PL102998B1 - Sposob ekstrahowania grzybiczych toksyn z odolejonej maki z orzeszkow ziemnych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrahowa¬ nia grzybiczych toksyn z odolejonej maki z orzesz¬ ków ziemnych.

Zanieczyszczenia pokarmów i pasz grzybiczymi toksynami moze uczynic te produkty niebezpiecz¬ nymi dla zdrowia, gdyz produkty przemiany ma¬ terii grzybów powoduja liczne ostre i chroniczne przejawy toksycznosci, a miedzy innymi dzialaja rakotwórczo i wywoluja wady rozwojowe.

Wsród róznych toksyn wyosobnionych z róz¬ nych chorobotwórczych mikroorganizmów odkryte w roku H90O aflatoksyny, maja szczególne znacze¬ nie ze wzgledu na ich silne dzialanie biologiczne.

Toksyczny czynnik aflatoksyny zostal wyosóbnio- t ny z hodowli Aspergillus flavus, który to mikro¬ organizm jest glównym zródlem zakazania nasion wielu .roslin, takich jak orzech ziemny, pszenica, kukurydza, slonecznik, rzepak i inne.

Klasa aflatoksyn sklada sie z wielu substancji, chemicznie podobnych, których liczba w pewnych przypadkach siega 10—1(2, przy czym 4 z nich, oznaczone jako aflatoksyny Blf B2, G± i G2 sa zawsze obecne. Metabolity Bx i Gt sa pochodnymi dwufuranokumaryny, podczas gdy B2 i G2 sa ich odpowiednimi pochodnymi dwuwodorowymi. Afla- toksyna B1 ma najwieksza toksycznosc i stanowi glówny skladnik mieszaniny /okolo 45?/o/.

Znana jest metoda ekstrahowania aflatoksyn /L. A. Golablatt „Removal of aflatoxin from peanut products with acetone — hexane — water solvent. Mycotoxin in foodstuffs". -MIT Press.

Cambridge, Mass. 1965, str. 261'/ za pomoca ukladu azeotropowego aceton : heksan : woda w stosunku objetosciowym 60:35:5. Prowadzone byly równiez próby /A. Ciegler i inni, Appl. Microb. 1966, t. 14, str. 934/ usuwania aflatoksyn przez organizmy zy¬ we, takie jak drozdze, plesnie, 'bakterie, promie¬ niowce itp. Wydajnosc tej metody jest na ogól niska i tylko jeden z badanych szczepów, a mia¬ nowicie Flavobacterium aurantiacum NRRL-B-184 usuwa aflatoksyny calkowicie. Wszystkie opraco¬ wane dotychczas sposoby usuwania aflatoksyn z ich srodowiska powoduja zmniejszenie wartosci odzywczej macznych produktów, a ich zastosowa¬ nie na skale przemyslowa jest trudne.

Obecnie odkryto sposób umozliwiajacy usuwanie aflatoksyn i wszsytkich toksyn grzybiczych o po¬ dobnej budowie, rozpuszczalnych w okreslonej mie¬ szaninie rozpuszczalników w warunkach nie po¬ wodujacych rozkladu protein. Sposób ten umozli¬ wia silne odkazanie odolejonej maki z orzeszków ziemnychi czyniac z niej produkt nadajacy sie do uzytku, mimo iz przed usunieciem toksyn grzy¬ biczych byla ona zakazona, a wiec trujaca.

Zgodnie z wynalazkiem odolejona make z orzesz¬ ków ziemnych poddaje sie ekstrakcji za pomoca mieszaniny n-butanolu i wodnego roztworu kwasu solnego o wartosci pH 2,0*—6,0, prowadzac ekstrak¬ cje w temperaturze nizszej od temperatury dena- turacji protein zawartych w mace. 102 998102 998 3 Dzieki obecnosci w ukladzie rozpuszczalnikowym silnie kwasowego elektrolitu jakim jest kwas sol¬ ny, rozpuszczalnosc'toksyn grzybiczych w roztworze wodnoalkoholowym jest znacznie wieksza, a za¬ tem usuwanie tych toksyn jest latwiejsze. N-buta- nol korzystnie powinien byc nasycony wodnym roztworem kwasu solnego. Uklad rozpuszczalniko¬ wy stosowany w sposobie wedlug wynalazku jest bardzo prosty i nie zachodzi w jego przypadku niebezpieczenstwo naruszenia równowagi ukladu, co ma miejsce przy stosowaniu ukladu azeotropo- wego w znanej metodzie ekstrakcji toksyn grzy¬ biczych.

