PL149290B1 - Sposób unieruchamiania enzymów - Google Patents

Description

OPIS PATENTOWY 149 290

POLSKA

RZECZPOSPOLITA

LUDOWA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 06 25 (P. 254178)

Pierwszzństwo--Int. Cl.* C12N 11/04

URZĄD

PATENTOWY

PRL

Zgłoszenie ogłoszono: 86 12 30

Opis patentowy opublikowano: 90 07 31

CZYTELNIA

Urzędu Patentowego Mue Iwwt^w r heWf

Twórcy wynalazku: Anna Wójcik, Jerzy Łobarzewski, Romuald Nasuto, Jan Fiedurek

Uprawniony z patentu: Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej,

Lublin (Polska)

Sposób unieruchamiania enzymów

Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchamiania enzymów, zwłaszcza glukoamylazy i peroksydazy przez wprowadzenie na powierzchnię żelu krzemionkowego grup aminowych i następnie wiązanie tak zmodyfikowanego nośnika z enzymem, mających duże zastosowanie w przemyśle, na przykład do otrzymywania cukrów prostych lub detoksyfikacji odpadów zawierających fenole.

Znanych jest szereg sposobów unieruchamiania enzymów, szczegółowo opisanych w literaturze /Biotechnolog and Bioengineering vol. XVII, 1975/. Można je podzielić na metody fizyczne takie jak: adsorpcje enzymów na nierozpuszczalnych w wodzie matrycach, zamykanie w sieci polimeru lub półprzepuszczalnej matrycy oraz metody chemiczne polegające na utworzeniu wiązania kowalencyjnego pomiędzy enzymem a nierozpuszczalną matrycą lub sieciowanie cząsteczki enzymu odpowiednimi związkami dwufunkcyjnymi aż do osiągnięcia związku wielkocząsteczkowego, nierozpuszczalnego w wodzie. Spośród tych metod szczególnie efektywne okazały się metody chemiczne zapewniające stabilność układów, stanowiącą ważną cechę w dynamicznych procesach przemysłu biotechnologicznego. Nośniki stosowane w tych metodach do unieruchamiania enzymów są to naturalne lub syntetyczne polimery organiczne, bądź materiały nieorganiczne, takie jak piasek, ziemia okrzemkowa, żel krzemionkowy, posiadające w swej strukturze ugrupowania chemiczne, umożliwiające reakcje chemiczne do wiązania typu enzym nośnik.

Metody chemiczne bazujące na materiałach nieorganicznych jako nośnikach, wykorzystują szereg sposobów wprowadzania grup funkcyjnych zdolnych do wiązania chemicznego z materiałem białkowym. Dla przykładu wymienić należy pokrywanie powierzchni nieorganicznego nośnika polimerami syntetycznymi lub naturalnymi albo silanizację powierzchni szkieł czy żeli krzemionkowych silanami posiadającymi w swej strukturze reaktywne grupy aminowe, epoksydowe lub tiolowe. W przypadku wprowadzania na powierzchnię żelu krzemionkowego grup aminowych, stosuje się silanizację za pomocą aminopropylotrójetoksysilanu lub innych czynników sililujących zawierających jako grupę funkcyjną — grupę aminową. Innym sposobem wprowadzania grup aminowych jest pokrywanie żelu krzemionkowego warstwą polimeru /z roztwora/ zawierającego

149 290 grupy aminowe, jak na przykład kreatyna, poliamidy. Zmodyfikowany nośnik poddaje się następnie reakcji wiązania z enzymem. Do niedogodności opisanych sposobów wprowadzania grup aminowych na powierzchnię żelu krzemionkowego należą w pierwszym przypadku wysoka cena y-aminopropylotrójetoksysilanu lub jego odpowiedników oraz to, że odczynniki te nie są produkowane w kraju, a w drugim przypadku zmiana struktury porowatej modyfikowanego żelu w stosunku do wyjściowego.

