PL168055B1

PL168055B1 - Sposób wytwarzania szczepionki PL

Info

Publication number: PL168055B1
Application number: PL90286711A
Authority: PL
Inventors: Neill M Mackenzie; Angele M O'sullivan
Original assignee: Mallinckrodt Veterinary Ltd
Priority date: 1989-09-01
Filing date: 1990-08-31
Publication date: 1995-12-30
Also published as: WO1991003256A1; DD297331A5; PL168316B1; PL286711A1; PT95164B; JPH05500056A; AU637405B2; IE903161A1; ZA906977B; NZ235119A; PT95164A; CA2064911A1; GB8919819D0; LV10394B; LV10394A; HU9200666D0; EP0766967A1; YU166790A; HU214110B; EP0415794A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania szczepionki do stosowania u ludzi lub zwierzat, zwlaszcza u swin lub owiec, polegajacy na (1) wytworzeniu matrycy z glikozydu i sterolu w obecnosci srodka ulatwia- jacego rozpuszczanie oraz (2) zmieszaniu wytworzonej matrycy z antygenem, zwiazanym z bakteria lub mykoplazma to jest z substancja zdolna do wytwarzania ochronnych przeciwcial lub immunologicznej odpowiedzi typu komórkowego przeciwko bakteriom lub mykoplazmie u eksponowanych na ten antygen kregowców, znamienny tym, ze srodek ulatwiajacy rozpuszcza- nie pozostawia sie w srodowisku przed lub podczas etapu (2). PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki do stosowania u ludzi lub zwierząt, zwłaszcza u świń lub owiec.

Profilaktyczne uodpornianie zwierząt przeciwko drobnoustrojom polega na podawaniu antygenu związanego z drobnoustrojem, w połączeniu z materiałem, który zwiększa powstawanie przeciwciał i/lub komórkową odpowiedź immunologiczną antygenu u zwierzęcia. Materiał taki zwany jest ajuwantem. Jedynymi adjuwantami dopuszczonymi obecnie do stosowania u ludzi i świń w wielu krajach są wodorotlenek glinu i fosforan glinu. Jakkolwiek jte adjuwanty są dla wielu szczepionek wystarczające, badania wykazały, że pełny adjuwant Freunda (FCA), lub Quil A (znany również jako saponina) są często skuteczniejsze w wywoływaniu odpowiedzi z wytworzeniem przeciwciał (to znaczy odpowiedzi typu humoralnego), oraz odporności komórkowej, ale niestety adjuwanty te mogą wywołać u zwierząt niepożądane reakcje po szczepieniu.

W europejskich opisach patentowych EP-A-0 109 942 i EP-A-0 180 564 opisano uodporniające kompleksy utworzone między glikozydami takimi jak triterpenoidowe sapoiny (zwłaszcza Quil A) a zawierającymi część hydrofobową antygenami. Te immunostymulujące kompleksy nazwano „iscom“. Dla wywołania tego samego efektu antygenowego ilość Quil A w iscom może być około 10 do 100 razy mniejsza niż kiedy Quil A jest z antygenem zmieszany. Iscomy nie wywołują niepożądanych reakcji, które występują przy Quil A.

168 055

W europejskim opisie patentowym EP-A-231039 wykazano, że obecność antygenu nie jest konieczna dla wytworzenia podstawowej struktury iscom, zwanej dalej „matrycą iscom“ i że możliwe jest utworzenie matrycy ze sterolu, takiego jak cholesterol, fosfolipidu takiego jak fosfatydyloetanoloamina i glikozydu takiego jak Quil A. Jednakże nie zastrzeżono, że takie matryce są użyteczne jako adjuwanty; wspomniano o nich jedynie mimochodem w celu wykazania, że struktury typu iscom mogą powstawać bez obecności antygenu. Nieoczekiwanie okazało się, że takie puste matryce można stosować w celu uzyskania działania adjuwantu przez dodanie ich do antygenów bakterii i mykoplazm, które nie stają się częścią matrycy iscom.

Ponadto we wszystkich cytowanych w stanie techniki opisach w przypadku stosowania nierozpuszczalnego w wodzie antygenu przeprowadza się go w roztwór za pomocą detergentu i następnie po zmieszaniu z glikozydem i tak dalej, w celu wytworzenia iscom, detergent usuwano na przykład przez dializę. Nieoczekiwanie okazało się, że iscom tworzy się w obecności detergentu i, że etap usuwania detergentu jest zbędny. W ten sam sposób tworzy się matryca iscom.

Szczepionka wytwarzana sposobem według wynalazku zawiera (I) antygen związany z bakterią lub mykoplazmą i (2) matrycę iscom, przy czym wspomniany antygen nie jest wbudowny w matrycę iscom.

Według wynalazku sposób wytwarzania szczepionki do stosowania u ludzi lub zwierząt, zwłaszcza u świń lub owiec polega na (1) wytworzeniu matrycy z glikozydu i sterolu w obecności środka ułatwiającego rozpuszczenie oraz (2) zmieszaniu wytworzonej matrycy z antygenem, związanym z bakterią lub mykoplazmą, przy czym nowość polega na tym, że środek ułatwiający rozpuszczanie pozostawia się w środowisku przed lub podczas etapu (2).

Pod pojęciem „zwierzę¹* rozumie się kręgowca z wyłączeniem człowieka, korzystnie ssaka takiego jak krowa, świnią, owca, koza, koń, pies lub kot.

Szczepionka ewentualnie zawiera rozcieńczalniki lub nośnik powszechnie znanego typu.

