PL103447B1 - Sposob wytwarzania nieimmunogennych,biologicznie aktywnych preparatow enzymatycznych z bialek nierozpuszczalnych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nieimmunogennych, biologicznie aktywnych preparatów enzymatycznych z bialek nierozpuszczalnych.

Znane sposoby otrzymywania hydrolizatów bialek, zawarte w opisie patentowym japonskim nr 10543 z 1973 r. i w opisie patentowym ZSRR nr 350452 z 1972 r. sprowadzaja sie do uzyskania bardzo róznorodnych produktów finalnych, które bez uzupelnien z zewnatrz pod wzgledem biologicznym scharakteryzowac nalezy jako preparaty o ograniczonych mozliwosciach zastosowan z uwagi na niepelny ilosciow aminokwasów, jak i zwiazków wysokoczasteczkowych i mineralów. Wynika to glównie z drastycznych warun¬ ków prowadzenia procesu hydrolitycznego rozkladu bialek co eliminuje powstale hydrolizaty z arsenalu srodków, które moga byc podane droga pozajelitowa, a wiec spelniajacych warunki preparatu odzywczego i krwiozastepczego. Z opisu patentowego ZSRR nr 350452, dotyczacego sposobu otrzymywania hydrolizatu bialkowego wynika, ze rozdrobnione mieso jako surowiec bialkowy zalewa sie 1,5 krotna objetoscia wody i ekstrahuje 2 godziny w autoklawie o temperaturze 393°K. Otrzymana mieszanine saczy sie na nuczy saczacej, a zebrany bulion chlodzi, odtluszcza i odparowuje na wyparce pod próznia w temperaturze 303°K- 313°K do % suchej masy. Stala pozostalosc zadaje sie 0,1 N NaOH i poddaje mieszaniu w czasie 1 godziny. Nastepnie alkaliczny roztwór bialka odsacza sie, tluszcz oddziela, a pozostala czesc stala zadaje sie 1 kg wegla aktywnego i 30 I stezonego kwasu solnego o ciezarze wlasciwym 1,19. Hydrolize prowadzi sie 6 godzin w temperaturze 373°K, po czym odparowuje nadmiar wody w temperaturze 333°K przez 4 godziny do objetosci 120 I plynu, po czym hydrolize kontynuuje sie dalej przez 4 godziny pod zwiekszonym do 2 atmosfer cisnieniem. Calosc saczy sie na nuczy saczacej, po czym hydrolizat rozdziela sie na kolumnie z zywica jonowymienna EDE-10P, doprowadzajac pH do 4,5. Dla wyklarowania hydrolizatu dodaje sie wegla aktywnego A i mieszanine saczy na nuczy. Neutralizacje hydrolizatu prowadzi sie kwasnym weglanem sodu i roztworem alkalicznym bialka. Tak przygotowany hydrolizat odparowuje sie w wyparce prózniowej przy 333° K do zawartosci 25% suchej masy, po czym miesza z otrzymanym wczesniej bulionem i odwadnia w suszarce rozpylowej, w temperaturze 363° K - 368°K do 95% suchej masy.s 2 103 447 Sposób wedlug naszego wynalazku eliminuje wady stosowanych dotychczas procesów degradacji bialek.

Bialka nierozpuszczalne zwlaszcza izolaty i koncentraty bialek zwierzecych poddaje sie dzialaniu enzymów proteolitycznych, takich jak pepsyna, trypsyna, papaina, korzystnie w malych stezeniach w roztworach wodnych i/lub w formie nierozpuszczalnych kompleksów, kowalencyjnie zwiazanych znanymi sposobami na nosnikach nierozpuszczalnych, po czym mieszanine inkubuje sie, korzystnie w temperaturze 313°K, przy stalym mieszaniu, utrzymujac jednoczesnie pH na stalym poziomie optymalnym dla dzialania enzymu i/lub enzymów, po czym hydrolize przerywa sie z chwila uzyskania korzystnie 50 mg azotu w 1 ml hydrolizatu oraz korzystnie 6 typów peptydów o zróznicowanych ciezarach czasteczkowych do 25000 i zawartosci korzystnie 1,5% wolnych amino¬ kwasów, po czym hydrolizat poddaje sie zamrazaniu z nastepnym rozmrazaniem, zobojetnia NaOH lub HO w zaleznosci od pH srodowiska, odwirowuje i/lub saczy na nuczach, po czym saczy przez filtry bakteryjne lub poddaje procesowi kontrolowanego odwodnienia znanymi sposobami do zawartosci 99% suchej substancji.

