PL153296B1 - Sposób produkcji koncentratu mezofilnych bakterii mlekowych - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 153 296

POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 87 11 20 (P. 268919)

Pierwszeństwo-Zgłoszenie ogłoszono: 89 05 30

Opis patentowy opublikowano: 1991 09 30

Int. Cl.⁵ C12N 1/21

Twórcy wynalazku: Leonard Kalinowski, Stanisław Sobczak, Janusz Bukowiński, Danuta Kikolska, Andrzej Grzempczyński

Uprawniony z patentu: Instytut Mleczarstwa,

Warszawa (Polska)

Sposób produkcji koncentratu mezofilnych bakterii mlekowych

Przedmiotem wynalazku jest sposób produkcji w skali przemysłowej koncentratu mezofilnych bakterii mlekowych, przeznaczonego do wytwarzania zakwasu do produkcji serów dojrzewających, serów twarogowych oraz masła.

Dotychczas w przemyśle mleczarskim w Polsce do produkcji zakwasów stosuje się szczepionki płynne, względnie suszone sublimacyjnie koncentraty bakterii mlekowych. Znane są ponadto mrożone koncentraty bakterii mlekowych.

Używanie szczepionek płynnych związane jest z koniecznością wielokrotnego pasażowania, co jest uciążliwe i pociąga za sobą niebezpieczeństwo zakażeń oraz zmiany składu szczepów, wpływające ujemnie na jakość produktów.

Z patentu polskiego nr 130796 znana jest pożywka do produkcji koncentratów mezofilnych bakterii mlekowych. Składa się ona z 70,0-80,0 g/1 mleka odtłuszczonego w proszku, 1,0-2,0 g/1 ekstraktu drożdżowego, 3,0-5,0 g/1 glukozy, 2,0-3,0 g/1 cytrynianu sodu, 0,10-0,15 g/1 siarczanu manganowego, 0,10-0,15 g/1 siarczanu magnezowego, 0,10-0,15 g/1 siarczanu cynkowego oraz wody w ilości uzupełniającej do objętości 11. Pożywkę tę zaszczepia się inoculum i prowadzi hodowlę w stałej temperaturze 27°C do momentu osiągnięcia pH 5,0. Następnie włącza się układ neutralizacji i prowadzi dalej hodowlę na stałym poziomie pH 6,4-6,6. Po ukończeniu hodowli dodaje się jałowy 18% roztwór laktozy. Następnie schłodzoną, namnożoną biomasę rozlewa się do butelek, zamraża i suszy sublimacyjnie.

Suszone koncentraty są trwałe, nie ulegają zmianom w czasie transportu i mogą być dodawane bezpośrednio do mleka przeznaczonego na zakwas. Wykazują jednak mankamenty, które zniechęcają niektóre zakłady do ich stosowania. Należą do nich znacznie przedłużona faza spoczynkowa, w czasie której możliwy jest rozwój mikroflory zakażającej, oraz zawężony zakres temperatur hodowli. Szczepy rozwijają się z zadawalającą szybkością tylko w temperaturze optymalnej, która dla mezofilnych bakterii mlekowych wynosi 30°C, natomiast obniżenie temperatury hodowli, co często ma miejsce w praktyce, zwalnia znacznie proces ukwaszania mleka tak, że w pewnych przypadkach zakwas nie jest jeszcze gotowy w momencie gdy trzeba uruchamiać produkcję serów.

153 296

Koncentraty zagęszczone mrożone nie mają tych mankamentów, jakie wykazują szczepionki płynne i koncentraty suszone sublimacyjnie. W niektórych krajach zachodnich produkowane są mrożone koncentraty bakterii mlekowych, jednak sposób ich wytwarzania stanowi tajemnicę produkcji.

Z patentu polskiego nr 75 735 znany jest sposób otrzymywania zamrożonych koncentratów bakterii fermentacji mlekowej. Bakterie namnaża się w hodowli statycznej lub ciągłej w podłożu serwatkowo-peptonowym lub mlecznym, po czym zobojętnia się podłoże 10% NaOH, schładza do temperatury 4°C i odwirowuje. Zebrany plon biomasy miesza się z medium ochronnym w postaci chudego jałowego mleka, w takiej proporcji, by gęstość zawiesiny nie przekraczała 1(01 komórek w 1 g, a następnie zamraża się w temperaturze -25°C, przy szybkości zamrażania 0,18-0,3 3°C/minutę.