Pod pojęciem „antygen związany z bakterią lub mykoplazmą** rozumie się substancję zdolną do wytwarzania ochronnych przeciwciał lub immunologicznej odpowiedzi typu komórkowego przeciwko bakteriom lub mykoplazmie u eksponowanych na ten antygen kręgowców.

Antygen jest w całości lub częściowo białkiem, glikoproteidem, glikolipidem, polisacharydem lub lipolisacharydem, który jest związany z bakterią lub mykoplazmą, lub jest ewentualnie polipeptydem lub inną substancją, która naśladuje całość lub część takiego białka, glikoproteidu, glikolipidu, polisacharydu lub lipopolisacharydu.

Ponieważ antygen nie jest wbudowany w matrycę iscom w czasie jej tworzenia, nie jest konieczne, aby zawierał on fragment hydrofobowy lub żeby był połączony z grupę hydrofobową, jak to ma miejsce w sposobach cytowanych w stanie techniki. Bakteria lub mykoplazma jako takie nie muszą być obecne w szczepionce, ale mogą obniżyć koszt szczepionki jeśli stosuje się całe komórki, na przykład Haemophilus pleuropneumoniae, zamiast ekstraktów.

Do pojęcia „mykoplazma* włączono również blisko spokrewnione organizmy znane jako ureaplazmy i acholeplazm.

Choroby bakteryjne obejmują choroby wywołane przez Mycobacterium (na przykład M.tuberculosis i M.bovis), Clostridium (na przykład C.welchii), Rickettsia, Spirochaetes (na przykład Treponema pallidum lub Leptospira pomona), Escherichia (np. E.coli), Staphylococci (na przykład S.aureus), Haemophilus (na przykład H.influenzae i H.pleuropneumoniae), Bordetella (na przykład B. pertussis), Vibrio (na przykład V.cholerae), Salmonella (na przykład S.typhi i S.paratyphi), Streptococci (na przykład S.agalactiae), Neisseria (na przykład N.gonorrhea), Pasteurella (na przykład P.multocido), Legionella (na przykład L.pneumoniae), Chlamydia (na przykład C.psittaci), Pseudomonas (na przykład P.malliae), Actinobacillus (na przykład A.pleuropneumoniae), Campylobacter (na przykład C.jejuni) i Listeria (na przykład L.monocytogenes), Brucella (na przykład B.abortus), Corynebacterium (na przykład C.diphteriae), Yersinia (na przykład Y.pseudotuberculosis), Pneumococci (na przykład Streptococcus pneumoniae), Bacillus (na przykład B.anthracis), Klebsiella (na przykład K.pneumoniae), Shigella (na przykład S.dysenteriae), i Actinomycetes (na przykład Nocardia asteroides).

168 055

Korzystnie bakteria oznacza Mycobacterium (na przykład M.tuberculosis), Clostridium (na przykład C.welchii), Rickettsia, Spirochaetes (na przykład Treponema pallidum), Escherichia (na przykład E.coli), Staphylococci (na przykład S.aureus), Haemophilus (na przykład H.influenzae i H.pleuropneumonia), Bordetella (na przykład B. pertussis), Vibrio (na przykład V.cholerae), Salmonella (na przykład S.typhi i S.paratyphi), Streptococci (na przykład S.agalactiae), Neisseria (na przykład N.gonorrhoea), Pasteurella (na przykład P.multocida), Legionella (na przykład

L. pneumoniae), Pseudomonas (na przykład P.malliae), Actinobacillus (na przykład A.pleuropneumoniae), Campylobacter (na przykład C.jejuni) i Listeria (na przykład L.monocytogenes). Niektóre antygeny zawierają czynnik adherencyjny (adherence factor) w Coli, na przykład fimbrie K 88 (pili K 88), białko porin (porin protein) w, na przykład Salmonella oraz białka zewnętrznej błony z B.pertussis i Neisseria meningitidis.

Korzystnie stosuje się taki antygen, który nie będzie tworzył tradycyjnego iscom, na przykład taki jak opisano w europejskich opisach patentowych EP-A-109942 i EP-A-180-564.

Szczególnie korzystne jest szczepienie świń.

Jako mykoplazmy mające zastosowanie w weterynarii stosuje się Mycoplasma bovis, M.gallisepticum, M.agalacitiae, M.hyopneumoniae, M.pneumoniae, M.synoviae, M.arthritidis, M.capricolium, M.dispar, M.hominis, M.mycoides subs, capri, M.orale, M.oripneumoniae, M.pulmonis,

M. cynos, M.hyorhinis, M.mycoides, M.salvarium i M.fermentans.

Matrycę iscom wytwarza się sposobem ujawnionym w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231039, to znaczy przez zmieszanie razem przeprowadzonego, przy użyciu substancji ułatwiających rozpuszczanie, w roztwór sterolu, glikozydu i (ewentualnie) fosfolipidu. Środka ułatwiającego rozpuszczanie nie usuwa się przed następnym etapem sposobu. W europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231039 na fig. 1 przedstawiono obraz iscom otrzymanego z Quil A, cholesterolu i fosfatydyloetanoloaminy uzyskany w mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 116 000 razy. Jeśli nie używa się fosfolipidów tworzą się struktury dwuwymiarowe. Przykład takiej struktury znajduje się na fig. 2 w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231039. Przedstawiono tam uzyskany w mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 146000 razy obraz struktury otrzymanej z Quil A i cholesterolu. Termin „matryca iscom“ używany jest zarówno w odniesieniu do struktur trójwymiarowych jak i dwuwymiarowych.

