PL181323B1

PL181323B1 - 2-heteroarylo-5,11-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2’,3'-e][1,4] diazepinyi ich zastosowanie w zapobieganiu i leczeniu zakazen HIV PL PL PL

Info

Publication number: PL181323B1
Application number: PL95316006A
Authority: PL
Inventors: Karl D Hargrave; Terence A Kelly; Suresh R Kapadia; John R Proudfoot; Daniel W Mcneil; Usha R Patel; Mario G Cardozo
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2001-07-31
Also published as: DE69502587D1; CN1043347C; CN1138861A; EP0745083A1; TW327171B; AU690646B2; CA2183571A1; AU1845795A; KR970701190A; EP0745083B1; CO4340691A1; ES2118575T3; DE69502587T2; DK0745083T3; WO1995022545A1; MX9603359A; RU2142464C1; ATE166353T1; PL316006A1; JPH09509179A

Abstract

1. 2-heteroarylo-5,11-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2,3-e]-diazepiny, o wzorze 1 w którym Z oznacza atom tlenu; R1 oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach we- gla; R oznacza alkil o 1 do 3 atomach wegla lub cykloalkil o 3 do 6 atomach wegla; R oznacza atom wodoru; R4 oznacza atom wodoru; Ar oznacza grupe o wzorze I, II, III, IV lub V w których R5 oznacza wodór, metyl, etyl, acetyl; kazdy z R6, R7 i R8 oznacza atom wodo- ru; albo jeden z R6, R7 i R8 we wzorach I-III oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, aminokarbonyl lub grupe cyjanowa, a obydwa z dwu pozostalych pod- stawników oznaczaja wodór; a R we wzorach IV i V oznacza wodór, metyl lub etyl; kaz- dy z A, B, D i E oznacza grupe metinowa, z których jedna moze ewentualnie byc podsta- wiona R9; a R9 we wzorze IV i V oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach wegla; lub ich far- maceutycznie dopuszczalne sole. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy nowych 2-heteroarylo-5,ll-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli oraz zawierających te związki kompozycji farmaceutycznych.

Występującą u ludzi chorobę, zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), wywołuje ludzki wirus niedoboru odporności (HIV), a szczególnie szczep znany jako HIV-1.

Podobnie jak inne wirusy, HTV-1 nie może replikować bez opanowania aparatu biosyntezy w komórce gospodarzą którą zakaża. Powoduje on, że aparat ten wytwarza białka strukturalne, które tworzą potomstwo wirusa. Białka te są kodowane przez materiał genetyczny zawarty w wirusowej cząsteczce zakażającej lub wirionie. Jednakże, ponieważ HIV jest retrowirusem, jego materiał genetyczny stanowi RNA, a nie DNA jak w genomie komórki gospodarza. Tak więc RNA wirusa najpierw musi być przekształcony w DNA, a następnie zintegrowany z genomem komórki gospodarzą aby komórka ta wytworzyła białka żądanego wirusa. Konwersja RNA w DNA przebiega z udziałem enzymu, odwrotnej transkryptazy (RT), która waz z RNA jest obecna w zakażającym wirionie. Znane są trzy enzymatyczne funkcje odwrotnej transkryptazy; działa ona jako RNA-zależna polimeraza DNA, jako rybonukleaza i jako DNA-zależna polimeraza DNA. W pierwszym z tych działań, jako RNAzależna polimeraza DNA, RT wytwarza jednoniciowy DNA, który jest kopią wirusowego RNA. Działając jako rybonukleazą RT uwalnia DNA wytworzony z oryginalnego wirusowego RNA i niszczy oryginalny RNA. Wreszcie, działając jako zależna od DNA polimeraza DNA, RT wytwarza drugą komplementarną nić DNA, wykorzystując jako matrycę pierwszą nić DNA. Te dwie nici tworzą dwuniciowy DNA, który za pomocą innego enzymu zwanego integrazą integruje się z genomem komórki gospodarza.

Związki, które hamują enzymatyczne funkcje odwrotnej transkryptazy HTV-1 będą hamować repłikację HIV-1 w zakażonych komórkach.

Znanych jest wiele związków hamujących enzymatyczne funkcje odwrotnej transkryptazy HIV-1. Jedną klasę znanych inhibitorów RT HIV-1 stanowią analogi nukleozydów. Klasa ta obejmuje 3'-azydo-3'-deoksytymidynę (AZT), 2',3'-dideoksyinozynę (ddl) i 2',3'-dideoksycytydynę (ddC). Następną klasą są analogi związków nienukleozydowych. Do

181 323 klasy tej należy, między innymi, newirapina, którą jest ll-cyklopropylo-5,ll-dihydro-4metylo-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]-diazepin-6-on. Newirapinę i inne szczególnie istotne związki z klasy nie-nukleozydów opisano w patencie USA 5,366,972; i w publikacji Hargrave i in., „Novel Ńon-Nucleoside Inhibitors of HIV-1 Reverse Transcriptase. 1. Tricyclic Pyridobenzo- and Dipyridodiazepinones”, J. Med. Chem. 34, 2231 (1991).

Zastosowanie inhibitorów RT w leczeniu zakażeń HTV-1 tak jak w dowolnej z terapii przeciwwirusowych powoduje powstawanie wirusa, który jest mniej wrażliwy na podawany lek. Oporność (zmniejszona wrażliwość) na te leki jest wynikiem mutacji, które występują w segmencie genu poi odwrotnej transkryptazy.

Celem wynalazku jest opracowanie ulepszonych, nienukleozydowych inhibitorów RT HIV-1, które są bardziej skuteczne wobec szczepów mutantów HIV-1 niż znane związki tej klasy. Związki według niniejszego wynalazku spełniają ten cel, ponieważ wykazują znacznie silniejsze działanie, nie tylko wobec enzymu RT wirusa typu dzikiego (nie zmutowanego), ale są również skuteczne wobec odwrotnej transkryptazy wielu mutantów wirusów, które zauważono u pacjentów leczonych inhibitorami RT. W szczególności, związki według wynalazku skutecznie zwalczają mutanta Y181C [w którym tyrozyna (Y) przy kodonie 181 uległa mutacji w resztę cysternową (C)], najczęściej obserwowanego mutanta w badaniach klinicznych po terapii wieloma nienukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy. Związki te są również skuteczne w stosunku do innych znanych zmutowanych enzymów, które zawierają pojedyncze mutacje punktowe, takie jak Y188L, K103N, V106A, G190A, Y188C lub P236L.

Wynalazek obejmuje nowe 2-heteroarylo-dipirydodiazepiny, które wykazują aktywność przeciwko RT HTV-1 zarówno typu dzikiego, jak i zmutowanego i hamują replikację HIV-1 w zakażonej HIV-1 komórce gospodarza ludzkiego. Związki według wynalazku służą do zapobiegania lub leczenia zakażeń HTV-1, przez podawanie człowiekowi narażonemu na zakażenia lub zakażonemu HIV-1, profilaktycznie lub terapeutycznie skutecznej ilości jednego z nowych związków, pojedynczo lub w kombinacji z innymi środkami przeciwwirusowymi, immunomodulacyjnymi, antybiotykami, środkami przeciwko zakażeniom lub szczepionkami. Wynalazek obejmuje też kompozycje farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia zakażeń HIV-1 zawierające wyżej wymienione związki.

Wynalazek obejmuje nowe 2-heteroarylo-5,ll-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepiny przedstawione wzorem 1

w którym

Z oznacza atom tlenu;

R^l oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla,

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 6 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru; a

Ar oznacza grupą o wzorze I, Π, ΙΠ, IV lub V

I

II

III

IV

w których

R⁵ oznacza wodór, metyl, etyl, acetyl lub aminokarbonyl;

każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ we wzorach I-HI oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, karboksyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową, a pozostałe dwa podstawniki oznaczają wodór; a R⁶ we wzorach IV-V oznacza wodór, metyl, etyl, acetyl metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, karboksyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową; z których jedna może ewentualnie być podstawiona R⁹; albo jeden z A, B, D i E oznacza atom azotu, a każdy z trzech pozostałych A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna może ewentualnie być podstawiona R⁹; a

R⁹ oznacza alkiloksyl o 1-3 atomach węgla.

Wynalazek obejmuje związki o wzorze 1, w którym

Z oznacza atom tlenu; '

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 4 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, Π, ΙΠ, IV lub V, w którym

R⁵ oznacza wodór, metyl lub etyl, każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową, a każdy z pozostałych dwu podstawników oznacza wodór;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna ewentualnie może być podstawiona R⁹;

R⁹ oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla.

Szczególna podklasa związków według wynalazku obejmuje związki o wzorze 1, w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza metyl;

R² oznacza alkil o 2 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 4 atomach węgla;

każdy z R³ i R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, II lub ΙΠ, gdzie

R⁵ oznacza wodór lub metyl, każdy z R⁶, R⁷, R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza metyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl albo grupę cyjanową; a pozostałe dwa podstawniki oznaczają atomy wodoru; albo

Ar oznacza grupę o wzorze IV lub V, gdzie

R⁵ oznacza wodór lub metyl;

R⁶ oznacza atom wodoru lub metyl;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna ewentualnie może być podstawiona R⁹; a

R⁹ oznacza atom alkiloksylu o 1 do 3 atomach węgla.

Korzystnymi związkami o wzorze 1 są:

181 323

5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin6-on;

-cyklopropylo-5,11 -dihydro-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e][ 1,4]diazepin-6-on;

-cyklopropylo-5,11 -dihydro-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e][l,4]diazepin-6-on; oraz

5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][1,4] diazepin-6-on.

