PL173302B1 - Środek biologicznie aktywny i sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego - Google Patents

Abstract

1. Srodek biologicznie aktywny na bazie zwiazków organicznych, bedacych skladnikami membran komórkowych zhomogenizowanej tkanki zwierzecej, znamienny tym, ze zawiera term ostabilne przy Tn = 120°, maloczasteczkowe zmodyfikowane skladniki membran komórkowych o wzglednej masie czasteczkowej 800 - 10 000 i strukturze antygenowej, zmodyfikowanej podczas procesów embriogenezy, i/lub proliferacji, i/lub zróznicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzajacej i/lub towarzyszacej rege- neracji i/lub reperacji tkanki. 12. Sposób wytwarzania srodka biologicznie aktywnego, posiadajacego wlasciwosc immunomoduluja ca, w którym surowiec z tkanki zwierzecej rozdrabnia sie i poddaje homogenizacji, a z homogenatu wydziela sie osad, zawierajacy membrany komórkowe, z którego po ponownym jego przeprowadzeniu w stan zawiesiny otrzymuje sie skladniki membran komórkowych, znamienny tym, ze jako surowiec wykorzystuje sie tkanke zwierzeca, zmodyfikowana podczas procesów embriogenezy, ewentualnie zrózni- cowania komórek, ewentualnie patologii, poprzedzajacej wzglednie towarzyszacej regeneracji oraz repe- racji tkanki, homogenat jest oczyszczany z niezniszczonych elem entów tkanki droga filtracji i/lub odwirowania z przyspieszeniem 150÷ 250 g w ciagu 10÷ 15 min i nastepnie wydziela sie osad, zawierajacy membrany komórkowe, który jest poddawany hydrolizie, produkty hydrolizy sa filtrowane i/lub odwirowywane z przyspieszeniem powyzej 1 500 g w ciagu 20÷ 40 min z wydzielaniem produktu koncowego w postaci sklarowanej cieczy produktów hydrolizy, zawierajacych skladniki membran komór- kowych. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek biologicznie aktywny na bazie związków organicznych, będących składnikami membran komórkowych zhomogenizowanej tkanki zwierzęcej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego, posiadającego właściwość immunomodulującą, w którym surowiec z tkanki zwierzęcej rozdrabnia się i poddaje homogenizacji, a z homogenatu wydziela się osad, zawierający membrany komórkowe, z którego po ponownym jego przeprowadzeniu w stan zawiesiny otrzymuje się składniki membran komórkowych.

Wynalazek dotyczy przemysłu chemicznego i farmaceutycznego, a mianowicie dziedziny otrzymywania środków biologicznie aktywnych, posiadających oddziaływanie immunomodulujące, dla wykorzystania w medycynie i weterynarii celem normalizacji stanu fizjologicznego organizmu człowieka i zwierząt, zwłaszcza celem odnowienia aktywności funkcjonalnej narządów i tkanek.

Środek biologicznie aktywny według wynalazku, należy do substancji pochodzenia zwierzęcego i zawiera związki organiczne.

Różnego rodzaju zaburzenia patologiczne w organizmie człowieka i zwierząt powodują odchylenie od normy parametrów stanu fizjologicznego. W podobnych wypadkach lecznicze oddziaływanie na organizm, w tej liczbie oddziaływanie profilaktyczne, polega na stabilizacji, czyli na podtrzymywaniu w normie wskazanych parametrów lub (w wypadku ich odchylenia od normy) na takim oddziaływaniu na organizm, przy którym wspomniane parametry są normalizowane.

Normalizacja stanu fizjologicznego organizmu człowieka i zwierząt może być dokonywana w dwóch kierunkach: po pierwsze, drogą bezpośredniego oddziaływania na patologię i, po

173 302 drugie, drogą pośredniego oddziaływania na systemy, organy i tkanki organizmu, odpowiadające za podtrzymywanie w normie parametrów homeostazy.

Wprowadzenie preparatów hormonalnych, mediatorów, czynników wzrostu, terapia chemiczna oraz podobne środki, zapewniają bezpośrednie oddziaływanie na komórki, drogą recepcji. Na przykład, podczas leczenia cukrzycy stosuje się insulinę, która uzupełnia funkcjonalną wadę trzustki. W wypadku zaburzenia aktywności funkcjonalnej systemu nerwowego używa się neuromediatorów, sprzyjających normalizacji granicznej czułości neuronów i, odpowiednio, polepszeniu przekazywania bodźców nerwowych. W przypadkach zaburzenia funkcjonalnej aktywności systemu odpornościowego organizmu wykorzystuje się immunomediatory, korelacjonujące odpowiedź systemu odpornościowego.

Podczas oddziaływania na organizm leczenie chorób dokonuje się dzięki zmobilizowaniu zasobów wewnętrznych organizmu. Na przykład, podczas przebiegu procesów, związanych z regeneracją organów i tkanek, z ich rehabilitacją i restytucją ich funkcji, jak również w przypadkach procesów zapalnych i zakaźnych, pobudzanajest działalność systemu odpornościowego organizmu. Dzięki temu następuje polepszenie zdolności odpornościowej, i w wyniku tego polepszenie ogólnego stanu organizmu.

Z opisu patentowego FR-A-2413912 znany jest środek biologicznie aktywny na bazie tkanki zarodkowej, posiadający właściwość immunomodulującą, odnawiający stan fizjologiczny organizmu i regulujący przemianę komórek. Wspomniany środek biologicznie aktywny (dalej - ŚBA) jest wyprodukowany ze składników rozdrobnionej i zhomogenizowanej tkanki zwierzęcej, wydzielonej z zarodków, zmieszanej z surowicą fizjologiczną.

Wskutek obecności czynnika immunomodulującego środek ten posiada stosunkowo wysoką właściwość immunomodulującą, dzięki czemu jego wykorzystanie zapewnia normalizację stanu fizjologicznego organizmu, w tym leczenie oraz podwyższenie produkcyjności zwierząt o 5 + 15% w porównaniu z grupą kontrolną.

Skuteczność działania znanego ŚBA jednakże jest niedostateczną w wyniku tego, że obok czynników immunomodulujących zawiera on immunodepresatory, przeszkadzające wystąpieniu pełnego efektu immunostymulującego. W istocie, właściwość immunomodulującą tego środka, jest działaniem sumarycznym, który jest wynikiem jednoczesnej obecności czynników immunomodulujących i depresatorów. W ten sposób, faktycznie aktywność specyficzna znanego ŚBA, zależąc od stosunku stężenia czynników immunomodulujących i depresatorów, jest porównawczo niewielką wskutek znacznego stężenia depresatorów.

Drugą wadą wspomnianego ŚBA jest podwyższona zawartość związków wielkocząs teczkowych, będących immunogenami, co powoduje pojawienie się ubocznych reakcji immunologicznych (alergia, hiperwrażliwość opóźnionego typu itd.).

W znacznym stopniu wady opisanego wyżej ŚBA zależą od sposobu jego wytwarzania, w którym proces technologiczny kończy się operacją rozdrabniania i homogenizacji surowca z tkanki pochodzenia zwierzęcego, co nieuchronnie powoduje obecność w jego składzie znacznej ilości desperatorów i związków wielkocząsteczkowych.

Z opisu patentowego numer US-A-4455302 znany jest również ŚBA, posiadający właściwość immunomodulującą, dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, wytwarzany z produktów hydrolizy składników rozdrobnionego surowca pochodzenia zwierzęcego, pobranego od zwierząt niedorozwiniętych. W skład jego wchodzą rozpuszczalne polipeptydy, aminokwasy i substancje mineralne, otrzymane w wyniku hydrolizy tkanki.

Wspomniany ŚBA ma wysoką skuteczność pod względem znormalizowania parametrów stanu fizjologicznego organizmu. Jest to tłumaczone tym, że znany ŚBA jest charakteryzowany wysokim stosunkiem efektów immunostymulacji i immunoinhibicji z jednej strony, w związku z bardziej wysoką zawartością czynników immunomodulujących kosztem obecności produktów hydrolizy, a z drugiej strony - w związku ze znacznym zmniejszeniem ilości związków wielkocząsteczkowych w toku tegoż samego, procesu hydrolizy.

Jednakże skuteczność znanego ŚBA jest niedostateczną, z powodu zawartości dość dużej ilości substancji balastowych i immunodepresatorów. Oprócz tego, znany ŚBA może również spowodować efekty uboczne, które występują podczas jego zastosowania (alergia i inne)

173 302 wskutek tego, że w jego skład wchodzą również związki wielkocząsteczkowe, które są immunogenami i których względna masa cząsteczkowa przewyższa 10 000.

Wadą znanego SBA jest i to, że skład otrzymywanego produktu końcowego nie jest stabilny i zmienia się od partii do partii, co komplikuje standaryzację produktu.

Właściwości znanego ŚBA, a przede wszystkim jego aktywność immunomodulująca, są bezpośrednio związane ze sposobem jego otrzymania, który obejmuje hydrolizę składników przepłukanego rozdrobnionego surowca pochodzenia zwierzęcego, odwirowywanie hydrolizatu, filtrację oraz wydzielanie produktu końcowego, przy czym hydroliza jest przeprowadzana w roztworze rozcieńczonego kwasu organicznego o pH 3,6 * 6,5 w temperaturze około 68°C, a jako surowiec wykorzystuje się nóżki niedorozwiniętego drobiu nie starsze niż 9 tygodni.

Produkt końcowy jest wydzielany w postaci proszku lub żelu, który przy stosowaniu jest nakładany na urażone miejsca ciała.

Wykorzystanie jako surowca tkanki zwierzęcej, zawierającej dość dużą ilość immunodepresatorów oraz brak możliwości polepszenia składu produktu końcowego za pomocą operacji wykonywanych w znanym sposobie, istotnie obniżają skuteczność otrzymywanego ŚBA.

Należy też wziąć pod uwagę, że zawierane w preparatach tkankowych komponenty ekstraktu w znacznym stopniu są stymulatorami aktywności funkcjonalnej narządów i tkanek, oddziaływania których jest w zasadzie jednokierunkowe, to znaczy że działanie ŚBA zależy tylko od jego stężenia w organizmie i nie jest uzależnione od fizjologicznego statusu organizmu. Wymaga to podczas leczenia starannego przestrzegania dawkowania preparatu leczniczego na bazie znanego ŚBA.

Wskazane wady częściowo usunięto w znanych ŚBA, efekt oddziaływania których koreluje ze statusem fizjologicznym organizmu i w przypadku jego normalizacji działanie podobnego ŚBA jest przerywane, czyli występuje efekt sprzężenia dupleksowego. Z tego powodu duże zainteresowanie wzbudzają znane ŚBa na bazie składników membran komórkowych tlenek zwierzęcych, które są w stanie zareagować na zmiany parametrów homeostazy organizmu (SU-A-1412596; EP-A-0106285; EP-A-0157427).

W tych środkach biologicznie aktywnych, stosowanych w postaci szczepionki, są wykorzystane specyficzne antygeny, które występują na powierzchni komórek podczas niektórych procesów patologii, a mianowicie podczas neoplazji, w związku z czym wykorzystanie szczepionek jest skierowane na wyeliminowanie podobnej patologii. Skuteczność działania wskazanych ŚBA zależy bezpośrednio od ilości antygenów w organizmie i jest przerywana w przypadku wyeliminowania neoplazy, co wskazuje na obecność samoregulującego się sprzężenia dupleksowego.

Wadą znanych środków biologicznie aktywnych jest ich wysoka specyficzność wobec patologii wyjściowej, to znaczy bardzo ograniczony zakres działania.

Jeszcze jedną ich wadą jest to, że takie ŚBA są stosowane tylko celem wyeliminowania patologii i tylko pośrednio są ukierunkowane na normalizację stanu fizjologicznego organizmu. Oprócz tego, ich wadą jest i to, że znane ŚBA nie powodują aktywacji procesów odnawiania i regeneracji. Podobne ŚBA powinny spełniać podwyższone wymagania stawiane co do stopnia czystości (homogeniczności) otrzymywanego antygenu, celem uniknięcia możliwości zaistnienia efektów ubocznych.

Znane ŚBA otrzymuje się znanym sposobem, zgodnie z którym surowiec pochodzenia zwierzęcego rozdrabnia się i poddaje homogenizacji, z następnym wydzielaniem z homogenatu membran komórkowych tkanek zwierzęcych, z których po rozpuszczaniu koloidowym otrzymuje się składniki membran komórkowych w postaci glikoproteiny (SU-A-1412596; EP-A-0106285; EP-A-0157427).

Zaletą znanego sposobu jest to, że sposób ten zezwala na otrzymanie zawierających węglowodany komponentów membran o wysokiej specyficzności, zdolnych do wywołania odwzajemniającej reakcji systemu odpornościowego organizmu na obecność antygenu, specyficznego dla nowotworów.

173 302

Do zalet znanego sposobu należy również i to, że ten sposób pozwala na wydzielanie zawierających węglowodany składników membran komórkowych za pomocą specyficznych lektionów, zdolnych do powiązania z określonymi końcowymi pozostałościami węglowodanów.

Jednakże podczas realizowania znanego sposobu membrany komórkowe są poddawane rozpuszczaniu koloidowemu za pomocą detergentów, zwykle natury niejonowej, na przykład detergentu Triton Χ-100, których później ciężko pozbyć się podczas następnych operacji wspomnianego sposobu i których sama obecność wywołuje efekty uboczne, podczas wykorzystywania środka w klinice.

Wadą znanego sposobu jest i to, że sposób ten ma dość małą wydajność i jest bardzo pracochłonnym, jak również zależy od obecności specyficznych tkanek rakowych, wykorzystywanych w postaci surowca wyjściowego. ,

Najbardziej zbliżonym do ŚBA według wynalazku jest ŚBA znany z opisu patentowego numer Ep-A-0318030, posiadający właściwość immunomodulującą, przeznaczony dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, na bazie związków organicznych pochodzących ze składników membran komórkowych rozdrobnionej i zhomogenizowanej tkanki zwierzęcej.

W porównaniu ze wspomnianymi wyżej środkami-analogami znany ŚBA posiada jeszcze większą skuteczność, która jest charakteryzowana podwyższeniem o 62% aktywności killerowej w stosunku do specyficznych komórek nowotworowych w porównaniu z kontrolą. Jest to tłumaczone tym, że ŚBA- analog jest oznacznikiem wzrostu komórek złośliwych i w sposób specyficzny aktywuje aktywność killerową, skierowaną na wyeliminowanie podobnych komórek. ,

Jednakże znany ŚBA zachowuje wszystkie wymienione wyżej wady, które są charakterystyczne dla analogów, a mianowicie:

- wysoką specyficzność wobec patologii wyjściowej (neoplazji), czyli ograniczony zakres leczniczego oddziaływania tego środka;

- obecność tylko aktywności killerowej;

- wysoki stopień niebezpieczeństwa zaistnienia efektów ubocznych, uwarunkowany tym, że znany ŚBA jest związkiem wielkocząsteczkowym.

Jak i w przytoczonych wyżej przypadkach, właściwości znanego ŚBA, przede wszystkim jego aktywność specyficzna, są bezpośrednio związane ze sposobem jego otrzymania, który przewiduje rozdrobnienie i homogenizację surowca zwierzęcego, jego następnego ultraodwirowywania oraz wydzielanie osadu z homogenatu, zawierającego membrany komórkowe. Z tego osadu po ponownym wprowadzeniu do stanu zawiesiny i rozpuszczaniu koloidalnym, otrzymuje się składniki membran komórkowych, które wykorzystuje się w postaci produktu końcowego (EP-A-0318030).

W porównaniu ze sposobami otrzymania ŚBA, wskazanymi wyżej, znany sposób ma tą zaletę, że zezwala na otrzymywanie posiadających jeszcze bardziej wysoką specyficzność zawierających węglowodany składników membran komórkowych, zdolnych do wywołania odwzajemniającej reakcji ze strony systemu odpornościowego na obecność antygenu, specyficznego dla nowotworu.

Oprócz tego, zaletą znanego sposobu jest wyższa skuteczność wydzielania składników, zawierających węglowodany.

Jednakże znanemu sposobowi są właściwe wymienione niżej wady, a mianowicie:

- konieczność wykorzystania detergentów, przy czym późniejsze pozbycie się ich sprawia znaczne trudności, a ich obecność powoduje wystąpienie ujemnych efektów ubocznych przy klinicznym zastosowaniu tego środka;

- stosunkowo niska wydajność znanego sposobu i jego wysoka pracochłonność;

- uzależnienie od obecności specyficznych tkanek nowotworowych w postaci surowca wyjściowego.

Wskazane wady są usunięte w środku biologicznie aktywnym według wynalazku, posiadającym właściwość immunomodulującą oraz w sposobie wytwarzania ŚBA według wynalazku.

Analiza znanych ŚBA i znanych sposobów ich otrzymywania, całokształt których określa poziom techniczny istniejący w tej dziedzinie, pozwala na sformułowanie zadania opracowania

173 302

ŚBA o szerokim zakresie działania immunomodulującego, posiadającego wysoki stopień skuteczności, pozbawionego przy tym wad, powiązanych z obecnością efektów ubocznych, występujących przy zastosowaniu znanych ŚbA i przejawiających się, na przykład, w alergii itd.

Tak sformułowany cel wynalazku uzyskano przez to że ŚBa, posiadający właściwość immunomodulującą i przeznaczony do normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, w tej liczbie do odnawiania aktywności funkcjonalnej narządów i tkanek, na bazie związków organicznych będących składnikami membran komórkowych zhomogenizowanej tkanki zwierzęcej, zawiera termostabilne, małocząsteczkowe zmodyfikowane składniki membran komórkowych o strukturze antygenicznej zmodyfikowanej podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki. ,

Cel ten uzyskano i w ten sposób, że ŚBA według wynalazku zawiera zmodyfikowane komponenty plazmatycznych membran komórkowych o strukturze antygenicznej zmodyfikowanej podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki.

ŚBA według wynalazku zawiera zmodyfikowane składniki membran komórkowych w postaci termostabilnych w temperaturze Tn < 120°C składników, jak również w postaci składników małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej M = 800 6 10 000 oraz w postaci składników zawierających węglowodany.

Środek według wynalazku zawiera związki organiczne w następującym stosunku wyrażonym w % wagowych:

Peptydy 28,0 6 60,(0

Aminokwasy 0,5 6 31,5;

Węglowodany 16,06 70,0;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 0,5 6 17,0.

W skład związków organicznych środka według wynalazku wchodzą węglowodany w następującym stosunku, wyrażonym w % wagowych, w składzie:

- związków wielkocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej > 10 000 do 3,0;

- związków małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej 800 - 10 000 11,56 57,9;

- monomerów wolnych o względnej masie cząsteczkowej < 800 3,5-67,0.

W ŚBA według wynalazku stosunek wagowy węglowodanów do peptydów w składzie związków organicznych z względną masą cząsteczkową 800 6 10 000 znajduje się w granicach G = 0,6 6 2,0.

ŚBA według wynalazku w korzystnym wykonaniu zawiera związki organiczne w stosunku, wyrażonym w % wagowych:

Peptydy 40,0-i 60,0;

Aminokwasy 12,9-617,1;

Węglowodany 16,0 6 63,8;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 4,4 6 10,6.

ŚBA według wynalazku w jeszcze innym wykonaniu zawiera związki organiczne w stosunku, wyrażonym w % wagowych:

Peptydy 34,0 6 60,1;

Aminokwasy 16,6 6 62,(6

Węglowodany 22,7 -63,2^

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 5,4 6 0,6.

173 302

ŚBA według wynalazku w innym wykonaniu zawiera związki organiczne w stosunku, wyrażonym w % wagowych:

Peptydy 28,0 -*33,6;

Aminokwasy 16,5-1-31,5;

Węglowodany 26,9 * 3^,S^;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 8,6 -e-17,0.

ŚBA według wynalazku w jeszcze innym wykonaniu zawiera związki organiczne w stosunku, wyrażonym w % wagowych:

Peptydy 29,0 * 36,3;

Aminokwasy ponieej 0,5;

Węglowodany 57,7 * 70,0;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 0,5 * 5,5.