W sposobie według wynalazku stosuje się ewentualnie takie same glikozydy jak wymienione w europejskim opisie patentowym EP-A-0 109942 i w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231039. Na ogół stosuje się glikozydy wykazujące własności 'amfipatyczne i zawierające w cząsteczce obszary hydrofobowe i hydrofilowe. Korzystnie stosuje się saponiny, zwłaszcza ekstrakt saponin z Quillaja saponaria Molina przede wszystkim DQ-ekstrakt wytworzony według K.Dalsgard:Saponin Adjuwants. Bull. Off. In., Epiz. 77 7-8, 1289-1295 (1972) i Quil A, również wytworzony według Dalsgaard: Saponin Adjuvants III Archiv fur die gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974). Innymi korzystnymi saponinami są aescine z Aesculus hippocastanum (T.Patt i W.Winkler: Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskoatanie/Aesculus hippocastanum) Arzneimittelforschung 10 (4) 273-275 (1960) i sapoalbin z Gypsophilla struthium (R.Vochten, P.Joos i R.Ruyssen: Physicochemical Properties of sapoalbin and their relation to the foam stability. J.Pharm. Belg 42 213-226 (1968). Szczególnie korzystne jest stosowanie Quil A.

W sposobie według wynalazku stosuje się glikozydy co najmniej w stężeniu krytycznym dla tworzenia micelli. W przypadku Quil A stężenie to wynosi około 0,03% wagowo. Na ogół, stosunek molowy glikozydu (zwłaszcza w przypadku Quil A) do sterolu (zwłaszcza w przypadku cholesterolu) do fosfolipidu wynosi 1:1:0-, ±20% (korzystnie nie więcej niż 10%) dla każdego układu. Odpowiada to stosunkowi wagowemu Quil A do cholesterolu około 5:1.

W sposobie według wynalazku stosuje się znane sterole pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego, takie jak cholesterol, lanosterol, lumisterol, stigmasterol i sitosterol. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się jako sterol cholesterol.

Korzystne jest użycie fosfolipidu, ponieważ tworzą się w tym przypadku trójwymiarowe struktury iscom. Zwłaszcza jako fosfolipidy stosuje się fasfatydylocholinę i fosfatydyloetanoloaminę.

168 055

Według wynalazku stosuje się określony wyżej antygen, z tym, że może on być związany z grzybem, pasożytem takim jak pierwotniaki i robaki lub wirusem zamiast właściwej mykoplazmy lub bakterii.

Jako grzyby chorobotwórcze stosuje się Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton spp. i Dermatophilus spp.

Jako pasożyty chorobotwórcze stosuje się pasożyty wymienione w europejskim opisie patentowym nr EP-A-109942.

Jako wirusy chorobotwórcze stosuje się wirusy wymienione w europejskim opisie patentowym nr EP-A-109942. Wiele z nich ma osłony, z których ekstrahuje się odpowiednie antygeny. Zwłaszcza stosuje się wirusy takie jak wirus grupy koni,wirus opryszczki koni, wirus wirusowej biegunki bydła, coronawirus, parvowirus, wirus białaczki kotów, wirus niedoboru odpornościowego kotów i wirus wirusowego zapalenia tętnic.

Jako środki ułatwiające rozpuszczanie stosuje się takie, jak wymieniono w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 109942, lub EP-A-0 231039, na przykład detergent, mocznik lub guanidynę.

Na ogół używa się w tym celu niejonowe, jonowe lub obojnacze detergenty, lub detergenty oparte na kwasie cholowym, takie jak dezoksycholan sodowy. Korzystnie, jako deteregent stosuje się oktyloglukozyd nonylo-N-metyloglukamid, lub dekanoilo-N-metyloglukamid, ale alkilofenylopolioksyetylenowe etery mogą również być stosowane, zwłaszcza p-izooktylofenylowy eter polietylenoglikolu mający 9 do 10 grup oksyetylenowych, dostępny w handlu pod handlową nazwą Triton X-100R. Poniższe przykłady ilustrują bliżej wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

Przykłady I-VI ilustrują etap (1) zastrz. 1, to jest wytwarzanie pustej matrycy z glikozydu i sterolu w obecności źródła ułatwiającego rozpuszczenie. Przykłady VII ilustrują (2) etap zastrz. 1, to jest mieszanie antygenu z matrycą. Przykład lek opisuje również działanie i skuteczność wytwarzanych szczepionek. Przykłady VIII-X ilustrują działanie i skuteczność szczepionek i zawierają też szczegółowe informacje o przeprowadzaniu etapu (2) sposobu według wynalazku.

W poniższych przykładach zastosowano następujące skróty:

PBSA solanka buforowana fosforanem (Dulbecco A)

SPF wolny od swoistych zarazków chorobotwórczych (specific pathogen free).

cfu jednostki tworzące kolonię/colonyforming unit)

ELISA test immunoenzymatyczny sprzężony z enzymem

NCTC Narodowa kolekcja mikroorganizmów w W.Brytanii, uznana przez traktat budapeszteński)

B NAD dwunukleotyd β-nikotynamidoadeninowy

FIA Niekompletny adjuwant Freunda

OD gęstość optyczna

OEA poronienie wirusowe owiec

Przykłady I-VI. Wytwarzanie pustej matrycy iscom.

Potrzebne odczynniki:

— Roztwór soli fizjologicznej zawierający bufor fosforanowy (Dulbecco A, Oxoid) — Mieszanina lipidowa (patrz niżej) — 10% masa/objętość roztwór Quil A (Superfos) w sterylnej wodzie destylowanej.