Synteza związków o wzorze 1 oraz ich soli

Związki o wzorze 1 i ich sole można wytwarzać znanymi sposobami. Związek o wzorze ogólnym 2A, w którym Z oznacza tlen, poddaje się sprzęganiu aryl-aryl, z wytworzeniem odpowiednich 2-arylo-podstawionych związków według wynalazku o wzorze 1A. Poniżej zilustrowano niektóre sposoby prowadzenia sprzęgania aryl-aryl. Sposoby te są ogólnie znane, na przykład z J.K. Stille, Angew. Chem.. Int. Ed. Engl., 25, 508 (1986); A.M. Echavarren i J.K. stille, J. Am. Chem. Soc. 109, 5478 (1987); V. Farina i B. Krishnan, J. Am. Chem. Soc., 113, 9585 (1991); oraz R.F. Heck, Acc. Chem. Res., 12, 146 (1979). Inna ogólna metoda prowadzenia takiego sprzęgania aryl-aryl, reakcja Suzuki, z zastosowaniem kwasów aryloboronowych w obecności katalizatorów palladowych, aczkolwiek nie zilustrowana poniżej, opisana jest na przykład w N.M. Ali, A. McKillop, M.B. Mitchell, R.A. Rebelo, i P.J. Wallbank, Tetrahedron, 48, 8117 (1992). Sposoby wytwarzania związków o wzorach 2A, 2B, 2C i 2D są ogólnie znane z publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego 0 429 987 i patentu USA Nr 5,366,972, ale również opisano je szczegółowo poniżej. Podobnie, opisane poniżej sposoby przeprowadzania związku o wzorze 1A w związek o wzorze IB, 1C lub ID stanowią oczywiste odmiany sposobów już opisanych w europejskim zgłoszeniu patentowym 0 429 987 i patencie USA Nr 5,366,972.

Metoda A

Związki o wzorze 1A

w którym Ar oraz R¹ do R⁴ mają wyżej określone znaczenia, można wytworzyć przez kondensację związku o wzorze 2A

181 323

w którym R¹ do R⁴ mają wyżej określone znaczenia, a R¹¹ oznacza grupę opuszczającą na przykład chlor, brom, jod lub -OSO₂CF₃, ze związkami tributylocyny o wzorze 3

^.SnBu₃

Ar w którym Ar ma wyżej określone znaczenie, w obecności katalizatorą korzystnie palladowego, takiego jak tetrakis(trifenylofosfino)pallad (0), tetrakis(trifenyloarsyno)palład (0), tetrakis(tri-2-furylofosfino)pallad (0) lub chlorek bis(trifenylofosfino)palladu (Π). Reakcje te prowadzi się w obojętnej atmosferze argonu lub azotu i w obojętnych rozpuszczalnikach, takich jak 1,4-dioksan, tetrahydrofuran, Ν,Ν-dimetyloformamid, N-metylopirolidynon, itp., i w temperaturach zasadniczo pomiędzy temperaturą pokojową i temperaturą wrzenia rozpuszczalnika. W niektórych przypadkach stosować można związki trimetylocyny odpowiadające związkom tributylocyny o wzorze 3.

Metoda B

W alternatywnej metodzie, związki o wzorze 1A, w którym Ar oraz R¹ do R⁴ mają wyżej określone znaczenią wytwarza się na drodze kondensacji związków o wzorze 2A, w którym R¹ do R⁴ i R¹¹ mają wyżej określone znaczenią ze związkami cynkoorganicznymi o wzorze 4

ZnCI

Ar które otrzymuje się dodając chlorek cynku do związku litoorganicznego o wzorze 5

Ar w którym Ar ma określone wyżej znaczenie. Reakcje te zazwyczaj prowadzi się w sposób analogiczny jak w Metodzie A, tj. w obojętnej atmosferze argonu lub azotu i w obecności katalizatora palladowego, takiego jak tetrakis(trifenylofosfino)pallad (0), tetrakis(trifenyloarsyno)pallad (0), tetrakis(tri-2-furylofosfino)pallad (0) lub chlorek bis(trifenylofosfino)palladu (II). Zazwyczaj stosuje się obojętne rozpuszczalniki, takie jak 1,4dioksan, tetrahydrofuran, eter, a temperatury reakcji zazwyczaj mieszczą się pomiędzy temperaturą pokojową i temperaturą wrzenia rozpuszczalnika.

Wytwarzanie związków wyjściowych o wzorze 2A

Związki o wzorze 2A wytworzyć można znanymi sposobami, opisanymi już w EP-A-0 429 987 lub w patencie USA nr 5,366,972, lub stosując ich oczywiste modyfikacje. Opisane poniżej metody C do E stanowią przykładowe sposoby wytwarzania takich związków.

181 323

Metoda C

Związki ó wzorze 2A

2A w którym R¹, R², R³ i R⁴ mają wyżej podane znaczenia, a R¹¹ oznacza chlor, brom, jod lub metoksyl, wytworzyć można poddając cyklizacji odpowiednie amidy kwasów karboksylowych o wzorze 9

Hal HN \ w którym R¹ do R⁴ i R¹¹ mają wyżej określone znaczenia, a Hal oznacza chlor, brom, fluor lub jod.

Korzystnie, do wytworzenia związków o wzorze 2A, w którym R⁴ oznacza grupę odciągającą elektrony, stosuje się wariant tego sposobu obejmujący cyklizację amidów kwasu karboksylowego o wzorze 9A

9A w którym R¹ do R⁴, R¹¹ i Hal mają znaczenia jak podano w odniesieniu do związków o wzorze 9.

Korzystnie cyklizację prowadzi się na drodze przekształcenia związku o wzorze 9 lub 9A w ich sole z metalem alkalicznym i następnie przez kondensację w temperaturach pomiędzy 0°C i temperaturą wrzenia mieszaniny reakcyjnej. Gdy w wyjściowych związkach o wzorze 9 lub 9A R¹ ma znaczenie inne niż wodór, aby wprowadzić metal należy stosować przynajmniej 1 mol środka wprowadzającego metal. Z drugiej strony, jeżeli R¹ oznacza wodór, muszą być użyte co najmniej 2 mole tego środka. Do wprowadzania metalu korzystnie stosuje się wodorki litu, sodu i potasu lub alkilolit, taki jak n-butylolit.

Reakcję cyklizacji zazwyczaj prowadzi się w obojętnych rozpuszczalnikach, np. w tetrahydrofuranie, 1,4-dioksanie, w eterze glikolu dimetylowego, w eterze dietylenowym glikolu dimetylowego, w eterze trietylenowym glikolu dimetylowego, w dimetyloformamidzie, w benzenie lub w anizolu. Cyklizację prowadzić również można ogrzewając amidy kwasów karboksylowych o wzorze 9 lub 9A w dipolamych rozpuszczalnikach aprotycznych, korzystnie w sulfolanie lub dimetylosulfonie. Korzystnie stosuje się katalityczne ilości mocnych kwasów, np. kwasu siarkowego, kwasu solnego, kwasu bromowodorowego, fosforowego, polifosforowego, metanosulfonowego lub p-toluenosulfonowego. Zazwyczaj konieczna jest temperatura reakcji w zakresie pomiędzy 110 i 220°C.

181 323

W celu wytworzenia związku o wzorze 2A, w którym R¹¹ oznacza -OSO2CF3, najpierw należy wytworzyć związek, w którym R¹¹ oznacza metoksyl. Następnie uzyskany produkt przejściowy poddaje się demetylowaniu, traktując odpowiednim kwasem, takich jak na przykład, stężony HBr lub BBr3. Następnie wytworzony hydroksylowy produkt przejściowy przekształca się w -OSO₂CF₃, traktując bezwodnikiem kwasu trifluorometanosulfonowego, zazwyczaj w obecności słabej zasady, takiej jak, na przykład, Ν,Ν-diizopropyloetyloamina lub trietyloamina.

Stosowane jako związki wyjściowe amidy kwasu karboksylowego o wzorze 9 wytwarza się na przykład przez aminowanie amidów kwasu 2-chloro-nikotynowego o wzorze 10

Hal Cl w którym R¹, R³, R⁴, R¹¹ i Hal mają określone powyżej znaczenia, pierwszorzędowymi aminami o wzorze 11

H₂N-R² (11) w którym R² ma uprzednio podane znaczenie. Reakcję można również prowadzić w obecności nieorganicznych lub organicznych pomocniczych zasad, takich jak trietyloamina, Ν,Ν-dimetyloanilina lub węglanu sodu albo potasu. Reakcję można prowadzić nie stosując rozpuszczalnika, jednakże korzystnie stosuje się obojętne rozpuszczalniki organiczne w temperaturach pomiędzy 0°C i 175°C, korzystnie w temperaturze wrzenia. Odpowiednie do stosowania obojętne rozpuszczalniki obejmuje nadmiar pierwszorzędowej aminy o wzorze ogólnym 11, etery o otwartym łańcuchu lub etery cykliczne, takie jak tetrahydrofuran, 1,4-dioksan, eter glikolu dimetylowego, eter dietylenowy glikolu dimetylowego, węglowodory aromatyczne, takie jak benzen, toluen, ksylen, chlorobenzen lub pirydyna; alkohole, takie jak metanol, etanol, izopropanol; dipolame rozpuszczalniki aprotyczne, takie jak dimetyloformamid, 1,3-dimetylo-2-imidazolidynon, 1,3-dimetylo-tetrahydro-2( 1 H)-pirymidynon i sulfolan.

Amidy kwasów karboksylowych o worze 9A wytworzyć można przez kondensację odpowiednio podstawionego chlorku kwasu 2-chloronikotynowego z odpowiednio podstawioną 3-amino-2-(alkiloamino)pirydyną w dobrze znanych warunkach reakcji.

