PL167316B1

PL167316B1 - Sposób otrzymywania preparatu immobilizowanej subtilizyny w postaci włókien

Info

Publication number: PL167316B1
Application number: PL29035891A
Authority: PL
Inventors: Edward Galas; Tadeusz Trzmiel; Slawomir Seliga; Malgorzata Fortak
Original assignee: Politechnika Lodzka
Priority date: 1991-05-22
Filing date: 1991-05-22
Publication date: 1995-08-31
Also published as: PL290358A1

Abstract

Sposób otrzymywania preparatu immobilizowanej subtilizyny w postaci włókien, znamienny tym, że sporządza się roztwór subtilizyny w wodzie, zawierający jony metali dwuwartościowych, korzystnie wapnia, o aktywności proteolitycznej 60 - 300 mjA/ml, pH = 6 -10 i o temperaturze0°C, który miesza się z uprzednio zhomogenizowanym i ochłodzonym do temperatury 0°C roztworem triacetylocelulozy w chlorku metylenu, o stężeniu 5-7%, zawierającym glicerynę w ilości 1-20% wagowych w stosunku do łącznej masy triacetylocelulozy i chlorku metylenu, użytym w stosunku objętościowym do roztworu subtilizyny równym 2-5, po czym z otrzymanej emulsji formuje się włókna przez wytłaczanie do kąpieli koagulacyjnej, złożonej z toluenu i chlorku metylenu zmieszanych w stosunku objętościowym 4:1, przy czym roztwór subtilizyny sporządza się w wyniku rozpuszczenia takiej ilości stałego preparatu subtilizyny w 0,05-0,2% wodnym roztworze soli metali dwuwartościowych, korzystnie octanu wapnia, aby aktywność proteolityczna roztworu subtilizyny wynosiła 60 - 300 mjA/ml, przy czym roztwór subtilizyny sporządza się w ten sposób, iż do cieczy otrzymanej w wyniku hodowli produkcyjnej bakterii Bacillus dodaje się roztwór wodny soli metali dwuwartościowych, korzystnie chlorku wapnia, o stężeniu 0,3-1,0%, odwirowuje powstały osad, a supernatant zatęża się do chwili, gdy aktywność proteolityczna roztworu subtilizyny osiągnie wartość 60-300 mjA/ml, następnie odwirowuje się i/lub filtruje i ewentualnie poddaje dodatkowemu oczyszczeniu na drodze frakcjonowanego wysalania siarczanem amonu, dializy wobec 0,1% octanu wapnia, działania jonowymieniaczami lub na drodze ultrafiltracji.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu immobilizowanej subtilizyny w postaci włókien. Subtilizyna jest wytwarzana przez bakterie z rodzaju Bacillus.

Znane są sposoby otrzymywania preparatów, w postaci włókien, enzymów specyficznych dla rozszczepienia cefalosporyny fenoksymetylowej, wytwarzanych przez grzyby takie jak Aspergillus, Penicillium, Borytris cinerea, Fusarium, Mucor, Alternaria, Streptomyces lub enzymów specyficznych dla rozszczepienia cefalosporyny benzylowej, wytwarzanych przez bakterie takie, jak E. coli, Megaterium, Aerobacter aerogenes, Alcaligenes faecalis.

Sposób otrzymywania preparatu immobilizowanej subtilizyny w postaci włókien, według wynalazku polega na tym, że sporządza się roztwór subtilizyny w wodzie, zawierający jony metali dwuwartościowych, korzystnie wapnia, o aktywności proteolitycznej 60 - 300 mjA/ml, pH = 6 - 10 i o temperaturze 0°C, który miesza się z uprzednio zhomogenizowanym i ochłodzonym do temperatury 0°C roztworem triacetylocelulozy w chlorku metylenu, o stężeniu 5-7%, zawierającym glicerynę w ilości 1 - 20% wagowych w stosunku do łącznej masy triacetylocelulozy i chlorku metylenu, użytym w stosunku objętościowym do roztworu subtilizyny równym 2-5, po czym z otrzymanej emulsji formuje się włókna przez wytłaczanie do kąpieli koagulacyjnej, złożonej z toluenu i chlorku metylenu zmieszanych w stosunku objętościowym 4:1.

Roztwór subtilizyny sporządza się w wyniku rozpuszczenia takiej ilości stałego preparatu subtilizyny w 0,05 - 0,2% wodnym roztworze soli metali dwuwartościowych, korzystnie octanu wapnia, aby aktywność proteolityczna roztworu subtilizyny wynosiła 60-300mjA/ml względnie roztwór subtilizyny sporządza się w ten sposób, iż do cieczy otrzymanej z hodowli produkcyjnej bakterii Bacillus dodaje się roztwór wodny soli metali dwuwartościowych, korzystnie chlorku wapnia, o stężeniu 0,3 - 1,0%, odwirowuje powstały osad, a supernatant zatęża się do chwili, gdy aktywność proteolityczna roztworu subtilizyny osiągnie wartość 60 - 300 mjA/ml, następnie odwirowuje się i/lub filtruje i ewentualnie poddaje dodatkowemu oczyszczaniu na drodze frakcjonowanego wysalania siarczanem amonu, dializy wobec 0,1% octanu wapnia, działania jonowymieniaczami lub na drodze ultrafiltracji.