Wytwarzanie mieszaniny lipidowej: (10 ml)

Materiały:

— Chloroform (analar), Cholesterol (Grade I, z wątroby wieprzowej, Sigma), L β-fosfatydylocholina (Sigma), Mega 9 lub 10 (Sigma), lub Triton (Mega 9 jest to nonylo-N-metyloglukamid, podczas gdy Mega 10 jest to dekanoilo-N-metyloglukamid oraz wysterylizowana woda destylowana.

168 055

Metoda (a) Sporządza się 20% masa/objętość roztwór Mega 10 w sterylnej wodzie destylowanej, to znaczy odważa się 2g Mega 10 i rozpuszcza w 10 ml wody.

(b) Odważa się 50 mg cholesterolu i dodaje do 50 mg fosfatydylocholiny.

(c) Po rozpuszczeniu cholesterolu w fosfatydylocholinie dodaje się 2 ml chloroformu.

(d) Dodaje się 10 ml 20% masa/objętość roztworu Mega 10. Mieszanina staje się mlecznobiała, a objętość jej wzrasta do 12 ml. Jednakże, chloroform następnie odparowuje podczas mieszania i końcowa objętość mieszaniny wynosi 10 ml.

(e) Mieszaninę w odkrytym pojemniku ustawia się na mieszadle magnetycznym w termostatyzowanym pomieszczeniu o temperaturze 37°C. W wyniku dalszego mieszania mieszanina staje się bardziej „ruchliwa i klarowna.

(f Przechowuje się w temperaturze pokojowej.

Przykład I. W wysterylizowanej uniwersalnej kolbie umieszcza się 20ml PBSA, dodaje 100 pl 10% roztworu Quil A i następnie 400pl mieszaniny lipidowej. Roztwór miesza się wirowo z pełną szybkością w ciągu 10 sekund, a następnie sterylizuje roztwór przez przepuszczenie przez filtr Milipore 0,2 pm. Małą objętość dekantuje się do badań pod mikroskopem elektronowym. Przechowuje się w temperaturze 4°C.

Przykład II. Postępuje się jak w przykładzie I z następującymi zmianami. W wysterylizowanej uniwersalnej kolbie umieszcza się 20 ml PBSA, dodaje 200pl 10% roztworu Quil A i 800 pl mieszaniny lipidów. Roztwór miesza się wirowo z pełną szybkością w ciągu 10 sekund, a następnie sterylizuje na filtrze 0,2 pm. Dekantuje się małą objętość do badań pod mikroskopem elektronowym. Przechowuje się w temperaturze + 4°C.

Przykład III. 20ml PBSA dodaje się do mieszanej celi Amicon (Amicon stirred celi) zawierającej błonę oddzielającą substancje o ciężarze cząsteczkowym 30K. Do tego dodaje się 800 pl mieszanki lipidów, oraz 200pl Quil A (roztwór 10%). Roztwór zagęszcza się do objętości 5 ml i dodaje 100 ml PBSA. Powyższy etap powtarza się dwa razy. 20 ml objętości są następnie przesączane przez filtr 0,2 pm, etykietowane i przechowywane w temperaturze + 4°C.

Przykład IV. 20 ml PBSA dodaje się do mieszanej celi Amicon zawierającej błonę oddzielającą substancje o ciężarze cząsteczkowym 30K. Następnie dodaje się 400pl mieszaniny lipidów, oraz 100pl 10% roztworu Quil A. Powyższy roztwór zagęszcza się do objętości 5 ml i ponownie zawiesza w 100 ml PBSA. Powyższy etap powtarza się dwukrotnie. Końcowe objętości celi po 20 ml następnie, w celu sterylizacji filtruje się przez filtr 0,2 pm, etykietuje i przechowuje w temperaturze + 4°C.

Przykład V. 20 ml PBSA dodaje się do mieszanej celi Amicon ze znajdującą się na miejscu błoną odcinającą substancje o ciężarze cząsteczkowym 30K. Następnie dodaje się 200 pl mieszaniny lipidowej, oraz 50 pl 10% roztworu Quil A. Powyższy roztwór zagęszcza się do objętości 5 ml i ponownie zawiesza w 100 ml PBSA. Powyższy etap powtarza się dwukrotnie. Końcowe 20 ml preparatu w celi przesącza się przez filtr 0,2 pm, etykietuje i przechowuje w temperaturze +4°C.

Przykład VI. 20 ml PBSA dodaje się do mieszanej celi Amicon (błona oddzielająca substancje o ciężarze cząsteczkowym 30K). Następnie dodaje się 100 pl mieszaniny lipidowej, oraz 25 pl 10% roztworu Quil A. Powyższy roztwór zagęszcza się do objętości 5 ml i ponownie zawiesza w 100 ml PBSA. Powyższy etap powtarza się dwukrotnie. Końcowe 20 ml objętości celi sterylizuje się przez przesączenie przez filtr 0,2 pm, etykietuje i przechowuje w temperaturze + 4°C. Badania pod mikroskopem elektronowym wykazały, że w tym przypadku matryce są mniej liczne niż w innych przykładach.

Przykład VII. Wytwarzanie szczepionek.

