PL160653B1 - Sposób wydzielania giberelin z zanieczyszczonych roztworów pofermentacyjnych - Google Patents

Abstract

1. Sposób wydzielania giberelin z zanieczyszczonych roztworów pofermentacyjnych przez przepuszczenie tych roztworów przez złoże anionitów z czynną grupą funkcyjną, znamienny tym, ze przez złoże anionitu przepuszcza się gibereliny w roztworze wodnoorganicznym zawierającym nie mniej niz 30% alkoholu alifatycznego o C1-C3 lub acetonu jako składnika organicznego, następnie desorbuje się ze złoża gibereliny przemywając go wodno-organtcznym roztworem o zawartości 30-60% składnika organicznego z dodatkiem powyżej 2% kwasu, z eluatu wydziela się gibereliny w znany sposób, zaś zanieczyszczenia desorbuje się ze złoża wodnym lub wodnoorganicznym roztworem substancji alkalicznych.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania giberelin z zanieczyszczonych roztworów pofermentacyjnych, zwłaszcza gibereliny A-3.

Gibereliny, zwłaszcza kwas giberelinowy A-3, są stosowane coraz szerzej w rolnictwie jako stymulatory wzrostu jak również rozwoju roślin przy odpowiednich warunkach agrotechnicznych.

Po zakończeniu fermentacji i odsączeniu biomasy, gibereliny znajdują się w klarownym roztworze wodnym zwanym bulionem. W bulionie gibereliny występują w niewielkich stężeniach rzędu 0,03-0,05% stąd duże trudności w ich wydzieleniu i często duże straty w kolejnych operacjach do uzyskania gotowego produktu.

Jedną z metod wydzielania giberelin z bulionu jest ekstrakcja alkoholem n-butylowym. Metoda ta wymaga użycia bardzo dużych ilości rozpuszczalnika i jest mało wydajna. Z polskiego opisu patentowego nr 126043 znany jest sposób wydzielania giberelin, który polega na tym, ze gibereliny wydziela się z bulionu po biosyntezie przepuszczając go przez kolumny wypełnione niejonową 1 niepolarną lub średniopolarną żywicą adsorpcyjną. Zasorbowane na żywicy gibereliny poddawane są następnie selektywnej desorpcji za pomocą wodnych roztworów acetonu, metanolu lub etanolu.

Na podstwie znanej ogólnie metody wychwytywania substancji kwaśnych na anionitach opracowano również sposób wydzielania giberelin z bulionu przy użyciu wymieniaczy jonowych. Jednakże metoda stosująca wymieniacze anionowe do wydzielania giberelin z roztworu wodnego cechuje się wydajnością z reguły nie większą niż 60-70%. Jest to spowodowane znacznym stopniem rozkładu giberelin na czynnych grupach żywic amonitowych. Następuje pękanie pierścienia laktonowego giberelin, co powoduje całkowitą dezaktywcję biologiczną cząsteczki.

Po szeregu operacjach uzyskuje się przeważnie rozcieńczone wodno-organiczne roztwory zawierające gibereliny w ilości do 0,3%, które odzyskuje się podczas dalszego przerobu polegającego na oddestylowaniu rozpuszczalnika organicznego i wydzieleniu giberelin z zatężonego roztworu wodnego znanym sposobem, np. przez ekstrakcję. W procesie długotrwałego odparowywania rozpuszczalnika następuje jednak znaczny rozkład giberelin wynoszący 20-25%.

Nieoczekiwanie okazało się, ze można wyeliminować niekorzstne operacje powodujące rozkład giberelin, jeżeli zastosuje się sposób według wynalazku. Polega on na tym, ze przez złoze amonitu z czynną grupą funkcyjną przepuszcza się gibereliny w roztworze wodno-organicznym

160 653 zawierającym nie mniej niż 30% alkoholu alifatycznego C1-C3 lub acetonu jako skłdnika organicznego. W sposobie według wynalazku stwierdzono nieoczekiwanie, że destrukcyjne działanie czynnych amonitowych grup na gibereliny w roztworze zawierającym co najmniej 30% rozpuszczalnika organicznego, jak rozpuszczalne w wodzie alkohole czy aceton, jest praktycznie całkowicie zahamowane.

