HU214110B - Process for making iscom matrixs and for preparing vaccines containing them - Google Patents

Abstract

(57) KIVONAT A találmány tárgya eljárás iszkőm mátrix előállítására, amely abbanáll, hőgy valamely glikőzidőt egy szterinnel, valamelyszőlűbilizálószerrel és kívánt esetben valamely főszfőlip ddelösszekevernek, mimellett a glikőzidőt legalább a kritikűs micella-képező kőncentrá-cióban alkalmazzák és az így kapőtt iszkőm mátrixbóla szőlűbilizálószert nem távőlítják el. A talál ány tővábbá az ígyelőállítőtt iszkőm mátrixőt tartalmazó vakcinákra is vőnatkőzik,melyekre jellemző, hőgy az antigén nem épül be az iszkőmba. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás vakcinákban adjuvánsként alkalmazható iszkom mátrixok előállítására valamely glikozidnak egy szterinnel, szolubilizáló szerrel és kívánt esetben valamely foszfolipiddel történő összekeverése útján; a találmány értelmében a glikozidot legalább a kritikus micellaképző koncentrációban alkalmazzuk és a kapott iszkom mátrixból a szolubilizáló szert nem távolítjuk el.

Az állatok megelőző immunizálása mikrobák ellen a mikrobából származó antigén beadásából áll valamely olyan anyaggal együtt, amely fokozza az antigénre adott antitest- és/vagy sejt-közvetített immunválaszt az állatban. Ez az anyag adjuvánsként ismeretes. Az egyedüli adjuváns, amely jelenleg hivatalosan engedélyezett több országban emberekben vagy sertésekben való felhasználásra, az alumínium-hidroxid és az alumínium-foszfát.

Bár ezek az adjuvánsok sok vakcinához megfelelőek, a tanulmányok kimutatták, hogy a Freund féle komplett adjuváns (FCA) vagy a Quil A (amely szaponinként is ismeretes) gyakran hatékonyabb az antitest válasz és a sejt-közvetített immunitás kiváltásában, de ezek az adjuvánsok sajnos káros reakciót idéznek elő az állatokban a vakcinálásra.

Az EP-A-0 109 942 és EP-A-0 180 564 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratok olyan immunogén komplexeket ismertetnek, amelyek glikozidok - pl. triterpenoid szaponinok (elsősorban Quil A) - és hidrofób területet tartalmazó antigének között alakulnak ki. Ezeknek az immun-stimuláló komplexeknek az „iszkom” (iscom) nevet adták. A Quil A mennyisége egy iszkomban mintegy 10-100-szor kisebb lehet, mint amikor a Quil A-t összekeverik az antigénnel, hogy azonos antigén hatást érjenek el. Az iszkomok nem alakítják ki a Quil A-val társuló káros reakciókat.

Az EP-A-231 039 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat az immun-stimuláló komplexek (iszkomok) előállításának ismertetése során köztitermékként olyan oldat előállítását írja le, amely egy hidrofób és hidrofil molekula-tartományokat tartalmazó glikozidot (legalább a kritikus micellaképző koncentrációban), egy szteroidot, adott esetben egy foszfolipidet és a hozzáadandó antigén-hatású fehérje vagy peptid szolubilizálása céljából egy detergenst (felületaktív szert) tartalmaz; ehhez az oldathoz adják azután az antigén-hatású fehérjét vagy pepiidet, majd a detergenst eltávolítják. Az antigénnek a leírás szerint amfipatikus jellegű membránfehéqének kell lennie. A kívánt hidrofób jelleget nem mutató, nem-membrán antigén-fehéqéket csak valamely hidrofób aminosawal, zsírsavval vagy alkilgyökkel történő összekapcsolás után lehet felhasználni iszkomnak az említett oldattal való előállítására. Arra a jelen találmányunk alapját képező felismerésünkre azonban semmi utalás nincs ebben a leírásban, hogy az iszkom-alapszerkezet képzésére köztitermékként alkalmazott, antigént még nem tartalmazó elegy - amelyet „üres iszkom mátrix-nak nevezhetünk - önmagában az antigén-fehérjével való komplexképzés nélkül is alkalmazható adjuváns funkció szolgáltatására. Az ilyen, üres iszkom mátrixot a szolubilizálószer (detergens) eltávolítása nélkül használjuk fel vakcina készítésére oly módon, hogy a vakcinához közvetlenül adjuk a valamely baktériummal vagy mikoplazmával társult antigént, amely így nem épül be az iszkomba. így a vakcina készítéséhez nemcsak hidrofób jellegű membrán-antigén, hanem a szükséghez képest más antigén-fehérjék vagy peptidek is alkalmazhatók.

Mindhárom fentebb idézett európai szabadalmi leírás olyan eljárásokat ismertet, amelyekben vízben nem oldható antigént alkalmazunk, ezt valamely detergenssel szolubilizálják, majd a glikoziddal, stb. végzett összekeverés után a detergens eltávolítják pl. dialízissel, ilyen módon lehet csak az iszkomot kialakítani. Az a felismerésünk is új, hogy iszkomok detergens jelenlétében is kialakulnak, így a jelen találmány szerinti vakcina-előállítási eljárásban nincs szükség a detergens-eltávolítási lépésre.