Technologia przewiduje hodowlę pojedynczych szczepów bakterii fermentacji mlekowej i łączenie w szczepionki uzyskanych koncentratów. Taki sposób postępowania zmusza do równoległego prowadzenia hodowli wszystkich szczepów wchodzących w skład szczepionki, co pociąga za sobą konieczność zainstalowania kilku fermentorów albo dolewania przez szereg dni do jednostkowych opakowań kolejnych koncentratów monokultury. Bardzo komplikuje to dozowanie, prowadząc do zakażeń i do obniżenia aktywności bakterii spowodowane znacznymi wahaniami temperatury. Trawałość tych koncentratów jest niezadawalająca, zwłaszcza przy dodatkowych zmianach temperatur w czasie transportu do zakładów mleczarskich. Sposób ten opracowany w warunkach laboratoryjnych nie nadaje się do zastosowania w produkcji na skalę przemysłową.

Celem wynalazku jest opracowanie technologii przemysłowego wytwarzania gotowych zestawów szczepowych dla otrzymywania trwałego koncentratu mezofilnych bakterii mlekowych. Cel ten osiągnięto przez opracowanie sposobu produkcji koncentratu zawierającego bakterie gatunku Streptococcus lactis, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus cremoris oraz ewentualnie Lactobacillus casei, poprzez ich inkubację w odtłuszczonym podłożu mlecznym z dodatkiem ekstraktu i/lub autolizatu drożdżowego i hodowlę w podłożu zawierającym 1,5-2,0% laktozy pochodzącej z serwatki, hydrolizat białka, źródła witamin B oraz cytrynian sodu, następnie schładzanie poniżej 12°C, neutralizację do wartości pH około 6,8, odwirowanie i zamrożenie.

Istota wynalazku polega na tym, że inkubację mieszaniny bakterii prowadzi się w temperaturze 26-30°C w wodnym roztworze mleka w proszku, mającym 9-11% zawartości suchej masy, aż do uzyskania kwasowości 10-12°SH. Hodowlę mieszaniny bakterii prowadzi się na podłożu hodowlanym będącym wodnym roztworem serwatki wzbogaconym dodatkowo o ekstrakt i/lub autolizat drożdżowy w ilości do 1%, aminobak i/lub peptobak i/lub mleko enzymatyczne hydrolizowane w ilości do 1%, do którego to podłoża dodaje się szczepionkę zapewniającą wyjściową zawartość pojedynczych komórek bakteryjnych na poziomie 10⁷ w cm³ i prowadzi się tę hodowlę do uzyskania zawartości pojedynczych komórek do 108 -10⁹ w cm3. Następnie dodaje się w ilości 10% do podłoża hodowlanego i dalej prowadzi hodowlę do momentu zmniejszenia się szybkości rozwoju w eksponencjalnej fazie wzrostu populacji w każdej z wymienionych grup bakterii. Tak wyhodowaną biomasę schładza się do temperatury korzystnie 4°C, neutralizuje się 20% roztworem wodorotlenku sodu lub wodorotlenkiem amonu, po czym biomasę odwirowuje się w obiegu zamkniętym przy przeciążeniu nie mniejszym niż G = 4000, a po zawieszeniu w czynniku kriochronnym porcjuje się i zamraża z szybkością powyżej 5°C/min do temeperatury poniżej -70°C i zależnie od potrzeby suszy się sublimacyjnie.

Szczepionki stanowiące inokulum do produkcji koncentratów składają się z różnych wybranych szczepów mezofilnych paciorkowców mlecznych gatunku Streptococcus lactis, Streptococcus diacetilactis i Streptococcus cremoris z przewagą Streptococcus lactis w różnych proporcjach międzygatunkowych i biotypach w obrębie jednego gatunku. Szczepionka użyta do produkcji koncentratu składa się ze szczepów Streptococcus lactis, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus cremoris i Lactobacillus casei.

Szczepionki stanowiące inokulum do wytwarzania koncentratów wytypowano po przeprowadzeniu licznych badań. Badano ich wrażliwość na fagi określoną stosunkiem ilości fagów lizujących szczepionkę do ilości użytych typów fagów. Wrażliwość ta wynosiła od 0/27 do 2/27, przy czym żaden z fagów stosowanych do testu nie działał na więcej niż jedną szczepionkę. Zdolność wytwarzania kwasu mlekowego po 24 godzinnej hodowli w mleku g (100 ciń) wynosiła od 0,653 do 0,720. Wszystkie szczepionki charakteryzują się 100% przeżywalnością po zamrożeniu,

153 296 średnią zdolnością aromatotwórczą (próba VP), całkowitą stabilnością cech po 3 miesiącach przechowywania w temperaturze -25°C i wysoką zdolnością proteolityczną. Badano również statystyczny współczynnik zmienności zdolności kwaszących w czasie 14-krotnego pasażowania (współczynnik ten winien być nie większy od 1,20 X 10-³ do 3,15 X 10”³.