Cel wynalazku osiągnięto również przez to, że w sposobie otrzymania ŚBA, posiadającego właściwość immunomodulującą, w którym surowiec z tkanki zwierzęcej rozdrabnia się i poddaje homogenizacji, a z otrzymanego homogenatu wydziela się osad zawierający membrany komórkowe, z którego po ponownemu przeprowadzeniu w stan zawiesiny otrzymuje się składniki membran komórkowych, jako surowiec wykorzystuje się tkankę zwierzęcą, zmodyfikowaną podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki, homogenat której oczyszcza się z niezniszczonych elementów tkanki drogą filtracji i/iub odwirowywania z przyspieszeniem 150 * 250 g w ciągu 10 * 15 min z wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy produktów hydrolizy, zawierających składniki membran komórkowych.

Jako surowiec wykorzystuje się tkankę, wybieraną z szeregu: tkanka embrionalna, tkanka różnicujących się tymocytów grasicy, spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, tkanka łożyskowa, tkanka nabłonkowa jelit, komórki szpiku kostnego, regenerującą się tkanką skórną, tkanka regenerującej się wątroby, tkanka regenerujących się kończyn płazów, tkanka zmieniona patologicznie, pobrana przed stadium regeneracji.

Przy tym osad, zawierający membrany komórkowe wydziela się z oczyszczonego homogenatu drogą odwirowywania z przyspieszeniem 1 500 * 90 000 g i/lub filtracją przez filtr z charakterystycznym rozmiarem porów F < 1 μm z następnym przepłukiwaniem i ponownym przeprowadzeniem w stan zawiesiny i ponownym odwirowywaniem i/lub filtracją w celu otrzymania osadu, zawierającego membrany komórkowe w ilości nie mniejszej niż 60% masy związków organicznych obecnych w osadzie.

Oprócz tego, osad zawierający membrany komórkowe, przed hydrolizą dodatkowo poddaje się odwirowywaniu z przyspieszeniem 20 000 * 100 000 g w gradiencie gęstości w ciągu 1 * 2 godzin z wydzielaniem plazmatycznych membran komórkowych.

Hydrolizę przeprowadza się w temperaturze Tr = 4 * 45°C. Przy tym hydroliza może być przeprowadzana w obecności środka antyseptycznego.

Cel wynalazku został zrealizowany również w ten sposób, że produkty hydrolizy, zawierające składniki membran komórkowych, są poddawane obróbce cieplnej w temperaturze Tn = 60 * 120°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i dodatkowym filtrowaniem i/lub odwirowaniem z przyspieszeniem ponad 1 500 g w ciągu 20 * 40 min z wydzieleniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy, zawierającej termostabilne elementy membran komórkowych.

Oprócz tego, klarowną ciecz z osadu albo produkty hydrolizy, zawierające składniki membran komórkowych, poddaje się frakcjonowaniu drogą dializy przez błonę półprzepuszczalną, i/lub ultra- filtracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem frakcji, zawierającej składniki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej M < 10 000, w postaci produktu końcowego.

173 302

Frakcja małocząsteczkowa produktów hydrolizy, zawierająca składniki membran komórkowych, jest poddawana chromatografii powinowactwa na lektynach z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, zawierającej składniki węglowodanowe. ,

Normalizacja stanu fizjologicznego człowieka i zwierząt za pomocą ŚBA według wynalazku jest dokonywana drogą stymulacji systemu odpornościowego, przeważnie przez aktywację systemu retikuloendotelialnego, T- i B-systemów, neutrofilów i/lub populacji killerów naturalnych.

Analiza porównawcza właściwości znanych i ŚBA według wynalazku wskazuje na to, że podczas gdy wspomniane wyżej znane ŚBA posiadają wąsko ukierunkowane działanie immunomodulujące z medostateczną skutecznością ogólnobiologiczną, wywołują negatywne efekty uboczne i wymagają ścisłości w określeniu dawki przy ich zastosowaniu, zgłaszany ŚBA posiada szeroki zakres działania, wysoką skuteczność, nie jest krytycznym w stosunku do przedawkowania i nie ma efektów ubocznych. ,

Drogą eksperymentalną ustalono, że skuteczność praktyczna ŚBA według wynalazku, otrzymanego za pomocą sposobu według wynalazku, polega na jego wysokiej aktywności biologicznej, a przede wszystkim - na podwyższonych efektach immunomodulującym i regeneracyjnym (właściwościach), co przy wprowadzeniu do organizmu zapewnia:

a) podwyższoną stymulację procesów regeneracyjnych, a mianowicie: odnawianie aktywności funkcjonalnej tkanki wątrobowej przy zapaleniu wątroby i regenerację wątroby po hepatektomii, wygojenie wrzodów, ran i skóry przy zranieniach i urazach, odnawianie krwi po jej stratach i w innych przypadkach;

b) występowanie efektu leczniczego podczas leczenia ostrych schorzeń dróg oddechowych, jak również stanów zapalnych (zapalenie płuc, zapalenie gruczołów sutkowych, zapalenie błonki śluzowej macicy oraz innych);

c) leczenie chorób zakaźnych zwierząt (paragrypa i inne), przy którym wyzdrowienie młodego bydła domowego było obserwowane przeciętnie nie mniej, niż w 88% przypadków, podczas gdy przy zastosowaniu znanych ŚBA w tych samych warunkach wyzdrowienie obserwowano przeciętnie w - 18 + 70%o przypadków, a przy spontanicznym wyleczeniu w grupie kontrolnej - w granicach 58 h 67% przypadków;

d) podwyższoną odporność zwierząt na choroby infekcyjne i w wyniku tego zmniejszenie poziomu pomoru pogłowia bydła;

e) polepszenie ogólnobiologicznego stanu zwierząt, co korzystnie odbija się na zwiększeniu ich produkcyjności.

Praktyczne zastosowanie ŚBA według wynalazku potwierdza jego nietoksyczność i brak efektów ubocznych (alergia, hiperwrażliwość opóźnionego typu itp.).

Wskazane rezultaty osiągnięto dzięki szczególnym właściwościom ŚBA według wynalazku, wystąpienie których jest skutkiem obecności zmodyfikowanych składników wydzielanych z membran komórkowych o zmodyfikowanej strukturze antygenowej. Należy podkreślić, że zmiana w statusie fizjologicznym komórek tkanki ma swoje odzwierciedlenie w modyfikacji struktury antygenowej membran komórkowych, której towarzyszy zmodyfikowanie składników membran komórkowych oraz zmiana immunogeniczności tkanki i reakcja systemu odpornościowego organizmu. .

Stopień podobnej modyfikacji struktury antygenowej membran komórkowych i odpowiednio, stopień reakcji systemu odpornościowego jest uzależniony od stopnia zmiany statusu fizjologicznego komórki.

Ustalono, że podwyższenie immunogeniczności zmodyfikowanej struktury antygenowej komórkowych, a przede wszystkim - plazmatycznych membran komórkowych, jest skutkiem obecności tkanki zwierzęcej w stadium przebiegu w niej wskazanych wyżej procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub procesów patologicznych, poprzedzających i/lub towarzyszących regeneracji i/lub reperacji tkanek.

Do takich tkanek, na przykład, należą:

- rrżnicująąc się tymocyty grrsicy (prrccs zróżnicowaaia komórek);

173 302

- spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, komórki szpiku kostnego, tkanka nabłonkowa jelit (procesy proliferacji i zróżnicowania komórek);

- tkanka embrionalna, tkanka łożyskowa (procesy proliferacji, zróżnicowania, embriogenezy);

- tkanki regenerujących się kończyn plazmów, regenerująca się wątroba szczurów po częściowej hepatektomii lub po porażeniu czterochlorkiem węgla (CCI), regenerująca się tkanka skórna, jak również tkanka z istniejącą w niej patologią, na przykład, przy gangrenie, po porażeniu cieplnym lub chemicznym (kombinacja w różnym zestawieniu wskazanych wyżej procesów).

Ustalono również, że cechą charakterystyczną wymienionych wyżej tkanek jest zmiana immunogenicznej struktury membran komórkowych, która idzie w parze z modyfikacją składników membran komórkowych tkanki, zezwalającą na ich zróżnicowanie od komórek intaktowych lub znajdujących się w stanie spoczynku komórek tkanek dorosłych osobników. Podobna właściwość zmodyfikowanych składników membran komórkowych wskazanych tkanek pozwala na ich wykorzystanie w ŚBA według 'wynalazku. Przy wprowadzeniu ŚBA do organizmu człowieka lub zwierząt osiąga się stymulowanie ukierunkowanej odwzajemniającej reakcji organizmu na patologię. Zasadniczą rolę w tym procesie odgrywa system odpornościowy organizmu.

Materialnymi nośnikami informacji w wymienionych wyżej procesach i/lub odchyleniach od normy we wskazanych tkankach są specyficzne składniki membran komórkowych. ŚBA według wynalazku zawiera zmodyfikowane komponenty membran komórkowych ze zmodyfikowaną strukturą antygenową, co pozwala przy jego zastosowaniu na stymulowanie reakcji odwzajemniającej organizmu. ,

Odwzajemniająca reakcja organizmu jest istotnie wzmacniana przy wprowadzeniu ŚBA według wynalazku, który zawiera zmodyfikowane komponenty membran komórkowych w postaci termostabilnych składników, tj. stabilnych w temperaturze nagrzania Tn < 120°C, w postaci składników małocząsteczkowych, tj. z względną masą cząsteczkową M = 800 * 10 000, jak również w postaci zawierających węglowodany składników membran komórkowych, przeważnie w postaci glikopeptydów, glikolipidów, oligowęglowodanów, nukleotydów i/lub wolnych monowęglowodanów.

Przy tym, zawdzięczając wysokiemu statycznemu i dynamicznemu stężeniu składników membran komórkowych w ŚBA według wynalazku obniża się zawartość immunoinhibitorów i związków balastowych, w związku z czym przy obecności wysokiej aktywności specyficznej ŚBA jest praktycznie pozbawiony efektów ubocznych.

Na rysunku schematycznie są przedstawione krzywe temperaturowo-czasowej zależności skuteczności ŚBA według wynalazku podczas procesu hydrolizy osadu, zawierającego membrany komórkowe.

Środek biologicznie aktywny według wynalazku, posiadający właściwość immunomodulującą, dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu otrzymuje się w następujący sposób.

Jako surowiec stosuje się tkankę zwierzęcą, zmodyfikowaną podczas embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki. Wspomnianą tkankę pochodzenia zwierzęcego płucze się i rozdrabnia, po czym poddaje homogenizacji w roztworze fizjologicznym i/lub buforowym do całkowitego zniszczenia komórek, a mieszankę zhomogenizowaną oczyszcza z niezniszczonych elementów tkanki drogą filtracji i/lub odwirowywania z przyspieszeniem 150 * 250 g w ciągu 10 * 15 min. Z oczyszczonego homogenatu za pomocą odwirowania z przyspieszeniem 1500 * 90 000 g i/lub filtracji przez filtr z charakterystycznym rozmiarem porów F 1< μm wydziela się osad, zawierający membrany komórkowe, który poddaje się hydrolizie, produkty hydrolizy filtruje się i/lub odwirowywuje z przyspieszeniem ponad 1 500 g w ciągu 20 * 40 min z wydzielaniem klarownej cieczy produktów hydrolizy, zawierającej składniki membran komórkowych w postaci produktu końcowego dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, zwłaszcza celem zastosowania zewnętrznego (inhalacji, aplikowania, wprowadzenia przez jamę nosową, w składzie maści itd.).

173 302

Skuteczność produktu końcowego zależy od zawartości w nim zmodyfikowanych komponentów membran komórkowych. Zwiększenie ich zawartości jest uzyskiwane drogą wyboru surowca z podwyższoną intensywnością procesów modyfikacji w tkankach i wyboru optymalnych warunków zrealizowania sposobu jego obróbki.

Wybór surowca z tkanki zwierzęcej jest uzależniony od intensywności zachodzących w nim procesów modyfikacji struktury antygenowej membran komórkowych, która idzie w parze ze zmodyfikowaniem składników membran komórkowych i ze zmianą immunogemczności tkanki.

Ustalono, że podwyższenie immunogeniczności zmodyfikowanej struktury antygenowej membran komórkowych, a przede wszystkim plazmatycznych membran komórek w tkankach zwierzęcych, jest uzyskiwane w stadium przebiegu w nich wspomnianych wyżej procesów embriogenezy i/lub proliferacji i/lub zróżnicowania komórek, i/lub procesów patologicznych, poprzedzających i/lub towarzyszących regeneracji i/lub reperacji tkanki.

W postaci podobnej tkanki zwierzęcej wykorzystuje się, w szczególności:

- różnicujące się tymocyty grasicy (proces zróżnicowania komórek);

- spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, komórki szpiku kostnego, tkankę nabłonkowa jelit (procesy proliferacji i zróżnicowania komórek);

- tkankę embrionalną, tkankę łożyskową (procesy proliferacji, zróżnicowania, embriogenezy);

- tkanki regenerujących się kończyn płazów, regenerującą się wątroba szczurów po częściowej hepatektomii lub po porażeniu czterochlorkiem węgla (CCl4), regeneruj ąca się tkanka skórna, jak również tkankę z istniejącą w niej patologią, na przykład, przy gangrenie, po porażeniu cieplnym lub chemicznym (kombinacja w różnym zestawieniu wspomnianych wyżej procesów).

Wykorzystanie opisanych wyżej tkanek zwierzęcych jako surowca w sposobie wytwarzania według wynalazku zapewnia otrzymanie środka biologicznie aktywnego posiadającego oczekiwane właściwości.

Ustalono, że cechą charakterystyczną wymienionych wyżej rodzajów tkanek jest zmiana w nich struktury antygenowej membran komórkowych, która idzie w parze z modyfikacją składników membran komórkowych tkanki, zezwalająca na ich zróżnicowanie od intaktowych albo znajdujących się w stanie spoczynku komórek tkanek dorosłych osobników. Podobna właściwość wskazanych tkanek pozwala na ich wykorzystanie w ŚBA według wynalazku, przy wprowadzeniu którego do organizmu człowieka lub zwierząt uzyskuje się możliwość odwzajemniającej reakcji organizmu na własną patologię. Zasadniczą rolę w tym procesie odgrywa system odpornościowy organizmu.

Pożądane jest wykorzystywanie tkanki zwierzęcej, pobranej w stadium inkrementu procesu modyfikacji. Wspomniane stadium określa się empirycznie według charakteru zmian immunogeniczności. Na przykład, w przypadku wykorzystania tkanki embrionalnej wspomniany okres stanowi pierwszą połowę embriogenezy. Regenerującą się wątrobę szczurów wykorzystuje się po upływie 4 + l2 godzin po częściowej hepatektomii, a w przypadku wykorzystania regenerujących się kończyn płazów - w stadium tworzenia się blastemy.

Celem otrzymania środka według wynalazku każdą ze wspomnianych tkanek, po uprzednim rozdrobnieniu do stanu mięsa mielonego, poddaje się homogenizacji w potrójnej objętości buforowanego roztworu fizjologicznego w homogenizatorze, do całkowitego zniszczenia komórek i otrzymania jednolitej masy. Homogenat jest oczyszczany z niezniszczonych elementów tkanki i nienaruszonych komórek drogą filtracji i/lub odwirowywania z przyspieszeniem 150 + 250 g w ciągu 10 + 15 min, a z oczyszczonego homogenatu wydziela się osad, zawierający membrany komórkowe, który jest poddawany hydrolizie.

Oczyszczanie z nienaruszonych elementów tkanki jest dokonywane podczas procesu odwirowywania w zakresie przyspieszenia 150 ·* 250 g w ciągu 10 + 15 min, co tłumaczy się tym, że w przypadku bardziej wysokiego przyspieszenia oraz dłuższego czasu trwania procesu następuje strącanie membran komórkowych, a w przypadku przyspieszenia poniżej 150 g oczyszczanie jest małoskuteczne.

173 302

Oczyszczanie z nienaruszonych elementów dokonuje się również drogą filtracji przez filtr makroporowaty, na przykład, przez kilka warstw gazy lub przez tkaninę bawełnianą (krośniak) lub przez siatki kapronowe.

Osad, zawierający membrany komórkowe, jest wydzielany z oczyszczonego homogenatu drogą odwirowywania z przyspieszeniem 1 500 * 90 000 g w ciągu 20 * 60 min i/lub filtracji.

Wybór zakresu przyspieszenia jest uwarunkowany warunkami wydzielania potrzebnej frakcji membran komórkowych, w których wydziela się maksymalna ilość plazmatycznych membran komórkowych.

W przypadku przyspieszenia poniżej 1 500 g, wydzielanie membran nie jest skuteczne, a ponad 90 0,0 g - są strącane również i inne balastowe struktury komórkowe, pogarszające jakość ŚBA.

Celem podwyższenia skuteczności produktu końcowego osad membran komórkowych jest oczyszczany z podatnych na sorpcję oraz zawartych wewnątrz organellii pęcherzyków skórnych (vesicula) składników ekstraktu tkanki. W tym celu osad jest przepłukiwany drogą wielokrotnego przeprowadzania w stan zawiesiny przez świeże porcje roztworu buforowego lub wody destylowanej z następnym ponownym odwirowywaniem i/lub filtracją do otrzymania osadu, zawierającego membrany komórkowe w ilości nie mniejszej niż 60% masy obecnych w nim związków organicznych.

Skuteczność produktu końcowego jest znacznie podwyższana przy zwiększeniu w nim zawartości składników plazmatycznych membran komórkowych. W tym celu osad, zawierający membrany komórkowe, przed hydrolizą dodatkowo ponownie przeprowadza się w stan zawiesiny i odwirowywuje się z przyspieszeniem 20 000 * 100 000 g w ciągu 1 * 2 godzin w gradiencie gęstości, na przykład, sacharozy, fikolu, perkolu i podobnych związków z wydzielaniem plazmatycznych membran komórkowych.

Przy wykorzystaniu sacharozy frakcja plazmatycznych membran komórkowych jest pobierana w zakresie gęstości d = 1,14 * 1,18 według znanych metod (H. M. Berman, W. Gram, M. A. Spirtes.- Biochemistry et biophisical acta, - 1969, - v. 183. -1. p. 10 - 18; J. Gurd, W. Evans, H. Perkins. - Biochemistry Journal, - 1973, - v. 135, -4, - p. 827 - 832; G. Schapira, J. Dobocz. - Biochemistry et biophisical acta, - 1974, - v. 345, -3, - p. 348 - 358).

Otrzymana frakcja plazmatycznych membran jest odmywana z sacharozy i podatnych na sorpcję składników ekstraktu drogą odwirowywania z roztworem fizjologicznym z przyspieszeniem 20 000 9 100 000 g w ciągu 20 ,· 40 min. i jest otrzyiuywanyoszd./eiwierający plazmatyczne membrany komórkowe.

Otrzymane osady, zawierające komórkowe i/lub plazmatyczne membrany komórkowe po ponownym przeprowadzeniu w stan zawiesiny w roztworze fizjologicznym i/lub buforowym poddaje się hydrolizie, produkty które są filtrowane i/lub odwirowywane z przyspieszeniem ponad 1 500 g z wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy produktów hydrolizy, zawierającej składniki membran komórkowych.

Skuteczność produktu końcowego wzrasta przy wykorzystaniu składników membran komórkowych w postaci małocząsteczkowych składników. To z jednej strony zezwala na uniknięcie wystąpienia niepożądanych efektów ubocznych, a z drugiej - na otrzymanie preparatu o szerokim zakresie działania bez ograniczeń z powodu specyficzności gatunku zwierząt i odpowiadającego wymogom medycyny. W tym celu membrany komórkowe poddawano hydrolizie, rozszczepiającej wielkocząsteczkowe strukturalne formacje membran komórkowych na produkty, zawierające składniki z mniejszą masą cząsteczkową. Skuteczność produktów hydrolizy jest uzależniona od specyficzności hydrolizy, która w znacznym stopniu zależy od charakterystyk temperaturowo-czasowych.