A találmány első tárgya tehát olyan új eljárás iszkom mátrixok előállítására, amelynek során valamely glikozidot egy szterinnel, valamely szolubilizálószerrel és kívánt esetben valamely foszfolipiddel keverünk össze, és az így kialakított iszkom mátrixbői a szolubilizálószert nem távolítjuk el.

A találmány további tárgyát képezi egy ugyancsak új eljárás humán vagy állati alkalmazásra szolgáló vakcináknak a találmány szerinti üres (antigént nem tartalmazó) iszkom mátrixok felhasználásával történő előállítására, olyan módon, hogy a találmány szerint előállított, glikozidot, szterint, szolubilizálószert, adott esetben foszfolipidet és a szükséghez képest vivőanyagot és/vagy hígítószert tartalmazó iszkom mátrixot egy baktériummal vagy mikroplazmával társult antigénnel keveqük össze. Ilyen módon az antigén-fehéqe nem épül be az iszkomba és hidrofób tartományt nem tartalmazó antigének is közvetlenül alkalmazhatók a vakcinák előállítására.

A fentiekben állati alkalmazáson a vakcina gerinces állatok, elsősorban emlősök, mint sertések, szarvasmarhák, juhok, kecskék, kutyák vagy macskák gyógykezelésére történő alkalmazását értjük.

A „valamely baktériummal vagy mikoplazmával társult antigén” kifejezésen olyan egységet értünk, amely képes védő antitest- vagy sejt-közvetített immunológiai választ előidézni a baktérium vagy a mikoplazma ellen az antigén hatásának kitett gerincesben. Az antigén valamely fehérje, glikoprotein, glikolipid, poliszacharid vagy lipopoliszacharid - amely társul a baktériummal vagy mikoplazmával - része vagy egésze lehet, vagy lehet valamely polipeptid vagy más egység, amely utánozni képes valamely ilyen fehéije, glikoprotein, glikolipid, poliszacharid vagy lipopoliszacharid részét vagy egészét. Mivel az antigén nem épül be az iszkom mátrixba a mátrix képződése során, nem szükséges, hogy az antigénnek hidrofób területe legyen vagy hozzá legyen kötve valamely hidrofób csoporthoz, mint ahogyan ez a technika állása szerinti eljárásoknál történik. A baktériumnak vagy a mikoplazmának magának nem szükséges jelen lennie a vakcinában, de a vakcina költségeit csökkenthetjük, - pl. a Haemophilus pleuropneumoniae-nél - ha teljes sejteket alkalmazunk a kivonat helyett.

A „mikoplazma” fogalma alá bevonjuk a közeli rokon organizmusokat, amelyek ureaplazma (ureaplasma) és acholeplazma (acholeplasma) néven ismeretesek.

HU 214 110B

A bakteriális eredetű betegségek magukban foglalják az alábbiak által okozott betegségeket: Mycobacterium (pl. M. tuberculosis és M. bovis), Clostridium (pl. C. welchii), Rickettsia, Spirochaetes (pl. Treponema pallidum vagy Leptospira pomona), Escherichia (pl. E. coli), Staphylococci (pl. S. aureus), Haemophilus (pl. H. influenzáé és H. pleuropneumoniae), Bordetella, (Pl. B. pertussis), Vibrio (pl. V. cholerae), Salmonella (pl. S. typhi és S. paratyphi), Streptococci (pl. S. agalactiae), Neisseria (pl. N. gonorrhoea), Pasteurella (pl. P. multocida), Legionella (pl. L. pneumoniae), Chlamydia (pl. C. psittaci), Pseudomonas (P. malliae), Actinobacillus (pl. A. pleuropneumoniae), Campylobacter (pl. C. jejuni), Listeria (pl. L. monocytogenes), Brucella (pl. B. abortus), Corynebacterium (pl. C. diptheriae), Yersinia (pl. Y. pseudotubercolosis), Pneumococci (pl. Streptococcus pneumoniae), Bacillus (pl. B. anthracis), Klebsiella (pl. K. pneumoniae), Shigella (pl. S. dysenteriae) és Actinomycetes (pl. Nocardia asteroides).

A baktériumok előnyösen az alábbiak: Mycobacterium (pl. M. tubercolosis), Clostridium (pl. C. welchii), Rickettsia, Spirochaetes (pl. Treponema pallidum), Escherichia (pl. E. coli), Staphylococci (pl. S. aureus), Haemophilus (pl. H. influenzáé és H. pleuropneumoniae), Bordetella, (pl. B. pertussis), Vibrio (pl. V. cholerae), Salmonella (pl. S. typhi és S. paratyphi), Streptococci (pl. S. agalactiae), Neisseria (pl. N. gonorrhoea), Pasteurella (pl. P. multocida), Legionella (pl. L. pneumoniae), Pseudomonas (pl. P. malliae), Actinobacillus (pl. A. pleuropneumoniae), Campylobacter (pl. C. jejuni), Listeria (pl. L. monocytogenes).

A szóban forgó antigének között találjuk az E. coli tapadó faktorait, pl, a K88 csillóit, a porin fehéijéket pl. Salmonellában, és a B. pertussisból és Neisseria meningitidisből származó külső membrán fehérjéket.

Az antigén előnyösen olyan, amely nem képez hagyományos iszkomot, pl. olyan, mint amelyet az EP-A-109 942 és EP-A 180 564 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratokban leírnak.

Különösen előnyös a sertések vakcinálása H. pleuropneumoniae ellen.