Ponizsze przyklady ilustruja sposoby wytwarzania nieimmunogennych, biologicznie aktywnych preparatów bialkowych.

Przyklad I. Do 50 g bialka zwierzecego, izolowanego z ryb i/lub organizmów morskich, dodaje sie 250 ml 0,5% pepsyny w wodnym roztworze HCI. pH roztworu równe 2 ustala sie 1 N HCI. Mieszanine utrzymuje sie w stanie ciaglego mieszania w stalej temperaturze 311°K, utrzymujac pH roztworu równe 2. Proces hydrolizy przerywa sie z chwila otrzymania w roztworze 1% wolnych aminokwasów i 5 typów peptydów oraz 42 mg azotu calkowitego w 1 ml roztworu. Po zakonczonym procesie enzymatycznej degradacji izoJatu bialka otrzymany preparat zamraza sie dwukrotnie w temperaturze 263°K, po czym rozmraza celem wytracenia bialek enzymu, który usuwa sie przez odwirowanie przy 10 tys. obrotów/min. i/lub saczy na nuczy. Hydrolizat zobojetnia sie 1 N NaOH do pH * 7 i saczy przez filtry bakteryjne z przeznaczeniem jako srodek krwiozastepczy.

Przyklad II. Do 50 g bialka zwierzecego, izolowanego z ryb i/lub organizmów morskich dodaje sie 1% pepsyny w wodnym roztworze HCI. pH mieszaniny równe 2 ustala sie 1 N HCI, po czym mieszanine inkubuje sie w temp. 313°K stale mieszajac do chwili uzyskania zawartosci azotu calkowitego 50 mg/1 ml, 1,5 g wolnych aminokwasów i 6 typów peptydów, po czym proces hydrolizy przerywa sie. Calosc po zobojetnienie do pH = 7 1N NaOH poddaje sie dwukrotnemu zamrozeniu, po czym usuwa sie wytracone bialka przez saczenie na nuczy, a nastepnie odwadnia w suszarce prózniowej w temperaturze 313° K do czasu uzyskania suchej masy 99%.

Wysokowartosciowy biologicznie preparat odzywczy pakuje sie w szczelnie zamykane opakowania jednostkowe.

Przyklad III. Do 50 g izolowanego bialka zwierzecego, izolowanego z ryb i/iub organizmów morskich dodaje sie 200 ml 1% roztworu wodnego trypsyny o pH- 8,2 po czym mieszanine zalewa sie 9 m\ czystego chemicznie toluenu i 1 ml czystego chemicznie chloroformu. Hydrolize prowadzi sie w temperaturze 313°K przy stalym mieszaniu, utrzymujac* pH roztworu na stalym poziomie 8,2. Proces hydrolizy przerywa sie z chwila uzyskania zawartosci azotu calkowitego rzedu 40 mg/1 mol oraz 1,5% wolnych aminokwasów i 5 peptydów. Po zakonczeniu hydrolizy odparowuje sie toluen i chloroform w suszarce prózniowej w temperaturze 353°K, a otrzymany produkt zobojetnia sie do pH ¦ 7 1 N HCI, po czym saczy przez nucze, a nastepnie przez filtry bakteryjne. Hydrolizat odwadnia sie w suszarce prózniowej w temperaturze 313°K do zawartosci 99% suchej masy i pakuje w szczelne jednostkowe opakowania.

Przyklad IV. Do 60 ml hydrolizatu pepsynowego, otrzymanego jak w przykladzie II, po zobojetnie¬ niu 1 N NaOH dodaje sie 30 mi 5% roztworu wodnego trypsyny, po czym dodaje sie 5 ml toluenu chemicznie czystego. Mieszanine po doprowadzeniu do pH ¦ 8,2 inkubuje sie w temperaturze 318°K stale mieszajac i utrzymujac stala wartosc pH do chwili uzyskania 64 mg/ml azotu calkowitego i 4% wolnych aminokwasów..