Stosowane w sposobie według wynalazku wodno-organiczne roztwory giberelin wytworzone z bulionu bądź będące produktami pośrednimi w innych metodach lub też ekstraktem wodnoorganicznym zawierają z reguły bardzo duże ilości substancji smolistych i barwnych, które w dużym stopniu przeszkadzają w dalszym przerobie zmniejszając krystalizację giberelin, co zmniejsza również wydajność końcową wydzielania. Stwierdzono jednak, że stosowane w sposobie według wynalazku anionity sorbują z roztworów tylko nieznaczne ilości zanieczyszczeń. Stwierdzono również, ze sorpcja substancji barwnych i smolistych z roztworów zmniejsza się bardzo w miarę wzrostu w nich ilości składnika organicznego. Korzystnie jeżeli stosuje się w procesie sorpcj i roztwór wodno-organiczny giberelin o zawartości 60-90% składnika organicznego. Po przepuszczeniu przez kolumnę anionitową odpowiedniej ilości roztworów, gwarantującej pełne wychwycenie giberelin oraz wykorzystanie pełnej pojemności sorpcyjnej, przeprowadza się selektywną desorpcję. W tym celu anionit obsadzony giberelinami i zanieczyszczeniami, przemywa się wodnoorganicznym roztworem substancji kwaśnych o zawartości 30-60% składnika organicznego i dodatkiem powyżej 2% kwasu, korzystnie kwasu siarkowego, solnego, fosforowego lub octowego. Ta operacja powoduje całkowitą desorpcję giberelin z niewielką ilością zanieczyszczeń. Po desorpcji giberelin przeprowadza się desorpcję substancji smolistych, równocześnie regenerując sorbent.

Desorpcję zanieczyszczeń przeprowadza się wodnym lub wodno-organicznym roztworem substancji alkalicznych, a następnie jonit przemywa wodą lub czystym roztworem wodnoorganicznym, do odmycia anionitu od substancji alkalicznych. Gebereliny wydziela się z kwaśnego eluatu wodno-organicznego znanym sposobem bez konieczności odparowywania rozpuszczalnika, korzystnie przez rozcieńczenie wodą i ekstrakcje octanem etylu. Sposób ten dzięki znacznemu zagęszczeniu pierwotnych roztworów giberelin i wyeliminowaniu konieczności długotrwałego odparowywania rozpuszczalników organicznych, pozwala na podwyższenie wydajności wydzielania do około 90-96% w stosunku do ilości giberelin, która znajdowała się w bulionie.

Przykład I. W przykładzie użyto roztwór wodno-metanolowy o zawartości 78% metnaolu i 0,29% kwasu giberelinowego, uzyskany w wyniku przepuszczania bulionu przez złoze sorbentu niejonowego i desorpcji giberelin roztworem wodno-metanolowym. Roztwór ten przepuszczano przez układ trzech kolumn pracujących szeregowo, od momentu gdy po kolumnie pracującej jako pierwsza, stężenie kwasu gibereliny A-3 wynosiło około 2/3 stężenia wyjściowego. Wyciek z kolumny pierwszej kierowany był na kolumnę drugą a z drugiej na trzecią. Kolumny wypełnione były silnie zasadową żywicą anionowymienną o st rukturze makroporowatej w formie wodorotlenowej (czynne grupy funkcyjne) o nazwie handlowej Amberlit IRA-910. Przez kolumny przepuszczono ogółem 25 objętości rotworu, licząc na objętość sorbentu w jednej kolumnie. Po zakończeniu sorpcji, kolumnę pracującą jako pierwsza odłączono i przemyto 1 objętością 60% roztworu metanolu Następnie prowadzono desorpcję giberelin w sposób następujący. Na kolumnę dozowano 45% wodny roztwór metanolu i 4% HC1. Frakcję główną giberelinową rozpoczęto odbierać z chwilą ukazania się wycieku kwaśnego (pH 4,3). Frakcji głównej odebrano 1,5 objętości. Po zdesorbowaniu całej ilości giberelin (co określano znaną metodą analityczną) przeprowadzono desorpcję substancji smolistych. W tym celu przez kolumnę przepuszczono 1,5 objętości 45% wodnego roztworu metanolu, po czym 1 objętość wody, a następnie 2 objętości 4% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego Ilość ta odmyła całkowicie substancje smoliste. Następnie amonit przemyto wodą do pH wycieku 9,3. Uzyskany eluat kwaśny zawierał 2,7% giberelin 1 około 49% metanolu. Eluat ten rozcieńczono wodą w stosunku 2:1 1 zalkalizowano do pH 4,5, po czym przeprowadzono czterokrotną ekstrakcję octanem etylu w ilości 1:1. Frakcję octanową zlano razem 1 osuszono bezwodnym siarczanem sodowym Następnie część octanu odparowano, pod zmniejszonym ciśnieniem do momentu ukazania się pierwszych kryształów gibereliny A-3. Po oddzieleniu wydzielonych kiyształów uzyskano produkt z wydajnością 93,5%.