Az orvosi vagy állatorvosi szempontból érdekes mikoplazmák között találjuk az alábbiakat:

Mycoplasma bovis, M. gallisepticum, M. agalactiae,

M. hypopneumoniae, M. pneumoniae, M. synoviae,

M. arthriditis, M. capricolium, M. dispar, M. hominis,

M. mycoides subs. capri, M. orale, M. oripneumoniae,

M. pulmonis, M. cynos, M. hyorhinis, M. mycoides,

M. salvarium és M. fermentans.

Bár az antigén nem épül be az iszkom mátrixba a korábbi módon, nevezetesen magának az iszkom szerkezetnek részeként ez jelen lehet az iszkom mátrix külsején vagy később integrálódhat az iszkom mátrixba. Egy másik eljárás szerint ez teljesen elkülönítetten is lehet jelen oldatban vagy diszperzióban.

Az iszkom mátrix elkészítése során önmagukban ismert műveleteket alkalmazunk, például az EP-A0 231 039 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban leírt módon: a szolubilizált szterint, a glikozidot és kívánt esetben a foszfolipidet összekevetjük. Glikozidként előnyösen az ismert Quil A-t, szterinként koleszterint és foszfolipidként foszfatidil-etanol-amint alkalmazhatunk; ezeknek az ismert anyagoknak a felhasználásával kapott iszkom elektronmikroszkópos képét az EP-A 0 231 034 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat 1. ábrája mutatja be 116 000-szeres nagyításban. Ha foszfolipideket nem használunk, kétdimenziós szerkezetek keletkeznek. Az ilyen szerkezetekre példát mutat be az EP-A-0 231 039 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat 2. ábrája. Ez a kép a Quil A-val és koleszterinnel kapott szerkezetek elektronmikroszkópos képe (146 000-szeres nagyítás). Az „iszkom mátrix” kifejezést alkalmazzuk mind a 3 dimenziós, mind a 2 dimenziós szerkezetekre.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazandó glikozidok ugyanazok lehetnek, mint amelyeket az EP-A-0 109 942 és EP-A-0 231 039 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratokban említenek. A glikozidok általában olyan glikozidok, amelyek amfipatikus tulajdonságokat mutatnak, és a molekulában tartalmaznak hidrofób és hidrofil területeket. Előnyösen szaponinokat alkalmazunk, elsősorban a Quillaja saponaria Molina-ból származó szaponin extraktumot, amelyet Dalsgard K. szerint állítunk elő [„Saponin Adjuvants, Bull. Off. Int. Epiz. 77 (7-8) 1289—1295 (1972)] és a Quil A-t, amelyet szintén Dalsgard K. szerint állítunk elő [„Saponin Adjuvants” III. Archív fúr die gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974)]. További előnyös szaponinok az aeszcin az Aesculus hippocastanumból [Patt T. és Winkler W.: „Das therapeutisch wirksame Prinzip dér Rosskastanie (Aesculus hippocastanum)”, Arzneimittelforschung 10 (4), 273-275 (1960)]; valamint a szapoalbin a Gypsophilla struthiumból [Vochten R., Joos P. és Ruyssen R.. „Physicochemical properties of sapoalbin and their relation to the foam stability”, J. Pharm. Béig. 42, 213-226 (1968)]. A Quil A alkalmazása különösen előnyös.

A találmány szerinti eljárásban a glikozidokat legalább a kritikus micella-képző koncentrációban alkalmazzuk. Quil A esetében ez a koncentráció mintegy 0,03 tömeg%.

A glikozid (elsősorban akkor, ha ez Quil A): szterin (elsősorban akkor, ha ez koleszterin): foszfolipid mólarány 1:1:0-l, ± 20% (előnyösen nem több mint ± 10%) az egyes számoknál. Ez mintegy 5:1 tömegaránnyal egyenértékű a Quil A: koleszterin esetében.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott szterinek lehetnek ismert állati vagy növényi eredetű szterinek, mint a koleszterin, lanoszterin, lumiszterin, sztigmaszterin, és szitoszterin. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott szterin előnyösen a koleszterin.

Előnyös foszfolipidet alkalmazni, hogy 3 dimenziós iszkom keletkezzék. A megfelelő foszfolipidek között találjuk a foszfatidil-kolint és a foszfatidil-etanolamint.

A szolubilizálószer az EP-A-0 109 942 vagy EP-A-0 231 039 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratokban említett szerek bármelyike lehet, pl. valamely detergens, karbamid vagy guanidin.

Erre a célra általában nem-ionos; ionos, vagy zwitterionos detergenst vagy kólsav-alapú detergenst; pl. nátri3

HU 214 110Β um-dezoxikolátot, alkalmazhatunk. Az alkalmazott detergens előnyösen oktilglükozid, nonil-N-metil-glükamid, vagy dekanoil-N-metil-glükamid, de alkalmasak az alkil-fenil-polioxi-etilén-éterek, különösen az olyan polietilénglikol-p-izooktil-fenil-éter, amely 9-10 oxietilén csoporttal bír, ez kereskedelmi forgalomban is van Triton X-100R néven.

A vakcinák előállításához a szükséghez képest folyékony vivőanyagot vagy hígítószert is alkalmazhatunk. Erre a célra fiziológiai szempontból elfogadható folyadékok: steril desztillált víz vagy fiziológiás konyhasóoldat használhatók.