Produkty przejściowe o wzorze 10, w którym R¹ ma znaczenie inne niż wodór, wytworzyć można z amidów kwasu 2-chloronikotynowego o wzorze 12

Hal Cl na drodze reakcji ze środkami alkilującymi o wzorze 13

R'X (13)

181 323 w którym R¹ ma podane wyżej znaczenie, a X oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, na przykład X oznacza rodnik reaktywnego estru, atom chlorowca, grupę OSOjR¹, grupę metanosulfonyloksy lub etanosulfonyloksy lub aromatyczną grupę sulfonyloksy, w obecności akceptora protonów, na przykład amin, takich jak trietyłoamina, diazabicykloundecen, 4-(dimetyloamino)pirydyna, lub wodorotlenków metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takich jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek wapnia, węglanów metali alkalicznych lub węglanów lub wodorowęglanów metali ziem alkalicznych, takich jak węglan sodu lub węglan potasu lub wodorowęglan potasu.

Amidy kwasu 2-chloronikotynowego o wzorze ogólnym 12 można wytworzyć na drodze kondensacji odpowiednio podstawionego chlorku kwasu 2-chloronikotynowego z odpowiednio podstawioną 3-amino-2-chlorowcopirydyną, w dobrze znanych warunkach reakcji.

Wszystkie pozostałe materiały wyjściowe potrzebne do wytworzenia związków o wzorze 2A są znane z literatury lub można je zakupić, albo wytworzyć znanymi z literatury sposobami.

Metoda D

Związek o wzorze 2A, w którym R¹ do R⁴ i R¹¹ mają wyżej podane znaczenia, ale R¹ nie oznacza wodoru, wytworzyć można przekształcając związek o wzorze 15

w którym R², R³, R⁴ i R¹¹ mają wyżej podane znaczenia, w odpowiadający mu związek z metalem alkalicznym lub metalem ziem alkalicznych w pozycji 5, a następnie poddając reakcji związek z metalem alkalicznym ze związkiem o wzorze 13

R'X (13) w którym R¹ ma podane wyżej znaczenie, a X oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, na przykład X oznacza rodnik reaktywnego estru, atom chlorowca, grupę OSO₂R^], grupę metanosulfonyloksy lub etanosulfonyloksy lub grupę sulfonyloksy z podstawnikiem aromatycznym. Zamiast przekształcania związku o wzorze 15 w odpowiadającą mu sól z metalem alkalicznym w pierwszym etapie, można również przeprowadzić alkilowanie związku o wzorze 15 poddając go reakcji ze związkiem o wzorze 13 w obecności amin, takich jak trietyloamina, diazabicykloundecen lub 4-(dimetyloamino)pirydyna, lub węglanów albo wodorowęglanów metali alkalicznych, takich jak węglan sodu i potasu lub wodorowęglan sodu.

Konwersję związku o wzorze 15 w odpowiadający mu związek z metalem alkalicznym lub z metalem ziem alkalicznych można przeprowadzić poddając reakcji związek o wzorze 15 z wodorotlenkiem metalu alkalicznego lub wodorotlenkiem metalu ziem alkalicznych, takim jak wodorotlenek litu, wodorotlenek baru, wodorotlenek sodu lub wodorotlenek potasu, z alkoholanem metalu alkalicznego, takim jak metanolan sodu lub tert-butanolan potasu, z arnidkami metali alkalicznych, takimi jak amidek sodu lub amidek potasu, albo z wodorkami metali alkalicznych, takimi jak wodorek sodu lub wodorek potasu. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego w temperaturach pomiędzy -78°C i +60°C, korzystnie w temperaturze pokojowej. Gdy jako środki wprowadzające metal stosuje się wodorki metali alkalicznych, korzystne są obojętne rozpuszczalniki organiczne, takie jak dimetyloformamid, sulfotlenek dimetylu, tetrahydrofuran, eter glikolu dimetylowego, toluen lub pirydyna, zaś gdy stosuje się wodorotlenek metalu alkalicznego lub metalu

181 323 ziem alkalicznych, używać również można wodnej mieszaniny rozpuszczalnika organicznego, takiego jak metanol lub tetrahydrofuran. Do konwersji tak wytworzonego 5,ll-dihydro-6Hdipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu podstawionego metalem alkalicznym lub metalem ziem alkalicznych w związek o wzorze ogólnym 2A, roztwór lub zawiesinę związku metalu alkalicznego lub metaluziem alkalicznych poddaje się reakcji bezpośrednio, tj. bez wydzielania, ze związkiem o wzorze V w temperaturze -20°C lub w temperaturach podwyższonych, do temperatury wrzenia rozpuszczalnika lub środowiska reakcyjnego, w zależności od tego która jest niższa. Podstawienie dokonuje się prawie wyłącznie przy atomie azotu w pozycji 5 dihydro-dipirydodiazepinonu, nawet jeśli w związku wyjściowym o wzorze 15 R² oznacza atom wodoru, pod warunkiem, że stosuje się jeden równoważnik zasady i jeden równoważnik związku o wzorze 13.

Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że obecność podstawników nukleofilowych w związkach o wzorze 2A może wymagać stosowania produktu przejściowego o wzorze 2A, zawierającego podstawniki inne niż atom azotu w pozycji 11, nienukleofilowe, ale ulegające przekształceniu z wytworzeniem żądanej grupy. Przykładowo, grupę aminową przy R⁴ uzyskuje się przez alkilowanie lub acylowanie związku przejściowego o wzorze 2A, zawierającego grupę nitrową przy R⁴, a następnie grupę nitrową redukuje się z wytworzeniem żądanego związku.

Związki przejściowe o wzorze 15 wytworzyć można przez cyklizowanie odpowiednio podstawionych związków o wzorze 9 lub 9A. Sposób ten jest korzystny w przypadkach, w których cyklizacja mogłaby być utrudnioną gdy R¹ ma znaczenie inne niż wodór.

Metoda L

Związek o wzorze 2A, w którym R¹ do R⁴ i R¹¹ mają uprzednio podane znaczenia, a R²ma znaczenie inne niż wodór, wytworzyć można przeprowadzając 5,ll-dihydro-6Hdipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on o wzorze 2A, w którym R² oznacza wodór, w odpowiadającą mu sól z metalem o wzorze 16A lub - w przypadku, gdy R¹ oznacza wodór - w związek o wzorze 16B .

R¹ O \ // 3 N—X

Y χ ί Y

M⁺

16A

16B w których M oznacza metal alkaliczny, taki jak lit, sód, potas, rubid lub cez, albo M oznacza grupę MgHal+, w której Hal oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a następnie alkilując związkiem o wzorze 17 w którym R² i X mają uprzednio podane znaczenia.

R²X (17)

181 323

Konwersję związku przejściowego o wzorze 2A w odpowiadający mu związek z metalem alkalicznym o wzorze 16A lub 16B można przeprowadzić poddając reakcji związek o wzorze 2A, w którym R² oznacza wodór, z alkilolitem (np. n-butylolitem lub t-butylolitem), ewentualnie w obecności tetrametyloetylenodiaminy, dialkiloamidolitu (np. diizopropyloamidolitu, dicykloheksyloamidolitu i izopropylo-cykloheksyloamidolitu), arylolitu (np. fenylolitu), wodorotlenku metalu alkalicznego (np. wodorotlenku litu, sodu lub potasu), wodorku metalu alkalicznego (np. wodorku sodu lub potasu), amidku metalu alkalicznego (np. amidków sodu lub potasu) lub odczynnika Grignarda (np. jodku metylomagnezu, bromku etylomagnezu lub bromku fenylomagnezu). Do wytworzenia związków o wzorze 16A konieczny jest jeden równoważnik zasady, podczas gdy do wytworzenia związków o wzorze 16B potrzebne są dwa równoważniki zasady. Wprowadzanie metalu korzystnie dokonuje się w obojętnym rozpuszczalniku organicznym w temperaturach pomiędzy -78°C i temperaturą wrzenia mieszaniny reakcyjnej. Gdy do wprowadzania metalu stosuje się alkilolit, arylolit, dialkiloamidolit lub odczynnik Grignarda, korzystne są takie rozpuszczalniki jak tetrahydrofuran, eter dietylowy lub dioksan, ewentualnie w mieszaninie z alifatycznymi lub aromatycznymi węglowodorami, takimi jak heksan lub benzen, a reakcję można prowadzić w temperaturach pomiędzy -20 i +80°C. Gdy wprowadzania metalu dokonuje się z użyciem wodorku metalu alkalicznego lub amidku metalu alkalicznego, obok wymienionych uprzednio rozpuszczalników można jeszcze stosować ksylen, toluen, acetonitryl, dimetyloformamid i sulfotlenek dimetylu, a gdy stosuje się wodorotlenek metalu alkalicznego, można również stosować alkohole, takie jak etanol, metanol, oraz alifatyczne ketony, takie jak aceton, jak również mieszaniny tych rozpuszczalników z wodą.

Do konwersji tak wytworzonej soli z metalem alkalicznym w związek o wzorze 2A, w którym R² ma znaczenie inne niż wodór, roztwór lub zawiesinę związku metalu alkalicznego poddaje się reakcji bezpośrednio, tj. bez wydzielania, ze związkiem o wzorze 17, w temperaturach pomiędzy -20° i temperaturą wrzenia mieszaniny reakcyjnej, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Wytwarzanie soli i innych pochodnych

Związki o wzorze 1 w razie potrzeby przeprowadzać można w ich nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne, stosując konwencjonalne sposoby; na przykład przez rozpuszczenie związku o wzorze 1 w odpowiednim rozpuszczalniku i traktowanie roztworu jednym lub więcej niż jednym równoważnikiem molowym żądanego kwasu lub zasady, w zależności od potrzeb. W zakres wynalazku wchodzą również takie sole.