Ze znanych sposobów unieruchamiania enzymów, takich zwłaszcza jak glukoamylaza i peroksydaza wymienić jeszcze należy sposób polegający na roztwarzaniu surowca poliamidowego w kwasie, modyfikację tak otrzymanego sorbentu przez przyłączenie dwufunkcyjnych związków organicznych, a następnie inkubację produktu z roztworem buforowym enzymu. Sposób ten znany jest z opisu patentowego PRL nr 139222.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie unieruchamiania enzymów przez zastosowanie jako nośników żeli krzemionkowych modyfikowanych chemicznie przez przyłączenie związków alifatycznych o regulowanej długości łańcucha, zakończonych grupą aminową, drogą prostych operacji z łatwo dostępnych surowców. Podany efekt osiągnięto sposobem według wynalazku, zastępując silanizację jako etap aktywacji nośników krzemionkowych, wprowadzający na ich powierzchnię reaktywne grupy aminowe, dwuetapowym procesem najpierw chlorowania powierzchni żelu, a następnie aminację.

Sposób według wynalazku polega na tym, że odwodniony żel krzemionkowy aktywuje się i poddaje reakcji z chlorkiem boru, chlorkiem tionylu lub czterochlorkiem krzemu, przy czym proces prowadzi się bez dostępu wilgoci powietrza i w podwyższonej temperaturze przez 0,2-2 godziny w przypadku chlorku boru i czterochlorku krzemu, a w przypadku chlorku tionylu przez 2-4 godziny w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika, a następnie modyfikuje się przez przyłączenie dwuamin alifatycznych o ilości atomów węgla w łańcuchu alifatycznym od 2 do 10, przy czym reakcję prowadzi się bez dostępu wilgoci powietrza w temperaturze 60-100°C przez 2-4 godziny, a następnie przyłącza się enzymy przez związanie grupy aminowej nośnika i enzymu znanymi metodami.

Modyfikatorami schlorowanej powierzchni żelu są dwuaminy alifatyczne o ogólnym wzorze NH₂ — /CHa/n — NH2, gdzie n = 2-10.

Immobilizowane według wynalazku enzymy nie tracą aktywności podczas 15-dniowego okresu ich przechowywania. Mogą one być w tym czasie wielokrotnie używane, wykazując niezmienną aktywność biokatalityczną. Przez to mogą być stosowane w procesach biotechnologicznych. W przypadku enzymu glukoamylazy, substrat tego enzymu — skrobia, może ulegać w ciągłym procesie zcukrzaniu prowadzącym do uwalniania znacznych ilości glukozy.

Podobnie w przypadku peroksydazy, enzym ten w postaci immobilizowanej powoduje biotransformację uciążliwych odpadów z przemysłu celulozowego, jakimi są kwasy lignosulfonowe, co w efekcie obniża ich toksyczność dla środowiska naturalnego, a ponadto może on być stosowany w innych procesach unieszkodliwiania związków fenolowych lub fenolokwasów.

Przykład I. 3g granulowanego żelu krzemionkowego, szerokoporowatego, o wielkości ziarna 0,1-0,5 mm i średniej szerokości porów 500 A aktywowano pod próżnią w temperaturze 200°C przez 4 godziny, po czym poddano reakcji z gazowym BCI3 wprowadzając reagent pod ciśnieniem do naczynia z żelem krzemionkowym przez 10 minut, a następnie ogrzewano ż.el w zamkniętym naczyniu w temperaturze 50°C przez 4 godziny. Po tym czasie nieprzereagowany BCI3 odgotowywano pod próżnią w temperaturze 100°C i otrzymano sorbent zawierający 25 mg jonów chlorkowych na gram żelu. Schlorowany żel poddano reakcji z etylenodwuaminą w roztworze benzenowym /50% roztwór dwuaminy w bezwodnym benzenie/ w temperaturze wrzenia rozpuszczalników przez 2 godziny. Po tym czasie produkt odsączano, przemyto benzenem i po wysuszeniu także metanolem oraz wodą.

Otrzymany produkt . zawierał 10 mg wolnych grup aminowych na 1 g nośnika. Tak przygotowany sorbent w ilości 1 g mieszano przez 25 minut z 15 ml 12,5% aldehydu glutarowego w 0,2 N NaHCOe o pH = 9,0. Po tym czasie aktywowany sorbent krzemionkowy przemywano 70 ml 0,05 M buforu fosforanowego o pH = 8 przez 15 minut. Następnie sorbent mieszano z 0,03 g preparatu glukoamylazy otrzymanego z Aspergillus niger C i rozpuszczonego w 15 ml 0,05 M buforu fosfora149 290 nowego o pH=8. Mieszaninę tę pozostawiono w temperaturze 4°C na 60 godzin, w celu połączenia enzymu z nośnikiem, a następnie roztwór odsączano, zaś nośnik przemywano 70 ml 0,05 M buforu fosforanowego o . pH=8. Otrzymany preparat immobilizowanej glukoamylazy zawierał 14,4 mg białka na gram nośnika i wykazywał aktywność enzymatyczną wobec 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej jako substratu, 18 jednostek międzynarodowych na gram nośnika. Jedna jednostka międzynarodowa aktywności glukoamylazy określonajestjako taka ilość enzymu, która w warunkach optymalnych uwalnia 1 miligram glukozy ze skrobi w ciągu minuty w temperaturze 45°C.

