PL166570B1 - Sposób wytwarzania nowych ośmiopeptydów - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania nowych ośmiopeptydów o wzorach 1 i 2 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że z N-terminalnym-ewentualnie zabezpieczonym aminokwasem lub jego resztą sprzęga się ewentualnie zabezpieczone odpowiednie aminokwasy w kolejności zgodnej z sekwencjami we wzorach 1 i 2, po czym ewentualnie usuwa się grupę zabezpieczającą lub grupy zabezpieczające i ewentualnie przeprowadza się powstały wolny ośmiopeptyd w jego farmakologicznie dopuszczalną sól.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych oOmSozepSłdów o wzorach 1 i 2 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli. Są one analogami somtSwsSttyny ctwiertjąącj Thr w pozycji 6 i mają działanie lecznSąze.

W lSteptStpce opisano ISczic analogi somttrsSaSyny o dziaatnit hamującym uwalnianie hormonu wzrostu, w tym analogi ctwieptjąąe mniej niż 14 aminokwasów występujących w przyrodzie. Np. w oppsie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 485 101 ujawniono dwunastwzepSydł mające N-termSnaOną grupę acetyawwą, C-Serminalną grupę aminową, D-Trp w pozycji 6 p z-Cl-Phe w pozycji 4.

W niniejszym opisie aminokwasy oznaczone są znanymi 3 liSwrowłmS skrótami, przy czym są to aminokwasy o konfiguracji L, o ile npe zaznaązrnr ριζ^^.

Aminokwasy występujące w przyrodzie są oznαązole ogólnie przyjętymi symbolami 3 literowymi. O Ple nie zαzlaccolo że aminokwas (inny niż β Ntl) mt postać stepcoizrmepu D, to przyjmuje się, że mt on postać L. βNal wzlwącw D- lub L- β-naftyloalaninę, o ile nie podano, że jest to stcreoicrśer D lub L.

Określenie farmakologicznie dopuszczalne sole dotyczy soli P kompleksów zachowujących aktywność biologiczną związku macierzystego P nSe mających niezożądalegw działania toksycznego. Przykładami takich soOP są (a) sole addycyjne kwasów nieorganicznych, np. kwasu solnego, bromowodorowego, siarkowego, fosforowego, azotowego SSp., oraz sole kwasów organicznych, takich jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, bursztynowy, maleinowy, askorbinowy, benzoesowy, garbnikowy, embonowy, alginowy, poliglutaminowy, nafStlenosulfonowy, naftαlwlodwusulfolrwy P zolSgalakturonowy, (b) sole addycyjne z wielwwaptoOcprwymp kationami metali, takich jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm ptz., Oub z kationami organicznymi pochodzącymi z N,N-dwubenzylwwtylclodwuαmPly lub wtłlcnodwuaminy, oraz (c) sole kompleksowe stanowiące połączenia (a) P (b), np. ΡζιριΡζι cynkowy iSz.

Sposób wytwarzania nowych ośmSrzcpSłdów o wzorach 1 i 2 polega według wynalazku na tym, że z N-terminalnym ewentualnie zabeczScązrnłś aminokwasem Oub jego resztą sprzęga się ewentualnie cabezpicczrnc odpowiednie aminokwasy w kolejności zgodnej z sekwencjami we wzorach 1 P 2, po czym ewentualnie usuwa spę grupę cabecppeccającą lub grupy zabezpieczające i ewentualnie przeprowadza się powstały wolny ośśiozcptyd w jego farmakologicznie dopuszczalną sól.

ZwiązkS wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują szeroki zakres dciaaalia biologicznego hamując wydzielalie i rozmnażanie. Hamują one włdzpclaliw wielu hormonów, w tym insuliny, gOukagonu i zwłaszcza hormonu wzrostu (GH). Związki Sc hamują włazpwlalPe substancji wydzielanych przez trzustkę i układ żołądkowo-jelitowy oraz tłumią Oub regulują uwalnianie pewnych leupoppcckaźników, w tym substancji P P acetylocholiny.

Analogi sośaSwstwSylł mogą oddziaływać nt rozmnażanie komórek nowotworowych, zapobiegając uwalnianiu czynników mit^enych, twkPch jak SnsulSnozodobnł czynnik wzrostu 1 (IGF-1), pepS^y

166 570 uwalniające gastrynę itp., i mogą oddziaływać na mechanizm transdukcji wewnątrzkomórkowej, jak np. w przypadku rozmnażania komórek wywołanego naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF).

Lipofilowy N-koniec aromatyczny może zapewnić długotrwałe działanie związku in vivo.