Przykładami nieorganicznych i organicznych kwasów, które tworzyć mogą nietoksyczne, dopuszczalne farmaceutycznie sole addycyjne z kwasami związku o wzorze 1 są następujące kwasy: kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas azotowy, kwas metanosulfonowy, kwas winowy, kwas fumarowy, kwas octowy, i tym podobne. Przykładami nieorganicznych i organicznych zasad, które tworzyć mogą nietoksyczne, dopuszczalne farmaceutycznie sole addycyjne z zasadami związku o wzorze 1 są następujące zasady: wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek magnezu, amoniak, trometamina, i tym podobne. W zależności od potrzeb, związki o wzorze 1 mogą tworzyć sole addycyjne z jednym lub więcej niż jednym równoważnikiem molowym kwasu lub zasady.

Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że w niektórych przypadkach reakcji opisanych w metodach A do E nie można przeprowadzić w obecności reaktywnych związków przejściowych niekompatybilnych z warunkami reakcji. W takich przypadkach, stosując znane metody, reaktywny podstawnik należy najpierw przeprowadzić w pochodną zawierającą odpowiednią grupę ochronną, którą następnie można usunąć.

Właściwości biologiczne

Opisane powyżej związki o wzorze 1 wykazują działanie hamujące wobec odwrotnej transkryptazy HIV-1. Poprzez hamowanie odwrotnej transkryptazy HIV-1 związki te w rezultacie hamują lub likwidują zdolność wirusa do zintegrowania jego genomu z genomem komórki potencjalnego gospodarza, co z kolei hamuje lub likwiduje replikację wirusową. Tak więc, związki te podawane w odpowiedniej postaci użytkowej, pojedynczo lub w kombinacji z innymi środkami przeciwwirusowymi, immunomodulatorami, antybiotykami, środkami

181 323 przeciwko zakażeniom lub szczepionkami, są skuteczne w zapobieganiu lub leczeniu zakażeń HIV-1. .... .

Stosowane tutaj określenie „zakażenie HTV-1” obejmuje replikację HTV-1 u człowieka.

Stosowane tutaj określenie „leczenie zakażenia HIV-1” obejmuje częściowe lub całkowite zahamowanie lub likwidację replikacji HTV-1 u człowieka jako gospodarza, u którego już rozpoczęła się replikacja wirusa.

Stosowane tutaj określenie „zapobieganie zakażeniu HTV-1” obejmuje całkowite zapobieganie rozpoczęciu replikacji wirusa u człowieka, który jest narażony na HIV-1, ale u którego replikacja wirusa jeszcze się nie rozpoczęła.

Związki według wynalazku są skutecznymi środkami w leczeniu zakażeń HIV-1 ze względu na ich zdolność do częściowego lub całkowitego hamowania lub likwidowania replikacji HTV-1 u zakażonego nim człowieka.

Związki według wynalazku, gdy stosowane są do leczenia zakażeń HTV-1, mogą być podawane albo przed lub po stwierdzeniu objawów klinicznych zakażenia HIV-1, takich jak ARC lub AIDS.

Związki według wynalazku są skuteczne w zapobieganiu zakażeniu HIV-1 u ludzi ze względu na ich zdolność do zapobiegania rozpoczęciu replikacji wirusa u człowieka, który jest narażony na HTV-1, ale u którego replikacja wirusa jeszcze się nie rozpoczęła.

Związki według wynalazku można stosować w postaci kompozycji farmaceutycznej wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Takie kompozycje farmaceutyczne, które jako substancję czynną zawierają profilaktycznie lub terapeutycznie skuteczną ilość związku o wzorze 1, wchodzą również w zakres wynalazku.

Związki o wzorze 1 podawać można w dawce pojedynczej lub w dawkach podzielonych drogą doustną, pozajelitową lub miejscowo. Odpowiednia dawka doustna związku o wzorze 1 mieścić się będzie w zakresie około 100 mg do 3 g dziennie. Korzystną doustną dawką związku o wzorze 1 będzie maksymalna dawka tolerowana, która zazwyczaj mieści się w zakresie około 200 mg do 2 g dziennie. W preparatach pozajelitowych odpowiednia dawka użytkowa zawierać może od 0,1 do 250 mg związku, korzystnie 1 mg do 200 mg, a przy podawaniu miejscowym, korzystne są kompozycje zawierające 0,01 do 1% składnika aktywnego. Należy jednakże rozumieć, że podawana dawka będzie zmieniać się w zależności od pacjenta, a dawkowanie dla konkretnego pacjenta zależeć będzie od osądu lekarza, któremu jako kryteria przy ustalaniu właściwej dawki służyć będą wiek i stan zdrowia pacjenta, jak również odpowiedź pacjenta na lek.

Nośnikiem dla kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego może być obojętna organiczna bądź nieorganiczna substancja odpowiednia do podawania doustnego. Przykładami takich substancji są woda, żelatyna, talk, skrobia, stearynian magnezu, guma arabska, oleje roślinne, glikole polialkilenowe, wazelina itp.

Kompozycje farmaceutyczne można wytwarzać na drodze konwencjonalnymi sposobami, a gotowe postaci użytkowe mogą być stałe, na przykład tabletki, drażetki, kapsułki itp., w postaci cieczy, na przykład roztworów, zawiesin, emulsji itp. Kompozycje farmaceutyczne można poddawać konwencjonalnym technikom farmaceutycznym, takim jak sterylizacja. Ponadto, kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać konwencjonalne substancje pomocnicze, takie jak konserwanty, stabilizatory, emulgatory, substancje poprawiające smak, środki zwilżające, bufory, sole regulujące ciśnienie osmotyczne itp. Stałe nośniki, które można stosować, obejmują na przykład, skrobię, laktozę, mannitol, metylocelulozę, mikrokrystaliczną celulozę, talk, krzemionkę, dwuzasadowy fosforan wapnia oraz polimery o wysokim ciężarze cząsteczkowym (takie jak glikol polietylenowy).

Do stosowania pozajelitowego związek o wzorze 1 podawać można w wodnym lub niewodnym roztworze, zawiesinie lub emulsji w farmaceutycznie dopuszczalnym oleju lub w mieszaninie cieczy, które zawierać mogą środki bakteriostatyczne, przeciwutleniacze, środki konserwujące, bufory lub inne substancje rozpuszczone dla zapewnienia izotoniczności roztworu z krwią, środki zagęszczające, środki zawieszające lub inne dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze. Tego typu dodatki obejmują, na przykład, bufory winianowy, cytrynianowy i octanowy, etanol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, związki

181 323 tworzące kompleksy (takie jak EDTA), przeciwutleniacze (takie jak wodorosiarczyn sodu, pirosiarczyn sodu i kwas askorbinowy), polimery o wysokim ciężarze cząsteczkowym (takie jak ciekłe tlenki polietylenu) do regulowania lepkości i polietylenowe pochodne bezwodników sorbitu. W razie potrzeby można również dodać substancje konserwujące, takie jak kwas benzoesowy, metylo- lub propyloparaben, chlorek bezalkoniowy i inne czwartorzędowe związki amoniowe.

Związki według wynalazku mogą również być podawane w postaci roztworów do podawania donosowego, które obok związków według wynalazku mogą ponadto zawierać odpowiednie bufory, substancje regulujące toniczność, przeciwbakteryjne substancje konserwujące, przeciwutleniacze i środki zwiększające lepkość w wodnym nośniku. Przykładami środków stosowanych w celu zwiększenia lepkości są polialkohol winylowy, pochodne celulozy, poliwinylopirolidon, polisorbaty łub gliceryna. Stosowane środki przeciwbakteryjne obejmować mogą chlorek benzalkoniowy, timerozal, chloro-butanol lub alkohol fenyloetylowy.

Ponadto, związki według wynalazku mogą być podawane w postaci czopków.

Związki według wynalazku można podawać pojedynczo lub w kombinacji z innymi środkami przeciwwirusowymi, immunomodulatorami, antybiotykami, środka przeciwko zakażeniom lub szczepionkami. Przykładowo, związki według wynalazku podawać można w kombinacji z jednym lub więcej znanymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy HIV typu analogu nukleozydu, takim jak AZT, ddl i ddC, z nienukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy HIV lub z inhibitorami proteazy HIV.

Jak uprzednio stwierdzono, związki według wynalazku hamują aktywność enzymatyczną RT HIV-1. W oparciu o opisane poniżej badania tych związków, stwierdzono, że hamują one aktywność RNA-zależnęj polimerazy DNA RT HIV-1. Wiadomo (danych nie przedstawiono), że hamująone również aktywność DNA-zależnęj polimerazy DNA RT HfV-l.

Za pomocą opisanego poniżej tekstu z odwrotną transkryptazą (RT), testowano związki pod względem ich zdolności do hamowania aktywności RNA-zależnej polimerazy DNA RT HIV-1. W ten sposób badano niektóre konkretne związki opisane w przedstawionych poniżej przykładach. Wyniki tych badań przedstawiono w tabeli 1, poniżej.

TEST ODWROTNEJ TRANSKRYPTAZY (RT)

Teoria testu:

Jednym z enzymów kodowanych przez ludzki wirus niedoboru odporności (HIV-1) jest odwrotna transkryptaza (1), nazywana tak, ponieważ transkrybuje kopię DNA z matrycy RNA. Aktywność tę można zmierzyć ilościowo w opisanym uprzednio (2) teście na enzym wolny od komórek i jest ona oparta na obserwacji, że odwrotna transkryptaza może również wykorzystywać syntetyczną matrycę [poły r(C) i starter oligo d(G)] do transkrypcji znakowanej radioaktywnie kwasostrącalnęj nici DNA, z zastosowaniem ³H-dGTP jako substratu. W opisanym poniżej teście stosuje się enzym typu dzikiego (WT), który jest dominującą postacią enzymu obserwowaną u pacjentów zakażonych HIV-1. Zastosowanie mutantów enzymów RT (Y181CiY181L, wytworzonych bezpośrednio przez mutagenezę ukierunkowaną, w których resztę tyrozyny przy kodonie 181 zastąpiono, odpowiednio, resztą cysteiny lub leucyny) i analogicznych warunków testu umożliwia ocenę związków pod względem ich skuteczności w hamowaniu tych mutantów enzymów.