A találmány szerinti eljárás további részleteit és az előállított termékek alkalmazási módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik:

1-6. példa: üres iszkom mátrix készítése

A szükséges reagensek

Foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldát (PBSA) (Dulbecco, oxoid)

Lipid keverék (lásd később)

Quil A (Superfos) 10%-os (tömeg/térfogat) oldata steril desztillált vízben.

Lipid keverék (10 ml) előállítása

Anyagok: Kloroform (analitikai tisztaságú); koleszterin (I. minőség - sertésmájból, Sigma); L-/3-foszfatidilkolin (Sigma); Mega 9 vagy Mega 10 (Sigma) vagy Triton (a Mega 9 nonil-N-metil-glukamid, míg a Mega 10 dekanoil-N-metil-glukamid); és ster’il desztillált víz.

Eljárás (a) 20%-os (tömeg/térfogat) Mega 10 oldatot készítünk steril desztillált vízben (bemérünk 2 g Mega 10-et feloldjuk 10 ml vízben), (b) Lemérünk 50 mg koleszterint és hozzáadjuk 50 mg foszfatidil-kolinhoz. (c) Amikor a foszfatidil-kolinban a koleszterin feloldódott, hozzáadunk 2 ml kloroformot, (d) Hozzáadjuk a 10 ml 20%-os (tömeg/térfogat) Mega 10-et. A keverék tej fehér megjelenésű lesz. A térfogat 12 ml-re emelkedik. A kloroformot azonban keverés közben lepárolj uk, és így elérjük a végső 10 ml térfogatot: (e) Az edényt mágneses keverőre állítjuk meleg szobában (37 °C), és az edény fedelét eltávolítjuk. Folyamatos keverés mellett a keverék mozgékonyabb és tisztább lesz (f) A keveréket szobahőmérsékleten tároljuk.

1. PÉLDA

Munkamenet: 20 ml PBSA-t steril univerzális lombikba helyezünk. Hozzáadunk 100 μ 1-t Quil A 10%-os oldatából. Hozzáadunk 400 ml lipid keveréket. Az oldatot örvénykeverővei kevertetjük teljes sebességgel 10 másodpercen át. Az oldatot sterilezzük olyan módon, hogy átengedjük egy 0,2 pm-es szűrőn (Millipore). Kis térfogatot leöntünk elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz. Tároljuk+4 °C hőmérsékleten.

2. PÉLDA

Az 1. példa eljárását követjük az alábbi változtatásokkal. 20 ml PBSA-t helyezünk steril univerzális lombikba. Hozzáadunk 200, /zl-t Quil A 10%-os oldatából. Hozzáadunk 800 μ 1 lipid keveréket. Az oldatot örvénykeverővei kevertetjük teljes sebességgel 10 másodpercen át. Az oldatot sterilre szűrjük 0,2 pm-es szűrőn. Kis térfogatot leöntünk elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz. Tároljuk +4 °C hőmérsékleten.

3. PÉLDA ml PBSA-t adagolunk egy kevertetett, 30 kD molekulatömeg kizárásos membránú Amicon cellához. Ehhez hozzáadunk 800 μ\ lipid keveréket és 200 ml Quil A-t (10%-os oldat). Az oldatot 5 ml-re koncentráljuk és hozzáadunk 100 ml PBSA-t. A fenti lépést kétszer megismételjük. A 20 ml cellatartalmat 0,2 mm-es szűrőn át szűrjük, megjelöljük és +4 C hőmérsékleten tároljuk.

4. PÉLDA ml PBSA-t adagolunk egy kevertetett, 30 kD molekulatömeg kizárásos membránú Amicon cellába. Ehhez hozzáadunk 400μ\ lipid keveréket és 100 ml 10%os Quil A oldatot. A fenti oldatot 5 ml-re koncentráljuk és újra szuszpendáljuk 100 ml PBSA-ban. A fenti lépést kétszer megismételjük. A végső 20 ml cellatartalmat azután 0,2 pm-es szűrőn át szűréssel sterilezzük, megjelöljük, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

5. PÉLDA ml PBSA-t adagolunk egy kevertetett, 30 kD molekulatömeg kizárásos membránú Amicon cellába. Ehhez hozzáadunk 200 μ\ lipid keveréket és 5 pl 10%-os Quil A oldatot. A fenti oldatot 5 ml-re koncentráljuk és újra szuszpendáljuk 100 ml PBSA-ban. A fenti lépést kétszer megismételjük. A végső 20 ml cellatartalmat azután 0,2 pm-es szűrőn átszüljük, megjelöljük és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

6. PÉLDA ml PBSA-t adagolunk egy kevertetett, 30 kD molekulatömeg kizárásos membránú Amicon cellába. Ehhez hozzáadunk 100 p 1 lipid keveréket és 25 pl 10%-os Quil A oldatot. A fenti oldatot 5 ml-re koncentráljuk és újra,szuszpendáljuk 1,00 ml PBSA-ban. A fenti lépést kétszer megismételjük. A végső 20 ml-es sejtpreparátumot azután 0,2 pm-es szűrőn átszűrjük, megjelöljük és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