Przykład II. Roztwór metanolowo-wodny o zawartości 55% metanolu i około 0,21% gibereliny A-3 przepuszczano przez układ dwóch kolumn wypełnionych żywicą anionowymienną o

160 653 nazwie handlowej Amberlit IRA-47 w formie wodorotlenowej. Jest to anionit żelowy, słabo zasadowy. Roztwór przepuszczano przez sorbent do chwili ukazania się w wycieku po kolumnie drugiej śladowych ilości giberelin. Ogółem przez kolumnę przepuszczono 28 objętości roztworu w stosunku do objętości sorbenta w jednej kolumnie. Następnie wykonano desorpcję giberelin w sposób następujący. Na złoże anionitu dozowano wodny roztwór zawierający 35% metanolu oraz 3% kwasu siarkowego. Z chwilą ukazania się kwaśnego wycieku o pH 4,5 rozpoczęto odbierać główną frakcję eluatów giberelinowych. Po odebraniu 1,6 objętości eluatów w wycieku nie stwierdzono giberelin. Następnie sorbent w kolumnie przemyto 1 objętością 30% wodnego roztworu metanolu, po czym dozowano taki sam roztwór z dodatkiem 4% wodorotlenku potasu. Roztwór ten dozowano do momentu gdy wyciek był lekko zabarwiony na kolor żółty. Następnie kolumnę przemyto czystym roztworem wodno-metanolowym o zawartości 59% metanolu w ilości 2 objętości. Uzyskany kwaśny eluat przerabiano podobnie jak w przykładzie I, uzyskując produkt z wydajnością 92,9%.

Przykład III. W przykładzie użyto roztwór acetonowo-wodny o zawartości 42% acetonu i około 0,35% gibereliny A-3. Roztwór przepuszczano przez kolumnę wypełnioną żywicą anionowymienną o nazwie handlowej Wofatyt AD-41 w formie wodorotlenowej. Jest to anionit słabo zasadowy, mikroporowaty. Przez kolumnę przeuszczono 10 objętości roztworu licząc na objętość sorbentu. Desorpcję przeprowadzano w sposób następujący. Sorbent przemyto jedną objętością wody w celu częściowego odmycia acetonu. Następnie przez kolumnę przepuszczono 30% wodny roztwór acetonu z 6% kwasu ortofosforowego. Do pełnej desorpcji użyto 2 objętości tego roztworu. Następnie złoże przemyto 4% wodnym roztworem NaOH do całkowitego odmycia zanieczyszczeń, następnie wodą do pH około 8.5. Postępując dalej jak w przykładzie I uzyskano produkt z wydajnością 95,6%.