Materiały:

a) Wytworzenie enzymu typu dzikiego

Enzym, odwrotną transkryptazę, ze szczepu LAV ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV-1) (1) wyizolowano ze szczepu bakteryjnego JM109 (3), w którym zachodzi ekspresja klonu DNA pBRTprtl+ (2), pod kontrolą promotora lac w wektorze ekspresyjnym pIBI21 (4). Kulturę wyhodowaną przez noc w podłożu 2ΧΥΤ (37°C, 225 obr./min.) (5) uzupełnionym 100 pg/ml ampicyliny, w celu dodatniej selekcji, inokulowano przy rozcieńczeniu 1:40 do podłoża M9 uzupełnionego 10 pg/ml tiaminy, 0,5% hydrolizatu kazeiny i 50 pg/rnl ampicyliny (5). Hodowlę inkubowano (37°C, 225 obr./min.) aż osiągnęła ona wartość OD540 0,30,4. W tym czasie dodano inhibitor represora IPTG (izopropylo-p-D-tiogalaktopiranozyd) do 0,5 mM i mieszaninę inkubowano jeszcze przez 2 godziny. Bakterie osadzono, zawieszono ponownie w buforze obejmującym 50 mM Tris, 0,6 mM EDTA, 0,375 M NaCl i trawiono

181 323 dodatkiem lizozymu (1 mg/ml) przez 30 minut na lodzie. Komórki poddano lizie dodatkiem 0,2% NP-40 i przeniesiono do 1 M NaCl.

Po usunięciu nierozpuszczonego debris przez odwirowanie, białko wytrącono dodatkiem 3 objętości nasyconego wodnego roztworu siarczanu amonu. Enzym zebrano, zawieszono w buforze RT (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1% NP-40, 0,1 M NaCl i 50% gliceryny) i przechowywano w temperaturze -70°C do dalszego stosowania.

b) Skład 2X zatężonej podstawowej mieszaniny reakcyjnej

Reagent podstawowej mieszaniny	2X stężenie mieszaniny
1 M Tris pH 7,4	100 mM
1 M Ditiotreitol	40 mM
1 MNaCl	120 mM
1% Nonidet P-40	0,1 %
1 M MgCl	4 mM
[poły r(C)/oligo d(G)] (5:1) Ή-dGTP (81 μΜ)	2 μg/ml 0,6 μΜ
Procedura testu:

2x zatężoną podstawową mieszaninę reakcyjną podzielono na porcje i przechowywano w -20°C. Mieszanina zestaliła się i przed stosowaniem w każdym teście była rozmrażana. Test ten został dostosowany do układu płytek do mikromianowania z 96 dołkami, uprzednio opisanego (6). Na płytkach do mikromianowania z 96 dołkami umieszczono bufor Tris (50 mM, pH 7,4), nośnik (rozcieńczony rozpuszczalnik dla ustalenia rozcieńczenia związku) lub związki w nośniku (10 μΐ/dołek; 3 dołki/związek). Rozmrożono enzym RT HIV-1, rozcieńczono w 50 mM Tris pH 7,0, tak że piętnaście μί rozcieńczonego enzymu zawierało 0,0001 jednostek (jedna jednostka stanowi taką ilość enzymu, która przekształca 1 pmol substratu na minutę w 25°C) i do każdego dołka dodano po 15 μί. Do pierwszych trzech dołków płytki do mikromianowania dodano 20 μί 0,12-0,5 M EDTA. EDTA chelatyzuje występujący Mg^ i zapobiega odwrotnej transkrypcji. Grupa ta, odjęta od wszystkich pozostałych grup, służy jako podstawa polimeryzacji. 25 μί 2X mieszaniny reakcyjnej dodano do wszystkich dołków i pozostawiono do inkubowania w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Test zakończono wytrącając DNA w każdym dołku za pomocą 50 μί 10% kwasu trichlorooctowego (TCA) (10% wag./obj.) w pirofosforanie sodu (1% wag./obj.). Płytkę do mikromianowania inkubowano przez 15 minut w 4°C, a osad zebrano na bibule z włókna szklanego # 30, stosując półautomatyczne urządzenie do zbierania Skatron. Następnie filtry przemyto jeszcze TCA (5%), zawierającym pirofosforan sodu (1%), przepłukano wodnym roztworem etanolu (70%), wysuszono i przeniesiono do fiolek scyntylacyjnych (6). Do każdej fiolki dodano 2 ml mieszaniny scyntylacyjnej i zliczono w β-liczniku Beckman. Procent hamowania obliczono, jak następuje:

Średnia wartość w teście CPM - Średnia wartość w badaniu kontrolnym CPM % hamowania --------------------------------------------------x 100

Średnia wartość w badaniu kontrolnym CPM

Literatura:

1. S. Benn, i in., Science 230:949, 1985

2. W.G. Farmerie i in., Science 236:305,1987

3. C. Yanisch-Perron, J. Viera i J. Messing, Gene 33:103, 1985

4. International Biotechnologies, Inc. New Haven, CT 06535

5. T. Maniatis, E.F. Fritsch i J. Sambrook, wyd. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982

6. T. Spira i in., J. Clinical Microbiology, 25:97, 1987.

W celu potwierdzenia, że związki, które są aktywne w testach z RT, są również zdolne do hamowania replikacji HIV w żywym organizmie, związki według wynalazku badano również w hodowli ludzkich limfocytów T (Syncytia), co opisano poniżej. Wyniki tych badań przedstawiono w tabeli 1.

181 323

TEST SYNCYTII (HODOWLA LUDZKICH LIMFOCYTÓW T)

Teoria testu:

Tworzenie się syncytii jest cechą hodowli in vitro limfocytów T CD4+ zakażonych HTV-L W teście tym, limfocyty T traktuje się związkami, które przypuszczalnie hamują replikację, a następnie zakaża się HIV-1. Po inkubacji, hodowlę sprawdza się pod kątem tworzenia się syncytiów. Jako miarę zdolności badanych związków do zahamowania replikacji HIV przyjęto brak lub zmniejszenie liczby syncytiów.

Procedura testu:

Założono hodowlę komórek docelowych, oznaczonych c8166, stanowiących subklon komórek chłoniaka ludzkiego pochodzących z limfocytów T, o początkowej gęstości 5 χ 10⁴na 100 μΐ, w podłożu do hodowli RPMI 1640 (+ 10% płodowej surowicy wołowej), na płytkach z 96 płaskodennymi dołkami. Dodano wybrane ilości badanego związku, rozpuszczonego w DMSO. Po 24 godzinach każdą hodowlę inokulowano 50-100 TCID₅₀ (dawka, która wywołuje efekt w 50% badanych hodowli) szczepu HTLV-IIIB HIV-1 (2). Hodowle kontrolne traktowano związkiem lub tylko wirusem. Cztery dni po ekspozycji na wirusa hodowle oceniano wizualnie na częstość i rozkład wywołanych wirusem komórek-olbrzymów syncytia. Procent zahamowania przez badane związki wyznaczono przez porównanie z wartościami kontrolnymi. Potwierdzenie występowania lub braku replikacji wirusowej przeprowadzono zbierając wolny od komórek płyn hodowli ze wszystkich grup eksperymentalnych i określono obecność lub brak zakażonego potomstwa wirusa przez wywołanie tworzenia się syncytiów we wtórnych hodowlach ludzkich limfocytów T po 3 dniach.

Literatura:

(1) M. Somasundaran i H.L. Robinson, Science 242, 1554 (1988).

(2) G.M. Shaw, R.H. Hahn, S.K. Arya, J.E. Groopman, R.C. Galio i F. Wong-Staal, Science, 226, 1165(1984).

Dla oszacowania specyficznej aktywności hamującej związków według wynalazku wobec enzymu, kilka z nich badano stosując znane procedury testowe pod względem ich zdolności do hamowania odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki kociej i alfa-polimerazy DNA pochodzącego z grasicy cielęcej. U żadnego z badanych związków nie stwierdzono działania hamującego wobec tych enzymów. Wyniki te wskazują, że aktywność hamująca związków według wynalazku wobec enzymu jest skierowana szczególnie przeciwko RT HIV-1.

Dla dokonania zgrubnej oceny cytotoksyczności związków według wynalazku, niektóre z nich badano w opisanych poniżej testach MTT. Wyniki tego badania przedstawiono poniżej w tabeli 1. Korzystne są związki o stosunkowo wysokim CC₅₀.

TEST MMT

Teoria testu:

Test MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazołu) jest oparty na odszczepianiu bromku tetrazoliowego przez metabolicznie aktywne komórki, w wyniku czego powstaje silne niebieskie zabarwienie. Opisany uprzednio test (1) zoptymalizowano dla celów przedstawionego tu badania.

Procedura testu:

Jako docelową linię komórkową w teście stosowano linię komórkową H9 (2), która jest linią komórkową chłoniaka ludzkiego, zawieszoną w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą wołową. Komórki (100 μΐ) umieszczono w dołkach płytek do mikromianowania w stężeniu 10⁵ komórek na ml w obecności różnych stężeń inhibitora. Komórki inkubowano w 37°C w wilgotnym inkubatorze w obecności CO₂. Po pięciu dniach do każdego dołka dodano 20 μΐ MTT (5 mg/ml w RPMI 1640, poddano działaniu ultradźwięków, sączono przez filtr 0,2 pm i przechowywano w 4°C). Po 4 godzinach dodatkowej inkubacji w 37°C do każdego dołka dodano 60 μΐ Tritonu-X i starannie mieszano, aby zsolubilizować kryształy. Do każdego dołka dodano absolutnego etanolu (5 μΐ) i wytworzoną mieszaninę inkubowano przez 30 minut w 60°C i natychmiast odczytano na czytniku płytkowym (Dynatech) przy długości fali 570 nm.