7. PÉLDA. Egér kísérletek: eredményesség

Beltenyésztett törzs (Balb/C) azonos korú (6-8 hetes) nőstény egereit alkalmazzuk. Az egereket a Harlan-Olac (Bicester) zártan fenntartott (SPF) részlegéből szerezzük be. A kísérletekben a National Cell Type Collection intézettől beszerezhető Mycoplasma hyopneumoniae ATCC 25095 és 25439 törzseket alkalmazzuk. Az organizmust a Friis tápközeg módosított utánzatában tenyésztjük. A törzstenyészeteket -70 °C hőmérsékleten tartjuk fenn. A vakcinába beépítéshez az egyes szuszpenziókat úgy készítjük el, hogy 40 ml tápközeget inokulálunk 4 ml törzstenyészettel pH 7,4-nél, majd 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3 napon át, vagy addig, amíg a pH 6,8-ra csökken le. Ekkorra az organizmus eléri a

HU214 110Β növekedés lóg fázisát. A tenyészeteket binér etilénimin alkalmazásával inaktiváljuk, koncentráljuk tangenciális áramlású ultraszűréssel, és mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal. Az antigén koncentrációját úgy állítjuk be, hogy az összes vakcina 10 mg összfehérjét tartalmazzon a vakcina 0,1 ml-es egér-dózisában.

A 3-6. példák iszkom készítményeit az alábbiak szerint alkalmazzuk.

Nyolc, 6-6 egérből álló csoportot immunizálunk két alkalommal; minden egér 0,1 ml-t kap az alábbi készítményekből.

Csoport	Vakcinálás
A	10/ígM. hyopneumoniae önmagában
B	10/íg M. hyopneumoniae, Freund-féle komplett adjuvánsban
C	10/íg M. hyopneumoniae, 10/íg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixszal
D	10 pg M. hyopneumoniae, 5 /íg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixszal
E	10/íg M. hyopneumoniae, 2,5 /íg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixszal
F	10/íg M. hyopneumoniae, 1,25/íg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixszal
G	0 /íg M. hyopneumoniae, 5 /íg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixszal
H	10/íg M. hyopneumoniae +107 cfü (telepképző egység) El. pleuropneumonia, 5 /íg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixszal.

A táblázatban alkalmazott QA jelentése Quil A.

Az egércsoportokból még az első immunizálás előtt vérmintát veszünk a farokvénán keresztül, majd ugyancsak vérmintát veszünk ugyanúgy az első immunizálás után 14 nappal. Az első immunizálás után 28 nappal az állatokat ismét vakcináljuk, majd vérmintát veszünk a második vakcinálás után 7 nappal, végül 28 nappal. Mintavételének napján a vérből szérumot különítünk el és -70 °C hőmérsékleten tároljuk ELISA-val végzett elemzéshez. Az egereket a vakcinálás után megfigyelés alatt tartjuk bármely káros helyi vagy szisztémás reakció észlelésére.

Eredmények

Az 1. és 2. táblázat mutatjabe azoknak a kísérleteknek az eredményeit, amelyeket arra terveztünk, hogy felbecsüljük a Quil A adjuváns hatásait olyan iszkom készítményben, ahol az antigén a készítményen kívül van.

Az eredmények világosan demonstrálják, hogy a legnagyobb fehérje: Quil A aránnyal (10 /tg: 10/íg/egér dózis) bíró iszkom készítmény idézi elő a legnagyobb választ a vakcinára, olyan választ adva, amely éppen olyan jó, ha nem jobb, mint a Freund-féle adjuvánssal készült vakcináé.

Az egereknek az a csoportja, amely egér dózisonként 10 g Quil A-nál kevesebbet tartalmazó iszkom vakcinát kap, az antigénre adott választ illetőleg nem mutat jobb eredményt, mint az adjuváns nélküli antigénre önmagára adott válasz.

Nem figyelhetők meg sem helyi, sem szisztematikus reakciók sem az iszkom vakcinát, sem az antigént önmagában tartalmazó vakcinát kapott egereknél. A Freund-féle adjuvánssal immunizált egerekben mintegy 3 mm-es kis granulómák figyelhetők meg az immunizálás helyén, de ugyanúgy, mint az összes többi egérnél, szisztémás zavarok jelei nem észlelhetők.

I. TÁBLÁZAT

M. hyopneumoniae elleni válasz eqerekben, közvetett ELISA-val mérve

Csoport	Vakcinálás előtt	28 nappal a második vakcinálás után
A	0,023	0,184
B	0,019	0,126
C	0,019	0,203
D	0,019	0,043
E	0,019	0,083
F	0,032	0,029
G	0,042	0,052
H	0,040	0,150

A standard eltéréseket elhagyjuk.

Az I. táblázatban összefoglalt kísérletek közül az A és B kísérlet a korábban ismert eljárással történt. A C kísérletet a találmány szerinti vakcinával végeztük; a G alatt a kontroll kísérlet volt. A többi, D, E, F és H alatti kísérleteket szintén a találmány szerint előállított vakcinával folytattuk le, de ezek a kísérletek csupán a szükséges adagolás meghatározására szolgáltak; ezek eredményei azt mutatják, hogy ebben a kísérleti modellben egerenként 5 /íg-nál nagyobb (például 10/íg) mennyiség szükséges hatásos immunválasz elérésére.