Przykład IV. W przykładzie użyto roztwór etanolowo-wodny o zawartości 73% etanolu i 0,31% gibereliny A-3. Roztwór przepuszczano przez dwie kolumny wypełnione anionitem słabo zasadowym w formie OH o nazwie handlowej Amberlit IRA-93; jest to anionit makroporowaty. Do momentu śladowego przebicia złoża w kolumnie drugiej przez układ przeuszczono 21 objętości roztworu. Desporcję przeprowadzano w sposób następujący. Po osiągnięciu przecibia jonitu, sorbent w kolumnie pierwszej przemyto jedną objętością 59% wodnego roztworu etanolu i następnie dozowano 30% wodny roztwór etanolu zawierający 2,5% kwasu solnego. Po ukazaniu się kwaśnego wycieku rozpoczęto odbierać frakcję główną giberelinową. Do całkowitej desorpcji geberelin odebrano 1,5 objętości eluatów. Następnie złoże przemyto 1 objętością 30% etanolu i 1 objętością wody. Po czym przeprowadzono desorpcję substancji smolistych i równoczesną regeneracją grup funkcyjnych sorbenta, przepuszczając przez złoże 3 objętości 3% wodnego roztworu NaOH. Następnie przepuszczono wodę do odmycia - do pH 8,5. Ogółem uzyskano 1,5 objętości eluatów kwaśnych zawierających 45% etanolu i 0,31% giberelin. Eluat ten rozcieńczono wodą destylowaną w stosunku 3:1 i bez odparowywania rozpuszczalnika prowadzono dalszy przerób znanym sposobem. Uzyskano czystą gibereliną A-3 z wydajnością 96%.

Przykład V. W przykładzie użyto silnie zanieczyszcony roztwór metanolowo-wodny o zawartości 81% metanolu 10,24% giberelin. Roztwór ten przeuszczano przez układ trzech kolumn pracujących szeregowo, wypełnionych Amberlitem IRA-47 w formie wodorotlenowej. Roztwór przepuszczano do chwili osiągnięcia pełnego przebicia sorbentu po kolumnie pierwszej. Stan przebicia uzyskano po przepuszczeniu przez układ 35 objętości roztworu. Po osiągnięciu przebicia zasorbowane w kolumnie pierwszej gibereliny poddano desorpcji. Desorpcję przeprowadzono w sposób następujący. Przez sorbent w kolumnie przepuszczono 2,5 objętości eluenta składającego się z 45% metanolu, 5% kwasu octoego i 50% wody. Po przepuszczeniu tego roztworu na kolumnę dozowano 40% roztwór metanolu bez kwasu. Główny eluat giberelinowy rozpoczęto odbierać z chwilą ukazania się wycieku o pH 4,8. Po odebraniu 2 objętości eluatów natąpiła całkowita desorpcja giberelin. Sorbent w kolumnie przemyto 1 objętością wody, po czym desorbowano substancje smoliste i przeprowadzono regenerację sorbentu podobnie jak w przykładzie IV. Uzyskano produkt z wydajnością 97,3%.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania giberelin z zanieczyszczonych roztworów pofermentacyjnych przez przepuszczenie tych roztworów przez złoże anionitów z czynną grupą funkcyjną, znamienny tym, że przez złoże anionitu przepuszcza się gibereliny w roztworze wodnoorganicznym zawierającym nie mniej niz 30% alkoholu alifatycznego o C1-C3 lub acetonu jako skłdnika organicznego, następnie desorbuje się ze złoża gibereliny przemywając go wodno-organicznym roztworem o zawartości 30-60% składnika organicznego z dodatkiem powyżej 2% kwasu, z eluatu wydziela się gibereliny w znany sposób, zaś zanieczyszczenia desorbuje się ze złoża wodnym lub wodno-organicznym roztworem substancji alkalicznych.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze w procesie sorpcji stosuje się roztwór wodnoorganiczny o zawartości 60-90% składnika organicznego.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie desorpcji stosuje się kwas siarkowy, solny, fosforowy lub octowy.
4. 4 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gibereliny wydziela się z eluatu przez rozcieńczenie wodą 1 ekstrakcję octanem etylu.