181 323

Dane z tego testu wykorzystuje się do przeprowadzenia nieliniowej analizy regresyjnej, na podstawie której oblicza się CC₅₀.

Literatura:

1. Tim. J. Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55,1983.

2. J.P. Jacobs, J. Natl. Cancer Inst., 34:231, 1965.

Tabela 1

Związek z przykładu nr	Test odwrotnej transkryptazy % zahamowania (1 μΜ)	Test Scyncytii IC50 (μΜ)	Test MTT CC₅₀ (μΜ)
WT	Y181C	Y188L
1	97	96	77	0,04	>60
2	67	72	13	NT	>60
3	63	36	24	NT	NT
4	60	54	29	NT	>60
5	90	90	63	NT	>60
6	94	87	84	0,01	>60
7	94	84	52	NT	NT
8	96	80	80	NT	NT
9	67	67	20	NT	NT
10	94	73	66	NT	NT
11	81	51	NT	NT	NT
12	95	91	78	0,04	>50
13	88	80	17	0,16	NT
14	74	51	23	NT	NT
15	52	59	10	NT	NT
16	83	74	34	NT	NT
17	78	62	27	NT	NT
18	87	82	57	NT	NT
19	91	75	55	NT	NT
20	65	36	26 .	NT	NT
21	33	28	46	NT	NT
22	76	72	30	NT	NT
23	58	37	47	NT	NT
24	39	50	18	NT	NT
25	92	86	80	80	>80
26	64	33	20	NT	NT
27	61	45	58	NT	NT
28	96	93	72	NT	> 15

Przykłady

Wynalazek niniejszy jest zilustrowany następującymi przykładami, które umożliwiają specjalistom w tej dziedzinie pełniejsze jego zrozumienie. Jednakże, rozumieć należy, że wynalazek nie jest ograniczony do poniżej zamieszczonych konkretnych przykładów. Nie opisane poniżej sposoby wytwarzania związków wyjściowych znaleźć można w będącym w trakcie rozpatrywania zgłoszeniu patentowym USA Nr Seryjny 08/091,418, złożonym 13 lipca 1993 oraz w europejskim zgłoszeniu patentowym Nr 90 121 954,3 (nr publikacji 0 429 987).

Przykład 1.

5,11 -dihydro-11 -etylo-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo [3,2-b:2', 3' -e] [ 1,4]diazepin6-on

a) 4-(tributylostannylo)pirazol

181 323

Do oziębionego do -60°C roztworu 4-jodopirazolu (0,964 g) w THF (20 ml) pod azotem dodano t-butylolitu (1,7 M, roztwór w pentanie, 9 ml), z taką szybkością aby utrzymać temperaturę poniżej -55°Ć. Następnie dodano chlorku tributylocyny (1,2 ml) i mieszaninę pozostawiono, aby ogrzała się do temperatury pokojowej. Reakcję przerwano dodatkiem wody, rozcieńczono octanem etylu, przemyto wodą wysuszono (bezwodny Na^OJ, przesączono i odparowano. Po chromatografii pozostałości na żelu krzemionkowym (octan etylu/heksan) uzyskano 4-(tributylostannylo)pirazol (0,288 g) w postaci oleju.

b) 5,11 -dihydro-11 -etylo-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3'-e][ 1,4]diazepin6-on

Mieszaninę 4-(tributylostannylo)pirazolu (0,270 g), 5,11-dihydro-11-etylo-5-metylo-2trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,292 g), LiCl (0,157 g) i Pd(PPH₃)₂Cl₂ (0,034 g) w DMF (2 ml) ogrzewano w szczelnej kolbie w temperaturze 130°C przez 15,5 godziny. Mieszaninę oziębiono do temperatury pokojowej i przez 2 godziny mieszano z wodnym roztworem fluorku potasu. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu, przemyto wodą wysuszono (bezwodny Na2SO₄), przesączono i odparowano. Pozostałość rozfrakcjonowano na żelu krzemionkowym (gradient octan etylu/heksan) i otrzymano związek tytułowy, który krystalizował z mieszaniny octanu etylu i eteru izopropylowego, temp. topn. 194-196°C.

Przykład 2.

5,11-dihydro-11-etylo-2-( 1-etylopirazol-4-ilo)-5-metylo-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (pianą temp. topn. 60-62°C) wytworzono z 5,11-dihydro-llety lo-5 -metylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo [3,2-b: 2' ,3'-e] [ 1,4] diazepin-6-onu i N-etylo-4-jodopirazolu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1.

Przykład 3.

5,11 -dihydro-11 -etylo-5-metylo-2-( 1 -metylopirazol-4-ylo)-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 65-67°C) wytworzono z 5,11-dihydro-lletylo-5-metylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e] [ 1,4]diazepin-6-onu i N-metylo-4-jodopirazolu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1.

Przykład 4.

5,11 -dihydro-1 l-n-propylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2 ',3 '-e] [ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 291-292°Ć) wytworzono z 5,11-dihydro-ll-n-propylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e][ 1,4]diazepin-6-onu i 4(tributylostannylo)pirazołu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1.

Przykład 5.

5,1 l-dihydro-5-metylo-l l-n-propylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 206-207°C) wytworzono z 5,ll-dihydro-5-metylo-ll-n-propylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu i 4-(tributylostannylo)pirazolu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1.

Przykład 6.

5,ll-dihydro-5-metylo-ll-c-propylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 233-235°C) wytworzono z 5,ll-dihydro-5-metylo-ll-cpropylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e][l ,4]diazepin-6-onu i 4(tributylostannylo)pirazolu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1.

Przykład 7.

2-(l-karbamylopirazol-3-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][1,4] diazepin-6-on

Do roztworu 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,054 g) w chloroformie (5 ml) dodano trifosgenu (0,050 g) i diizopropyloetyloaminy (0,2 g). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Następnie dodano stężonego roztworu wodorotlenku amonu (10 kropli) i mieszaninę

181 323 mieszano przez 10 minut. Mieszaninę rozcieńczono chloroformem, przemyto wodą wysuszono (bezwodny Na2SO₄), przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (octan etylu/etanol) i otrzymano związek tytułowy, który krystalizował z mieszaniny octan etylu/eter izopropylowy, temp, topn. 175-180°C.

Przykład 8 .

2-(l-acetylopirazol-4-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e] [ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 186-188°C) wytworzono z 5,ll-dihydro-ll-etylo-5metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu, ogrzewając przez 1 godzinę do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w bezwodniku kwasu octowego w obecności octanu potasu.

Przykład 9.

5,11 -dihydro-11 -etylo-5-metylo-2-(3-pirazolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2 ',3 '-e] [ 1,4]diazepin-6on

Mieszaninę 5,1 l-dihydro-[l-(N,N-dimetyloaminosulfonylo)pirazol-5-ilo]-l l-etylo-5metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,051 g) i hydratu hydrazyny (0,41 g) w etanolu (0,5 ml) mieszano i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3 dni. Oziębioną mieszaninę rozcieńczono octanem etylu, przemyto wodą wysuszono (bezwodny NajSOJ, przesączono i odparowano. Pozostałość rozfrakcjonowano metodą preparatywnej chromatografii płytkowej (octan etylu/heksan) i otrzymano 0,020 g związku tytułowego w postaci piany.

Przykład 10.

5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(3-metylopirazol-4-iloi-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 113-115°C) wytworzone z 5,ll-dihydro-ll-etylo-5metylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu i 3metylo-4-(tributylostannylo)pirazolu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1.

Przykład 11.

5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(l-metylopirol-2-ilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on

a) (l-metylopirol-2-ilo)tributylocyna

Do oziębionego (-35°C) roztworu butylolitu (2,5 M, 0,32 ml) w suchym THF (5 ml) dodano podczas mieszania 1-metylopirolu (0,065 g). Następnie dodano Ν,Ν,Ν',Ν'tetrametyloetylenodiaminy (0,090 g) i mieszaninę mieszano przez 90 minut w temperaturze -10 do -15°C. Następnie powoli dodano chlorku tributylocyny (0,26 g) i mieszaninę pozostawiono, aby ogrzała się do temperatury pokojowej, mieszając przez 15 minut. Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano (l-metylopirol-2-ilo)tributylocynę, odpowiednią do stosowania w następnej reakcji.

b) 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(l-metylopirol-2-ilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][ 1,4]diazepin-6-on .

Mieszaninę wytworzonej powyżej (l-metylopirol-2-ilo)tributylocyny, 5,11-dihydro-l 1etylo-5-metylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 -e][ 1,4]diazepin-6-onu (0,20 g), Pd(PPh₃)₂Cl₂ (0,010 g), LiCl (0,100 g) i suchego DMF (5 ml) mieszano w temperaturze 90°C przez 15 minut. Po oziębieniu do temperatury pokojowej, mieszaninę rozcieńczono wodą ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny MgSO₄), przesączono i zatężono. Pozostałość najpierw poddano chromatografii kolumnowej, stosując mieszaninę octan etylu/heksany (1:4), a następnie mieszaninę octan etylu/heksany (1:1) i otrzymano mieszaninę dwóch produktów. Po końcowym oczyszczeniu na kolumnie do preparatywnej chromatografii (octan etylu/heksany, 1:1) otrzymano 0,025 g związku tytułowego w postaci piany, temp, topn. > 60°C.

Przykład 12.