Do badań skuteczności szczepionki stosowano myszy samice ze szczepu wsobnego (Balb/C) będące w tym samym wieku 6-8 tygodni. Myszy pochodziły z odizolowanej wolnej od swoistych zarazków chorobotwórczych (SPF) jednostki z Harlan-Olac (Bicester). Szczepionki opisane poniżej sporządzano mieszając zawiesinę zawierającą antygen sporządzoną niżej opisanym sposobem z matrycą iscom otrzymaną według dowolnego z przykładów III-VI. Do wytwarzania antygenu stosowano szczep Mycoplasma hyopneumpniae z Narodowej Kolekcji Typów Komórkowych. Mikroorganizmy hodowano w zmodyfikowanym podłożu Friisa. Kultury przechowywane w temperaturze -70°C.

168 055

Każdą zawiesinę zawierającą antygen, stosowaną do wytwarzania szczepionki, przygotowywano przez posianie 40 ml brzeczki za pomocą 4 ml przechowywanej kultury przy wartości pH = 7,4 i następnie inkubowanie w temperaturze 37°C w ciągu 3 dni, lub do momentu gdy wartość pH spadnie do 6,8. W ciągu tego czasu organizm osiąga logarytmiczną fazę wzrostu. Hodowle osłabiano za pomocą binarnej etylenoiminy, zagęszczano stosując ultrafiltrację o stycznym przepływie i przemywano roztworem soli fizjologicznej zawierającym bufor fosforanowy (PBS). Stężenie antygenu ustawiano w ten sposób, że wszystkie szczepionki zawierały 10pg wszystkich białek w 0,1 ml dawki szczepionki dla jednej myszy.

Szczepionki wytwarzane sposobem według wynalazku sporządzono przez zmieszanie jednej z matryc iscom, wytworzonej według przykładów I-VI z antygenem M.hyopneumoniae, wytworzonym jak opisano powyżej. Do zmieszania stosowano konwencjonalne metody mieszania składników szczepionek. Matryce stosowano w takich ilościach aby uzyskać wymienioną poniżej ilość Quil A na dawkę 0,1 ml.

Szczepionki o niżej podanych składach otrzymane przez zmieszanie matrycy iscom z zawiesiną zawierającą antygen, stosowano w następujący sposób:

Osiem grup po sześć myszy immunizowano dwukrotnie, przy czym każda mysz otrzymywała 0,1 ml następujących preparatów.

Grupa

A

B

C

D

E

F

G

H

Szczepionka pg samego M.hyopneumoniae pg M.hyopneumoniae z dodatkiem kompletnego adiuwantu Freunda pg M hyopneumomae z matrycą iscom zawierającą 10pg QA/dawkę dla 1 myszy

10pg M hyopneumomae z matrycą iscom zawierającą 5 pg QA/dawkę dla 1 myszy pg M.hyopneumoniae z matrycą iscom zawierającą 2,5 pg QA/dawkę dla 1 myszy

10pg M.hyopneumoniae z matrycą iscom zawierającą 1,25 pg QA/dawkę dla 1 myszy pg M.hyopneumomae z matrycą iscom zawierającą 5pg QA/dawkę dla 1 myszy

10pg M.hyopneumoniae + 107 cfu H.pleuropneumomae z matrycą iscom zawierającą 5pg QA na dawkę dla 1 myszy

QA = Quil A

Wszystkim grupom myszy przed pierwszą immunizacją i czternaście dni później pobierano krew przez żyłę ogonową. Dwadzieścia osiem dni po pierwszej immunizacji zwierzęta szczepiono powtórnie i pobierano krew siedem dni później i na koniec 28 dni po drugim pobraniu. Surowicę oddzielano od krwi w dniu pobrania i przechowywano w temperaturze -70°C w celu wykonania analiz techniką ELISA. Po szczepieniu obserwowano czy u myszy nie występują jakiekolwiek niepożądane reakcje miejscowe, lub systemiczne.

Wyniki

Wyniki doświadczeń mających na celu ustalenie, czy Quil A w preparacie iscom, w którym antygen jest „na zewnątrz wykazuje działanie adjuwantu przedstawione są poniżej w tabelach 1 i 2.

Wyniki wykazują jasno, że preparat ISCOM charakteryzujący się wyższym stosunkiem białko:Quil A wynoszącym 10pg do 10pg/dawkę dla 1 myszy wykazuje najsilniejszą odpowiedź na szczepienie, przy czym jest to odpowiedź taka sama jeżeli nie lepsza niż w przypadku szczepionki z adjuwantem Freunda.

W grupach myszy, którym podawano szczepionki iscom zawierające mniej niż 10 pg Quil A w dawce dla 1 myszy nie obserwowano lepszej odpowiedzi na antygen, niż w przypadku samego antygenu bez adjuwantu.

U żadnej myszy otrzymującej szczepionkę iscom lub sam antygen w szczepionce nie zauważono żadnych reakcji, ani miejscowych, ani systemicznych. U myszy immunizowanych szczepionką z adjuwantem Freunda, w miejscu szczepienia wystąpiły małe ziarniniaki (około 3 mm), ale tak jak u innych myszy, również u tych nie było żadnych oznak zaburzeń systemicznych.

168 055

Tabela 1

Odpowiedź przeciw M hyopneumomae u myszy mierzona pośrednią techniką ELISA

Grupy/czas	Szczepienie wstępne	28 DP2°C
A	0,023	0,184
B	0,019	0,126
C	0,019	0,203
D	0,019	0,043
E	0,019	0,083
F	0,032	0,029
G	0,042	0,052
H	0,040	0,150

Standardowe odchylenie opuszczono;

DP2°-dni po drugim szczepieniu

Przykład VIII. Badania na myszach - skuteczność; ocena pustej matrycy iscom jako adju· wantu dla szczepionki z Haemophilus pleuropneumoniae (hpl) u myszy.