Po podaniu ssakom, a zwłaszcza ludziom (np. doustnie, miejscowo, dożylnie, pozajelitowo, w postaci zapewniającej stopniowe uwalnianie i ulegającej degradacji biologicznej, donosowo lub w postaci czopków) związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą skutecznie hamować wydzielanie różnych hormonów i czynników troficznych. Można je stosować dla hamowania wydzielania pewnych substancji wydzielanych przez gruczoły wewnętrzne takich jak GH, insulina, glukagon i prolaktyna, w leczeniu np. akromegalii, nowotworów gruczołów wydzielania wewnętrznego, takich jak rakowiaki, wipoma, gruczolaki wysepkowato-komórkowe i glukagonoma lub cukrzyca i choroby związane z cukrzycą, w tym retinopatia, nefropatia, zespół Dawna i cukrzyca typu 2. Związki te można również stosować dla hamowania wydzielania substancji wydzielanych w trzustce, żołądku i jelitach, przy leczeniu zapalenia trzustki, przetok, krwawiących wrzodów i biegunki związanej z takimi chorobami jak AIDS lub cholera. Do zaburzeń związanych z wydzielaniem autokrynowym i parakrynowym. czynników troficznych, takich jak IGF-1 (jak również pewnych czynników wydzielania wewnętrznego), które można leczyć podając związki wytwarzane sposobem według wynalazku, należą raki piersi, prostaty i płuc (epidermoidy zarówno małokomórkowe jak i nie małokornórkowe), jak również nowotwory wątroby, nerwiaki niedojrzałe, gruczolakoraki (kanalikowe) okrężnicy i trzustki, mięsaki tkanki chrząstnej i czerniaki, a także stwardnienie tętnic związane z przeszczepami naczyń i restenozą po angiopiastii.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są również użyteczne jako środki hamujące działanie mediatorów zapalenia nerwów (np. substancji P i tachykinin), a więc można je stosować w leczeniu takich chorób jak pierwotnie postępujący gościec stawowy, łuszczyca, zapalenie miejscowe, np. związane z naświetlaniem słonecznym, egzemą i innymi źródłami powodującymi swędzenie, oraz alergie, w tym astma. Związki te mogą także działać jako neuromodulatory w ośrodkowym układzie nerwowym, przy czym są one szczególnie użyteczne w leczeniu choroby Alzheimera i innych postaci otępienia, bólu (jako środek przeciwbólowy podawany dordzeniowo) i bólów głowy. Ponadto, związki te mogą zapewniać cytoochronę w przypadku zaburzeń związanych z trzewnym przepływem krwi, w tym marskości, żylaków przełyku i pewnych przypadków zatrucia grzybami.

Związki te można podawać ssakom, np. ludziom, w dawce 0,01 - 50, korzystnie 0,1 - 5 mg/kg/ /dzień.

Związkom wytwarzanym sposobem według wynalazku można nadawać postać środków farmaceutycznych, zawierających nowy związek jako substancję czynną i farmakologicznie dopuszczalny nośnik, takich jak pigułki, tabletki, kapsułki, lub preparaty ciekłe do podawania doustnego, kremy, żele, płyny, preparaty do rozpylania lub maście w przypadku stosowania na skórę pacjenta, preparaty ciekłe, które można podawać w postaci kropel lub w postaci rozpylonej do nosa, albo preparaty ciekłe przeznaczone do podawania dożylnego, podskórnego, pozajelitowego lub śródotrzewnowego. Środki lecznicze mogą mieć też postać olejowej emulsji lub dyspersji zawierającej lipofilową sól, taką jak sól kwasu embonowego, albo postać ulegającego degradacji biologicznej preparatu o stopniowym uwalnianiu substancji czynnej, przeznaczonego do podawania podskórnego lub domięśniowego. Dla uzyskania maksymalnej skuteczności pożądane jest uwalnianie rzędu zerowego. Takie uwalnianie można zapewnić, stosując pompę do wszczepiania lub pompę zewnętrzną do podawania środka leczniczego.

środki farmaceutyczne zawierające związki o wzorach 1 i 2 ewentualnie w postaci soli są środkami leczniczymi mającymi zdolność hamowania wydzielania hormonu wzrostu, naskórkowego czynnika wzrostu, insuliny, glukagonu, substancji wydzielanych przez trzustkę i układ żołądkowo-jelitowy lub substancji P, a zwłaszcza hormonu wzrostu.

Przykład. Wytwarzanie ośmiopeptydu o wzorze 2.

Pierwszy etap w procesie wytwarzania związku o wzorze 2 polega na wytworzeniu związku pośredniego, to jest t-butoksykarbonylo-D-Phe-S-metylobenzylo-Cys-Tyr-D-Trp-N ζ -benzyloksykarbonylo-Lys-Thr-S-metylobenzylo-Cys-β Nal-NH2-benzhydryloamina-żywica.