Przy produkcji koncentratu sposobem według wynalazku, szczepionkę korzystnie w formie mrożonego koncentratu, aktywizuje się poprzez inkubację w odtłuszczonym podłożu mlecznym z dodatkiem ekstraktu i/lub autolizatu drożdżowego i/lub wody drożdżowej. Proces prowadzi się przez 2-3 godziny, do uzyskania kwasowości 10-12°SH. Podłoże użyte do inkubacji szczepionki wytwarza się poprzez rozpuszczenie w wodzie odtłuszczonego mleka w proszku w ilości zapewniającej 9-11% zawartość suchej masy w podłożu. Tak zaktywizowaną szczepionką przenosi się w ilości zapewniającej wyjściową zawartość pojedynczych komórek bakteryjnych na poziomie 10⁷ w cm³ do fermentora, w którym prowadzi się proces hodowli. Proces ten prowadzi się najkorzystniej na podłożu, w którym źródło laktozy stanowi rozcieńczona wodą serwatka. Podłoże to jest wzbogacone dodatkiem do 1% ekstraktu i/lub autolizatu drożdżowego, do 1% aminobaku i/lub peptobaku i/lub mleka enzymatycznie hydrolizowanego oraz do 1% cytrynianu sodu. Proces prowadzi się aż do momentu zmniejszania się szybkości rozwoju w eksponencjalnej fazie wzrostu populacji. W przypadku prowadzenia hodowli na większą skalę, po uzyskaniu w fermentorze zawartości pojedynczych komórek 10⁸-10⁹ w cm³, uzyskany zakwas doddaje się w ilości ok. 10% do opisanego wyżej podłoża serwatkowego i dalej prowadzi się hodowlę stacjonarną. Wyhodowaną biomasę po schłodzeniu neutralizuje się 20% roztworem wodorotlenku sodu lub wodorotlenku amonu i odwirowuje w obiegu zamkniętym przy przeciążeniu korzystnie G = 4200, po czym płucze się ją w mieszaninie buforowej o pH 6,8., korzystnie według Sórensena, ponownie odwirowuje, miesza z czynnikiem kiroochronnym i zamraża.

Zamrożony koncentrat poddaje się suszeniu sublimacyjnemu, lub przechowuje się w stanie zamrożonym w temperaturze poniżej -25°C.

Sposób według wynalazku ilustrują niżej podane przykłady nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Zagęszczoną zamrożoną szczepionkę bakteryjną dodano w ilości zapewniającej 108 komórek w 1 cm³ do podłoża mlecznego zawierającego 9% suchej masy, wzbogacanego 0,3% dodatkiem ekstraktu drożdżowego. Aktywizację prowadzono przez 2 godz. w temp. 28°C uzyskując kwasowość 10°SH. Tak uaktywnioną szczepionkę dodano w ilości zapewniającej 10⁷ komórek w 1 cm³ do podłoża serwatkowego w mateczniku. Podłoże to składało się z rozcieńczonej wodą serwatki do zawartości końcowej laktozy 1,8% z dodatkiem 1% autolizatu drożdżowego, 1% aminobaku i 1% cytrynianu sodu.

Namnażanie biomasy prowadzono metodą stacjonarną w czasie 7 godz. w temp. 28°C aż do uzyskania stężenia komórek 10⁹ w 1 cm³ liczonych bezpośrednio w komorze Thoma.

Następnie biomasę przeniesiono do fermentora, w którym znajdowało się 10% zawartości podłoża serwatkowego o wyżej podanym składzie. Prowadzono hodowlę przez 9 godz. (stacjonarną) do momentu zmniejszania szybkości przyrostu bakterii mierzonego metodą nefelometryczną. Wartość ta wynosiła 0,825 (z uwzględnieniem wartości tła hodowli określonego bezpośrednio po zaszczepieniu). Następnie zawartość fermentora schłodzono do temp. 10°C i zneutralizowano 20% roztworem NaOH do wartości pH 6,8 i odwirowano w separatorze w G — 4200 w obiegu zamkniętym.

Zebrany plon biomasy po wypłukaniu w buforze Sórensena i po określeniu liczby pojedynczych komórek w komorze Thoma rozcieńczono jałowym, odtłuszczonym mlekiem zregenerowanym z proszku do wartości 0,51 X 10¹¹ pojedynczych komórek bakteryjnych w 1 cm³. Otrzymany koncentrat porcjowano, częściowo po 50 cm³, częściowo po 500 cm³ i zamarażano do temperatury -70°C przy szybkości zamrażania 8°C/min. Po zamrożeniu ilość pojedynczych bakterii w cm³ wynosiła 0,7 · 10”.

Wytworzony koncentrat w opakowaniach po 50 cm³ służy do produkcji zakwasu roboczego w zakładach przetwórstwa mleczarskiego. Przy użyciu jednej porcji można wyprodukować przykładowo 3 tony sera edamskiego.

Wytworzony koncentrat w opakowaniach po 500 cm³ służy także do bezpośredniego zakwaszania 5000 dm³ mleka w wannie serowarskiej. W tym przypadkuprzy użyciu jednego opakowania można wyprodukować 0,5 tony sera edamskiego.