Myszy immunizowano szczepionkami zawierającymi całe, osłabione bakterie H. pleuropneumoniae i matrycę iscom utworzoną ze zmiennymi zawartościami Quil A. Myszy immunizowane dwukrotnie szczepionką zawierającą 10pg Quil A/mysz wykazywały większą odporność humoralną (z wytworzeniem przeciwciał) niż myszy immunizowane równoważnymi ilościami bakterii w adjuwancie Freunda. Niższe dawki Quil A wykazywały niewielkie działanie adjuwantu. Po podaniu szczepionek zawierających matryce iscom nie obserwowano żadnych niepożądanych działań ubocznych, ani miejscowych ani systemicznych.

Referencyjny szczep NCTC H. pleuropneumoniae serotyp 3 (Szczep 1421) namnażano do logarytmicznej fazy wzrostu w podłożu z ekstraktem drożdżowym uzupełnionym dodatkiem B NAD. Kultury osłabiano przez dodanie 0,2% formaliny i przemywano trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i uzyskiwano przemyty, osłabiony preparat antygenowy z całymi komórkami. Antygen standaryzowano przez policzenie bakterii przy użyciu komory Neubaumera ze zmodyfikowanym liniowaniem Thoma i przechowywano w PBS w temperaturze 4°C do czasu użycia.

Szczepionki wytwarzane sposobem według wynalazku sporządzano przez zmieszanie jednej z matryc iscom, wytworzonej według przykładów I-VI z antygenem H. pleuropneumoniae, wytworzonym jak opisano powyżej. Do zmieszania stosowano konwencjonalne metody mieszania składników szczepionek. Matryce stosowano w takich ilościach aby uzyskać wymienioną poniżej ilość Quil A na dawkę 0,1 ml.

Grupy myszy po sześć sztuk immunizowano samym H. pleuropneumoniae, H. pleuropneumoniae w FIA, lub H. pleuropneumoniae razem z iscom-matrycą zawierającą różne ilości Quil A, jak to podano poniżej. Ostatnia grupa otrzymała zarówno antygen H. pleuropneumoniae jak i M. hyopneumoniae razem z matrycą iscom w celu przebadania możliwej interakcji między dwoma antygenami. Myszy otrzymywały po dwie podskórne iniekcje po 0,1 ml odpowiedniej szczepionki dwukrotnie, w odstępie trzech tygodni między immunizacjami.

Immunizacja myszy.

Grupa Szczepienie brak sam Hpl

Hpl w FIA

Hpl z matrycą iscom zawierającą 10pg QA na dawkę szczepionki dla 1 myszy

Hpl z matrycą iscom zawierającą 5 pg QA na dawkę szczepionki dla 1 myszy

Hpl z matrycą iscom zawierającą 2,5 pg QA na dawkę szczepionki dla 1 myszy

Hpl z matrycą iscom zawierającą 1,2pg QA na dawkę szczepionki dla 1 myszy

Hpl z matrycą iscom zawierającą 5 pg QA na dawkę szczepionki dla 1 myszy i 10 pg antygenu Mycoplasma hyopneumoniae na dawkę dla 1 myszy

168 055

Po pierwszym szczepieniu w każdej grupie wystąpiła niewielka odpowiedź humoralna. Po drugim szczepieniu wystąpił szybki i wyraźny wzrost poziomu przeciwciał w dwóch z ośmiu immunizowanych grup. Najsilniejszą odpowiedź obserwowano u myszy immunizowanych bakteriami razem z matrycą iscom zawierającą 10 ig Quil A na mysz; pomiar gęstości optycznej (OD) po upyłwie 1 tygodnia po drugim szczepieniu wykazywał słaby pik o wartości 1,24 (± 0,17). Jednostek Gęstości Optycznej (UOD). Myszy immunizowne bakteriami z FIA wykazywały podobną, ale nieco słabszą odpowiedź z wytworzeniem przeciwciał, przy czym słaby pik OD o wartości 1,11 (± 0,08) występował w tym samym czasie. Myszy immunizowane samymi bakteriami, bakteriami z niższymi dawkami Quil A lub bakteriami razem z antygenem M. hyopneumoniae wykazały wszystkie podobne, ale słabsze odpowiedzi z wytworzeniem przeciwciał, przy czym piki mierzone po upływie jednego miesiąca po drugiej immunizacji miały wartości od 0,43 do 0,63 UOD.

Tabela 2

Odpowiedź anty-H. pleuropneumoniae oznaczana pośrednią techniką ELISA

	Szczepienie wstępne	28 DP2°
A	0,87	0,189
B	0,170	0,428
C	0,185	1,002
D	0,135	1,161
E	0,131	0,626
F	0,164	0,645
G	0,119	0,620
H	0,227	0,480

Przykład IX. Badania na świniach

Do badań użyto 30 prosiąt Landrace-cross, w wieku trzech tygodni, ze stada o którym wiadomo, że jest wolne od wszelkich klinicznych i serologicznych przejawów zakażenia H. pleuropneumoniae i M. hyopneumoniae. Prosięta utrzymywano w izolacji od reszty stada i karmiono „ad libertum“ według standardowej diety wzrostowej dla prosiąt odstawionych od maciory (weaner/grower diet).

Nisko pasażowany (mniej niż 10) „field“ izolat (SVA3) M.hyopneumoniae hodowano do logarytmicznej fazy wzrostu na podłożu Friisa.