Ustalono, że właściwość immunomodulującą zgłaszanego środka, w szczególności podwyższenie aktywności eksudatu otrzewnowego szczurów in vitro jest maksymalna w przypadku przeprowadzenia hydrolizy w zakresie temperatur roboczych Tr = 4 * 45°C. Odchylenia od tego zakresu nie są pożądane, z tego powodu, że:

- przy Tr < 4°C znacznie wzrasta czas trwania procesu hydrolizy, co obniża efektywność ekonomiczną;

173 302

- przy Tr > 45°C następuje obniżenie aktywności fermentów, zapewniających hydrolizę surowca oraz są przyspieszane procesy rozkładu aktywnych składników, w wyniku czego obniża się jakość produktu końcowego.

Czas trwania hydrolizy określa się według osiągnięcia maksymalnego poziomu efektu immunomodulującego środka według wynalazku, w szczególności według aktywacji makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów, zgodnie z testem NBT.

Hydroliza o dłuższym czasie trwania jest przeprowadzana w obecności środka antyseptycznego.

Podwyższenie zawartości względnej (względnego stężenia) składników małocząsteczkowych w produktach hydrolizy w stosunku do zawartości wielkocząsteczkowych związków termolabilnych jest zapewniane za pomocą obróbki cieplnej hydrolizatu do całkowitej denaturacji związków termolabilnych, które następnie są usuwane w postaci osadu, drogą odwirowywania z przyspieszeniem nie mniejszym niż 1 500 g w ciągu 20 6 40 min i/lub filtracją. Klarowna ciecz, zawierająca składniki termostabilne, jest wykorzystywana jako produkt końcowy.

Obróbka cieplna produktów hydrolizy jest przeprowadzana w zakresie temperatur Tn = 60 6 120°C, z tego powodu, że przekroczenie granic wskazanego zakresu przyczynia się do zmniejszenia specyficznej aktywności ŚBA.

Na przykład, w temperaturze Tn < 60°C nie wszystkie białka poddają się denaturacji, w wyniku czego zawartość związków termolabilnych w produkcie końcowym jest podwyższona. Z tego powodu aktywność specyficzna środka zostanie obniżona. W temperaturze Th > 120°C następuje skokowy wzrost szybkości zmian strukturalnych w składnikach peptydowych i węglowodanowych produktu końcowego, co również obniża jego jakość.

Po obróbce cieplnej wydzielanie składników termostabilnych jest dokonywane drogą odwirowywania z przyspieszeniem nie mniejszym niż 1 500 g w ciągu 20 6 40 min, ponieważ przy zmniejszeniu wielkości przyspieszenia istotnie obniża się stopień usunięcia zdenaturowanych związków termolabilnych, a jego przeprowadzenie w ciągu 20 6 40 min jest najbardziej optymalnym.

Koagulowane zdenaturowane związki termolabilne można od dzielić od cieczy z nad osadu drogą filtracji poprzez sączek z bibuły.

Produkt końcowy, zawierający składniki termostabilne membran komórkowych, posiada większą aktywność specyficzną w porównaniu z cieczą produktów hydrolizy i pozwala na rozwiązanie bardziej szerokiego kręgu zadań. Ten produkt może być zastosowany w postaci środka do wstrzykiwania, tak w weterynarii, jak i w medycynie.

Dalsze podwyższenie aktywności specyficznej ŚBA jest osiągalne drogą wydzielania składników małocząsteczkowych z względną masą cząsteczkową M < 10 000 z produktów hydrolizy za pomocą dializy przez błonę półprzepuszczającą i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji, co pozwala na całkowite usunięcie związków wielkocząsteczkowych, zdolnych do wywołania efektów ubocznych.

' Jak to już było zaznaczone wyżej, skuteczność ŚBA według wynalazku znacznym stopniu jest określona zawartością zawierających węglowodany składników membran komórkowych z względną masą cząsteczkową M = 800 6 10 000. W związku z tym, celem otrzymania produktu końcowego mającego najwyższą aktywność specyficzną, z frakcji małocząsteczkowej drogą chromatografii powinowactwa na lektynach wydziela się zawierające węglowodany składniki w postaci glikopeptydów, glikolipidów, oligowęglowodanów, nukleotydów oraz wolnych monowęglowodanów, które wykorzystuje się jako produkt końcowy.

Osiągana w ten sposób podwyższona wielkość skuteczności produktu końcowego i brak efektów ubocznych pozwalają na szerokie zastosowanie otrzymanego produktu końcowego w medycynie.

Niżej są przytoczone przykłady konkretnego wykonania wynalazków, jak również są zreferowane wykorzystane metody określenia składu i właściwości ŚBA.

Przykład 1. Celem wyprodukowania środka biologicznie aktywnego według wynalazku jako surowiec zastosowano tkankę embrionalną bydła domowego w stadium pier173 302 wszej połowy ciąży krów. Z embrionów po odkażeniu w słabym roztworze nadmanganianu potasowego (KMnO4) wycinano tkankę skórną i mięśniową, wątrobę, śledzioną, trzustkę, nerki, płuca i serce, które poddawano rozdrabnianiu i homogenizacji. Potem 10 kg mielonego mięsa wymieszano z 30 kg centymolowego fosforanowego solonego roztworu buforowego (0,01 M PBS) pH 7,2, zawierającego centymolowy dwupodstawiony fosforan sodowy i piętnastocentymolowy roztwór chlorku sodowego (0,01 M Na₂HPO i 0,15 M NaCl) i poddawano homogenizacji na młynie koloidowym do otrzymaniajednolitowej masy. Niezniszczone elementy tkanki usuwano w postaci osadu po odwirowywaniu z przyspieszeniem 150 g w ciągu 15 min. Ciecz z nad osadu po usunięciu flotowanego tłuszczu drogą filtrowania przez tkaninę bawełnianą (krośniak) poddawano odwirowywaniu z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 60 min. Otrzymany osad, zawierający membrany komórkowe w ilości 60% obecnych w mm związków organicznych, ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w 15 kg centymolowego buforu fosforanowego (0,01 M PBS) oraz odwirowywano z przyspieszeniem 5 000 g w ciągu 40 min. Osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w 7,5 l wody destylowanej i odwirowywano z przyspieszeniem 20 000 g w ciągu 30 min, po czym operację przeprowadzenia w stan zawiesiny w wodzie powtarzano jeszcze jeden raz i odwirowywano w ciągu 40 min. Osad po raz czwarty przeprowadzano w stan zawiesiny w 7,5 kg centymolowego buforu fosforanowego (0,01 M PBS) i odwirowywano z przyspieszeniem 20 000 g w ciągu 20 min.

Przemyty w podobny sposób osad, zawierający 90% membran komórkowych, po przeprowadzeniu w stan zawiesiny w 5,0 kg centymolowego fosforanowego solnego roztworu buforowego (0,01 M PBS) i po dodawaniu środka antyseptycznego (chinozol) do końcowego stężenia 0,08% masy, poddawano hydrolizie w temperaturze 4°C w ciągu 6 tygodni.

Otrzymany hydrolizat odwirowywano z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 40 min z wydzielaniem klarownej cieczy produktów hydrolizy, zawierających składniki membran komórkowych, w postaci produktu końcowego, skład związków organicznych, którego i wywoływana przez niego aktywność specyficzna w postaci wskaźnika ilościowego efektów ŚBA są podane w tabeli 1 i w tabeli 2.

173 302

CN rt*

CN

CN

O

O

CN

T—4 00

CM

CN o\ eo o

CN

CN co

Efekty immunomodulujące i regeneracyjne śród- i Wskaźnik ilościowy efektów ŚBA zgodnie z przykładami

O

CN u

oo

U ru o

u cd

U

UD

U

CD

U

CN u

5d fi £

>>

rt

Ξ < n m

O UZI

5b o

Jo s

Ό

CN ©

CN

Tt

Tt

CD o

Γ-

O\ ©

CD

Γr05 fi O 4> <Λ ε β ,<5 Η fi ‘5? * Η, >?

*^· ο rt fi y t> rt 3·§ O (Z)

S ·* ε o

N > CZ1 ί*

Ν Ό >, W> $ 42 •o o <2

O cu

St o

Ή

N

N

OT o a

SP ³ ω c o £ 3 t.

ud oo

00.

CN

CN ud

O i>

ΓGC

Ο rt*

UD~

CO

CN θ' • o O _o '3 o c > *'57 £* £ 7Ś S

O cd o

O\

CN

OO

CN

UD

Γoo

O

CN

CN

UD oo

UD o

Xfr

UD

Γ05

CN

UD oo

Tf

Ό

CN r-~ cd

O\ οο

UD

Tj·

CD

CD

CN ©

τΤ

CN ud

TjΓCD

CN

C C? O <Z3 ε w ,o H

ΤΛ ΟΟ —, c 5? £ ^c r?

tj ^υ 2 u g 'OT $

O vg 3 u * e,

S S « .2 § > 3“ N > 7S ot Η P N -M £3 >· > C

O LG N et, 3 . O fi CN fi fi

Tj© ud

CN

CN

50*

ΓCN

Ud tJr00 r05

Γ50

UD

OO θ'

UD

CD

CD

Tf r50

UD

CN

Tł*

CN

OO

CN

UD

CD

CD rCN

UD

O

ΓUD o

>, o $ w • O O _O ΤΛ TT O § fi £

ΓΟΟ

CN

CD rt* oo θ'

CD

Tj* rt*

CD

ΟΟ

CN

UD τί*

ΓUD £

)2

O o

£ ^2 >» υ

o ffl

Γ05 *rt05

ΓUD

CN

CN τΙUD rt*

CD

CN

CD

O

CD^

Γο

CN

Tl*

Γοο

CD

UD ©~ tj*

I^- oo

O

CD

CN

O

CD

CD

O\

TT

CD o

Γrt*

CN co N ε o fi fi. <3 Ć? c rt QΉ -£ o

CD ło !

C

N O O OjO O N ctf .2 o £ S § .M ° 3 60.2 3J Ξ .2 u

Ν Μ 22 g

Tł* fi

O O © s Ja Si 3 Ϊ o

ΧΛ

O fi £

>>

rt

5?

u rt

Ό

U

O ct

.. Ό fi *“ ³

N ©* a 22 £ ε

1¾ ^1/3 8^ UD fi

N rt £

ώ %

rt

CU o

c rt o t•S) >

Q> O o

o u χλ - -e o £ > fi Ό

O , .

S 8 ó <1> rt N w et o o js fi •2 y S

Γ <1 rt b u 3 <υ n o- o o N rt £

O

O£ o

o- ;

'3^ >8 .ε* *3 u fi - O

N u £ fi Ό

173 302 <S

Tabela

przykładami	nr 21	mniej niz 0,3	28,7	1 29,0	GD		mniej niż 0,2	1 57,9 1	o\ ł—1	70,0	0,5	o	2,00	2,20
1 Nr 20	36,0	[ 36,3	•N C O CL	41,4	d	57,7	5,5	0*001	GD	1,90
N O c Ό O	Nr 18	27,7	| 28,0	16,5	30,8	6*9	37,9	r-’'	100,0	O	06*1
y w ŚBA otrzymanych zj.	Nr 17	33,3	CD CD	24,0	20,0	d	26,9	15,5	0*001	0,60	r-
Nr 16	27,7	[ 28,0	31,5	23,2 L_____________	8,5	31,9	00	100,0	0,84	1,60
Nr 13	CD	20,3	34,0	22,6		22,3	UD ©	34,2	CN CD	©	©	GD
Zawartość związków organicznych w % mas	Nr 11	25,1	25,0	50,1	9*91	TJ- θ'	15,0	7,3	22,7	10,6	100,0	09*0	0,72
Nr 9	21,9	23,9	45,8	ID ·—i	00 θ'	21,0	GD σ\	31,3	5,4	100,0	88*0	oo CD ©~
ud Z	20,6	θ' CS	40,7	s	CN	24,1	6,5	32,8	σΓ	o	1,20	O.
Nr 3	40,9	σ\	0*09	13,4	O		3,5	16,0	10,6	100,0	0,60	0,47
Nr 2	34,7	GD 00	53,2	(N CD	4,0 1 i	19,5	GD	29,0	4,6	0*001	1,05	0,76
Nr 1	CD	00	55,7	12,9	5,0	1 15,5	|- 6,5	O r- CN	4,4	o © o	0,86	©
Związki organiczne	Polipeptydy	| Peptydy	RAZEM:	Aminokwasy	Węglowodany w składzie: - związków wielkocząsteczkowych z względną masą cząsteczkową M > 10000	- związków małocząsteczkowych z względną masą cząsteczkową M = 800 - 10000 - monomerów wolnych albo związków z względną masą cząsteczkową M < 800	RAZEM.	Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne	RAZEM:	Stosunek zawartości węglowodanów i peptydów, G	Współczynnik obliczeniowy skuteczności, K

G i K - są to współczynniki, charakteryzujące względną zawartość węglowodanów w związkach z względną masą cząsteczkową M = 800 - 10000.

- w stosunku do peptydów (G) i

- w stosunku do związków organicznych ŚBA z różną masą cząsteczkową (K), (bardziej szczegółowe informacje są podane w rozdziale Analiza składu i właściwości zgłaszanego ŚBA oraz preparatu na jego podstawie).

173 302

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano drogą wprowadzenia przez jamę nosową jako preparat leczniczy do leczenia zapalenia gruczołów sutkowych kobiet. Do każdego nozdrza wnoszono po dwie krople preparatu z następnym masażem, celem zapewnienia rozciekania się preparatu po śluzówce. Zabieg powtarzano 2-3 razy dziennie. Efekt leczniczy występował po upływie 1 - 3 dni i był kontrolowany według stanu piersi (według obecności stwardnień, wydzielin ropnych) i analizy krwi.

Przykład 2.

Tkankę embrionalną, otrzymaną w ten sam sposób, jak i w przykładzie 1, poddawano rozdrobnieniu i homogenizacji w potrójnej objętości roztworu fizjologicznego chlorku sodowego w homogenizatorze z nożami blenderowymi do otrzymania jednolitej masy zniszczonych komórek. Celem usunięcia niezniszczonych elementów tkanki, w tym elementów tkanki łączącej, masę zhomogenizowaną odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 10 min. Po odwirowywaniu osad był usuwany, a otrzymaną ciecz poddawano filtracji przez tkaninę bawełnianą i poddawano ponownemu odwirowywaniu z przyspieszeniem 90 000 g w ciągu 20 min. Wydzielony w rezultacie odwirowywania osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w ilości zmniejszonej o połowę od pierwotnej objętości roztworu fizjologicznego i odwirowywano w tych samych warunkach. Potem osad dwukrotnie ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w wodzie destylowanej i jeszcze jeden raz w roztworze fizjologicznym, z następnym odwirowywaniem w ciągu 20 min. Otrzymany w ten sposób osad, zawierający membrany komórkowe, ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w 4-ch objętościach roztworu fizjologicznego i po dodawaniu środka antyseptycznego do stężenia końcowego 0,08% masy, poddawano hydrolizie w temperaturze T_r = 20°C w ciągu 8 dni.

Otrzymany hydrolizat odwirowywano z przyspieszeniem 15 000 g w ciągu 20 min z wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy, zawierającej składniki membran komórkowych. Skład produktu końcowego i wywoływana przez niego aktywność specyficzna, w postaci ilościowego wskaźnika efektu ŚbA, są przytoczone w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, mieszano z 5 objętościami roztworu fizjologicznego chlorku sodowego i wykorzystywano jako preparat leczniczy w postaci okładów, celem leczenia rozszerzenia naczyń żylnych na nogach. Okłady nakładano na noc codziennie. Efekt leczniczy występował w 5 -14 dniu i był kontrolowany według stanu naczyń, obrzmiałości nóg oraz odczuwania bólu.

Przykład 3.

Homogenizowanie tkanki embrionalnej jest dokonywane w ten sam sposób, jak i w przykładzie 2. Celem usunięcia niezniszczonych elementów tkanki zhomogenizowaną masę filtrowano przez tkaninę bawełnianą (krośniak) na nuczy w próżni. Potem 50 kg przesączu poddawano ultrafiltracji przez włókna drążone ΒΠΥ-100-ΠΑ (TY 6-12-151-87) aparatu typu AP-2,0. W procesie recyrkulacji przez włókna drążone z homogenatu usuwano ekstrakt tkanki, którego składniki miały względną masę cząsteczkową mniejszą niż 100 000, a związki wielkocząsteczkowe zagęszczano. Homogenat o masie 50 kg zagęszczano do otrzymania zawiesiny membran komórkowych, której masa stanowiła 5 kg. Zawiesinę potem mieszano z 45 kg roztworu fizjologicznego i ponownie zagęszczano, oczyszczając w ten sposób frakcje membran komórkowych ze składników eksudatu z masą cząsteczkową M < 100 000. Podobna operacja była przeprowadzana 4 razy. Otrzymana zawiesina zawierała 60% masy membran komórkowych w stosunku do sumy mas wszystkich obecnych w niej związków organicznych. Po dodawaniu 10 kg roztworu fizjologicznego zawiesinę poddawano autolizie w temperaturze 45°C w ciągu 48 godzin.

Otrzymany hydrolizat filtrowano przez sączek z bibuły, a przesącz zawierający składniki membran komórkowych wykorzystywano jako produkt końcowy, którego skład i wywoływana przez niego aktywność specyficzna w postaci wskaźnika ilościowego są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, mieszano z 9 objętościami miąższu ogórkowego i wykorzystywano jako preparat leczniczy w celach kosmetycznych w postaci maseczki z żelu do twarzy. Przy długotrwałym przechowaniu

173 302 do żelu dodawano środek antyseptyczny (nipagina i nipazol w stosunku wagowym 5:1) w stężeniu końcowym 0,1% masy. Żel nakładano na twarz na 2 - 3 godziny. Zabieg powtarzano 1-2 razy w ciągu tygodnia. Efekt leczniczy występował po 2 - 6 zabiegach i był kontrolowany według stanu cery.

Przykład 4.

Homogenat tkanki embrionalnej, oczyszczony z niezniszczonych elementów tkanki w przykładzie 3, poddawano filtracji przez włókna wiskozowe zatrzymujące cząstki o wymiarze ponad 1 gm. Wszystkie następne operacje przeprowadzano w ten sam sposób, jak i w przykładzie 3, i w rezultacie otrzymywano produkt końcowy, który posiadał analogiczny skład i właściwości.

Przykład 5.

Osad, zawierający membrany komórkowe, otrzymany w przykładzie 1 po czterokrotnym przepłukiwaniu, ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w stężonym roztworze sacharozy ze stężeniem końcowym otrzymanej zawiesiny d1 >1,25. Zawiesinę poddawano ultraodwirowywaniu z przyspieszeniem 100 000 g w ciągu 60 min w stopniowym gradiencie sacharozy d1 > 1,25; d2 = 1,20; d3 = 1,18; d4 = 1,16; d5 = 1,14; d6= 1,12. Frakcja membran komórkowych była pobierana w odstępie stężenia sacharozy, wielkość którego stanowiła d = 1,18* 1,14. Potem membrany odmywano z sacharozy drogą odwirowywania przez roztwór fizjologiczny z przyspieszeniem 20 000 g w ciągu 60 min. Osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w czterokrotnej objętości centymolowego fosforanowego solnego roztworu buforowego (0,01 M PBS) pH 7,2 i po dodawaniu środka antyseptycznego do stężenia końcowego 0,08% masy, zawiesinę plazmatycznych membran komórkowych poddawano hydrolizie w temperaturze Tr = 4°C w ciągu 6 tygodni.

Otrzymany hydrolizat odwirowywano z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 40 min z wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy, zawierającej składniki plazmatycznych membran komórkowych. Skład produktu końcowego oraz wywoływana przez niego aktywność specyficzna w postaci wskaźnika ilościowego efektu ŚBA są przytoczone w tabelach 1 i 2. _x

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano w postaci preparatu leczniczego do inhalacji, celemleczenia zapaleniaoskrzeli. Codziennie na noc przez inhalator robiono 10-15 gwałtownych wdechów przez usta i wydechów przez nos. Efekt leczniczy występował po 2 - 8 dniach i był kontrolowany według stanu płuc i analizy krwi.

Przykład 6.