5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][l,4]diazepin

6-on

181 323

a) 3-bromo-1 -(triizopropylosililo)pirol

Do roztworu l-(triizopropylosililo)pirolu (8,00 g) w suchym THF (80 ml) w temperaturze -78°C w jednej porcji dodano podczas mieszania NBS (6,4 g). Mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 2 godziny, a następnie pozostawiono na noc, aby ogrzała się do temperatury pokojowej. Usunięto rozpuszczalnik, do pozostałości dodano wody i produkt ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny Na^OJ, przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (heksany) i zatężono, uzyskując 10,00 g 3-hromo-l-(triizopropylosililo)pirolu w postaci bezbarwnego oleju.

b) [l-(triizopropylosililo)pirol-3-ilo]tributylocynę wytworzono w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 16.

c) 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-[l-(triizopropylosililo)pirol-3-ilo]-6H-dipirydo-[3,2b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on wytworzono w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 16.

d) 5,11-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin6-onu

Do roztworu 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-[l-(triizopropylosililo)pirol-3-ilo]6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,17 g) w suchym THF (10 ml) dodano fluorku tetrabutyloamoniowego w THF (IM, 0,36 ml). Wytworzoną mieszaninę mieszano przez 1 godzinę, po czym rozcieńczono eterem, przemyto wodą wysuszono (bezwodny NajSOJ, przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (octan etylu/heksany, 1:1), a następnie krystalizowano z mieszaniny chloroform/heksany i otrzymano 0,083 g związku tytułowego, temp. topn. 173-174°C.

Przykład 13.

5,11 -dihydro-11 -etylo-5-metylo-2-(2-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2 ',3 '-e] [ 1,4]diazepin-6on

a) 1 -(t-butoksykarbonylo)pirol-2-ilo)tributylocyna

Do oziębionego (-78°C) roztworu l-(t-butoksykarbonylo)pirolu (0,67 g) w suchym THF (5 ml) dodano powoli LDA w suchym THF (1,2 M, 0,83 ml). Po 3 godzinach mieszania powoli dodano chlorku tributylocyny (0,65 g) i mieszaninę pozostawiono, aby ogrzała się do temperatury pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto i otrzymano l-(tbutoksykarbonylo)pirol-2-ilo)tributylocynę, odpowiednią do stosowania w następnej reakcji.

b) Mieszaninę 5,11 -dihydro-11 -etylo-5 -metylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6Hdipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,2 g), wytworzonej powyżej l-(tbutoksykarbonylo)pirol-2-ilo)tributylocyny, Pd(PPh₃)₄ (0,065 g), LiCl (0,127 g) i suchego dioksanu (8 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny. Następnie odparowano rozpuszczalnik, a pozostałość rozpuszczono w CH₂C1₂, przemyto wodą wysuszono (bezwodny Na^OJ, przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (octan etylu/heksany, 1:1), a następnie krystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksany. Grupę BOC usunięto, przez 30 minut mieszając produkt kondensacji z mieszaniną HCl/eter. Odparowano rozpuszczalnik, a pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii płytkowej (octan etylu/heksany, 1:4), otrzymując 0,022 g związku tytułowego w postaci piany, temp. topn. > 60°C.

Przykład 14.

2-( 1 -acety lopirol-2-ilo)-5,11 -dihydro-11 -etylo-5-metylo-6H-dipirydo- [3,2-b :2' ,3 '-e] [l,4]diazepin-6-on

Do roztworu 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(2-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,100 g) w suchym DMF (3 ml) dodano wodorku sodu (0,013 g, 60% roztwór w oleju) i mieszano przez 30 minut. Po oziębieniu do 0°C dodano chlorku acetylu (0,025 g) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono na noc, aby ogrzała się do temperatury pokojowej. Dodano wody i produkt ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny Na^OJ, przesączono i odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii płytkowej (octan etylu/heksany, 1:1). Po krystalizacji z mieszaniny octan etylu/eter naftowy otrzymano 0,018 g związku tytułowego, temp. topn. 106-108°C.

181 323

Przykład 15.

2-(acetylopirol-3-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on, temp. topn. > 80°C

Do oziębionego (10°C) suchego N,N-dimetyloacetamidu (0,031 g) dodano tlenochlorku fosforu (0,054 g), a po usunięciu łaźni oziębiającej mieszaninę mieszano przez 15 minut. Dodano dichloroetanu (2 ml) i wytworzoną mieszaninę oziębiono do 5°C. W ciągu 10 minut dodano 5,1 l-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e] [l,4]diazepin-6onu (0,10 g) w dichloroetanie (5 ml), usunięto łaźnię oziębiającą i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3 godziny. Po oziębieniu do temperatury pokojowej, mieszaninę wylano do nadmiaru wodnego roztworu octanu sodu i mieszano przez 2 godziny. Produkt ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny Na₂SO₄), przesączono i odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii płytkowej (eter) i otrzymano 0,014 g związku tytułowego w postaci piany, temp. topn. > 80°C. Wydzielono również 0,038 g 2-(2-acetylopirol-4-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin6-onu (przykład 17), temp. topn. 219-220°C.

Przykład 16.

5,11 -dihydro-2-[2-(etoksykarbonylo)pirol-4-ilo]-11 -etylo-5-metylo-6H-dipirydo[3,2-b :2 ',3'-e] [ 1,4]diazepin-6-on

a) Do roztworu 5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'e][l,4]diazepin-6-onu (0,052 g) (2,5 ml) w eterze metylowym glikolu dietylenowego („digłim”) dodano chlorku trichloroacetylu (0,114 g) i wytworzoną mieszaninę mieszano w temperaturze 100°C przez 2 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną wylano na lód, produkt ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny Na2SO₄), przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (octan etylu/chlorek metylenu, 1:9), i otrzymano 0,070 g 5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-[2-(trichloroacetylo)pirol-4-ilo]-6Hdipirydo-[3,2-b:2 ',3 '-e][l ,4]diazepin-6-onu.

b) Do absolutnego etanolu (6 ml) i trietyloaminy (0,035 g) dodano produktu z przykładu 16a (0,065 g) i wytworzoną mieszaninę mieszano w temperaturze 90°C przez 10 godzin. Po oczyszczeniu jak w przykładzie 16a, a następnie krystalizacji z octanu etylu/heksanów, otrzymano 0,048 g związku tytułowego, temp. topn. 209-210°C.

Przykład 17.

2-(2-acetylopirol-4-ilo)-5,11-dihydro-11-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 219-220°C) wydzielono z mieszaniny reakcyjnej, jak opisano w przykładzie 20.

Przykład 18.

2-(2-cyjanopirol-3-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on

Roztwór 5,11-dihydro-1 l-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,093 g) w DMF (1 ml) i CH₃CN (1 ml) oziębiono do -50°C i w jednej porcji dodano izocyjanianu chlorosulfonylu (0,041 g). Wytworzoną mieszaninę pozostawiono, aby ogrzała się do temperatury pokojowej i mieszano przez 2 godziny, po czym przelano do wody, ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny Ną2SO₄), przesączono i odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii płytkowej (eter) i otrzymano dwa czyste związki. Po krystalizacji każdego z tych czystych związków z mieszaniny octan etylu/eter naftowy otrzymano 0,038 g związku tytułowego, temp. topn. 262-263°C, i 0,038 g 2-(2-cyjanopirol-4-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin6-onu, temp. topn. 268-269°C.

Przykład 19.

2-(2-cyjanopirol-4-ilo)-5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][ 1,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 268-269°C) wydzielono z mieszaniny reakcyjnej, jak opisano w przykładzie 18.

181 323

Przykład 20.

5,11-dihdyro-l l-etylo-5-metylo-2-(l-metylopirol-3-ilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][ 1,4] di azepin-6-on

Do roztworu 5,11-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (0,065 g) w suchym DMF (3 ml) dodano wodorku sodu (0,008 g, 60% roztwór w oleju) i mieszano przez 30 minut. Dodano jodku metylu (0,2 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 2 godziny. Dodano wody i produkt ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny NajSO^, przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (octan etylu/heksany, 1:1), a następnie oczyszczono na płytce do preparatywnej chromatografii (octan etylu/heksany, 1:1) i otrzymano 0,040 g związku tytułowego, temp. topn. 187-188°C.

Przykład 21.

2-(2-karboksypirol-4-ilo)-5,l 1-dihydro-l l-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][1,4] diazepin-6-on

Mieszaninę 0,092 g 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-[2-(trichloroacetylo)pirol-4-ilo]6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (przykład 21a), K₂CO₃ (0,55 g) i wody (2,5 ml) mieszano w temperaturze 95°C przez 1,5 godziny. Mieszaninę oziębiono, zakwaszono i przemyto CH₂C1₂. Fazę wodną przesączono i otrzymano 0,016 g związku tytułowego, który rekrystalizowano z mieszaniny kwasu octowego i heksanów, temp. topn. 256-257°C.

Przykład 22.

2-(2-karbamylopirol-4-ilo)-5,l 1-dihydro-l l-etylo-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 'e]- [l,4]diazepin-6-on

Roztwór 0,100 g 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-[2-(trichloroacetylo)pirol-4-ilo]-6Hdipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu (przykład 21a) w suchym THF (15 ml) oziębiono do -15° i przez roztwór przez 15 minut barbotowano gazowy amoniak. Następnie mieszaninę szczelnie zamknięto i mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu rozpuszczalnika dodano wody i mieszaninę przemyto CH₂C1₂. Produkt odsączono od fazy wodnej, wysuszono i rekrystalizowano z mieszaniny DMF/etanol, uzyskując 0,056 g związku tytułowego, temp. topn. 284-285°C .

Przykład 23.

5,1 l-dihydro-5-etylo-l l-metylo-2-(2-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][l,4]diazepin6-on

Mieszaninę 2-chloro-5,l l-dihydro-5-etylo-l l-metylo-6H-dipirydo[3,2-b:2',3 '-e][l,4]diazepin-6-onu (0,21 g), (t-butoksykarbonylo)pirolu (0,25 g), octanu potasu (0,20 g), Pd(PPh₃)₂Cl₂ (0,030 g) i l-metylo-2-pirolidynonu (2,5 ml) ogrzewano w uszczelnionej kolbie w temperaturze 140°C przez 14 godzin. Po usunięciu rozpuszczalnika dodano wody i produkt ekstrahowano CH₂C1₂, wysuszono (bezwodny Na^OJ, przesączono i odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (octan etylu/chlorek metylenu, 1:9), a następnie oczyszczono na płytce do preparatywnej chromatografii (octan etylu/chlorek metylenu, 1:9) i po rekrystalizacji z mieszaniny octan etylu/heksany otrzymano 0,020 g związku tytułowego, temp. topn. 161-162°C.