Mieszanine zamraza sie dwukrotnie w temperaturze 261°K i zobojetnia do pH - 8 HCI 1 N. Po odparowaniu toluenu w suszarce prózniowej o temperaturze 313° K hydrolizat zobojetnia sie do pH - 7 i saczy przez nucze, nastepnie przez filtry bakteryjne i odparowuje do zawartosci 99% suchej masy w suszarce rozpylowej w temperaturze 363° K.

Przyklad V Do koncentratu bialka z ryb i/lub organizmów morskich dodaje sie 400 ml wody destylowanej i 16 g trypsyny, trwale zwiazanej z CM celulozy (karboksymetyloceluloza). Enzym nierozpuszczal¬ ny przygotowuje sie przez zawieszenie w homogenizowanej zawiesinie CM celulozy w buforze fosforanowym o pH = 7,5 czystej trypsyny w stosunku 2:1. Roztwór miesza sie 8 hiw temperaturze 277°K, po czym 10 krotnie wiruje w nadmiarze buforu fosforanowego. Ostanie wirowanie prowadzi sie w 0,9% NaCI roztworze wodnym.

Otrzymany enzym nierozpuszczalny liofilizuje sie. Mieszanine zadana nierozpuszczalnym enzymem doprowadza sie do pH = 8,2 1 N NaOH, po czym stale mieszajac prowadzi sie hydrolize w temperaturze 313°K do chwili uzyskania 100 mg/ml azotu calkowitego. Hydrolizat saczy sie na nuczy po zobojetnieniu do pH = 7, a nastepnie 'poddaje sie procesowi kontrolowanego odwadniania w suszarce rozpylowej o temperaturze 369°K do 99% suchej masy i pakuje w opakowania jednostkowe.103 447 3 Przyklad VI, 20,4 g plynnego hydrolizatu pepsynowego, otrzymanego jak w przykladzie I, poddaje sie ubijaniu w mikserze przy 8000 obrotów/minute. Otrzymuje sie trwala piane o wskazniku trwalosci wg Love 0,15 i pienistosci 1,28.

Przyklad VII. 10,1 g odwodnionego hydrolizatu, jak w przykladzie V, o zawartosci 99% suchej masy ubija sie w mikserze przy 6000 obrotów/minute. Otrzymuje sie trwala piane o wskazniku wedlug Love 0,18 i pienistosci równej 1,45.

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nieimmunogennych, biologicznie aktywnych preparatów enzymatycznych z bialek nierozpuszczalnych, znamienny tym, ze bialka nierozpuszczalne, zwlaszcza izolaty i koncentraty bialek zwierzecych, poddaje sie dzialaniu enzymów proteolitycznych, takich jak pepsyna, typsyna, papaina, korzystnie w malych stezeniach w roztworach wodnych i/lub w formie nieropuszczalnych kompleksów, kowalencyjnie zwiazanych znanymi sposobami na nosnikach nierozpuszczalnych, po czym mieszanine inkubuje sie, korzystnie w temperaturze 313°K, przy stalym mieszaniu, utrzymujac jednoczesnie pH na stalym poziomie optymalnym dla dzialania enzymu i/lub enzymów, po czym hydrolize przerywa sie z chwila uzyskania korzystnie 50 mg azotu calkowitego w 1 ml hydrolizatu oraz korzystnie 6 typów peptydów o zróznicowanych ciezarach czasteczkowych do 25000 i zawartosci korzystnie 1,5% wolnych aminokwasów, po czym hydrolizat poddaje sie zamrazaniu z nastepnym rozmrazaniem, zobojetnia NaOH lub HCI w zaleznosci od pH srodowiska, odwirowuje i/lub saczy na nuczach, po czym saczy przez filtry bakteryjne, lub poddaje procesowi kontrolowanego odwadniania znanymi sposobami do zawartosci 99% suchej substancji.