Zawiesinę membran komórkowych w sacharozie ze stężeniem końcowym d > 1,25, otrzymaną w przykładzie 5, poddawano odwirowywaniu z przyspieszeniem 20 000 g w ciągu 2 godzin w analogicznym stopniowym gradiencie sacharozy. Wszystkie następne operacje dokonywano w ten sam sposób, jak i w przykładzie 5, z otrzymywaniem produktu końcowego, posiadającego analogiczny skład i właściwości.

Przykład 7.

Celem określenia zawartości składników membran komórkowych w stosunku odsetkowym (wg masy) do składników tkanki łącznej i ekstraktu w ŚBA według wynalazku, otrzymanego w przykładach 1 * 6, przeprowadzano analizę aminokwasową, jak również określano ilość białka i węglowodanów w osadzie i cieczy nad osadem, otrzymanych drogą ultraodwirowywania zawiesiny membran komórkowych z przyspieszeniem 100 000 * 150 000 g w ciągu 60 min przed przeprowadzeniem operacji hydrolizy.

Stosunek ilości białka w całym osadzie do ilości białka w całej cieczy nad osadem wskazuje na stosunek białka składników membran komórkowych do białka ekstraktu.

Zawartość białka w osadzie i w cieczy nad osadem określano po ultraodwirowywaniu zawiesiny. Po usunięciu klarownej cieczy do 0,1 ml osadu dodawano 4,9 ml roztworu fizjologicznego i po przeprowadzeniu w stan zawiesiny pobierano 0,1 ml celem określenia ilości białka sposobem fotometrycznym według intensywności zabarwienia roztworu, zgodnie z metodą SDS-Louri (U. K. Laemmli. - Nature, - 1970, - v. 227, -5259, - p. 680 - 685).

173 302

Celem określenia ilości białka w klarownej cieczy pobierano 0,1 ml. Podczas przeprowadzenia analizy białkowej środka, otrzymanego w przykładach 1, 2 i 5, zawartość składników membran komórkowych stanowiła 88 ± 8%, w przykładzie 3 - 70 ± 10%.

Składniki tkanki łącznej określano za pomocą analizy aminokwasowej według obecności oksylizyny i oksyproliny. W zgłaszanym ŚBa podobne aminokwasy były nieobecne.

Określenie ilości węglowodanów w badanych próbkach przeprowadzano według reakcji antronowej (S. Seifter, S. Dayton, C. Hovic. Arch. Biochemistry and Biophyscal, - 1950, -25, -1, - p. 191 - 200). Przy tym uwzględniano ogólną zawartość węglowodanów po hydrolizie oraz zawartość wolnych węglowodanów w postaci monomerów. Zgodnie z różnicami wielkości, otrzymywanych przy przeprowadzeniu pomiarów określano ilość wolnych węglowodanów w składzie różnych związków.

Celem przeprowadzenia ogólnej hydrolizy pobierano 1,0 ml badanej próbki i mieszano z 1 ml czteronormalnego roztworu kwasu solnego (4,0 N HCl). Hydrolizę dokonywano w temperaturze 105°C w ciągu 2 godzin, po czym hydrolizat odparowywano w eksykatorze z suchą sodą żrącą (NaOH) w próżni. Wysuszoną próbkę rozcieńczano w 1,0 ml wody destylowanej i wykorzystywano do analizy. ,

Określenie ilości wolnych węglowodanów bezpośrednio w ŚBA albo po hydrolizie kwasowej przeprowadzano w sposób następujący¹: 1 ml próbki mieszano z 1ml wody destylowanej, po czym dodawano przy ciągłym mieszaniu w temperaturze - 5°C 4 ml 0,2% odczynnika antronowego, przygotowanego na podstawie 95% kwasu siarkowego (H2SO4). Otrzymaną mieszankę gotowano w temperaturze 95°C w ciągu 10 min i po chłodzeniu określano gęstość optyczną przy długości fali 620 nm. Jako wzorzec wykorzystywano glukozę o stężeniu 20 mkg/ml.

Zawartość stężenia węglowodanów, wchodzących w skład związków strukturalnych o względnej masie cząsteczkowej M > 800, w ŚBA według wynalazku, otrzymanym w przykładach 12,3 i 5 odpowiednio stanowiła 20,5%; 24,5%; 12,5% i 26,4% w stosunku do pozostałych składników tkankowych.

W tym przykładzie i w przykładach następnych wielkości określane eksperymentalnie są wyrażane ich średnimi wartościami z granicami odchylenia od średniego, obliczonymi z uwzględnieniem testu Studenta.

Przykład 8.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 1, poddawano obróbce cieplnej w różnych temperaturach ogrzewania (obróbki cieplnej) Tn1 = 55°C, T_n2 = 60°C, Tn3 = 95°C, T n4 = 120°C i Tn5 = 135°C. Ogrzewanie przeprowadzano do całkowitej denaturalizacji związków termolabilnych w produktach hydrolizy, potem odwirowywano z przyspieszeniem ponad 1 500 g w ciągu 30 min z wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy zawierającej składniki termostabilne membran komórkowych. Otrzymany produkt końcowy w każdym przypadku posiadał własny efekt immunomodulujący, wartości którego są podane w tabeli 3, w której przedstawiono aktywność specyficzną (aktywacja makrofagów) w zależności od wybranego zakresu temperatury ogrzewania. Optymalną jest temperatura nagrzewania Tn = 95°C, w której otrzymywany produkt końcowy zapewnia maksymalne, w porównaniu z kontrolą, wzmacnianie aktywności fermentacyjnej i fagocytowej, które odpowiednio wynosiło 102,3 ± 5,5% i 92,1 ± 7,4%. Przy Tn = 55°C podwyższenie wielkości aktywności specyficznej w porównaniu z kontrolą stanowi przeciętnie 76,8 ± 4,6% - według testu NBT i 53,8 ±5,1% - wobec fagocytozy. Przy Tn > 120°C następuje skokowy wzrost szybkości zmian strukturalnych peptydów i zawierających węglowodany związków, co powoduje zmiany strukturalne składników produktu końcowego, co jest odzwierciedlane w obniżeniu wielkości specyficznej aktywności środka. Na przykład, przy Tn = 135°C wzrost specyficznej aktywności środka według wynalazku w porównaniu z kontrolną wynosi przeciętnie 68,4 ± 5,0% - według testu NBT i 66,2 ± 6,1% - wobec fagocytozy. Maksymalna wielkość aktywności specyficznej ŚBA w porównaniu z kontrolą jest uzyskiwana w zakresie temperatur Tn = 60 -5- 120°C, w którym podwyższenie aktywności makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów (in vitro) stanowi przeciętnie 102,3 ± 5,5% 173 302 według wzmacniania aktywności fermentacyjnej (test NBT), a według wzmacniania aktywności fagocytowej (wobec E. Coli) - 92,1 ± 7,4%.

Przykład 9.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 1, poddawano obróbce cieplnej przez gotowanie w temperaturze Tn = 95°C, do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po ochłodzeniu odwirowywano z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 40 min. Osad w postaci związków zdenaturowanych usuwano, aj ako produkt końcowy wykorzystywano klarowną ciecz nad osadem, która zwierała składniki termostabilne membran komórkowych. Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki ilościowe efektów ŚBA są podane w tebelach 1 i 2. ,

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe- wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy do leczenia chorób skórnych w postaci maści, którą przygotowywano drogą mieszania lanoliny, wazeliny i produktu końcowego ŚBA w stosunku 1:3:1 części wagowych. Maść codziennie wcierano w skórę. Efekt leczniczy występował po 2 * 8 dniach i był kontrolowany według stanu skóry.

Tabela 3

Temperatura nagrzewania (obróbki cieplnej) °C	Aktywizacja makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów (in vitro) w wyniku oddziaływania zgłaszanego ŚBA, otrzymanego przy różnej obróbce cieplnej, %, w porównaniu z kontrolą
Wzmocnienie aktywności fermentacyjnej (NBT test)	Wzmocnienie aktywności fagocytowej wobec E Coli
55	76,8 ± 4,6	53,8 ± 5,1
60	82,5 ± 4,9	70,8 ± 6,5
95	102,3 ± 5,5	92,1 ± 7,4
120	88,4 ±5,1	78,3 ± 7,0
135	68,4 ± 5,0	66,2 ±6,1

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P < 0,05

Tabela 4

Numer porządkowy frakcji	Względna masa cząsteczkowa frakcji, M,	Aktywacja makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów, przy oddziaływaniu małocząsteczkowych frakcji zgłaszanego ŚBA, %, w porównaniu z kontrolą
1	Mi > 50000	58,4 ± 4,5
2	10000 < M2 < 50000	103,6 ±9,2
3	M3 < 10000	170,3 ±18,1
4	Mą <5000	186,8 ± 14,2
5	Ms < 1000	138,7 ± 12,3
6	Mć <800	86,2 ± 7,7
7	M? < 500	55,1 ±6,4

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P < 0,05

173 302

Przykład 10.

Hydrolizat, otrzymany w przykładzie 1, poddawano obróbce cieplnej drogą gotowania w temperaturze nagrzewania Tn = 95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po ochłodzeniu odwirowywano z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 40 min. Osad w postaci zdenaturowanych związków usuwano, a ciecz nad osadem, zawierającą termostabilne składniki membran komórkowych, wykorzystywano jako produkt końcowy, posiadający analogiczny skład i właściwości, jak i w przykładzie 9.

Przykład 11.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 3, poddawano obróbce cieplnej w temperaturze Tn = 95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po chłodzeniu filtrowano przez sączek bibułowy na nuczy. Przesącz, zawierający termostabilne składniki membran komórkowych, wykorzystywano jako produkt końcowy.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki ilościowe efektów ŚBA są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy poddawano suszeniu sublimacyjnemu i wykorzystywano podjęzykowo jako preparat leczniczy do leczenia zapaleniagruczułów sutkowych kobiet. Zabieg wykonywano codziennie. Efekt leczniczy występował po 1 - 3 dniach i był kontrolowany według stanu piersi (obecności stwardnień, wydzielin ropnych) i analizy krwi.

Przykład 12.

Hydrolizat, otrzymany w przykładzie 3, poddawano obróbce cieplnej w temperaturze Tn = 95° do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po chłodzeniu filtrowano przez sączek bibułowy na nuczy. Przesącz, zawierający termostabilne składniki membran komórkowych, wykorzystywano jako produkt końcowy, posiadający analogiczny skład i właściwości, jak w przykładzie 11.

Przykład 13.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 5, poddawano obróbce cieplnej przez gotowanie w temperaturze Tn = 95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po cł^łoc^^^r^iu odwirowywano z przyspieszeniem 50 000 g w cćągu 20 min. Osad w postaci związków zdenaturowanych usuwano, a jako produkt końcowy wykorzystywano klarowna ciecz, zawierającą termostabilne składniki plazmatycznych membran komórkowych.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki ilościowe efektów ŚBA są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy do leczenia zapalenia gruczołów sutkowych krów drogą wstrzykiwania, dokonywanego domięśniowo w dawce 0,05 ml/Kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po 164 zastrzykach i był kontrolowany według stanu wymienia i ilości wydzielin ropnych z sutek.

Przykład 14.

Hydrolizat, otrzymany w przykładzie 5, poddawano obróbce cieplnej przez gotowanie w temperaturze Tn=95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po chłodzeniu odwirowywano z przyspieszeniem 50 000 g w ciągu 20 min. Osad w postaci związków zdenaturowanych usuwano, a jako produkt końcowy wykorzystywano klarowną ciecz z nad osadu, która zawierała komponenty termostabilne, posiadające analogiczny skład i właściwości jak w przykładzie 13.

Przykład 15.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymana w przykładzie I, poddawano frakcjonowaniu na urządzeniu do ultrafiltracji typu A m i c o n z wykorzystaniem ultrafiltrów, przepuszczających związki z względną masę cząsteczkową, mniejszą albo równą: 50 000,10 000, 5 000, 1 000, 800 i 500.

Biologiczną aktywność otrzymanych frakcji, zawierających związki z masą cząsteczkową:

1) Mi>50 000; 2) 10 000 <M₂<50 000; 3) Ms<10 000; 4) Mą<5 000; 5) M^ł 000; 6)Mó<800 i 7) M7<500 - analizowano zgodnie z ich zdolnością do aktywacji makrofagów otrzewnego eksudatu szczurów za pomocą testu NBT. Rezultaty badań są przytoczone w tabeli 4.

173 302

Analiza danych tabeli 4 pozwala na wyciągnięcie poniższych wniosków:

1) rozmieszczenie aktywności specyficznej według frakcji wykazuje maksimum, przypadające na zakres względnych mas cząsteczkowych od 800 do 10 000;

2) obniżenie aktywności specyficznej w przypadku względnej masy cząsteczkowej M>10 000 jest powiązane ze wzmocnieniem wpływu inhibitorów w produkcie końcowym i obniżeniem stężenia substancji aktywnej;

3) obniżenie aktywności specyficznej w przypadku względnej masy cząsteczkowej M<800 jest powiązane z obniżeniem stężenia substancji aktywnej w postaci związków oligomerowych z M>800.

Przykład 16.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w ten sam sposób jak i w przykładach 1 i 9, poddawano ultrafiltracji za pomocą aparatu filtracyjnego typu AP-2,0, wypełnionego włóknami wiskozowymi ΒΠΥ-15-ΠΑ (TY 6-12-151-87). Otrzymany ultraprzesącz, zawierający składniki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej M<10 000, wykorzystywano jako produkt końcowy, zawierający składniki małocząsteczkowe membran komórkowych o względnej masie cząsteczkowej <10 000.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy i ilościowe wskaźniki efektów ŚBA są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy do leczenia eksperymentalnego hepatytu szczurów drogą wstrzykiwania, dokonywanego domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co drugi dzień (charakter i rezultaty leczenia bardziej dokładnie są opisane w przykładach 42 i 43).

Przykład 17.

Hydrolizat, otrzymany w przykładzie 3, poddawano hydrolizie w ciągu 16^24 godzin przez folię wiskozową przeciw roztworowi fizjologicznemu, 1 kg którego zawierał 0,8 g środka antyseptycznego. Otrzymany hydrolizat wykorzystywano jako produkt końcowy, który zawierał składniki małocząsteczkowe membran komórkowych o względnej masie cząsteczkowej M<10 000.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki ilościowe efektów ŚBA są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy celem normalizacji parametrów homeostazy cieląt w postaci wstrzykiwań, które dokonywano domięśniowo cielętom, mającym odchylenia od normy w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co 1-2 miesiąca. Kontrola efektu była dokonywana drogą comiesięcznego ważenia cieląt, rezultaty którego świadczyły o podwyższeniu o 60^100% średniodobowego przyrostu ciężaru w porównaniu z grupą kontrolną zwierząt, nie poddawanych obróbce preparatem.

Przykład 18.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w ten sam sposób jak i w przykładach 5 i 13, poddawano ultrafiltracji przez włókna drążone ΒΠΥ-15-ΠΑ (TY 6-12-151-87) aparatu typu AP-2,0. Otrzymywany ultraprzesącz, zawierający składniki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej M<10 000, wykorzystywano jako produkt końcowy, zawierający składniki małocząsteczkowe plazmatycznych membran komórkowych z M <10 000.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki specyficznej aktywności otrzymanego środka, określone eksperymentalne, są pokazane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy do wprowadzenia drogą wstrzykiwania celem leczenia eksperymentalnego wrzodu żołądka szczurów. 20 codziennych zastrzyków dokonywano domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg i 0,5 ml/kg masy ciała (charakter i rezultaty leczenia są opisane bardziej dokładnie w przykładzie 44).

Przykład 19.

Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie I, poddawano żelfitracji w sefadeksie G-25 na kolumnie o średnicy d=26 mm i długości h=600 mm, zrównoważonej decymolo24

173 302 wym (0,01 M) buforem fosforanowym o pH 7,2, zawierającym piętnastocentymolowy chlorek sodowy (0,15 M NaCl). Frakcjonowanie klarownej cieczy hydrolizatu według mas cząsteczkowych było dokonywane drogą eluowania kolumny tym samym roztworem buforowym, przy czym eluat kontrolowano spektrometrycznie przy długości fali 280 nm. Frakcja małocząsteczkowych składników hydrolizatu, zawierającego składniki membran komórkowych, była eluowana jako produkt końcowy, posiadający analogiczny skład i właściwości, jak i w przykładzie 16.

Przykład 20.

Frakcję składników małocząsteczkowych, otrzymaną w przykładzie 16, poddawano chromotografii powinowactwa na Kon-A-Sefarozie firmy Pharmacia. Kolumnę o średnicy 2 cm i długości 10 cm, wypełnioną Kon-A-Sefarozą, przygotowywano do pracy zgodnie z zaleceniami producenta.

Po przepłukaniu osadzającym roztworem buforowym, zawierającym dwudziestomilimolowy bufor tris-chlorowodorowy (0,02 M Tris-HCl) o pH 7,4 i półtoradecymolowy chlorek sodowy (0,15 M NaCl). Kon-A-Sefarozę obrabiano ładującym roztworem buforowym, zawierającym decymolowy bufor octanowy (0,1 M CHsCOONa) o pH 6,5, milimolowy chlorek wapniowy (1 mM CaCl2), milimolowy chlorek magnezowy (1 mM MgCh) i jednomolowy chlorek sodowy (1 M NaCl), a potem ponownie przepłukiwano osadzającym roztworem buforowym. Frakcją składników małocząsteczkowych, otrzymaną w przykładzie XVI, po miareczkowaniu do pH 7,4 powlekano kolumnę i przepłukiwano buforem osadzającym do całkowitego usunięcia związków, nie podatnych na sorpcję.

Wydzielanie zawierających węglowodany składników, powiązanych na zasadzie powinowactwa z Kon-A-Sefarozą, przeprowadzano za pomocą decymolowego buforu octanowego (0,1 M CHsCOONa) o pH 3,5 w roztworze fizjologicznym chlorku sodowego. Kontrolę elucji dokonywano sposobem spektrofotometrycznym przy długości fali 280 nm. Frakcję, wydzielaną chematografią powinowactwa, ze składnikami membran komórkowych, zawierającymi węglowodany, po zobojętnianiu odczynu kwaśnego roztworem sody kaustycznej (NaOH) do pH 7,4 i po dodawaniu środka antyseptycznego o stężeniu końcowym 0,08% masy, otrzymywano w postaci produktu końcowego, którego skład oraz wywoływana przez niego aktywność specyficzna, są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy celem leczenia zapalenia jajników w postaci zastrzyków, które dokonywano domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co drugi dzień. Efekt leczniczy występował po 6*10 zastrzykach i był kontrolowany według parametrów stanu zapalnego.

Przykład 21.

Frakcję składników małocząsteczkowych, otrzymaną w przykładzie 18, poddawano chromatografii powinowactwa na Kon-A-Sefarozie, w ten sam sposób, jak i w przykładzie 20. Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy, zawierających składniki plazmatycznych membran komórkowych oraz wskaźniki ilościowe efektów ŚBA, są podane w tabelach 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy celem leczenia cukrzycowej gangreny kończyn u chorych na cukrzycę w postaci zastrzyków, dokonywanych domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała z odstępem w 1*3 dni. Efekt leczniczy występował po 5 * 15 zastrzykach i był kontrolowany według stanu tkanki i naczyń kończyn.

Przykład 22.

Dla określenia zależności skuteczności ŚBA według wynalazku od zawartości w nim zmodyfikowanych składników membran komórkowych wykorzystywano surowiec z tkanek zwierzęcych, z istniejącymi w nich procesami embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki. Otrzymane tkanki obrabiano w ten sam sposób, jak i w przykładzie 9. Właściwości produktu końcowego otrzymanego z wykorzystaniem tkanki każdego ze wskazanych rodzajów modyfikacji struktur komórkowych, a mianowicie - membran komórkowych, są zebrane w tabeli V.

173 302

Analiza tabeli V wskazuje na to, że obecność efektu immunomodulującego w zgłaszanym środku oraz istotne wzmocnienie tego efektu, są uzależnione od wykorzystywanego surowca, z którego otrzymuje się produkty hydrolizy, zawierające zmodyfikowane składniki membran komórkowych.