Do 20 ml sterylnego PBSA dodano 400μΐ 1O%o roztworu Quil A i 1600μΐ mieszaniny lipidowej. Mieszaninę mieszano następnie w ciągu 20 sekund ruchem wirowym z maksymalną szybkością, a następnie przesączono przez filtr 0,45 im. Do 10 ml tej mieszaniny ISCOM dodano 10 ml antygenu M.hyopneumoniae i stężeniu 4mg/ml i uzyskano mieszaninę ISCOM zawierającą 2 mg/ml antygenu i 1 mg/ml Quil A. Grupę pięciu prosiąt immunizowano używając 1 ml matrycy ISCOM zawierającej 2 mg/ml antygenu M.hyopneumoniae o całych komórkach. Dalsze pięć prosiąt otrzymało 1 ml M. hyopneumoniae o stężeniu 2 mg/ml z dodatkiem adiuwantu Freunda. Ostatnie pięć prosiąt otrzymało tylko PBSA.

Prosięta zaszczepiono pierwszy raz w wieku trzech tygodni wstrzykując głęboko domięśniowo po 1 ml odpowiedniej szczepionki do głębokich mięśni na lewej stronie szyi. Drugi taki zastrzyk otrzymały w sześć tygodni później w prawą stronę szyi. Dwa tygodnie po tej drugiej immunizacji prosięta w wieku 11 tygodni zostały doświadczalnie zakażone. Prosięta zabito w około dwa tygodnie po zakażeniu w celu pośmiertnego zbadania zmian patologicznych w płucach.

a) Kliniczne reakcje na szczepienie

U żadnej ze świń nie zaobserwowano żadnych niepożądanych reakcji, ani po pierwszym, ani po drugim szczepieniu. W żadnej z grup nie wystąpił wyraźny wzrost temperatury, ani po pierwszej, ani po drugiej immunizacji. Największy wzrost temperatury o 1,1 ± 0,23°C obserwowano u prosiąt immunizowanych antygenem M. hyopneumoniae w niekompletnym adjuwancie Freunda. Ogólnie rzecz biorąc, słabe grupowe wzrosty temperatur o około 0,3°C były zbyt małe, aby wywołać kliniczne objawy gorączki. Szczepionki, które zawierały antgeny M. hyopneumoniae nie były w sposób zauważalny bardziej progenne niż szczepionki nie zawierające tego antygenu.

W miejscach iniekcji którejkolwiek ze szczepionek, w żadnym momencie badania nie było, ani widocznych, ani wyczuwalnych reakcji miejscowych.

168 055

Nie obserwowano żadnych różnic w przybieraniu prosiąt na wadze.

b) Kliniczne reakcje na infekcję

Nie wystąpiły wyraźne kliniczne reakcje po zakażeniu. Doświadczalne zakażenie nie wywołało gorączki. W ciągu dwóch tygodni po zakażeniu świnie pozostały klinicznie normalne. Nie było żadnych różnic między grupami pod względem przyrostu wagi i zapotrzebowania na paszę w tym okresie.

c) Oznaczenie poziomu przeciwciał w surowicy

Po pierwszym szczepieniu tylko grupa otrzymująca M. hyopneumoniae z adjuwantem Freunda wykazała odpowiedź immunologiczną z wytworzeniem przeciwciał. Jednakże, po drugim szczepieniu wystąpił wyraźny wzrost poziomu przeciwciał u wszystkich zwierząt otrzymujących szczepionkę M. hyopneumoniae. Odpowiedzi z wytworzeniem przeciwciał M. hyopneumoniae w surowicy mierzone techniką ELISA OD (492 nm) przed zakażeniem wynosiły — dla zwierząt otrzymujących szczepionkę ISCOM 0,6 ±0,156 — dla zwierząt otrzymujących szczepionkę z dodatkiem adjuwantu Freunda 1,7 ± 0,089

Odpowiedź humoralną anty-M.hyopnaeumoniae (OD 492 nm = 0,6 ±0156) obserwowano również u zwierząt, które otrzymały szczepionki z matrycą ISCOM.

W żadnej z grup nie wystąpił dalszy, wyraźny wzrost poziomu przeciwciał po infekcji.

d) Miejscowe reakcje na szczepienie

Najostrzejsze reakcje obserwowano u zwierząt, które były immunizowane antygenem M. hyopneumoniae w adjuwancie Freunda. Reakcje polegały na licznych rozproszonych ziarniniakach i były charakterystyczną reakcją na adjuwant Freunda u świń. Żadnych zmian nie obserwowano u świń zaszczepionych szczepionkami ISCOM.

Przykład X. Badania na owcach

Owce samice Blackface-Swaledale uzyskano z fermy, o której wiadomo, że w ciągu ostatnich czterech lat była wolna od OEA. Zwierzęta w wieku 5 - 6 lat przed użyciem przebadano na obecność przeciwciał na Chlamydia psittaci i Toxoplasma gondii. Owce utrzymywano w izolacji od reszty inwentarza i karmiono sianem i koncentratami odpowiednio do ich stanu fizjologicznego i zapotrzebowania żywieniowego.

1. Szczepionki

Szczepy OEA A22 i S26/3 Chalmydia psittaci namnażano i następnie połowicznie oczyszczano (were semi purified). Wstępną objętość kultury każdego ze szczepów wynoszącą 101 zagęszczano w tym procesie uzyskując 11 „10xantygen“.

Szczepionkę Iscom (IV) wytwarza się w sposób następujący.

(a) 50 ml „ 10xantygenu“ zadaje się 100 μΐ „stock“ (50%) aldehydu glutarowego w temperaturze 4°C w ciągu 15 minut.

