び範囲を逸脱しないかぎり、明らかな変更が可能であると理解される。 本発明の実施に有用な菌株の寄託 以下の菌株の生物学的に純粋な培養の寄託は、アメリカ培養細胞コレクション （ＡＴＣＣ） American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Roc kville，Marylandで成された。記載した寄託番号は、成育可能性試験が成功した 後に割り当てられたもので、必要料金を支払った。寄託は、特許手順のための及 びその下での調節のための微生物の寄託の国際認識に関するブダペスト条約（ブ ダペスト条約）の規定に基づいてなされた。これは、寄託日から30年間、保管所 による受入れ標本の据え付けに対する最新の要求後、少なくとも５年間、成育可 能培養の保持を保証する。35 USC§122及びそれに準じた長官命令（37 CFR §1 .12を含む）によりその資格があると米国特許局長官により確定された者に培養 の恒久的且つ拘束されない利用可能性を保証するブダペスト条約の約定下でＡＴ ＣＣにより生物は利用可能にされる。 これらの寄託は、当業者に便利なものとして提供されるだけで、寄託は35 USC §122 下で必要であるという認可ではない。これらのプラスミドの核酸配列、並 びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参照により本明細 書中に含まれ、本明細書中の記載との不一致が生じた場合には照査している。寄 託物質の製造、使用又は販売には許可が必要で、このような許可は、本文書によ り与えられるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 マンス，ジョン ジー. カナダ国，エス７ティー １エー１ サス カッチェワン，サスカトゥーン，リバーサ イド エステート，ポニー トレイル ロ ード 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的に１つ以上の選択されたＧｎＲＨポリペプチドから成る多量体と融 合したロイコトキシンポリペプチドを包含するキメラタンパク質であって、上記 キメラタンパク質の上記ロイコトキシン部分が上記ＧｎＲＨ多量体の免疫原性を 増大するように作用するキメラタンパク質。 ２．上記ロイコトキシンポリペプチドがロイコトキシン活性を欠く請求項１記 載のキメラタンパク質。 ３．上記ロイコトキシンがＬＫＴ ３５２である請求項２記載のキメラタンパ ク質。 ４．上記ロイコトキシンがＬＫＴ １１１である請求項２記載のキメラタンパ ク質。 ５．上記ＧｎＲＨ多量体が一般式ＧｎＲＨ−Ｘ−ＧｎＲＨ（式中、Ｘはペプチ ド結合、アミノ酸スペーサー基及び〔ＧｎＲＨ〕_n'（ここで_nは１以上である） から成る群から選択され、さらにＧｎＲＨはあらゆるＧｎＲＨポリペプチドを包 含する）による分子を包含する請求項１記載のキメラタンパク質。 ６．Ｘが少なくとも１つのヘルパーＴ細胞エピトープを含めたアミノ酸スペー サー基を包含する請求項５記載のキメラタンパク質。 ７．上記キメラタンパク質が図５に記載のアミノ酸配列、又はそれと実質的に 相同で且つ機能的に等価のアミノ酸配列を包含する請求項１記載のキメラタンパ ク質。 ８．上記キメラタンパク質が図７に記載のアミノ酸配列、又はそれと実質的に 相同で且つ機能的に等価のアミノ酸配列を包含する請求項１記載のキメラタンパ ク質。 ９．請求項１〜８のいずれかに記載のキメラタンパク質、及び製 薬上許容可能なビヒクルを包含するワクチン組成物。 １０．選択されたＧｎＲＨ多量体を被験者に呈示するための方法であって、上 記被験者に有効量の請求項９記載のワクチン組成物を投与することを包含する方 法。 １１．請求項１〜８のいずれかのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物 。 １２．以下の： （ａ）請求項１１記載のＤＮＡ構築物；及び （ｂ）上記構築物の転写を指示し、それにより上記構築物が宿主細胞中で転写 され、翻訳され得る制御配列 で構成される発現カセット。 １３．請求項１２の発現カセットで形質転換される宿主細胞。 １４．以下の： （ａ）請求項１３記載の宿主細胞の集団を提供し；そして （ｂ）上記発現カセットによりコードされるポリペプチドが発現される条件下 で上記細胞集団を培養する 工程から成る組換え体ポリペプチドの製造方法。