Na przykład, jako surowiec tkanki zwierzęcej, pobrany właśnie w stadium proliferacji i różnicowania się komórek, wykorzystano spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych szczurów, komórki szpiku kostnego, tkankę nabłonkowa jelit szczurów, a jako surowca z procesami embriogenezy - wykorzystano tkankę embrionalną szczurów. Jako surowiec z procesami patologii, poprzedzającej regenerację, wykorzystano tkankę wątrobową szczurów po częściowej hepatektomii, a z patologią, towarzyszącą regeneracji - tkankę regenerujących się kończyn aksolotlu, tkankę wątrobową szczurów po podskórnym wprowadzeniu czterochlorku węgla (CCL).

Jednocześnie z danymi eksperymentalnymi celem porównania w tabeli 5 przytoczono również dane, dotyczące efektu immunomodulującego, otrzymanego przy wykorzystaniu jako surowca tkanki mięśniowej i wątrobowej tkanki intaktowej dorosłych osobników szczurów-samców.

Analiza danych tabeli 5 wskazuje na to, że efekt immunomodulujący ŚBA według wynalazku w przypadku wykorzystania tkanek, pobranych w stadium przebiegu w nich procesu embriogenezy, proliferacji i patologii, która poprzedzała i/lub towarzyszyła regeneracji i/lub reperacji, jest istotnie wyższy, niż analogiczny efekt, posiadany przez znane środki, w których wykorzystano surowiec z tkanki zwierzęcej z nieobecnością w nich wskazanych wyżej procesów.

Oprócz tego, można również dojść do wniosku, że z tkanek, w których są obserwowane wskazane wyżej procesy, największy efekt immunomodulującym mają regenerująca się tkanka wątroby, kończyn aksolotlu i tkanka embrionalna.

Przykład 23.

Celem wyprodukowania środka według wynalazku jako surowiec wykorzystano regenerującą się wątrobę szczurów po 4^12 godzinach po hepatektomii, wykonanej według znanej metody (G.H. Higgins, R.M. Anderson. - Experimental pathology of the liver. - Arch. Pathology, - 1931,-N 12,-p. 186).

Tkankę wątrobową obrabiano w ten sam sposób, jak i w przykładach 1, 9 i 16.

Aktywność specyficzną otrzymanych produktów końcowych określano eksperymentalnie według aktywacji zdolności reperacyjnych hepatocytów wątroby szczurów po porażeniu czterochlorkiem węgla (CCI4) przy którym aktywność Na, K-ATFazy była odnawiana: w 38,6 4 3,4% w przypadku wykorzystania produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób, jak w przykładzie I, w 58,6-4 4,2% - jak w przykładzie 9 i w 88,54 8,6% - jak w przykładzie 16, w porównaniu z grupą kontrolną zwierząt, którym nie wprowadzano środka według wynalazku.

173 302

Tabela 5

Rodzaje wykorzystywanych tkanek zwierzęcych	Aktywacja makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów (in vitro) w wyniku oddziaływania zgłaszanego ŚBA-TS otrzymanego z różnych tkanek, %, w porównaniu z kontrolą
Wzmocnienie aktywności fermentacyjnej (NBT test)	Wzmocnienie aktywności fagocytowej wobec E.Coli
Heptocyty intaktnej wątroby	55,3 ±4,7	43,9 ±4,1
Mięśniowa intaktna tkanka dorosłych zwierząt	62,6 ±4,8	UJ ± 4,3
Spermatogonia i spermatocyty gruczołów płciowych	81,3 ±5,6	70,2 ±4,8
męskich	84,5 ± 5,9	73,2 ±5,4
Tkanka nabłonkowa jelit	88,4 ± 5,4	78,8 ±5,1
Hepatocyty wątroby po wprowadzeniu CCI4	90,3 ± 6,8	81,6 ± 6,1
Komórki szpiku kostnego	92,4	83,6
Tkanka regenerujących kończyn aksolotlu	101,2	94,1
Embrionalna tkanka mięśniowa	95,6 ± 6,2	88,2 ±5,7
Hepatocyty regenerującej wątroby szczurów po hepatektomii	112,4 ±6,8	104,6 ±6,2

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P< 0,05

Tkanka, dla której podane w tabeli wielkości wskaźników są otrzymane podczas konkretnego wykonania eksperymentu.

Aktywność aminotransferaz we krwi była odnawiana odpowiednio, w: 71,6 ± 10,3% jak w przykładzie I; 89,2 ± 6,2% (9) i 98,7 -1,3% (16), a stężenie potasu w hepalocytach wątroby - w 28,4 ± 4,4% (1); 36,8 ± 5,4% (9) i 71,8 ± 8,8% (16).

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1 % masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy celem leczenia cieląt chorych na hepatytę w postaci zastrzyków, dokonywanych domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po 46 zastrzykach i był kontrolowany według aktywności aminotransferaz, stężenia bilirubiny i azotu we krwi.

Przykład 24.

Celem wyprodukowania środka według wynalazku jako surowiec zastosowano makuchę gruczołów płciowych byków, otrzymaną po wydzielaniu z nich lidazy drogą ekstrahowania 3%-wym kwasem octowym homogenatu tkanki.

Otrzymaną makuchę gruczołów płciowych, która jest odpadem poprodukcyjnym lidazy, ponownie poddawano homogenizacji w potrójnej objętości roztworu fizjologicznego za pomocą homogenizatorów nożowych i odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 12 min celem usunięcia niezniszczonych elementów tkanki. Kolejne operacje otrzymania produktu końcowego dokonywano w ten sam sposób, jak i w przykładach 1, 9, 16.

Aktywność specyficzną otrzymanych produktów końcowych określano eksperymentalnie według aktywacji makrofagów eksudatu otrzewnego i neutrofilów krwi szczurów. Przy wykorzystywaniu produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób, jak w przykładzie XVI, aktywność fermentacyjna makrofagów wzrosłao 120,2 ± 14,1%, a aktywność fagocytowa wobec E.Coli - o 115,4 ± 10,8%. Dla neutrofilów krwi podobne wskaźniki wzrastały odpowiednio o 115,4 ± 14,5% i 83,4 ±8,6%. ,

Produkt końcowy, zawierających ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, mieszano z 50 objętościami wody i wykorzystywano jako preparat leczniczy w postaci cieczy do pojenia celem normalizacji parametrów homeostazy kur. Pojenie preparatem kur z odchyleniami wskazanych parametrów od normy dokonywano w dawce 5 ml/kg masy ciała co 2i6

173 302 tygodni. Kontroli działania ŚBA dokonywano przez obliczenie nośności, która wzrastała o 20*40%, w porównaniu z grupą kontrolną drobiu nie potraktowaną preparatem.

Przykład 25.

Celem wyprodukowania środka według wynalazku jako surowiec wykorzystno tkankę łożyskową krów, którą obrabiano w ten sam sposób jak i w przykładach 1, 9 i 16.

Aktywność specyficzna otrzymanego produktu końcowego określano eksperymentalnie według aktywacji makrofagów eksudatu otrzewnego i neutrofilów krwi szczurów, w porównaniu z kontrolą. Przy wykorzystywaniu produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładzie XVI, aktywość fermentacyjna makrofagów wzrosłao 183,6 ± 17,4%, aaktywność fagocytowa makrofagów - o 131,4 ± 11,8%. Dla neutrofilów krwi podobne wskaźniki stanowiły 156,1 ± 11,2% i 111,2± 11,3% odppwiednio.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy do leczenia krów, chorych na zapalenie błony śluzowej macicy w postaci zastrzyków, które dokonywano domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po 4*8 zastrzykach i był kontrolowany według parametrów stanu zapalnego.

Przykład ,6.

Celem wyprodukowania środka według wynalazku jako surowiec wykorzystano makuchę grasicy, otrzymaną po wydzielaniu z homogenatu nierozpuszczalnych składników tkanki, które są odpadami poprodukcyjnymi tymozyny.

Makuchę grasicy obrabiano w ten sam sposób jak i w przykładach 1, 9 i 16.

Specyficzną aktywność otrzymanych produktów końcowych określano eksperymentalnie według stymulacji reakcji blasttraysformacji T-limfocytów, która zwiększyła się o 212,4 ± 15,5% w porównaniu z kontrolą, w przypadku wykorzystania produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładzie 16.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystano przez wprowadzenie przez jamę nosową, celem profilaktyki chorób zakaźnych człowieka. Do każdego nozdrza wkrapiano po 2 krople preparatu z następnym masażem dla rozprowadzenia preparatu po śluzówce. Zabieg powtarzano 2 razy dziennie. Kontrola efektu była dokonywana według ogólnego stanu organizmu i temperatury ciała.

Przykład 27.

Analizę aminokwasową składu ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1* 26, przeprowadzano w trzech kierunkach, określając:

- Ogólny skład amiyokwasowy;

- Skład aminokwasowy peptydów i wolnych aminokwasów przy nieobecności nierozpuszczalnego w kwasach białka;

- Skład wolnych aminokwasów. _r

1) Ogólną analizę aminokwasową ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1* 26, przeprowadzano drogą hydrolizy środka w 6 normalnym kwasie solnym (6 N HCl) w temperaturze 110°C w ciągu 24 godzin w próżni nad suchą sodą żrącą (NaOH). Suchą pozostałość rozcieńczono w pwudecyydrma|yzm (0,2 N) roztworze buforowym cytrynianu sodu o pH 2,2 i powlekano nią kolumienki wymieniaczy jonów analizatorów aminokwasów.

2) Celem usunięcia nierozpuszczalnego w kwasach białka do 0,5 ml próbki dodawano 0,5 ml 3% kwasu sulfasalicylowegOl pozostawiono na 1 godzinę, w ciągu której zestaw periodycznie mieszano. ZPenaturowayd białko usuwano odwirowywaniem z przyspieszeniem 8 000 g w ciągu 15* 20 min. Otrzymaną ciecz poddawano ogólnej analizie aminokwasowej.

3) Zawartość wolnych aminokwasów w ŚBA, otrzymanym w ten sam sposób, jak i w przykładach 1 * 26, określano po zrównoważeniu próbek dwudecyyormalnym (0,2 N) roztworem buforowym cytrynianu sodu o pH 2,2 i po filtracji przez odpopidloyy sączek bibułowy, powlekano kolumienki wymieniaczy jonów analizatorów aminokwasów.

Elucję aminokwasów z kolumienek przeprowadzano za pomocą buforowych roztworów cytrynianu sodu o pH 3,25; pH 4,25 i pH 5,28. Frakcjonowane aminokwasy obrabiano odczyn28

173 302 nikiem ninhydrynowym i określano gęstość optyczną za pomocą fotometru przepływowego przy długości fali 440 i 570 nm.

Przykład 28. ,

Zawartość ogólnych lipidów w ŚBA, otrzymanym w ten sam sposób jak i w przykładach 1+ 26, określano w następujący sposób. 0,5 ml ŚBa mieszano z 1,5 ml stężonego kwasu siarkowego (H2SO4) i gotowano w temperaturze 95°C w ciągu 15 minut. Po schłodzeniu, do 0,1 ml hydrolizatu dodawano 1,5 ml odczynnika fosfowanilinowego firmy Chemapol (Czecho-Słowacja) zgodnie ze znaną metodą określenia ogólnych lipidów według specyficznego zabarwienia (J. M. Knight, S. Anderson, J. M. Rawie. - Clinical Chemistry - 1972, -18, -p. 199). Gęstość optyczną roztworu określano przy długości fali 530 nm.

Przykład 29.

Analizę składu nukleotydowego ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1+26, przeprowadzano w następujący sposób. Rozpuszczalne w kwasach nukleotydy purynowe pirymidynowe ekstrahowano z 1,5-5,5 ml próbki za pomocą 5% schłodzonego kwasu nadchlorowego (HCIO4). Próbki po 20 min ekstrahowania na chodzie odwirowywano z przyspieszeniem

500 g w ciągu 10 min, osad trzykrotnie przepłukiwano 5%-wym kwasem nadchlorowym (HCIO4), uzyskane ciecze połączano i wykorzystywano celem wydzielania rozpuszczalnych w kwasach nukleotydów. Frakcję rozpuszczalną w kwasach poddawano hydrolizie jednomolowym kwasem nadchlorowym (1 M HCIO4) w temperaturze 100°C w ciągu 1 godziny do monofosforanów pirymidynowych i zasad purynowych. Roztwory zobojętniano potasem żrącym (KOH) i produkty hydrolizy rozdzielono na wymieniaczu kationów typu DAUEKS 50x4, stosując eluowame stopniowe: wodą destylową (H2O) dla kwasu moczowego i urydynmonofosforanu (UMP); dwudecymolowym kwasem nadchlorowym (0,2 M HCIO4) - dla ksantyny i cytozynmonofosforanu (CMP); czterodecymolowym kwasem nadchlorowym (0,4 M HCIO4) - dla hipoksantyny; jednomolowym kwasem nadchlorowym (0,1 M HCIO4) - dla guaniny; dwumolowym kwasem nadchlorowym (2,0 M HCIO4) - dla adeniny.

Nukleotydy identyfikowano według ruchliwości chromatograficznej na wymieniaczu kationów w porównaniu z standardami, jak również według widma absorpcyjnego w zakresie 200+ 300 nm. Ilość nukleotydów określano, wykorzystując wielkości współczynników ekstyncji molowej.

Przykład 30.

J /

Aktywność imunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1+26, określano według aktywacji makrofagów eksudatu otrzewnego szczurów linii Wister w eksperymentach in vitro, według wzmacniania się aktywności fermentacyjnej w odnowieniu nitro-błękitnego tetrazolium w dyformazan (test NBT) i według wzmacniania się aktywności fagocytowej wobec E.Coli.

Dojamy brzusznej zdekapitowanych zwierząt za pomocą igły ze strzykawką wprowadzano 20 ml bezbarwnego roztworu Henksa, zawierającego 20 jed/ml heparyny. Po masażu brzucha w ciągu 2+3 min robiono nadcięcie i tą samą strzykawką odsysano z jamy brzusznej wprowadzoną ciecz, którą po filtracji przez filtr nylonowy odwirowywano z przyspieszeniem 150+ 200 g w ciągu 15 min. Otrzymany osad przeprowadzano w stan zawiesiny w ilości zmniejszonej o połowę objętości świeżej porcji roztworu Henksa i ponownie odwirowywano w tych samych warunkach. Przepłukiwanie wydzielonych komórek dokonywano 3+ 4 razy, po czym stężenie komórek w zawiesinie doprowadzano do 80 x 10⁶ komórek/ml. Zawartość makrofagów w eksudacie tkankowym wszystkich komórek stanowiła 25+35%.

Określenie fermentacyjnej aktywności makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów przeprowadzano spektrofotometrycznie według odnowienia nitro-błękitnego tetrazolium w dyformazan. Osad komórek eksudatu otrzewnowego szczurów rozcieńczano bezbarwnym roztworem Henksa do stężenia 80 x 10⁶ komórek/ml.

Do 50 ml zawiesiny komórkowej dodawano 50 ml próbki o pH 7,4 i o stężeniu peptydów 1,0 mg/ml. Mieszankę pozostawiano do inkubacji w temperaturze 37°C na łaźni wodnej przy ciągłym wstrząsywaniu w ciągu 30 min, po czym dodawano 50 ml nasyconego w temperaturze 20°C roztworu nitro-błękitnego tetrazolium firmy R eana 1 (Węgry) i kontynuowano proces

173 302 inkubacji w ciągu jeszcze 30 min. Potem dodawano 3 ml acetonu i odwirowywano z przyspieszeniem 2 000 g w ciągu 20 min. Acetonowy wyciąg nadosadowy badano fotometrycznie przy długości fali 515 nm.

Dla porównania aktywności fermentacyjnej jako kontrolę wykorzystywano próbkę ze środkiem antyseptycznym w roztworze fizjologicznym.

Aktywność fagocytową komórek eksudatu otrzewnowego szczurów określano według ich zdolności do wychwytywania E.Coli.

Do 50 ml zawiesiny komórkowej dodawano 50 ml próbki o pH 7,4 i o stężeniu peptydów 0,05 mg/ml. Mieszankę odstawiano do inkubacji w temperaturze 37°C do łaźni wodnej przy stałym wstrząsywaniu w ciągu 30 min. Po skończeniu inkubacji mieszankę przeprowadzano w stan zawiesiny w 10 ml bezbarwnego roztworu Henksa w temperaturze 4°C i odwirowywano z przyspieszeniem 150* 200 g w ciągu 15 min. Osad komórek eksudatu otrzewnego szczurów rozcieńczano roztworem Henksa do stężenia 2,5 x 106 komórek/ml. Otrzymaną zawiesinę w ilości 0,2 ml powlekano szkło o wymiarze 18x18 mm i poddawano hk^Lbaicjji w temperańrrze 37°C w ciągu 30 min w atmosferze, zawierającej 5%-wy dwutlenek węgla (CO2) celem przymocowania makrofagów do szkła.

Po inkubacji dla usunięcia nieprzymocowanych komórek szkło opłukiwano 3 razy w szklankach ze środowiskiem Henksa. Do pozostałych na szkle komórek dodawano 0,2 ml zawiesiny E.Coli ze stężeniem 20 x 106 komórek/ml i poddawano inkubacji w tych samych warunkach 45 min. Potem szkło znów trzykrotnie opłukiwano, utrwalano metanolem i farbowano według Romanowskiego-Gimzy.

Indeks fagocytozy (IF) określano według wzoru:

IF = ( 0 + 2,5n + 6t + 9p +10R)/ilość komórek, (1) gdzie: O - ilość komórek, nie fagocytujących E.Coli;

n - ilość komórek, absorbujących 1* 4 komórki; t - ilość komórek, absorbujących 5* 7 komórek; p - ilość komórek, absorbujących 8* 9 komórek;

R - ilość komórek, absorbujących 10 i więcej komórek E.Coli.

Identyfikację makrofagów dokonywano według zabarwienia estrazy niespecyficznej. Przykład 31.

Aktywność immunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1+26, określano według aktywacji neutrofilów krwi szczurów linii Wistar w eksperymentach in vitro, według wzmacniania aktywności fermentacyjnej w odnawianiu nitro-błękitnego tetrazolium w dyformazan (test NBT) i według wzmocnienia aktywności fagocytarnej wobec E.Coli.

Krew z arterii ogonowej szczura od razu pobierano do probówek z bezbarwnym roztworem Henksa na heparynie i mieszano. Do otrzymanej mieszanki dodawano 6%-wy dekstran T-500 w stosunku 3:1 i probówki na jedną godzinę wstawiano do lodówki. Po osadzaniu erytrocytów nadosadową warstwę leukocytów pobierano pipetę i odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 15 min. Usunięcie erytrocytów z masy leukocytowej dokonywano przez hemohzowanie drogą pononego przeprowadzenia w stan zawiesiny osadu leukocytów w wodzie destylowanej, po czym dodawano roztwór Henksa i mieszankę odwirowywano. Osad leukocytów ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny świeżym roztworem Henksa i odwirowywano w tych samych warunkach. Operację przepłukiwania leukocytów dokonywano 3 razy.

Określenie aktywności fermentacyjnej neutrofilów krwi przeprowadzano spektrofotometrycznie według odnawiania nitro-błękitnego tetrazolium w dyformazan.

Osad leukocytów krwi szczurów rozcieńczano bezbarwnym roztworem Henksa do stężenia 80 x 10⁶ komórek/ml. Do 100 ml zawiesiny komórkowej dodawano 300 ml ŚBA, otrzymanego zgodnie z przykładami 1 * 26, pH doprowadzono do 7,4 i stężenie peptydów - do 1,0 mg/ml. Mieszankę odstawiano do inkubacji w temperaturze 37°C na łaźni wodnej przy stałym wstrząsaniu w ciągu 30 min, po czym dodawano 400 ml roztworu nitro-błękitnego tetrazolium firmy R e a n a l (Węgry) i następne operacje przeprowadzano w tej samej kolejności, jak i w przykładzie 30.