Żywicę metylobenzhydryloaminoso-polistyΓenosą (Advanced Chem-Tech, Inc.) w postaci chlorkowej umieszczono w naczyniu reakcyjnym, którym był reaktor do syntezy peptydów typu Beckman

166 570

990B, zaprogramowany dla przeprowadzenia reakcji z użyciem następujących substancji: (a) chlorek metylenu, (b) 33% roztwór kwasu trdjfluorooctowego w chlorku metylenu (2 razy po 1 i 25 min. za każdym razem), (c) chlorek metylenu, (d) etanol, (e) chlorek metylenu, (f) 10% roztwór trójetyloaminy w chloroformie.

Zobojętnioną żywicę mieszano z Boc-β Nal i dwuizopropylokarbodwuimidem (po 1,5 mmola) w chlorku metylenu przez 1 godzinę i powstały układ aminokwaś-żywica poddano obróbce stosując substancje (a) - (b) zgodnie z powyższym programem przemywania. Postępując w taki sam sposób sprzęgnięto kolejno następujące aminokwasy (1,5 mmola): Boc-S-metylobenzylo-Cys, Boc-Thr, Boc-N S-benzyloksykarbonylolizyna, Boc-D-Trp, Boc-Tyr, Boc-S-metylobenzylo-Cys, Boc-D-Phe.

Żywicę przemyto i wysuszono, po czym zmieszano ją z 4 ml anizolu i 36 ml bezwodnego fluorowodoru w 0°C i mieszano przez 45 minut. (Można również stosować tioanizol, kwas trójfluorooctowy i kwas trójfluorometanosulfonowy w stosunku 1 : 90 : 9, mieszając przez 6 h). Nadmiar fluorowodoru szybko odparowano przepuszczając strumień suchego' azotu i wytrącony wodny peptyd przemyto eterem. Surowy peptyd rozpuszczono w 800 ml 90% kwasu octowego, do którego dodano roztwór jodu (I₂) w metanolu aż do uzyskania trwałej brązowej barwy. Roztwór mieszano przez 1 godzinę, po czym rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Uzyskany olej rozpuszczono w minimalnej ilości 50% kwasu octowego i poddano elucji w kolumnie (2,5 x 100 mm) zawierającej Sephadex G-25. Frakcje zawierające główne składniki, po analizie metodą absorpcji UV i metodą chromatografii cienkowarstwowej, połączono, odparowano do małej objętości i wprowadzono do kolumny (2,5 x 50 cm) zawierającej oktadecylosilan Vydac (10 - 15 pm).

Kolumnę poddano elucji gradientowej stosując 10 - 50% roztwory acetonitrylu w 0,1% roztworze kwasu trdjfluorooctowego w wodzie. Frakcje poddano analizie metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), połączono je i otrzymano produkt o maksymalnym stopniu czystości, po czym w razie potrzeby wytworzono różne sole, np. octan lub fosforan. Po poddaniu roztworu wodnego kilkakrotnej liofilizacji otrzymano 120 mg produktu w postaci białego, puszystego proszku.

Produkt był homogeniczny, jak to stwierdzono metodami HPŁC i TLC. Analiza aminokwasów w kwaśnym hydrolizacie potwierdziła budowę ośmiopeptydu.

Związek o wzorze 1 wytworzono w sposób analogiczny do sposobu opisanego powyżej, stosując odpowiednie modyfikacje znane fachowcom.

Budowę związków o wzorach 1 i 2 potwierdziła analiza metodą spektrometrii masowej. Wyniki podano w poniższej tabeli. Należy wziąć pod uwagę, że w spektrometrze masowym następuje protonowanie związków, tak więc uzyskane wartości są o jedną jednostkę wyższe od rzeczywistej wartości .

Tabela

Związek	Widmo masowe
Obliczono	Stwierdzono
wzór 1	1097,46	1098,5
wzór 2	1143,48	1144,7

166 570

166 570

D-jBNal-Cys-TyrD-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH

Wzór 1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-pNal· NH2

Wzór 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania nowych ośmiopeptydów o wzorach 1 i 2 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że z N-terminalnym ewentualnie zabezpieczonym aminokwasem lub jego resztą sprzęga się ewentualnie zabezpieczone odpowiednie aminokwasy w kolejności zgodnej z sekwencjami we wzorach 1 i 2, po czym ewentualnie usuwa się grupę zabezpieczającą lub grupy ..aabezpiccająące i wwnntaalnie przeprowadźa się owwstały wołyy ośmiopppyyd w jgoo farmakologicznie dwptscczallą sól.

   * * *