(b) Dodaje się 50 ml wysterylizowanego na filtrze 0,15 M roztworu glicyny w PBS i zawiesinę inkubuje w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C.

(c) Zawiesinę odwirowuje się przy 17000 g w ciągu 45 minut w temperaturze 4°C, następnie peletkę przemywa się dwukrotnie sterylnym PBS pH 7,2.

(d) Peletkę zwiesza się ponownie w 50 ml PBS.

(e) Dodaje się 0,5 ml 1% roztworu Thimersalu (wysterylizowanego na filtrze) i uzyskuje się końcowe stężenie 0,01%.

Do 100 ml wysterylizowanego PBSA dodaje się 50 μΐ 10% roztworu Quil A i 2 ml mieszaniny lipidowej. Mieszaninę miesza się pod ciśnieniem 465,3 mm Hg (62 KN.m’²) i zagęszcza do objętości 20 ml. Dodaje się wysterylizowany PBSA do uzyskania objętości 200 ml i następnie ponownie zagęszcza do objętości 20 ml. Czynność tę powtarza się dwukrotnie. Końcową objętość przesącza się przez filtr 0,45 im. Do mieszaniny Iscom dodaje się preparat antygenowy uzyskując stężenie 0,2 5 xan tyge n/ml.

Dla kontroli przygotowano szczepionki na bazie oleju (OBV) i wodną adsorbowaną na Alhydrogelu (AAV) o stężeniach odpowiednio lxantygen/ml i 0,25xantygen/ml.

168 055

Doświadczenie obejmowało 5 grup i łącznie 106 owiec-samic. Grupy 1, 2 i 3 zaszczepiono odpowiednio szczepionkami OBV, AAV i IV. Grupy 4 i 5 stanowiły grupy kontrolne będąc odpowiednio zakażoną-nie zaszczepioną i nie zakażoną-nie zaszczepioną.

Szczepionkę OBV podano tylko jeden raz w dawce 1 ml, na 9 tygodni przed kryciem. Pozostałe dwie szczeponki zastosowano dwukrotnie, 9 tygodni i 3 tygodnie przed kryciem, przy czym każda iniekcja stanowiła dawkę 2 ml, a wszystkie szczepionki wprowadzały 4pg właściwego białka Chlamydii. Wszystkie szczepionki wstrzykiwano podskórnie, w określone, wygolone miejsce na prawej stronie szyi.

Owce grup 12,3 i 4 zakażono żywymi bakteriami Chlamydia 85-90 d.g. Grupa 5 pozostała nie zakażona.

Po okoceniu, lub poronieniu pobrano, w miarę możliwości, łożyska do badań. Zarejestrowano również stan jagnięcia (żywe, zdychające lub martwe). Nie starano się utrzymać przy życiu jagniąt słabych, i chorych, poza tym, że podawano im mleko matki.

Badano obecność, lub brak uszkodzeń OEA w łożyskach i oceniano ich rozmiary. Łożyska (lub wymazy pochwowe) badano na obecność ciał chlamydii przez barwienie zmodyfikowaną metodą Ziehl-Neelsena i hodowano w komórkach BHX21 traktowanych 5-jododezoksyurydyną.

Wyniki

Wyniki wykazały, że szczepionka ISCOM dała co najmniej takie dobro zabezpieczenia przed zakażeniem Chlamydiąjak uzyskano za pomocą użytych w doświadczeniu szczepionek konwencjonalnych.

168 055

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki do stosowania u ludzi lub zwierząt, zwłaszcza u świń lub owiec, polegający na (1) wytworzeniu matrycy z glikozydu i sterolu w obecności środka ułatwiającego rozpuszczanie oraz (2) zmieszaniu wytworzonej matrycy z antygenem, związanym z bakterią lub mykoplazmą to jest z substancją zdolną do wytwarzania ochronnych przeciwciał lub immunologicznej odpowiedzi typu komórkowego przeciwko bakteriom lub mykoplazmie u eksponowanych na ten antygen kręgowców, znamienny tym, że środek ułatwiający rozpuszczanie pozostawia się w środowisku przed lub podczas etapu (2).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w stadium (1) wprowadza się dodatkowo fosfolipid.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako fosfolipid stosuje się fosfatydylocholinę.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako glikozyd stosuje się Quil A.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że jako sterol stosuje się cholesterol.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się antygen związany z jednym z następujących gatunków, rodzajów lub klas organizmów; Mycobacterium Clostridium, Rickettsia, Spirochaetes, Escherichia, Staphylococci, Haemophilus, Bordetella, Vibrio, Salmonella, Streptococci, Pasteurella, Legionella, Chlamydia, Pseudomonas, Actinobacillus, Campylobacater, Listeria, Mycoplasma bovis, M.gallisepticum, M.agalacatiae, M.Hyopneumoniae, M.pneumoniae, M.synoviae, M.arthritidis, M.capricolium, M.dispar, M.hominis, M.mycoides subs. capri, M.orale, M-oripneumoniae, M-pulmonis, M-cynos, M. hyorhinis, M.mycoides, M.salvarium i M.fermentans lub antygen obejmujący czynnik adherencyjny w Coli, białko porin lub białka z zewnętrznej błony z B.pertussis lub Neisseria meningitidis.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 6, znamienny tym, że jako środek ułatwiający rozpuszczanie stosuje się środek wybrany spośród oktyloglikozydu, nonylo-N-metyloglukamidu, mocznika i guanidyny.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się antygen związany z Mycoplasma hyopneumoniae.