173 302

Aktywność fagocytową leukocytów krwi szczurów określano według ich zdolności do wychwytywania E.Coli. _

Do 50 ml zawiesiny leukocytów dodawano 50 mkl ŚBA z pH 7,4 i stężeniem peptydów 0,05 mg/ml. Mieszankę poddawano inkubacji, a potem dodawano 10 ml bezbarwnego roztworu Henksa w temperaturze 4°C i odwirowywano z przyspieszeniem 1504 200 g w ciągu 15 min. Osad leukocytów rozcieńczano w 0,3 ml roztworu Henksa i dodawano 0,05 ml zawiesiny E.Coli ze stężeniem 500 x 10⁶ komórek/ml, a potem poddawano inkubacji w ciągu 30 min w temperaturze 37°C. Po inkubacji robiono rozmazy, w których po zabarwieniu obliczano ilość komórek fagocytujących oraz indeks fagocytozy (IF) w ten sam sposób, jak i w przykładzie 30.

Przykład 32. _z

Aktywność immunomodulującą ŚBA otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 14 26, określano w eksperymentach in vivo na myszach linii BALB/C. Zwierzętom robiono dwa podskórne zastrzyki preparatu z odstępem dwudniowym w dawce 0,5 ml/kg masy ciała ze stężeniem peptydów 1,0 mg/ml. Analizę właściwości immunomodulujących dokonywano po upływie dwóch dób po ostatnim zastrzyku. W każdym eksperymencie wykorzystywano nie mniej niż 10 zwierząt. Jako kontrolę wykorzystywano zwierzęta, potraktowane według wskazanego wyżej schematu 0,08%-wym środkiem antyseptycznym, rozcieńczonym roztworem fizjologicznym.

Celem określenia reakcji blasttransformacji limfocytów w postaci T-komórkowego mitogenu był wykorzystany fitohemaglutenin (FGA), a jako mitogen B-komórkowy - lipopolisacharyna E.Coli (LPS). Limfocyty, wydzielone ze śledziony myszy, poddawano inkubacji ze wspomnianymi mitogenami w ciągu 72 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% dwutlenek węgla (CO2). Poziom proliferacji komórek oceniano radiometrycznie według inkluzji ³H-tymidyny. W tym celu do kultur dodawano ³H-tymidynę (3,7 x 10⁴ Bq/próbkę) i poddawano inkubacji w ciągu 3 godzin. Potem próbkami powlekano filtry miliporowate (Synpor Nr 5, CSRS), trzykrotnie przemywano środowiskiem 199, potem - 5% roztworem kwasu trójchlorooctowego i etanolem. Filtry suszono, wkładano do flakonu z cieczą scyntylującą ^C-106 i określano promieniotwórczość próbek za pomocą licznika Mark-111.

Pr z y kł a d 33.

Skuteczność immunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 14 26, określano według stymulacji naturalnej aktywności killerowej splenocytów myszy w eksperymentach in vivo. Zwierzętom w ciągu dwóch dni robiono dwa zastrzyki podskórne w dawce 0,05 ml/kg masy ciała ze stężeniem w nich peptydów 1,0 mg/ml. Analizę właściwości immunomodulujących przeprowadzano w następnym dniu po ostatnim zastrzyku. W każdym eksperymencie wykorzystywano nie mniej niż 10 zwierząt. Jako kontrolę wykorzystywano zwierzęta, potraktowane według wskazanego wyżej schematu 0,08% środkiem antyseptycznym, rozcieńczonym roztworem fizjologicznym.

Stan naturalnej aktywności killerowej splenocytów określano na komórkach limfomy myszy YAC-12, znaczonych izotopem chromu ⁵¹Cr. Inkubację przeprowadzano w ciągu 18 godzin ze stosunkiem komórek-celi do komórek efektorów 1:25 (1 x 105 : 2,5 _χ komórek). Specyficzne wyzwalanie się izotopu chromu 5*Cr, odpowiednie do aktywności cytotoksycznej komórek efektomych, obliczano według wzoru:

_ (wyzwalanie podczas eksperymentu) - (samoczynne wyzwalanie się) (maksymalne wyzwalanie się) - (samoczynne wyzwalanie się) gdzie maksymalne wyzwalanie się oznacza promieniotworczość, przy której wszystkie komórki są lizyrowane. Jako kontrolę wzmacniania naturalnej aktywności killerowej proponowanymi ŚBA stosowano środek antyseptyczny, rozcieńczony w roztworze fizjologicznym.

Przykład 34.

Skuteczność immunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1426,określano według aktywności funkcjonalnej grasicy myszy w eksperymentach in vivo w warunkach, analogicznych do przykładu 32.

173 302

Efekt oddziaływania oceniano według miana t^micznego surowiczego czynnika (TSC). Metoda opiera się na zdolności hormonów grasicy do odnawiania czułości spontanicznych tworzących rozetę komórek śledziony dorosłych myszy, poddanych thymektomii, wobec surowicy antythymocytowej.

Surowicę krwi doświadczalnych myszy przepuszczano przez ultrafiltr systemu CENTRIFLO CF-50A firmy A m i c o n. W reakcji wykorzystywano po 0,1 ml yidrozcidńczondj i surowicy seryjnej rozcieńczonej środowiskiem 199. Jako kontrolę wykorzystywano środowisko 199.

Śledzionę pobierano u myszy po upływie 10* 14 dni po thymektomii. Ze śledziony pobierano komórki drogą rozdzielania włókna tkanki igłami prepara^nymi w środowisku 199. Po filtracji przez sito kapronowe komórki dwukrotnie przemywano środowiskiem 199 odwirowywaniem z przyspieszeniem 4 000 g. Osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w środowisku do stężenia 4 x 10⁷ komórek/ml i w ten sposób otrzymywano zawiesinę o objętości 0,1 ml, którą dodawano do probówek z surowicą i ze środowiskiem 199. Zawartość probówek mieszano pipetkowaniem i poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 60 min.

Po inkubacji do wszystkich probówek wnoszono po 0,1 ml surowicy antythomocytowej oraz komplementu świnki morskiej w rozcieńczeniu 1:10. Zawiesinę poddawano inkubacji w temperaturze 37°C jeszcze 30 min. Potem do mieszanki dodawano po 0,1 ml zawiesiny erytrocytów (12 x 10i komórek/ml), mieszano, odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 5 min i poddawano inkubacji w ciąg 60 min w temperaturze 4* 8°C. Osad w probówkach ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w ciągu 5 min. Obliczenie rozetek przeprowadzano w komorze Goriajewa. Jako rozetę uważano limfocyt, który dołączył cztery i więcej erytrocytów. Za miano TSC uważano ostatnie rozcieńczenie surowicy, powodujące 50% zredukowanie liczby komórek tworzących rozetki (KTR) w stosunku do kontroli. Rezultaty wyrażano w postaci logarytmu miana z podstawą 2, tj. w postaci log A, gdzie A - wielkość miana.

Przykład 35.

Skuteczność ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1*26, wyrażającą się jako wzmocnienie zdolności reperacyjnej hepatocytów szczurów in vivo po podskórnym wprowadzeniu czterochlorku węgla (CClą), określano według odnawiania się aktywności Na, K-ATFazy w następujący sposób.

Szczurom-samcom o wadze 230-250 g linii Wistar codziennie w ciągu 4 dni podskórnie wprowadzano czterochlorek węgla (CCI4) zmieszany z olejem roślinnym w stosunku 1:1 w dawce 4,0 ml/kg masy ciała. 4 godziny po pierwszym zastrzyku czterochlorku węgla (CCI4) zwierzętom doświadczalnym robiono pierwszy z 4 zastrzyków podskórnych środka z odstępem jednodniowym w dawce po 0,05 ml/kg masy ciała szczura. Skuteczność działania środka rejestrowano w dniu następnym po ostatnim jego wstrzykiwaniu. Przy tym, jako kontrolę porównawczą, wykorzystywano wątrobę zwierząt porażoną w sposób analogiczny czterochlorkiem węgla (CCI4), ale bez zastosowania badanych środków ŚbA, jak również wątrobę zwierząt intaktowych.

Celem określenia aktywności Na, K-ATFazy, wykorzystywano frakcję membran komórkowych hepatocytów. W tym celu 15 g schłodzonej wątroby trzech szczurów homogenizowano w 150 g jdPnomilimolowego boranowego roztworu buforowego (1 mM Na₂B4O7) o pH = 7,5 w obecności pięciodecymilimolowego roztworu chlorku wapniowego (0,5 mM CaCl₂), za pomocą ręcznego homogenizatora z tłuczkiem teflonowym. Zhomogeyizowaną mieszankę odwirowywano z przyspieszeniem 150 g w temperaturze 4°C w ciągu 10*12 min. Uzyskaną ciecz poddawano ponownemu odwirowywaniu z przyspieszeniem 100 000 g w ciągu 20 min, a otrzymany osad 3 razy odmywano w 130 ml buforu w tych samych warunkach odwirowywania. Po skończeniu odmywania osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w roztworze buforowym, doprowadzając stężenie białka do 3,0 mg/ml, zgodnie z metodą SDS-Luori.

Wszystkie operacje związane z otrzymywaniem frakcji membran, przeprowadzano w chłodzie.

Aktywność Na, K-ATFazy plazmatycznej membrany hepatocytów określano w środowisku znormalizowanym, .składającym się z: sześćdziesięciosześciomilimolowego chlorku sodowego (66 mM NaCl), trzydziestoczteromilimolowego chlorku potasowego (34 mM KCl),

173 302 pięciomilimolowego chlorku magnezowego (5 mM MgCl₂), dwudziestopięciomilimolowego (25 mM) Tris-HCl, do którego przed rozpoczęciem eksperymentu dodawano pięciomilimolowego kwasu adenozynotrójfosforowego (5 mM ATP).

Do 1,8 ml standaryzowanego środowiska dodawano 0,2 ml zawiesiny frakcji membran o stężeniu białka 3,0 mg/ml i poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 15 min, po czym reakcję przerywano, dodając 0,6 ml 50% roztworu kwasu trójchlorooctowego. Mieszankę odwirowywano z przyspieszeniem 3006500 g w ciągu 15 min. Do 1,0 ml otrzymanej cieczy dodawano 4 ml dwudecymolowego (0,2 M) buforu octanowego o pH = 4,0,0,5 ml 1% roztworu molibdenianu amonowego w 1% roztworze kwasu siarkowego (H₂SO4), 0,5 ml kwasu askorbinowego w 0,16% roztworze siarczanu miedziowego pięciowodnego (CuSO4) i po mieszaniu poddawano inkubacji w ciągu 10 min w temperaturze 25°C. Gęstość optyczną określano spektrofotometrycznie przy długości fali 700 nm.

Aktywność Na, K-ATFazy obliczano według różnic pomiędzy aktywnościami ogólnej ATFazy i Mg-ATFazy. Celem określenia aktywności Mg-ATFazy przeprowadzono analogiczne badania, jednak zamiast dodawania 0,6 ml kwasu trójchlorooctowego do mieszanki dodawano 0,3 ml 0,05%-go roztworu strofantyny.

Ustalono, że w przypadku toksycznego porażenia wątroby czterochlorkiem węgla (CCU) aktywność Na, K-ATFazy zmniejsza się 3,5 razy, jednak przy zastosowaniu ŚBA według wynalazku, jak w przykładzie XVI, jej aktywność jest odnawiana nie mniej niż o 80%, w porównaniu z normą. W tych samych warunkach znany preparat hepatotropowy Essenziale przemysłowy analog ŚBA według wynalazku odnawia aktywność Na, K-ATFazy w 43 ± 4,8%.

Przykład , 36.

Skuteczność ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 16 26, która ujawnia się we wzmacnianiu zdolności reperacyjnych hepatocytów wątroby szczurów (in vivo) po podskórnym wstrzykiwaniu czterochlorka węgla (CCU), określano według odnawiania aktywności we krwi aminotransferaz i stężenia potasu (K) w hepatocytach wątroby szczurów w następujący sposób.

U zwierząt, potraktowanych w ten sam sposób, jak i w przykładzie XXXV, aktywność aminotransferaz we krwi sprawdzano z zastosowaniem systemu testowego firmy C hemapol (Czecho-Słowacja) zgodnie z metodą fotometryczną według specyficznego zabarwienia. (S.Reitman, S.Frankel. - American Journal of Clinical Pathology, -0957-28-06).

Do 0,25 ml roztworu, zawierającego roztwór decymolowy (0,1 M) L-aspartatu, dwumilimolowy (0,002 M) 2-oksoglutoratu i decymolowy (0,1 M) buforowy roztwór fosforanowy o pH=7,4, dodawano 0,05 ml surowicy krwi szczurów i poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 60 min. Po zakończeniu inkubacji do roztworu dodawano 0,25 ml milimolowej (0,001 M) 2,4-dinitrofenylohydrazyny, rozcieńczonej w jednomolowym kwasie solnym (1M HCl) i próbkę pozostawiano na 20 min w temperaturze pokojowej, po czym dodawano 2,5 ml czterodecymolowej (0,4 M) sody żrącej, mieszano i po 10 min dokonywano pomiaru gęstości optycznej przy długości fali 520 nm przeciw roztworowi kontrolnemu, do którego zamiast 0,05 ml surowicy krwi dodawano 0,05 ml roztworu fizjologicznego.

Porażenie toksyczne wątroby czterochlorkiem węgla (CCI4) idzie w parze ze zniszczeniem hepatocytów i odpowiednio, wyjściem aminotransferaz, w związku z czym ich aktywność w surowicy krwi wzrasta 2 razy. Jednocześnie, wykorzystanie ŚBA według wynalazku w sposób, opisany w przykładzie XVI, pozwala na całkowite odnawianie podobnej aktywności.

Znany hepatotropowy preparat Essenziale w tych samych warunkach odnawia aktywność aminotransferaz we krwi w 87,2±7,4%.

Stężenie potasu (K±) w hepatocytach wątroby doświadczalnych szczurów określono znormalizowaną metodą fotometrii płomieniowej, według Brikkera, za pomocą fotometru płomiennego typu ΠΦΜ-1 (Β. Η. Ερηκκερ. OnpeąejieHne coąepacaHHH K, Ha mctoaom njiaMeHHoii φοτοΜετριηι. - JlaSopaTopiroe ąejio -1961-7- str. 3-6).

Ustalono, że w przypadku toksycznego porażenia wątroby czterochlorkiem węgla (CCI4) aktywność Na, K-ATFazy zmniejsza się 3,5 razy, co idzie w parze z obniżeniem stężenia K± w hepatocytach wątroby szczurów o 40%. Jednocześnie, zastosowanie ŚBA według wynalazku,

173 302 otrzymanego w ten sam sposób, jak w przykładzie XVI, pozwala na odnawianie stężenia K+ w stopniu nie mniejszym niż 55%. Znany preparat Essenziale w tych samych warunkach odnawia stężenie K+ w hepatocytach o 33,0±6,2%.

Przykład 37.

Stymulację procesów regeneracyjnych przy wykorzystaniu ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładzie 16, przeprowadzano na eksperymentalnym modelu wrzodu żołądku, spowodowanego przez oddziaływanie kriogeniczne.

Szczurom-samcom o wadze 190*200 g pod narkozą, eterową robiono laparotomię górnej trzeciej części ścianki brzusznej, wyprowadzano żołądek i powodowano uszkodzenie jego błony śluzowej przez oddziaływanie kriogeniczne w ciągu 10 sekund za pomocą schłodzonego w ciekłym azocie prętu metalowego o średnicy 7 mm według znanej metody (Bcptcjikmh

B.A KpnoreHHbiii ciiocoo φορΜΗροΒηηηο 3KcneppMeHTaHbou a3Bbi 'n<e;pv7n<a, - HlaT. φΗ3Ηθπ . u 3KcnepnM. 5 Tep., - 1987, Nr 2, str. 77-78). Po czym żołądek umieszczano w jamie brzusznej i rozcięcie zszywano. W 5-tym dniu u zwierząt tworzył się wrzód, morfologicznie podobny do chronicznego wrzodu człowieka, wygojenie którego bez leczenia zwierząt odbywało się w 3*4 tygodniu.

Skuteczność właściwości regeneracyjnych ŚBA według wynalazku określano według przyspieszenia procesu wygojenia się ran w stosunku do grupy kontrolnej zwierząt, nie poddawanych leczeniu, jak również w porównaniu z efektem, wywoływanym przez znany biostymulator Solcoseril firmy Alcoid-Skopje(Jugosławia), produkowanym na podstawie licencji Solco Bazel (Szwajcaria). Kontrola procesu regeneracji była dokonywano biochemicznie w 5, 15 i 25 dniu po operacji - według poziomu malonianowego dwualdehydu (MDA) we wrzodzie, patomorfologicznie - na podstawie skrawków uszkodzonego miejsca żołądka, według pomiarów powierzchni uszkodzenia śluzówki.

Poziom MDA w uszkodzonej tkance żołądka określano za pomocą kwasu tiobarbiturowego i obliczano jego stężenie właściwe w stosunku do 1 mg białka w próbce według znanej metody (CTanbHaa H.J(. CoepeMeHHOie MeTogo b 6hoxhmuu, -M.- 1997, str. 66-68).

Zidentyfikowanie ŚBA według wynalazku wśród innych środków biologicznie aktywnych jest możliwe w sposób bezpośredni - według analizy biochemicznej składu i w sposób pośredni - według wielkości efektu immunomodulującego, który wykazuje środek według wynalazku.

Ustalono, że właśnie zawartość zmodyfikowanych składników membran komórkowych o zmodyfikowanej strukturze antygenowej w składzie ŚBA według wynalazku zapewnia istotne wzmocnienie reakcji odpornościowej organizmu w porównaniu z kontrolą. To zezwala na zidentyfikowanie ŚBa według następującego zespołu wskaźników:

a) Według podwyższenia aktywności makrofagów eksudatu otrzewnego szczurów, a mianowicie według wzmacniania się aktywności fermentacyjnej makrofagów, kontrolowanej za pomocą testu NBT, - nie mniej, niż o 61 % (przy wykorzystaniu w eksperymentach nitro-błękitnego tetrazolium węgierskiej firmy R e a n a l) i według wzmacniania aktywności fagocytowej E.Coli - nie mniej, niż o 49%;

b) Według podwyższenia aktywacji neutrofilów krwi szczurów, a mianowicie - według wzmacniania aktywności fermentacyjnej, kontrolowanej według testu NBT, - nie mniej, niż o 75% (w przypadku wykorzystania w eksperymentach nitro-błękitnego tetrazolium węgierskiej firmy Re an a l) i według wzmacniania się aktywności fagocytowej E.Coli - nie mniej, niż o 52%;

c) Według wzmacniania reakcji blasttransformacji T-limfocytów - nie mniej, niż o 52%, i B-limfocytów - nie mniej, niż o 69%;

d) Według wzmacniania aktywności funkcjonalnej grasicy - zgodnie z zawartością we krwi szczurów thymicznego surowiczego czynnika (TSC) - nie mniej, niż o 234%;

e) Według wzmacniania naturalnej aktywności killerowej splenocytów szczurów - nie mniej, niż o 62%;

f) Według wzmacniania zdolności dostabilizacji plazmatycznych membran hepatocytów wątroby szczurów po wprowadzeniu czterochlorku, węgla (CCL;):

- wedhłg oonawiania aktywnnściNa,K-ATFaay- niemniee, niżw 30%;

173 302

- według odnawiania aktywności transferazy we krwi szczurów nie mniej, niż w 61%;

- według odnawiania stosunku potasu (K) i sodu (Na) w hepatocytach wątroby szczurów - nie miej, niż w 20%.

Przy tym jako bazę porównawczą wykorzystywano kontrolę w postaci wprowadzanego do organizmu środka antyseptycznego, rozcieńczonego w roztworze fizjologicznym.

W przypadku ŚBA według wynalazku jest obserwowana wyraźna tendencja do wystąpienia efektu stymulacji procesów regeneracyjnych i odnowiania aktywności funkcjonalnej narządów i tkanek przy patologiach różnego rodzaju, przy czym przy leczeniu stanów zapalnych skuteczność działania może w znacznym stopniu przewyższać skuteczność znanych ŚBA.