Przykład .II. Nośnik zawierający wolne grupy aminowe, otrzymany jak w przykładzie I sprzęgano z enzymem peroksydazą sposobem podanym w przykładzie I. Otrzymany preparat immobilizowanej peroksydazy zawierał 12 mg białka na .lg nośnika i wykazywał aktywność enzymatyczną wobec H2O2 i gwajakolu 0,013 jednostek aktywności na 1 g nośnika. Za jednostkę aktywności peroksydazy uznano taką ilość, która powoduje wzrost ' absorpcji przy 470 nm o 0,001 na minutę w temperaturze 22°C. Immobilizowany preparat peroksydazy przechowywany w temperaturze pokojowej zachowywał około 76% aktywności po 14 dniach.

Przykład III. Nośnik zawierający wolne grupy aminowe otrzymanyjak w przykładzie Iz tą. różnicą, że zamiast chlorku boru zastosowano czterochlorek krzemu jako odczynnik wprowadzający reaktywny chlor w ilości 3 -ml. Nośnik sprzęgano z aldehydem glutarowym, a następnie z glukoamylazą lub peroksydazą sposobem według przykładu I i II. Otrzymane preparaty zawierały 6 mg białka glukoamylazy i 4 mg białka peroksydazy na gram nośnika i wykazywały aktywność enzymatyczną odpowiednio: glukoamylaza 5 jednostek, a peroksydazą 0,01 jednostki na gram nośnika. Po 14 dniach aktywności enzymów zmieniały się nieznacznie.

Przykład IV. Nośnik zawierający wolne grupy aminowe otrzymano jak w przykładzie I, z tą różnicą, że zamiast etylenodwuaminy zastosowano sześciometylenodwuaminę /5% roztwór w bezwodnym toluenie/ w ilości 5 ml na 1g chlorowanego żelu. Otrzymany w reakcji z sześciometylenoduwaminą nośnik wykazywał zawartość 12 mg/g wolnych grup aminowych. Nośnik sprzęgano z aldehydem glutarowym, a następnie z glukoamylazą lub peroksydazą sposobem według przykładu I i II. Otrzymane preparaty zawierały 16,0 mg białka glukoamylazy i 16,0 mg białka peroksydazy na 1 g nośnika. Nośniki zawierające enzymy wykazywały aktywność odpowiednio — glukoamylaza

5,85 jednostek, a peroksydazą 41X 10³ jednostek na gram nośnika. Po 14 dniach aktywność omawianych preparatów nie zmieniała się.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób unieruchamiania enzymów przez wprowadzanie na powierzchnię żelu krzemionkowego reaktywnych grup aminowych i następnie wiązanie tak zmodyfikowanego nośnika z enzymem, znamienny tym, że odwodniony żel krzemionkowy aktywuje się i poddaje reakcji z chlorkiem boru, chlorkiem tionylu lub czterochlorkiem krzemu, przy czym proces prowadzi się bez dostępu wilgoci powietrza i w podwyższonej temperaturze przez 0,2-2 godziny w przypadku chlorku boru i czterochlorku krzemu, a w przypadku chlorku tionylu przez 2-4 godziny w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika, a następnie modyfikuje się przez przyłączanie dwuamin alifatycznych o ilości atomów węgla w łańcuchu alifatycznym od 2 do 10, przy czym reakcję prowadzi się bez dostępu wilgoci powietrza w temperaturze 60-100°C przez 2-4 godziny, a następnie przyłącza się enzymy przez związanie grupy aminowej nośnika i enzymu znanymi metodami.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikatorami schlorowanej powierzchni żelu są dwuaminy alifatyczne o ogólnym .wzorze NH2 — /CH211 — NH2, gdzie n =- 2—0.