8. PÉLDA. Egér kísérletek: az üres iszkom mátrix, mint adjuváns értékelése Haemophilus pleuropneumonia vakcinához egerekben Egereket immunizálunk olyan vakcinákkal, amelyek teljes inaktivált H. pleuropneumoniae (Hpl) baktériumokat és Quil A különböző szintjeivel kiszerelt iszkom mátrixot tartalmaznak. Azok az egerek, amelyeket kétszer vakcinálunk, nagyobb antitest választ adnak, mint azok az egerek, amelyek azonos számú, de Freund-féle adjuvánsban található baktériummal vannak immunizálva. A Quil A kisebb adagjai szemmel láthatóan kisebb adjuváns hatással bírnak. Káros helyi vagy szisztémás hatások nem figyelhetők meg egyetlen, iszkom mátrixot tartalmazó vakcina beadása után sem.

A 3. szerotípusú H. pleuropneumonia NCTC referencia törzset (1421 törzs) lóg fázisú növekedésig növesztjük B NAD-dal kiegészített élesztőkivonat tápközegben. A tenyészetet 0,2% formáimnál inaktiváljuk, és

HU 214 110B

2. TÁBLÁZAT

Anti-EI.pleuropneumoniae válasz, közvetett

ELISA-val mérve háromszor mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS); így mosott, inaktivált teljes sejt antigén készítményt kapunk. Az antigént standardizáljuk a baktériumok megszámlálásával, módosított Thoma-vonalkázással ellátott Neubaumer kamra alkalmazásával, majd felhasználásig PBS-ben tároljuk 4 °C hőmérsékleten.

egérből álló csoportokat immunizálunk H. pleuropneumoniaeval önmagában, H. pleuropneumoniaeval Quil A különböző szintjeit tartalmazó iszkom mátrixszal együtt. Az utolsó csoport kap mind H. pneumoniae-t, mind M. hyopneumoniae antigént az iszkom mátrixszal együtt, hogy megvizsgáljuk az esetleges kölcsönhatást a két antigén között. Az egerek két alkalommal kapnak szubkután injekciót, 0,1 ml-t a megfelelő vakcinából, a két immunizálás között 3 hét eltéréssel.

Egerek immunizálása

Csoport	Vakcinálás
1	Semmi
2	Hpl önmagában
3	Hpl FIA-ban
4	Hpl 10 /z g QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixos vakcinában
5	Hpl 5 /tg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixos vakcinában
6	Hpl 2,5 /tg QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixos vakcinában.
7	Hpl 1,2 g QA/egér dóziat tartalmazó iszkom mátrixos vakcinában
8	Hpl 5 g QA/egér dózist tartalmazó iszkom mátrixos vakcinában, és 10 g/egér dózis Mycoplazma hyopneumoniae antigén.

Az első vakcinálást követően minden csoportban van csekély antitest válasz. A szekunder vakcinálást követően gyors és hangsúlyozott emelkedés észlelhető az antitest szintekben a 8 immunizált csoport közül kettőben. A legnagyobb válaszok azokban az egerekben láthatók, amelyek baktériumokkal együtt olyan iszkom mátrixszal vannak immunizálva, amely 10 /< g/egér Quil A-t tartalmaz ennek átlagos OD csúcsa 1,24 (±0,17) optikai sűrűségegység (UOD) amikor egy héttel a második immunizálás után méijük. A baktériumokkal és FIA-val immunizált egereknek hasonló, de valamivel kisebb antitest-válasza van, az átlagos OD csúcs 4,11 (± 0,008) UOD ugyanazon alkalommal. A csak baktériumokkal immunizált kisebb dózisú Quil A-val és baktériumokkal immunizált, vagy baktériumokkal és M. hyopneumoniae antigénnel együtt immunizált egerek mind hasonló, de kisebb antitest válaszokkal bírnak, ahol a csúcs-értékek 0,43 és 0,63 UOD között vannak egy hónappal a második immunizálás után.

	Elő-vakcinálás	28 nappal a 2. vakcinálás után
1.	0,87	0,189
2.	0,170	0,428
3.	0,185	1,002
4.	0,135	1,161
5.	0,131	0,626
6.	0,164	0,645
7.	0,119	0,620
8.	0,227	0,480

A táblázatban összefoglalt kísérleti eredményeket a fentebb „Egerek immunizálása” cím alatt ismertetett körülmények között végeztük; az 1. 2. és 3. csoporttal különböző kontroli-kísérleteket folytattunk le, a 4. csoportot a találmány szerinti eljárással előállított vakcina optimálisnak vélt adagolásával kezeltük, míg az 5-8. csoporttal folytatott kísérleteket ugyancsak a találmány szerint elkészített vakcinával, a különböző adagolási módok összehasonlító vizsgálatára folytattuk le.

9. PÉLDA. Vizsgálatok sertésekkel

Harminc keresztezett Landrace malacot szerzünk be három hetes korukban olyan kondából, amelyről ismert, hogy mentes a H. pleuropneumoniae és M. hyopneumoniae fertőzés minden klinikai és szerológiai bizonyítékától. A malacokat elkülönítve tartjuk az állomány többi tagjaitól, és tetszés szerinti mennyiségben tápláljuk standard elválasztó/növesztő étrenddel.