Wykorzystanie środka według wynalazku pozwala na otrzymanie pozytywnych rezultatów przy jego wprowadzeniu do organizmu zwierząt przy leczeniu stanów⁷ zapalnych. Na przykład, podczas leczenia eksperymentalnie wywołanego zapalenia proliferacyjnego na modelu kieszonkowej granulemy według Selie w modyfikacji Rozena (^romoa BocnpoH3Be,aeHiu CTangapTiioro aceiiTnaccKoro bo cnaneHHH, - Ho. φ hoiou. n OKcnepirri. Tep., - 1961, -5, Nr 6, str. 72-76) ŚBA według wynalazku dwa razy skuteczniej niż Solcoseril hamował tworzenie się tkanki granulacyjno-zwłókniającej i eksudatu.

Podczas leczenia zapalenia gruczołów sutkowych krów wyzdrowienie było obserwowane w 80+ 93%, natomiast przy zastosowaniu znanych ŚBA, jak i w przypadku wykorzystania antybiotyków w połączeniu z preparatem przeciwzapalnym Mastisan, wyzdrowienie obserwowano nie więcej, niż w 70% przypadków, a przy wyzdrowieniu spontanicznym w grupie kontrolnej - w granicach 53+ 63% przypadków. Przy leczeniu zapalenia płuc cieląt otrzymano następujące rezultaty: przy zastosowaniu ŚBA według wynalazku wyzdrowienie zdarzało się w 85+ 95% przypadków; przy zastosowaniu znanych ŚBA - w 69% przypadków; przy leczeniu z zastosowaniem antybiotyków i preparatu Bowiwereks - w 60+ 70% przypadków, w grupie kontrolnej - w 48+ 61% przypadków. Przy leczeniu zapalenia śluzówki macicy krów wyzdrowienie obserwowano w 80+ 95% przypadków, podczas gdy przy zastosowaniu znanych ŚBA, również antybiotyków z preparatem Oksitocin, wyzdrowienie było obserwowane nie więcej, niż w 70% przypadków.

Podczas prrzebiegu ekspe^mentu właściwości immunomodulujcee i regeneracyjne znanych ŚBA i ŚBA według wynalazku zostały określone zgodnie z zespołem wskaźników, służących do zidentyfikowania badanych obiektów. Rezultatyieksperymentu są zebrane w tabeli 6, w której są podane ilościowe wskaźniki efektów znanych ŚBA nr 1, otrzymanych zgodnie z technologią, opisaną w (US-A-4455302) i ŚBA nr 2, przedstawionego na podstawie danych z opisu patentowego numer EP-A-0318030, oraz ŚBA według wynalazku, reprezentowanego w postaci grup WS, PM, TS, LM i CW, a mianowicie uogólnionych odpowiednio do rezultatów:

WS - przykładów 1+ 4 (składniki membran komórkowych);

PM - przykładów 5+ 6 (składniki membran komórkowych);

TS - przykładów 9+ 14 (termostabilne składniki membran komórkowych);

LM - przykładów 16+19 (składniki małocząsteczkowe membran komórkowych M<10 000);

CW - przykładów 20+21 (zawierające węglowodany składniki membran komórkowych).

W postaci obiektu do kontroli wykorzystywano roztwór fizjologiczny chlorku sodowego, zawierający środek antyseptyczey. Otrzymane rezultaty są zebrane w tabeli 6 i porównawczo charakteryzują ŚBA według wynalazku i znane ŚBA.

Przytoczone rezultaty dotyczą charakterystyk ŚBA według wynalazku, otrzymanego w postaci mieszanki o nieustalonej strukturze, jak również potrzebnych do zidentyfikowania wiadomości o efektach, uwarunkujących jego przeznaczenie.

Obok możliwości zidentyfikowania ŚBA według wynalazku, analiza danych tabeli 6 pozwala na ocenę konkretnego rezultatu, powodowanego przez ŚBA według wynalazku, polegającego na istotnym polepszeniu aktywności biologicznej w postaci wskaźnika ilościowego kosztem obecności w nim składników membran komórkowych o strukturze zmodyfikowanej, wpływ których nie był ujawniony w znanych ŚBA.

173 302

Z analizy danych tabeli 6, wynika, że efekt immunomodulujący ŚBA według wynalazku istotnie zwiększa się w tych przypadkach, kiedy zawiera on składniki plazmatycznych membran komórkowych ŚBA-PM, składniki membran komórkowych w postaci składników termostabilnych ŚBA-ST, jak również w postaci składników małocząsteczkowych ŚBA-LM i w postaci zawierających węglowodany składników ŚBA-CW, przy czym wzrost wspomnianego efektu w tym szeregu idzie od lewej ku prawej.

Właściwości ŚBA według wynalazku są ściśle uzależnione od jego składu.

173 302

Tabela

CC

CA cm

CM +i oo

CA rsq

Tt +1 cc so oo

00^ cc £

cc ws cc o

+1 cc os iti c3 'S· cc o

wi +1

T“H \d rcc

O ?!

σ\ $

oo

Os so~ os

Ή cc

SO rW0 ©

Os cc

Tt +1

Γγ wi

OS r+1

CM so

Os

Os wy cc +1 ws sd

OS ?!

Tł00 +1 sd

SO <

w 'OO %

Ό

I

O £

O o

'ς/3 o

fi 'N

CS <

CQ

NZ) >>

c cS

OD

N

WS

UC +1

CC ci

O

Tt

Tt +j

Ci os

WP ίΰ

CM os +i rso ©

cc o

r3

WP

OS

Tt*

CA ci c+1 cc sd ws

Tt +1

W?

+1

CA oo

-H

SO,

CC

Os

Os oo +1

CM o

CM i

ro wi

O

CA r00 +1 ’ζζ wi rUC a

iti ci

TT sO o

+1 cc

CA sd +1

CM +1 cc wi ws +1 sd cc

CM tJOs +1 cc

Tt o

?!

CM so

Ή sq

W)

Ό r£ ?! 00 τ—I ?!

wi cc cc o

τζ wi

CM <

«

NZ)

O fi cS fi

N o

o cc s

ca

SO

Tj+1 sd +1 cc cc cc

-H

CM

WP rCA ?i

CC cm

Tt

OS +1 wi +1 cc ws +1 so ca

CA 'Τ' cc

CM cc +1

CM

OD o

Lo £

Ό o

i/5 o

CS Q fi O OD <D

C $ < >?CQ C S-tZ) <s “O

O £

o fi fi £

£ >>

i £

m o

c £

ca &

>»

O o

£ ·ΰ 2? £ •2 P £

<

ώ

Λ

CS

CL

-fi &

+ cS '£

D ' •N *j> O ti P i

‘S1 S

N 5 oo ·« o υ SD § £ s > O fi C c o 4^ o N

S fi .a s °

O fi

M ·£ => CO ,Π •ΓΜ ' O \Q >> fi Ui £ O -q o ca* cS • Ό >vd i Sd)©⁵'

CM es d¹

SS łśS ρ N cl .2

S £ sp

O,

CC &

ź

Ό

U

O

CL

O Sd) £ u

ω oo ⁶ 5 cce 'a 2 S

S5 >» E W5 N S

O p N SO -3 O £ 5 N CS O fi

G>

£

N

J- O ??

'55 >d 2 c

S2 ·£ 3 •*ri O O N fi OG ca3 £ o S >> ϋ s o _c .2,

CN

CL (Λ fi s j? a £? £ e ^w2i ws

X SI o

CS O fe fi Cl O o o 0D ^N £ fi C*3 O o

J=!

’ο N o W5

Έ $: .o Ό ‘fi >i CS O £-S ms e?

CS* s

| CL O

F-“ ° ? Cl 2 T ^c & 2 ° § fi >

£ 'S >» o - CL

1’ .2 ^C _£ o MRóżnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

173 302

CD < r-. n o

s? +1

N CD £3

O

CL

CS ©

S ε

o

CL +1 rd

Tt +i

Cy

CD

Ό uy cs δ

Tt

UD

Tt ©,

CS* f

uy

CD* ty©*

CD

CD +1

CD

CD*

OO

Zawartość związków organicznych, w % masy w ŚBA _l

CD '£?·?) il

S UD © ε

α ce

N oo

N

X

O >>

c

Λ

C

N co

H co

OO Uy Uy c O Tt* Tt O CD CS UD CL t—¹ © 00 fi f f fi ud ^y oo uy © rD o\ CD CS <S 1-1 Ό

CD 00 UD X HD r— i—- Ό ©

d +1

UD

Q A.

OO CD* CS* # s S d oo ud* c?

<O +1 uy

CD*

Tt

UD , f uy

CD*

Tt

T-H CS CS 1-H fi +i fi f c^y u cs* d o*

CD r—« CD 00

CS ©

c o

CL

CD f

CD

Tt

CS tyf ry oo +1

CD fi

UD +i

UD ©*

CS

UD i

f

Tt

CS*

CD f

UD

00*

CS c-y

Tt +1

CS*

CS oo δ

UD* tyO* x

CS* +1 oo

OO

CS* δ

© oo

Cy ©* a

ty-* ty©* tyy +i

CD +1

UD

CS

CS +1 rtyΦ +i

CS* <3\ o P.

+i δ Ά

A >2 o °+i δ

Ι/-Ϊ '

CD

CS

CD +1

CD \o

CD

X cs^

CS* +1

CD

CD tyθ' δ

CD

0\ \£>

UD f

UD d

UD ©* ty©*

X fi

X

CS

CD

O c

N

O ε

ce

N cy £

N

NJ g

8* -o g ω g ł ł < c:

c

Λ

O

Ź

O *00

ϋ c

s

Q ’3 ce

S

O

O (3 >,

O £

Ό d

o, o

CL £

O c

ce

O £

O *00

4>

Ź

O c3 £

ce s

X

O c

Q '05

O c

N

O

O

X w

£ o

ε <υ

N x

o ε

oo ε

<

Ό0 o

Ό5

O

O

N

O

CL

X ce oo ce o

oo <L>

C

S

O >>

CL <u c

<e ce

X o

ce oo ce ce ε

ϊ£

3*

X

N

O

CL *57

5ty

S

O

CL ε

O £

<

m '00 o

•to o>

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05 * Wartości są obliczone według przeciętnych statystycznych wartości, przytoczonych w tabeli.

173 302

Jak na to wskazują rezultaty analizy biochemicznej (patrz tab. 7), ŚBA zawiera głównie takie związki organiczne, jak poiipeptypy, peptyp0l aminokwasy, związane i wolne węglowodany, lipidy, nukleotydy oraz inne związki. Dane tabeli 7 demonstrują rozdzielenie związków organicznych w ŚBA według masy przy wykorzystaniu jako surowca wyjściowego tkanki embrionalnej bydła domowego. Oprócz tego, w tabeli 7 są przytoczone rezultaty wytwarzania różnych rodzajów ŚBA według wynalazku (WS, PM, TS, LM, CW) za pomocą sposobu według wynalazku. Oprócz rezultatów zrealizowania sposobu, który zapewnia otrzymanie ŚBA-WS i przy realizowaniu którego jako surowiec jest wykorzystywana tkanka zwierzęca, pobrana w stadium procesu modyfikacji struktury antygenowej membran komórkowych tkanki ze wspomnianymi wyżej procesami. W tabeli 7 są również podane rezultaty realizowania sposobu wytwarzania ŚBA według wynalazku ze zmodyfikowanymi składnikami plazmatycznych membran komórkowych ŚBA-PM, ze składnikami w postaci termostabilnych ŚBA-TS, w postaci składników małocząsteczkowych ŚBA-LM oraz zawierających węglowodany składników membran komórkowych ŚBA-CW, przeważnie w postaci glikopeptydów, glikolipidów, oligowęglowoPanów, yukldotypów i/lub wolnych monowęglowdPayów.

Dane z tabeli 6 i z tabeli 7 pozwalaj ą na przeprowadzenie analizy porównawczej rezultatów zrealizowania sposobu wytwarzania ŚBA według wynalazku i znanych sposobów otrzymania ŚBA, jak również ich składu i właściwości.

Analiza porównawcza wskazuje na to, że aktywność specyficzna w postaci wskaźników ilościowych efektu ŚBA, jest uzależniona od ich składu: w znanych ŚBA stosunek komponentów składu nie zapewnia pożądanego efektu, podczas gdy stosunek komponentów w ŚBA według wynalazku istotnie podwyższa aktywność specyficzną.

Charakterystyczną oznaką składu biochemicznego ŚBA według wynalazku jest obecność w nim składników, zawierających węglowodany, w znacznym stopiu kształtujących strukturę antygenową membran komórkowych tkanki podczas procesów modyfikacji. Właśnie z tego powodu zawartość węglowodanów w najbardziej aktywnych frakcjach (frakcje 3,4 i 5 z tabeli 4) małocząsteczkowych składników membran komórkowych z względną masą cząsteczkową M=800* 10 000 (oligowęglowodayy, glikopeptydy, nukleotydy) jest decydującą podczas identyfikacji i scharakteryzowania zgłaszanego ŚBA. Istotnym wskaźnikiem z tego punktu widzenia jest stosunek zawartości węglowodanów do peptydów w składnikach z względną masą cząsteczkową M=800-10 000 (tabele 2 i 7), który jest obliczony według wzoru:

gdzie: Cw i Cp - stężenia odpowiednio węglowodanów i peptydów w składnikach z względną masą cząsteczkową M=800* 10 000.

Dla ŚBA według wynalazku wielkość tego wskaźnika leży w granicach G_Zg=0,6* 2,0, podczas gdy dla znanych ŚBA wielkość tego wskaźnika nie przewyższa wartości ^Gzn<⁰J²⁵. W ten sposób, wielkość wskaźnika G w sposób uogólniony charakteryzuje właściwość produktów hydrolizy i jest uzależniona od zastosowanego w ŚBA surowca, od całokształtu operacji, związanych ze sposobem obróbki wskazanego surowca oraz od warunków·' zrealizowania procesów hydrolizy.

N ależy podkreślić, że skuteczność produktu końcowegojest uzależniona od charakterystyk temperaturowo-czasowych procesu hydrolizy i podobna zależność może być wyrażona graficznie (patrz rysunek). Przedstawione na rysunku krzywe 1, 2 i 3 schematycznie pokazują zmianę wielkości skuteczności ŚBA według wynalazku w zależności od czasu trwania (t) operacji hydrolizy, wykonywanej w różnych wartościach temperatury roboczej Tr, to znaczy Tr>Tr2>Tr3.

Dla krzywej 2 w odstępie czasu od t=0 do t=t2 wielkości skuteczności ŚBA według wynalazku jako całokształt wskaźników specyficznych zwiększa się od 3=0 do 3=Rmax, co jest tłumaczone stosunkowym wzrostem podczas procesu hydrolizy udziału zawierających węglowodany składników małocząsteczkowych z względną masą cząsteczkową M_Wm=800* 10 000 w składzie produktu końcowego z jednoczesnym obniżeniem udziału związków wielocząsteczkowych, związków immunoinhibitujących oraz balastowych.

W odstępie czasu od t=t2 do t=t4 skuteczność zmniejsza się od 3=Rmas do 3=0 wskutek tego, że kontynuowanie procesu hydrolizy powoduje zmiany struktury zawierających węglowodany składników z względną masą cząsteczkową M=80610 000, i przede wszystkim glikopeptydów, w związku z hydrolizą ich podstawy peptydowej, łączącej kilka łańcuchów oligowęglowodanowych, jak również w wyniku zmodyfikowania samych oligowęglowodanów lub wystąpienia nieaktywnych form monomerowych.

Opisane wyżej procesy są uzależnione od temperatury oraz posiadają wyraźnie oznaczone maksimum, co jest sumarycznie wyrażane przez maksimum na odpowiednich krzywych 1, 2 i 3, to znaczy że szybkość przebiegu wskazanych procesów i, odpowiednio, stałe szybkości wspomnianych reakcji chemicznych są w znacznym stopniu uzależnione od wielkości temperatury roboczej Tr we wskazanym odstępie temperaturowym, w którym jest zapewnione zachowanie aktywności funkcjonalnej fermentów, za pomocą których dokonywano hydrolizy wyjściowej surowca. Przy podwyższeniu temperatury Tr maksima krzywych 1,2 i 3 są przesuwane w lewo, w stronę początku współrzędnych. Z tego powodu wybór temperatury roboczej, ściślej - zakresu temperatur roboczych, dokonywany jest jednocześnie z wyborem odstępu czasu przebiegu procesu hydrolizy, a mianowicie takiego odstępu czasu, w którym wartość skuteczności jest nie mniejsza niż 0,8 R_raax, to znaczy

- 0,8 1U (4)

Wybór wyjściowego surowca, czas trwania procesu hydrolizy i podtrzymywanie temperatury roboczej, jak również możliwość ustalenia jego zakończenia, zezwalają na zapewnienie potrzebnej, porównawczo wyższej skuteczności ŚBA według wynalazku w porównaniu ze znanymi ŚBA.

Oprócz tego, wymienione wyżej warunki zezwalają na utrzymanie powtarzalności rezultatów, tj. zezwalają na znormalizowanie otrzymania ŚBA według wynalazku z wyznaczonymi właściwościami. ,

Eksperymentalnie ustalono, że właściwości immunomodulujące ŚBA według wynalazku, w szczególności, podwyższenie aktywności makrofagów eksudatu otrzewnego szczurów in vitro, są uzależnione od temperaturowo-czasowych charakterystyk procesu hydrolizy w zakresie temperatur roboczych '646 45°C. Wybór temperatury roboczej we wskazanym zakresie jest dokonywany w oparciu o dane, przytoczone niżej:

- przy temperaturze Tr<4°C znacznie wzrasta czas trwania procesu hydrolizy, co obniża efektywność ekonomiczną zgłaszanego sposobu.

- przy temperaturze Tr>45°C występuje obniżenie aktywności fermentów, wywołujących hydrolizę surowca, i są przyspieszane procesy rozpadu składników produktu końcowego. W rezultacie jest obniżana jakość produktu końcowego i zmniejsza się efektywność ekonomiczna zgłaszanego sposobu. ,

Należy też podkreślić, że skuteczność ŚBA według wynalazku w znacznym stopniu jest uzależniona nie tylko od obecności czynnej substancji, ale i od sumarycznego składu produktu końcowego, a więc, i od sposobu jego wyprodukowania, co wskazuje na wieloplanowość oceny jakości otrzymywanego środka.

Największy wkład do efektu immunomodulującego wnoszą składniki, zawierające węglowodany, w składzie frakcji (3, 4 i 5 w tabeli 4), względna masa cząsteczkowa których M_Wm=8006 10 000 (oligowęglowodany, glikopeptydy, nukleotydy). Niżej umownie oznaczono je jako oligowęglowodany (Ow). Jednakże należy uwzględnić, że wpływ wskazanych oligowęglowodanów na właściwość immunomodulującą zgłaszanego ŚBA jest dostatecznie skomplikowany i koreluje z kilkoma efektami. Na przykład, drogą eksperymentalną zostało ujawnione, że wielkość wskaźnika, w sposób uogólniony odzwierciedlającego skuteczność, jest wyrażana stosunkiem:

gdzie:

R = F x (A ± B ± C) (5)

173 302

R - wskaźnik, w sposób uogólniony charakteryzujący skuteczność jako komplet wskaźników aktywności specyficznej;

F - współczynnik, charakteryzujący stopień zmodyfikowania składników membran komórkowych tkanki zwierzęcej, wykorzystywanej jako surowiec; „

A, B, C - funkcjonalne charakterystyki stosunków składników w składzie ŚBA. Przy tym:

A - względne stężenie węglowodanów, wchodzących do składu składników, z względną masą cząsteczkową M=80M- 10 000 (Ow), w stosunku do pozostałych składników ŚBA, to znaczy __Ow_ (6)

P + PP + Amk + Pw + Ow + Mw + G1 + LN

B - względne stężenie Ow w stosunku do składników z względną masą cząsteczkową M>800, to znaczy _{B =} _Ow_ (7)

PP+ P + Pw+ Ow+ G1

C - względne stężenie Ow w stosunku do składników z względną masą cząsteczkową M>10 000, to znaczy _c= Qw (8)

PP+ Pw+ Ow gdzie stężenie składników ŚBA jest wyrażane przez:

Ow - oligowęglowodany, to znaczy węglowodany, wchodzące do składu komponentów z względną masą cząsteczkową M=800+10 000;

Bw - pgliweglowonlely_i to znaczy węglowodirny, wchodzące do składu kąmponentów z względoąeoa;ą cząsteczkową M>10 000;

Mw - monowęglowodany, to znaczy węglowodany w postaci monomerów albo w składzie komponentów z wzglBdna masą cząsteczkową M<800;

PP - polipeptydy, z względną masą cząsteczkową M>10 000;

P - peptydy, z masą cząsteczkową 0+0;

Amk - wolne aminokwasy;

G1 - ^kęh^d^

L - lipidy

N- nukleotydy.