167 316 3

Preparat otrzymany sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie jako katalizator enzymatyczny, przy czym cechuje go wysoka aktywność, efektywność działania i trwałość.

Sposób według wynalazku ilustruje bliżej niżej podany przykład nie ograniczając jego zakresu.

Przykład . W kolbie trójszyjnej o pojemności 0,251, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną i mieszadło, umieszczono 104,8 ml chlorku metylenu i 10 g triacetylocelulozy i całość mieszano z szybkością 600 obrotów/minutę aż do uzyskania klarownego roztworu o stężeniu 6,6%. Do tak otrzymanego roztworu dodano 4,5 ml gliceryny i po 0,5-godzinnym homogenizowaniu połączonym z jednoczesnym ochłodzeniem mieszaniny do temperatury 0°C, dodano 30 ml roztworu subtilizyny o temperaturze 0°C. Roztwór subtilizyny otrzymano w następujący sposób.

Do 3000 ml cieczy po hodowli produkcyjnej bakterii Bacillus subtilis IBTC-3 o aktywności proteolitycznej 12,2 mjA/ml dodano 150gCaCl2 X 5HzO,po 15 minutach od chwili rozpuszczenia soli odwirowano utworzone osady z szybkością 4000 rpm, supernatant zatężono w wyparce próżniowej 9,7-krotnie, w wyniku czego otrzymano 288 ml cieczy, którą powtórnie wirowano i poddano filtracji przez płytkę EKS. Otrzymano 272 ml cieczy o aktywności proteolitycznej 109,3 mjA/ml, której 30 ml dodano do roztworu triacetylocelulozy.

Po wymieszaniu roztworów triacetylocelulozy i subtilizyny, całość dokładnie zhomogenizowano w czasie 0,5 godziny z szybkością 5000 obrotów/minutę i powstałą emulsję, po 0,5godzinnym odpowietrzeniu, przetłaczano ciśnieniem azotu 68646 Pa przez 500-otworową dyszę przędzalniczą o średnicy otworów 0,08 mm do kąpieli koagulacyjnej zawierającej 80% objętościowych toluenu i 20% objętościowych chlorku metylenu, ochłodzonej do temperatury 0°C. Długość drogi włókna w kąpieli wynosiła 1,2m, stopień rozciągu -1,1, a szybkość odbioru włókna na szpulę - 8 m/minutę. Uzyskane włókna suszono w strumieniu powietrza o temperaturze pokojowej w czasie 1godziny. Otrzymano 11,8g włókna triacetylocelulozy z immobilizowaną subtilizyną, które przechowywano w zamkniętym naczyniu w obniżonej temperaturze, co stanowiło 16,6% wydajności teoretycznej.

Aktywność proteolityczna otrzymanego preparatu, oznaczona metodą Ansona wobec hemoglobiny o pH = 10,2, wynosiła 46,1 mjA/gwłókna. OptymalnepH działania preparatu mieściło się w zakresie 9 -10, optymalna temperatura działania wynosiła 60 - 70°C, subtilizyną osadzona na włóknach była stabilna w przedziale pH = 6-11 i do temperatury 60°C, jakkolwiek preparat ogrzewany w czasie 1 godziny w temperaturze 70°C w buforze uniwersalnym o pH = 7,0 zachował jeszcze około 4% aktywności wyjściowej.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób otrzymywania preparatu immobilizowanej subtilizyny w postaci włókien, znamienny tym, że sporządza się roztwór subtilizyny w wodzie, zawierający jony metali dwuwartościowych, korzystnie wapnia, o aktywności proteolitycznej 60 - 300 mjA/ml, pH = 6 -10 i o temperaturze 0°C, który miesza się z uprzednio zhomogenizowanym i ochłodzonym do temperatury 0°C roztworem triacetylocelulozy w chlorku metylenu, o stężeniu 5-7%, zawierającym glicerynę w ilości 1-20% wagowych w stosunku do łącznej masy triacetylocelulozy i chlorku metylenu, użytym w stosunku objętościowym do roztworu subtilizyny równym 2-5, po czym z otrzymanej emulsji formuje się włókna przez wytłaczanie do kąpieli koagulacyjnej, złożonej z toluenu i chlorku metylenu zmieszanych w stosunku objętościowym 4:1, przy czym roztwór subtilizyny sporządza się w wyniku rozpuszczenia takiej ilości stałego preparatu subtilizyny w 0,05-0,2% wodnym roztworze soli metali dwuwartościowych, korzystnie octanu wapnia, aby aktywność proteolityczna roztworu subtilizyny wynosiła 60 - 300 mjA/ml, przy czym roztwór subtilizyny sporządza się w ten sposób, iż do cieczy otrzymanej w wyniku hodowli produkcyjnej bakterii Bacillus dodaje się roztwór wodny soli metali dwuwartościowych, korzystnie chlorku wapnia, o stężeniu 0,3-1,0%, odwirowuje powstały osad, a supernatant zatęża się do chwili, gdy aktywność proteolityczna roztworu subtilizyny osiągnie wartość 60-300 mj A/ml, następnie odwirowuje się i/lub filtruje i ewentualnie poddaje dodatkowemu oczyszczeniu na drodze frakcjonowanego wysalania siarczanem amonu, dializy wobec 0,1% octanu wapnia, działania jonowymieniaczami lub na drodze ultrafiltracji.