153 296

Przykład II. Zagęszczoną zamrożoną szczepionkę bakteryjną dodano w ilości zapewniającej 10⁸ komórek w lcm³ do podłoża mlecznego zawierającego 9% suchej masy, wzbogaconego 0,5% dodatkiem ekstraktu drożdżowego. Aktywizację prowadzono przez 3 godz. w temp. 28°C uzyskując kwasowość 12°SH. Tak uaktywnioną szczepionkę dodano w ilości zapewniającej 10⁷ komórek w 1 cm³ do podłoża serwatkowego w mateczniku. Podłoże to składało się z rozcieńczonej wodą serwatki do zawartości końcowej laktozy 1,5% z dodatkiem 0,7% autolizatu drożdżowego, 0,8% aminobaku, 1% cytrynianu sodu.

Hodowlę stacjonarną prowadzono w czasie 6 godz. w temp. 28°C aż do zmniejszania szybkości przyrostu bakterii mierzonego metodą nefelometryczną. Wartość ta wynosiła 0,624 (z uwzględnieniem wartości tła hodowli określonego bezpośredniego po zaszczepieniu).

Następnie zawartość fermentora schłodzono do temp. 10°C i zneutralizowano 20% roztworu NaOH do wartości pH 6,8 i odwirowano w separatorze w G = 4200 w obiegu zamkniętym. Zebrany plon biomasy po wypłukaniu w buforze Sórensena i po określeniu liczby pojedynczych komórek w komorze Thoma rozcieńczono jałowym, odtłuszczonym mlekiem zregenerowanym z proszku do wartości 1,6· 10¹¹ pojedynczych komórek bakteryjnych w 1 cm³.

Otrzymany koncentrat porcjowano, częściowo po 50 cm³, częściowo po 500 cm3 i zamrażano do temperatury -70°C przy szybkości zamrażania 8°C/min. Po zamrożeniu ilość pojedynczych komórek bakteryjnych wynosiła 1,4· 10”. Wytworzony koncentrat w opakowaniach po 50 cm³ służy do produkcji zakwasu roboczego w zakładach przetwórstwa mlecznego. Przy użyciu jednej porcji 50 cm³ można wyprodukować przykładowo 3 tony sera tylżyckiego. Wytworzony koncentrat w opakowaniach po 500 cm³ służy do bezpośredniego zakwaszania 5000 dm³ mleka w wannie serowarskiej. Przy użyciu jednego opakowania wyprodukowano przykładowo 0,5 tony sera tylżyckiego.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób produkcji koncentratu mezofilnych bakterii mlekowych zawierającego bakterie gatunku Streptococcus lactis, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus cremoris oraz ewentualnie Lactobacillus casei, poprzez ich inkubację w odtłuszczonym podłożu mlecznym z dodatkiem ekstraktu i/lub autolizatu drożdżowego i hodowlę w podłożu zawierającym 1,5-2,0% laktozy pochodzącej z serwatki, hydrolizat białka, źródła witamin B oraz cytrynian sodu, następnie schłodzenie poniżej 12°C, neutralizację do wartości pH około 6,8, odwirowanie i zamrożenie, znamienny tym, że inkubację mieszaniny bakterii prowadzi się w temperaturze 26-30°C w wodnym roztworze mleka w proszku mającym 9-11% zawartości suchej masy aż do uzyskania kwasowości 10-12°SH, a hodowlę mieszaniny bakterii prowadzi się na podłożu hodowlanym będącym wodnym roztworem serwatki wzbogaconym dodatkowo o ekstrakt i/lub autolizat drożdżowy w ilości do 1%, aminobak i/lub peptobak i/lub mleko enzymatycznie hydrolizowane w ilości do 1%, do którego to podłoża dodaje się szczepionkę zapewniającą wyjściową zawartość pojedynczych komórek bakteryjnych na poziomie 10⁷ w cm³ i prowadzi się tę hodowlę do uzyskania zawartości pojedynczych komórek do 1)8-10⁹ w cm³, następnie dodaje się w ilości 10% do podłoża hodowlanego i dalej prowadzi hodowlę do momentu zmniejszenia się szybkości rozwoju w eksponencjalnej fazie wzrostu populacji w każdej z wymienionych grup bakterii, i tak wyhodowaną biomasę schładza się do korzystnie 4°C, neutralizuje się 20% roztworem wodorotlenku sodu lub wodorotlenku amonu,po czym biomasę odwirowuje w obiegu zamkniętym przy przeciążeniu nie mniejszym niż G = 4000, a po zawieszeniu w czynniku krioochronnym porcjuje się i zamraża z szybkością powyżej 5°C/min do temperatury poniżej -70°C i zależnie od potrzeby suszy się sublimacyjnie.

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

   Cena 3000 zł