Zgodnie z równaniem (5) widkość wąkaźmka R jest uzależnioPa nie tylko o+ natury wyjściowego surowca, wykorzystywanegw celcm otrzymywania ŚBA i charakteryzowanego wielkością współezynnikaF, d i oB sypsoduotraympwehia ŚBA, określającego wielkość sumy Ay W-g C = K (O wteays0wcegie (5) postać

RzyF^ ow) g^pzic K - wspólezynnik, cherakteryzujący skdteczno^-ć ŚBA, otrzymanego zgodnie ze sposotem wed¹u^pwynalazkdⁱ hiktowymtei e równąń wtelkość ⁱa/.nika K jest w znacznym stopniu uzależniona od stężemia w^nwotów Ow i związków wielocząsteczkowych w postaci polipeptydów PP i poliwęgl owOtkinów Pw, wartości których są przedstawione we wszystkich składnikach równań. Jednak- wkkid tych składników do specyficzności ŚBA jest skierowany w różne strony i wartość wrelkości współczynnika K wzrasta w miarę zwiększenia się stężenia oligowęglowodanów Ow ⁱ znieizjracn^ja nN/mia zwiąkków wiklocz^tecekow^ęh^o.

173 302

Z analizy równań 3* 8 można dojść do wniosku, że bardziej istotne względne polepszenie właściwości immunomodulującej ŚBA według wynalazku jest uzyskiwane w poszczególnych przypadkach wykonania zgłaszanego sposobu otrzymywania tego Sb A. To może być wytłumaczone tym, że w miarę przejścia przez każde z kolejnych stadium wytwarzania sposobu według wynalazku zwiększa się stężenie oligowęglowonaaów Ow w ŚBA według wynalazku i zmniejsza się zawartość w nim związków wielocząsteczkowych w poostaci poi i peptydów PP i pooliwęglowodanów Pw. ,

Dane podobnego charakteru są zgodne z rezultatem analizy składników ŚBA według wynalazku i znanych ŚBA, wartości których przytoczono w tabeli 7. ,

Jak widać z analizy danych tabeli 2 i 7, wartość wskaźnika K znanego ŚBA jest istotnie niższą, niż w ŚBA według wynalazku. Przy tym wielkość K dobrze koreluje z zawartością oligowęglowodanów Ow i związków wielkocząsteczkowych (PP+Pw).

Na przykład, dla znanego ŚBA nr 1 (US-A-4455302) w tabeli 7 stężenie oligowęglowodanów stanowi 0w=0,0%, a stężenie związków wielkocząsteczkowych stanowi PP+Pw=34,0% i wartość wskaźnika K stanowi K=0,17. Natomiast wielkości analogicznych wskaźników stężenia ŚBA według wynalazku, (patrz tab. 2 i 7), wynoszą odpowiednio, Ow=11,5* 30,8; PP+Pw=39,5, a wartość wskaźnika K wynosi 0,47-1,90. Dla ŚBA otrzymanego ze składników, zawierających węglowodany, wartość stężenia Ow=49,7%, a PP+Pw jest mniejsza niż 0,5%, i wartość wskaźnika K wynosi 2,20 (patrz tab. 2).

W ten sposób, właściwość immunomodulująca ŚBA według wynalazku, jak to wynika z analizy tab. 2 i 7, jest istotnie wyższą, niż u znanego ŚBA. Analiza danych pozwala również wysnuć wniosek, że przy wykorzystywaniu jednego i tego samego surowca, a więc, przy jednej i tej samej wartości współczynnika F, skuteczność R ŚBA według wynalazku koreluje z wielkością wskaźnika K produktów końcowych, otrzymywanych przy zastosowaniu różnych wariantów zgłaszanego sposobu. Ten wniosek jest potwierdzony wynikami przeprowadzonych badań próbnych (patrz tab. 1 i 6).

Na przykład, aktywność fermentacyjna makrofagów eksudatu otrzewnego szczurów, zgodnie z testem NBT (patrz. tab. 6), podwyższa się w porównaniu z grupami kontrolnymi dla rozpuszczalnych w wodzie składników ŚBa według wynalazku o 70%, a dla składników małocząstdcykowych - o 170%, to oznacza że rezultat techniczny według tego wskaźnika aktywności specyficznej zwiększa się 2,4 razy. Analogicznie do tego 2,5 razy jest polepszany również rezultat techniczny według aktywności fagocytowej makrofagów. Dane podobnego charakteru dobrze korelują z wielkością współczynnika K dla każdego z tych produktów, które odróżniają się 2,6 razy. ,

Wynalazek dotyczący ŚBA i sposobu jego wytwarzania, oparty jest na wyborze surowca wyjściowego i na wyborze warunków przebiegu procesu otrzymania ŚBA z gwarantowaną wysoką specyficzną aktywnością. Przy tym wybrana technologia otrzymywania SB A zapewnia powtarzalność rezultatów, tj. pozwala na standaryzowanie otrzymywania zgłaszanego ŚBA z wyznaczonymi właściwościami, a mianowicie - z wyznaczoną ustaloną aktywnością specyficzną, określającą elekt farmakologiczny, terapeutyczny i ogólaobiologicyny przy zastosowaniu wynalazku.

Otrzymywane produkty końcowe w ogólnym i w poszczególnych przypadkach zrealizowania sposobu otrzymywania ŚBA według wynalazku są równowartościowe pod względem swojego oddziaływania biologicznie, ale odróżniaj ą się pod względem aktywności specyficznej. Dlatego racjonalność zastosowania tego czy innego konkretnego środka biologicznego aktywnego jest określana przez wymagania, stawiane przez objekt, dla którego są oni przeznaczone, tj. przez wymagania weterynarii i/lub medycyny. W związku z tym w każdym konkretnym przypadku zastosowania produktu końcowego wybór tego czy innego wariantu ŚBA jest określany zależnością wymagań, w stosunku jego aktywności immunomodulującej i skuteczności od kosztów jego otrzymywania.

W szczególności, wysoka skuteczność^środka, zawierającego małocyąstdczkowd składniki z względną masą cząsteczkową M<10 000 ŚBA-LM według wynalazku, jak również składniki zawierające węglowodany ŚBA-CW, znajduje odbicie w podwyższeniu aktywności makrofa42

173 302 gów, nekrofilów, limfocytów, killerów naturalnych, co zapewnia wzmacnianie się procesów regeneracyjnych (patrz tab. 6). Dla zwierząt domowych podobne efekty idą w parze ze zwiększeniem dodatkowego przyrostu ciężaru zwierząt przy intensywnym tuczeniu (patrz tab. 8).

Przy leczeniu chorób zakaźnych i chorób dróg oddechowych (paragrypa) podobna zaleta nie jest na tyle istotną i w podobnym przypadku jest bardziej racjonalnym z ekonomicznego punktu widzenia, zastosowanie ŚBA, zawierających rozpuszczalne w wodzie składniki membran komórkowych - ŚBA-WS i ŚBA-PM. Przy leczeniu stanów zapalnych (zapalenia gruczołów sutkowych, zapalenia śluzówki ścianek macicy itd.) bardziej racjonalnym jest wykorzystanie środka, zawierającego termostabilne składniki ŚBA-TS według wynalazku.

Przy zastosowaniu zewnętrznym bardziej racjonalnym z ekonomicznego punktu widzenia jest stosowanie ŚBA zawierającego termostabilne składniki ŚBA-ST, zamiast ŚBA-LM.

ŚBA według wynalazku jest skutecznym środkiem do leczenia chorób zakaźnych (paragrypa, ostre schorzenia oddechowe itp.). Przy jego zastosowaniu wyzdrowienie młodego bydła domowego było obserwowane w 88-95% przypadków, podczas gdy przy zastosowaniu znanych ŚBA w tych samych warunkach, jak również przy zastosowaniu antybiotyków i preparatu Bowiwereks, wyzdrowienie zwierząt było obserwowane nie więcej, niż w 70% przypadków, a przy spontanicznym wyleczeniu w grupie kontrolnej - w granicach 58* 67% przypadków.

ŚBa według wynalazku zwiększa odporność zwierząt na choroby zakaźne, co w znacznym stopniu obniża poziom pomiaru podłowia.

Wykorzystanie stosowanego ŚBA w celach profilaktycznych zmniejszało poziom zachorowania zwierząt na paragrypę do 5%, podczas gdy przy wykorzystaniu znanych ŚBA poziom zachorowalności zwierząt stanowił do 12* 17%, a w grupie kontrolnej - do 22* 28%.

, Normalizacja ogólnego stanu biologicznego bydła domowego przy wykorzystywaniu ŚBA według wynalazku sprzyjała polepszeniu wskaźników produkcyjnych i, w szczególności, zwiększeniu dodatkowego przyrostu żywej masy bez obniżenia jakości mięsa, zbliżając wspomniane wskaźniki do genetycznie zaprogramowanego poziomu przy intensywnym tuczeniu. Podobna właściwość korzystnie odróżnia ŚBA według wynalazku od hormonalnych i innych stymulatorów wzrostu, które, podwyższając wskaźniki ilościowe, wywierają ujemny wpływ na homeostazę zwierząt i obniżają jakość produkcji.

Tabela 8

Efekt farmaceutyczny, terapeutyczny i dg0lnobidldglczny (właściwość) przy zastosowaniu środków biologicznie aktywnych (ŚBA)	Charakterystyka ilościowa
Znany ŚBA	Zgłaszany ŚBA,
N 1	WS	ST	LM
1	2	3	4	5	6	7
1. Stany zapalne	Zapalenie gruczołów sutkowych krów, %, wyzdrowienia	Eksperyment Kontrola	70±5 61±5	80±5 58±8	86±5 63±7	93±5 53±8
Zapalenie płuc, %, wyzdrowienia	Eksperyment Kontrola	69±6 55±7	85±5 51±8	92±6 61+6	95+5 48±6
2 Choroby infekcyjne	Paragrypa i ostre scho rzenia oddechowe, %, wyzdrowienia	Eksperyment Kontrola	70±6 64±7	88±6 58±6	94±6 61±7	95±5 67±5
3 Zwiększenie dodatkowego przyrostu ciężaru cieląt, %, w porównaniu z kontrolą	24±7	54±8	70±12	145±31
4. Ostra toksyczność, LD 50, ml/kg (mg/kg) masy ciała	ponad 25 (260)	ponad 25 (260)

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

173 302

Wprowadzenie ŚBA według wynalazku do organizmu zwierząt, mających odchylenia od normy parametrów homeostazy, przy intensywnym tuczeniu zapewniało zwiększenie dodatkowego przyrostu ciężaru przeciętnie o 524-1-45% w porównaniu z przyrostem ciężaru w grupie kontrolnej, nie potraktowanej ŚBA. Jednocześnie, przy wykorzystaniu w tych samych warunkach znanych ŚBA-analogów (środek nr 1), przyrost ciężaru w porównaniu z przyrostem ciężaru w grupie kontrolnej, stanowił przeciętnie 12624%. Grupa kontrolna i grupa doświadczalna były utworzone z 14618 cieląt w jednym wieku i, przeciętnie, o tej samej wadze startowej.

Normalizacja parametrów homeostazy sprzyja również zwiększeniu:

- udojów mleka bydła domowego;

- nieśności drobiu;

- jakości futra zwierząt futerkowych;

- utrzymywania się przy życiu młodych zwierząt;

- miodobrania pszczół itp.

ŚBA według wynalazku nie jest toksyczny i nie wywołuje efektów ubocznych (alergii itp.).

ŚBA według wynalazku wzbudza podwyższoną stymulację procesów regeneracyjnych, a mianowicie odnowienie aktywności funkcjonalnej tkanki wątrobowej przy hepatycie i regenerację wątroby po częściowej hepatektomii, wygojenie się wrzodów, ran i skóry przy zranieniach i urazach, odnowienie formuły krwi po jej dużych stratach i w innych przypadkach.

Brak efektów ubocznych podczas zastosowania ŚBA według wynalazku oraz dane związane z ich farmakologicznym, terapeutycznym i ogólnobiologicznym oddziaływaniem na organizm zwierząt określiły możliwość klinicznego zakwalifikowania ŚBA.

Podczas badania grupy pacjentów stwierdzono pozytywne oddziaływanie ŚBA według wynalazku na stan fizjologiczny organizmu, jak również praktycznie pełną analogię z badaniami, przeprowadzanymi przedklimcznie na zwierzętach doświadczalnych.

Sposób wytwarzania ŚBA według wynalazku może być zrealizowany tak w warunkach laboratoryjnych jak i w warunkach przemysłowych.

173 302

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 6,00 zł

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek biologicznie aktywny na bazie związków organicznych, będących składnikami membran komórkowych zhomogenizowanej tkanki zwierzęcej, znamienny tym, że zawiera termostabilne przy T_n < 120°, małocząsteczkowe zmodyfikowane składniki membran komórkowych o względnej masie cząsteczkowej 800 -10 000 i strukturze antygenowej, zmodyfikowanej podczas procesów embriogenezy, i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki.
2. 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera zmodyfikowane składniki plazmatycznych membran komórkowych o strukturze antygenowej, zmodyfikowanej podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki.
3. 3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera zmodyfikowane składniki membran komórkowych zawierające węglowodany.
4. 4. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera zmodyfikowane składniki plazmatycznych mambran komórkowych zawierające węglowodany.
5. 5. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera związki organiczne w stosunku wyrażonym w % wagowych:

   Peptydy 28,0 *60,0;

   Aminokwasy 0,5 * 31,5;

   Węglowodany 16,0 * 70,0;

   Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 0,5 * 17,0.
6. 6. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że w skład związków organicznych wchodzą węglowodany w następującym stosunku, wyrażonym w % wagowych:

   - związków wielkocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej > 10 000 do 3,0;

   - związków małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej 800 - 10 000 11,5 * 57,9;

   - monomerów wolnych o względnej masie cząsteczkowej < 800 3,5 * 11,0;
7. 7. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera związki organiczne w następującym stosunku, wyrażonym w % wagowych:

   Peptydy 40,0 * 60,0;

   Aminokwasy 11,99-11,1;

   Węglowodany H,0 *32,8;

   Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 4,4 * 10,6.
8. 8. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera związki organiczne w następującym stosunku, wyrażonym w % wagowych:

   Peptydy 34,0*50,1;

   Aminokwasy 16,6*22,6;

   Węglowodany 22,7 *13^^,:^;

   Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 5,4 * 10,6.

   173 302
9. 9. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera związki organiczne w następującym stosunku, wyrażonym w % wagowych:

   Peptydy

   Aminokwasy

   Węglowodany

   28,0 6 33,6; 16,5 -151,5; 26,9 4Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 8,6 6 17,0.
10. 10. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera związki organiczne w następującym stosunku, wyrażonym w % wagowych:

    29,0 6 36,3; poniżej 0,5; 57,7 6 70,0;

    Peptydy

    Aminokwasy

    Węglowodany

    Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne 0,:5 6 5,:5.
11. 11. Środek według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, że stosunek wagowy węglowodanów do peptydów w składzie związków organicznych o względnej masie cząsteczkowej 800 6 10 000 mieści się w granicach G = 0,6 6 2,0.
12. 12. Sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego, posiadającego właściwość immunomodulującą, w którym surowiec z tkanki zwierzęcej rozdrabnia się i poddaje homogenizacji, a z homogenatu wydziela się osad, zawierający membrany komórkowe, z którego po ponownym jego przeprowadzeniu w stan zawiesiny otrzymuje się składniki membran komórkowych, znamienny tym, że jako surowiec wykorzystuje się tkankę zwierzęcą, zmodyfikowaną podczas procesów embriogenezy, ewentualnie zróżnicowania komórek, ewentualnie patologii, poprzedzającej względnie towarzyszącej regeneracji oraz reperacji tkanki, homogenat jest oczyszczany z niezniszczonych elementów tkanki drogą filtracji i/lub odwirowania z przyspieszeniem 150 6 250 g w ciągu 10 6 15 min i następnie wydziela się osad, zawierający membrany komórkowe, który jest poddawany hydrolizie, produkty hydrolizy są filtrowane i/lub odwirowywane z przyspieszeniem powyżej 1 500 g w ciągu 20 6 40 min z wydzielaniem produktu końcowego w postaci sklarowanej cieczy produktów hydrolizy, zawierających składniki membran komórkowych.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako surowiec jest wykorzystywana tkanka embrionalna, różnicująca się tkanka tymocytów grasicy, spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, tkanka łożyskowa, tkanka nabłonkowa jelit, komórki szpiku kostnego, regenerująca się tkanka skórna, tkanka regenerującej się wątroby, tkanka regenerujących się kończyn płazów, tkanka patologicznie zmieniona, pobrana przed stadium regeneracji oraz ich dowolne kombinacje.
14. 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że osad, zawierający membrany komórkowe, jest wydzielany z oczyszczonego homogenatu za pomocą odwirowania z przyspieszeniem 1 500 6 90 000 g i/lub filtracji przez filtr z charakterystycznym wymiarem porów F < 1 pm z następnym przepłukiwaniem drogą ponownego przeprowadzenia w stan zawiesiny i ponownego odwirowywania i/lub filtracji do momentu otrzymania osadu, zawierającego membrany komórkowe w ilości nie mniejszej niż 60% masy związków organicznych znajdujących się w osadzie.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że otrzymany osad, zawierający membrany komórkowe, przed hydrolizą poddaje się dodatkowemu odwirowywaniu z przyspieszeniem 20 000 6 100 000 g w gradiencie gęstości w ciągu 1 6 2 godzin z wydzielaniem plazmatycznych membran komórkowych.
16. 16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że hydroliza jest przeprowadzona w temperaturze T_r = 4 6 45°C.
17. 17. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że hydroliza jest przeprowadzana w obecności środka antyseptycznego.
18. 18. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że klarowna ciecz produktów hydrolizy, zawierających składniki membran komórkowych, jest poddawana obróbce cieplnej w temperaturze Tn = 60 6 120°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i za pomocą

    173 302 dodatkowego filtrowania i/lub odwirowywania z przyspieszeniem ponad 1 500 g w ciągu 20 + 40 min wydziela się jako produkt końcowy klarowna ciecz, zawierającą termostabilne składniki membran komórkowych.
19. 19. Sposób według zastrz. 12 albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, znamienny tym, że klarowna ciecz produktów hydrolizy, zawierających składniki membran komórkowych, jest poddawanafrakcjonowaniu drogą dializy przez błonę pólprzepuszczalną, i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, zawierającej składniki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej < 10 000.
20. 20. Sposób według zastrz. 12 albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, znamienny tym, że produkty hydrolizy, zawierające składniki membran komórkowych, są poddawane frakcjonowaniu drogą dializy przez błonę pólprzepuszczalną i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, zawierającej małocząsteczkowe komponenty o względnej masie cząsteczkowej < 10 000.
21. 21. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że klarowna ciecz produktów hydrolizy, zawierających składniki membran komórkowych, jest poddawana frakcjonowaniu drogą dializy przez błonę pólprzepuszczalną i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, zawierającej składniki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej < 10 000.
22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że frakcja małocząsteczkowa produktów hydrolizy, zawierająca składniki membran komórkowych, jest poddawana chromatografii powinowactwa na lektynach z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, obejmującej składniki zawierające węglowodany.
23. 23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że frakcja małocząsteczkowa produktów hydrolizy, zawierająca składniki membran komórkowych, jest poddawana chromatografii powinowactwa na lektynach z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, obejmującej składniki zawierające węglowodany.