Kevésszer (tíznél kevesebbszer) passzált helyszíni M. hyopneumonia izolátumot (SVA3) tenyésztünk lóg növekedési fázisig Friis tápközegben.

ml steril PBSA-hoz hozzáadunk 400 pt, 10%-os Quil A oldatot és 1600 μΐ lipid keveréket. A keveréket azután örvénykeverővei kevertetjük 20 másodpercen át maximális sebességgel, majd átszüljük 0,45 pm-es szűrőn. 10 ml ilyen iszkom keverékhez hozzáadunk 10 ml 4 mg/ml-es M. hyopneumoniae antigént, hogy olyan iszkom keveréket kapjunk, amely 2 mg/ml antigént és mg/ml Quil A-t tartalmaz.

sertésből álló csoportot immunizálunk 1 ml olyan iszkom mátrixszal, amely 2 mg/ml M. hyopneumoniae teljes sejt antigént tartalmaz. További 5 sertés 1 ml-t kap mg/ml-es M. hyopneumoniaeból, amely Freund-féle adjuvánsban van. Az utolsó 5 sertés csak PBSA-t kap.

A malacok az első vakcinálást 3 hetes korukban kapják mély intramuszkuláris injekcióval, a megfelelő vakcina

I ml-ét adva a nyak bal oldalának mély izmaiba. A második, hasonló injekciót 6 héttel később kapják a nyak jobb oldalába. Két héttel a második immunizálás után, amikor

II hetesek, a malacokat kísérletileg fertőzzük. A fertőzés után 2 héttel a malacokat leöljük és post mortem vizsgálatnak vetjük alá tüdejüket, a patológiás állapot kimutatására.

HU 214 110B

a) Klinikai reakciók a vakcinálásra

Nem figyelhetők meg káros klinikai jelek egyik sertésben sem a primer vagy szekunder vakcinálás után. A primer és szekunder immunizálás után nincs szignifikáns növekedés a hőmérsékletben egyik csoportban sem. A legnagyobb hőmérséklet-emelkedés, 1,1 ± 0,23 °C, a M. hyopneumoniae-val és Freund-féle inkomplett adjuvánssal immunizált malacokban figyelhető meg a második immunizálás után. Általában az átlagos csoporthőmérsékletek mintegy 0,3 °C-al növekednek, amely elég kicsi ahhoz, hogy a lázas állapot klinikai jeleit mutassa. Azok a vakcinák, amelyek M. hyopneumoniae antigéneket tartalmaznak, észrevehetően nem inkább lázkeltők, mint azok, amelyek nem tartalmaznak ilyen antigéneket.

Helyi reakciók nem láthatók vagy nem tapinthatók egyik vakcina injekciójának helyén sem, egyetlen vizsgált esetben sem.

Nem figyelhető meg különbség a malacok tömeggyarapodásában,

b) Klinikai reakciók injekcióra

A fertőzést követően klinikai reakciók nem láthatók. A kísérleti fertőzés nem okoz lázas állapotot. A sertések klinikailag normális állapotúak maradnak két héttel a fertőzést követően. A tömeggyarapodás és a táplálékfelvétel nem mutat jelentős különbségeket a két csoport között.

c) A szérum antitest mérése

Az. első (primer) vakcinálást követően csak az a csoport mutat antitest választ, amely M. hyopneumoniae-t Freund-féle adjuvánssal együtt kap. A második immunizálást követően azonban kifejezett növekedés észlelhető az antitest szintekben az összes olyan állatban, amely M. hyopneumoniae vakcinát kap. A szérum M. hyopneumoniae antitest válaszai ELISA-val mérve (OD 492 nmnél) a fertőzés előtt az alábbiak:

az iszkom vakcinát kapott állatoknál 0,6 ± 0,156

Freund-féle adjuvánssal készült vakcinát kapott állatoknál 1,7 ± 0,089

Megfigyelhető M. hyopneumoniae antitest válasz (OD492 = 0,6 ± 0,156 olyan, állatokban is, amelyek iszkom mátrix vakcinákat kaptak.

Az antitest szintekben nincs semmi további jelentős emelkedés egyik csoportban sem a fertőzést követően.

d.) Helyi reakciók a vakcinálásra

A legsúlyosabb reakciók azokban a malacokban figyelhetők meg, amelyek Freund-féle adjuvánsban levő M. hyopneumoniae antigénnel vannak immunizálva. A többszörösen szétszórt sejtszerü granulómákból álló reakció nagyon jellemző a Freund-féle adjuvánsok reakcióira sertésekben. Az iszkom vakcinákat kapott sertésekben károsodások nem figyelhetők meg.

10. PÉLDA: Juhokkal végzett vizsgálatok

Blackface x Swaledale jerkéket szerzünk be olyan gazdaságból, amelyről ismert, hogy legalább 4 éve mentes OEA-tól. Az 5-6 éves állatokat elővizsgáljuk felhasználás előtt Chlamydia psittaci és Toxoplasma gondii elleni antitestekre. A jerkéket elkülönítve tartjuk a nyáj többi tagjaitól, és szénával, valamint koncentrátumokkal etetjük ezeket olyan szinten, hogy fiziológiai és táplálkozási állapotuk kielégítő legyen.

1. Vakcinák

Chlamydia psittaci A22 és S26/3 törzseket (beszerezhetők az American Type Culture Collection intézettől ATCC VR-656 és ATCC VR-629 számon) növesztünk, majd a tenyészeteket csupán részlegesen tisztítjuk. Az egyes törzsek 10 1-es kiindulási tenyészeteit 1 literre koncentráljuk ebben a munkafolyamatban, így kapjuk meg a „10X antigén-t.