Przykład 24.

5,11 -dihydro-5,11 -dimetylo-2-(2-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2 ',3 '-e] [ 1,4]diazepin-6on

Związek tytułowy (temp. 158-160°C) wytworzono z 2-chloro-5,ll-dihydro-5,lldimetylo-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-onu i (t-butoksykarbonylo)pirolu w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 23.

Przykład 25.

-cyklopropylo-5,11 -dihydro-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2 ',3 '-e][l,4]diazepin-6-on

Związek tytułowy (temp. topn. 254-255°C) wytworzono z ll-cyklopropylo-5,11dihydro-5-metylo-2-trifluorometanosulfonyloksy-6H-dipirydo[3,2-b:2',3 '-e][l,4]diazepin-6onu i [l-(triizo-propylosililo)piroł-3-ilo]tributylocyny w sposób analogiczny do opisanego w przykładach 16 i 17.

181 323

Związki według następujących przykładów wytworzono w sposób analogiczny do opisanych powyżej albo na drodze ich oczywistych modyfikacji.

Przykład 26.

5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3 '-e][l,4]diazepin-6on, temp. topn. 213-214°C.

Przykład 27.

5,11-dihydro-l l-etylo-2-(5-metoksyindol-2-ilo)-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on, temp. topn. 234,5-235,5°C.

Przykład 28.

5,11-dihydro-l l-etylo-2-(indol-3-ilo)-5-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6on, temp. topn. 241-241,5°C.

Przykład A. Kapsułki lub tabletki

A-l

Składniki Ilość

Związek z prz. 12 250mg

Skrobia 160mg

Mikrokrystaliczna celuloza 90mg

Sól sodowa glikolanu skrobi10 mg

Krzemionka koloidalna 1mg

A-2

SkładnikiIlość

Związek z prz. 12 50mg

Fosforan diwapnia 160mg

Mikrokrystaliczna celuloza 90mg

Kwas stearynowy 5mg

Sól sodowa glikolanu skrobi 10mg

Krzemionka koloidalna 1mg

Związek z przykładu 12 miesza się ze sproszkowaną mieszaniną zmieszanych wstępnie substancji pomocniczych, określonych powyżej, z wyjątkiem substancji poślizgowej. Następnie miesza się z substancją poślizgową i wytworzoną mieszaninę sprasowuje się na tabletki, lub napełnia się nią twarde kapsułki żelatynowe.

Przykład B. Roztwory do podawania pozajelitowego

Składniki Ilość

Związek z prz. 12 500 mg

Kwas winowy 1,5 g

Alkohol benzylowy 0,1% wag.

Woda do iniekcji q.s.do 100 ml

Substancje pomocnicze miesza się z wodą i następnie dodaje związek z przykładu 12. Miesza się dalej, aż do uzyskania klarownego roztworu. pH roztworu reguluje się do wartości 3,0, a następnie napełnia się odpowiednie fiolki lub ampułki i sterylizuje w autoklawie.

181 323

Przykład C. Roztwory do podawania do nosa

Składniki	Ilość
Związek z prz. 12	100 mg
Kwas cytrynowy	1,92 g
Chlorek benzalkoniowy	0,025% wag.
EDTA	0,1% wag.
Alkohol poliwinylowy	10% wag.
Woda	q.s. do 100 ml

Substancje pomocnicze miesza się z wodą i następnie dodaje związek z przykładu 12. Miesza się dalej, aź do uzyskania klarownego roztworu. pH roztworu reguluje się do wartości 4,0, a następnie napełnia się odpowiednie fiolki lub ampułki.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 2-heteroarylo-5,ll-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]-diazepiny, o wzorze 1

w którym 1

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 6 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, Π, ΙΠ, IV lub V

w których

R⁵ oznacza wodór, metyl, etyl, acetyl;

każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ we wzorach Ι-ΙΠ oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową, a obydwa z dwu pozostałych podstawników oznaczają wodór; a R⁶ we wzorach IV i V oznacza wodór, metyl lub etyl;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna może ewentualnie być podstawiona R⁹; a

181 323

R⁹ we wzorze IV i V oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla;

lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
2. Nowe związki, 2-heteroarylo-5,l l-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]-diazepiny, o wzorze 1

w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 6 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, Π, III, IV lub V

I

III

w których

R⁵ oznacza aminokarbonyl;

każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza wodór, albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ we wzorach Ι-ΙΠ oznacza grupę karboksylową, a pozostałe dwa podstawniki oznaczają wodór, a R⁶ we wzorach IV i V oznacza acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, karboksyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna może ewentualnie być podstawiona R⁹; a

R⁹ we wzorze IV i V oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla;

lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
3. Związki o wzorze 1 według zastrz. 1, w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

181 323

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 4 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, Π, ΙΠ, IV lub V, w którym

R⁵ oznacza wodór, metyl lub etyl, każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową a każdy z pozostałych dwu podstawników oznacza wodór, każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową z których jedna ewentualnie może być podstawiona R⁹; a

R⁹ oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla; lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
4. Związki o wzorze 1 według zastrz. 1, w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza metyl;

R² oznacza alkil o 2 lub 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 lub 4 atomach węgla;

każdy z R³ i R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, II lub ΠΙ, gdzie

R⁵ oznacza wodór lub metyl;

każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo, jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza metyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl albo grupę cyjanową a pozostałe dwa podstawniki oznaczają atomy wodoru; albo

Ar oznacza grupę o wzorze IV lub V, gdzie

R⁵ oznacza wodór lub metyl;

R⁶ oznacza atom wodoru lub metyl, każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową z których jedna ewentualnie może być podstawiona R⁹; a

R⁹ oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węglą lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
5. Związki według zastrz. 1, wybrane z grupy obejmującej:

5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3 e] [ 1,4]diazepin-6-on;

ll-cyklopropylo-5,ll-dihydro-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on;

ll-cyklopropylo-5,ll-dihydro-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on; oraz oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
6. Związek według zastrz. 2, o wzorze 1, którym jest 5,ll-dihydro-ll-etylo-5metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2 ',3 '-e] [ 1,4]diazepin-6-on;

oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
7. Kompozycja farmaceutyczna nadająca się do zapobiegania lub leczenia zakażeń HIV-1 zawierająca substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera profilaktycznie lub terapeutycznie skuteczną ilość związku o wzorze 1

181 323 w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 6 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, Π, HI, IV lub V

III

w których

R⁵ oznacza wodór, metyl, etyl, acetyl;

każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ we wzorach I-III oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową, ą obydwa z dwu pozostałych podstawników oznaczają wodór; a R⁶ we wzorach IV i V oznacza wodór, metyl lub etyl;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna może ewentualnie być podstawiona R⁹; a

R⁹ we wzorze IV i V oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.
8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera związek o wzorze 1, w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 4 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, II, III, IV lub V, w którym

R⁵ oznacza wodór, metyl lub etyl, każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza metyl, etyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową a każdy z pozostałych dwu podstawników oznacza wodór;

każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową, z których jedna ewentualnie może być podstawiona R⁹; a

R⁹ oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla; lub

181 323 jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera związek o wzorze 1, w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza metyl;

R² oznacza alkil o 2 lub 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 lub 4 atomach węgla;

każdy z R³ i R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze I, II lub III, gdzie

R⁵ oznacza wodór lub metyl;

każdy z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza atom wodoru; albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ oznacza metyl, acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl albo grupę cyjanową; a pozostałe dwa podstawniki oznaczają atomy wodoru; albo

Ar oznacza grupę o wzorze IV lub V, gdzie

R⁵ oznacza wodór lub metyl;

R⁶ oznacza atom wodoru lub metyl, każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową z których jedna ewentualnie może być podstawiona R⁹; a

R⁹ oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
10. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera związek wybrany z grupy obejmującej

5,ll-dihydro-ll-etylo-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin6-on;

1 l-cyklopropylo-5,1 l-dihydro-5-metylo-2-(3-pirolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3 '-e][ 1,4]diazepin-6-on;

11-cyklopropylo-5,11-dihydro-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on; oraz lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
11. Kompozycja farmaceutyczna nadająca się do zapobiegania lub leczenia zakażeń HTV-1, zawierająca substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera profilaktycznie lub terapeutycznie skuteczną ilość związku o wzorze 1,

w którym

Z oznacza atom tlenu;

R¹ oznacza atom wodoru lub alkil o 1 do 3 atomach węgla;

R² oznacza alkil o 1 do 3 atomach węgla lub cykloalkil o 3 do 6 atomach węgla;

R³ oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza atom wodoru;

Ar oznacza grupę o wzorze 1, II, ΠΙ, IV lub V

R⁸ R⁸ R⁷

I

II

III

181 323

IV V w których

R⁵ oznacza aminokarbonyl;

albo jeden z R⁶, R⁷ i R⁸ we wzorach Ι-ΙΠ oznacza grupę karboksylową a pozostałe dwa podstawniki oznaczają wodór;

a R⁶ we wzorach IV i V oznacza acetyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, karboksyl, aminokarbonyl lub grupę cyjanową każdy z A, B, D i E oznacza grupę metinową z których jedna może ewentualnie być podstawiona R⁹; a

R⁹ we wzorze IV i V oznacza alkiloksyl o 1 do 3 atomach węgla;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.
12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera 5,11-dihydro-l l-etylo-5-metylo-2-(4-pirazolilo)-6H-dipirydo[3,2-b:2',3 '-e][l,4]-diazepin-6on lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.