Iszkom vakcinát (IV) készítünk a következőképpen:

(a) 50 ml ÍOx antigént kezelünk 100 μ 1 glutáraldehid törzsoldattal (50%-os) 15 percen át 4 °C hőmérsékleten.

(b) 50 ml, szűréssel sterilezett, 0,15 mól/literes (PBSben) glicin oldatot adunk hozzá, és a szuszpenziót 5 percen át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten.

(c) A szuszpenziót 1700 g-nél centrifugáljuk 45 percen át 4 °C hőmérsékleten, majd az üledéket kétszer mossuk steril PBS-sel (pH 7,2). (d) Az üledéket újra szuszpendáljuk 50 ml PBS-ben. (e) 0,5 ml tiomerizált (1%; sterilre szűrve) adunk hozzá, hogy 0,01% végső koncentrációt éljünk el.

100 ml steril PBSA-hoz 50 μ 1 10%-os Quil A oldatot és 2 ml lipid keveréket adunk. A keveréket 62 kN.m ² nyomáson kevertetjük és 20 ml térfogatra koncentráljuk. Ehhez steril PBSA-t adunk 200 ml térfogatig, majd a térfogatot ismét 20 ml-re csökkentjük. Ezt még kétszer megismételjük. A végső térfogatot 0,45 m-es szűrőn keresztül szüljük.

Az antigén preparátumot hozzáadjuk az iszkom keverékhez úgy, hogy az antigén koncentráció 0,25 x antigén/ml legyen.

Egy olaj-alapú (OBV) és egy alhidrogélen adszorbeált vizes (AAV) vakcinát készítünk kontrollokként, 1 x antigén/ml, illetve 0,25 x antigén/ml koncentrációban.

A kísérlet 5 csoportot, összesen 106 jerkét érint. Az 1., 2., és 3. csoportok OBV-vei, AAV-vel, illetve IV-vel vannak vakcináivá. A 4. és 5. csoportok alkotják a kontrollt; az egyik csoport fertőzött/nem vakcináit, a másik csoport nem fertőzött/nem vakcináit.

Az OBV vakcinát csak egyszer adjuk be 1 ml-es adagban, 9 héttel a fedeztetés előtt. A további két vakcinát kétszer adjuk be, 9 héttel és 3 héttel a fedeztetés előtt; mindegyik 2 ml-es adagot jelent (az összes vakcina 4 pg Chlamydia fehérje terhelést jelent).

Az összes vakcinát szubkután adjuk be, a nyak jobb oldalán, azonosított, nyírott helyen.

Az 1., 2., 3., és 4. csoport jerkéit élő Chlamydiával fertőzzük, 85-90 d.g.-vel. Az 5. csoportot nem kezeljük.

Az ellésnél vagy vétélésnél a placentákat, ha vannak, mintaként összegyűjtjük. Feljegyezzük ekkor a bárányok állapotát (élő, haldokló vagy döglött). Nem teszünk kísérletet arra, hogy élve tartsuk a satnya bárányokat, a íocstejjel való ellátáson kívül

A placentán jelentkező OEA eredetű elváltozásokat feljegyezzük és mértéküket megbecsüljük. A placentákat (vagy hüvelyi tamponokat) megvizsgáljuk Chlamydia testekre a módosított Ziehl-Neelsen eljárással festve, és

HU 214 110B tenyésztést végzünk S-jód-dezoxiridinnel kezelt BHK21 sejteken.

Eredmények:

Az eredmények azt mutatják, hogy az iszkom vakcina védelmet nyújt Chlamydia fertőzés ellen, és legalább 5 olyan jó, mint az a védelem, mint amelyet a kísérletben használt hagyományos vakcinák nyújtanak.

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 10

   1. Eljárás iszkom mátrix előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely glikozidot egy szterinnel, valamely szolubilizálószerrel és kívánt esetben valamely foszfolipiddel keverünk össze, mimellett a glikozidot lég- 15 alább a kritikus micella-képező koncentrációban alkalmazzuk, és az így kapott iszkom mátrixból a szolubilizálószert nem távolítjuk el.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozidkén triterpenoid szaponinokat alkalma- 20 zunk, előnyösen legalább 0,03 tömeg% koncentrációban.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti, eljárás, azzal jellemezve, hogy szterinként koleszterint, lanoszterint, lumiszterint, sztigmaszterint vagy szitoszterint, elönyö- 25 sen koleszterint alkalmazunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mátrix képzéséhez foszfolipidet, előnyösen foszfatidil-kolint vagy foszfatidil-etanolamint alkalmazunk.
5. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szolubilizálószerként oktil-glükozidot, nonil-N-metil-glükamidot, karbamidot vagy guanidint alkalmazunk.
6. 6. Eljárás vakcina előállítására azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított iszkom mátrixot egy baktériummal vagy mikoplazmával társult antigénnel keverjük össze, ahol az említett antigén nem épül be az iszkomba.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénként a Mycoplasma, Haemophilus vagy Chlamydia nemzetség valamelyikéhez tartozó organizmushoz társult antigént alkalmazunk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy a Mycoplasma hyopneumoniae fajba tartozó organizmussal társult antigént alkalmazunk.
9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy a Haemophilus pleuropneumoniae fajba tartozó organizmussal társult antigént alkalmazunk.
10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy a Chlamydia psittaci fajba tartozó organizmussal társult antigént alkalmazunk.