Proces ekstrakcji prowadzi sie w temperaturze nizszej od temperatury, w której rozpoczyna sie denaturacja protein, przy czym stosunek substan¬ cji rozpuszczanej do rozpuszczalnika wynosi od 1:2 do 1:5, albo tez stosuje sie wyczerpujaca per- kolacje roztworu ekstrahujacego o wartosci pH 2,0--6,0.

Ponizej opisano szczególowo sposób wedlug wy¬ nalazku w odniesieniu do ekstrahowania aflatok- syn Bj i B2 z maki z orzeszków ziemnych, otrzy¬ manej z olejarni. Oczywiscie jednak proces ten moze byc stosowany do odkazania maki zakazonej innymi toksynami grzybicowymi o podobnej bu_ dowie lub rozpuszczalnymi w mieszaninie rozpusz_ czalników stosowanej zgodnie z wynalazkiem, np. nalezacymi do klasy okratoksyn, bedacych meta¬ bolitami Aspergillus ochraceus -lub Penicillium viridicatum.

Podane nizej przyklady oczywiscie nie ogranicza¬ ja wynalazku. W przykladach tych stosuje sie na¬ stepujace materialy i metody postepowania. Prób¬ ki aflatoksyn B± i B2 otrzymano z przedsiebior¬ stwa Calbiochem, jako zel krzemionkowy bedacy nosnikiem w analizie metoda chromatografii cien¬ kowarstwowej stosowano zel krzemionkowy MN, GHR firmy Macherey, Nagel and Co., a jako eluent stosowano Eoztwór chloroformu i acetonu 90:10.

Alkohol n-butylowy i n-heksan byly dostarczane jako rozpuszczalniki RPE przez firme Carlo Erba /Erba Pure Reagent/. Aflatoksyny Bx i B2 dozo¬ wano metoda Association Official Analytical Che- mists /AOAC/ 26 001^-26030, wydanie 11 /1970/.

Próby chemiczne w celu szybkiego wyznaczania aflatoksyn B± i B2 prowadzono metoda L. M. Seitz i H. E. Mohr, Cereal Chemistry 51 ,/4/, 487 /1974/.

Fluorometryczne odczytywanie plam w cienkiej warstwie w odniesieniu do aflatoksyn Bx i B2 oraz próbek porównawczych prowadzono za pomoca przyrzadu Chromato-Vue, stosujac dlugofalowe pro¬ mieniowanie nadfioletowe — Ultraviolet Products, Inc., San Gabriel, California, St. Zj. Am.

Rozpuszczalnik do* ekstrahowania grzybiczych toksyn przygotowywano z roztworu n-butanolu za¬ wierajacego 0,005 n kwas solny i majacego wartosc pH 2,50, przy czym roztwór ten stosowano w sto¬ sunku objetosciowym 9:1. Stosunek ten moze byc zmieniany jako funkcja wartosci pH az do osiag¬ niecia calkowitego nasycenia rozpuszczalnika wod¬ nym roztworem zawierajacym elektrolit.

Make z orzeszków ziemnych, stanowiaca produkt po wyekstrahowaniu oleju w olejarni, proszkowa- 4 no w mlynie systemu Biihler, stopien 3 i doda¬ wano do mieszaniny stanowiacej rozpuszczalnik w stosunku 1 czesc wagowa na 15 czesci objetoscio¬ wych w ciagu 15 minut w temperaturze pokojo- wej i przy ciaglym mieszaniu. Otrzymana zawie¬ sine saczono na lejku Buchnera, stosujac bibule filtracyjna Whatman No. 3. Pozostalosc po ekstrak¬ cji ekstrahowano ponownie mieszanina rozpusz¬ czalników w sposób wyzej opisany. io Po zakonczeniu procesów ekstrakcji make suszo¬ no w strumieniu azotu w ciagu co najmniej 3 go¬ dzin i pobierano z niej próbki w celu szybkiego oznaczenia alfatoksyn Bx i B2 metoda Seitz-Mohr.

Aflatoksyny dozowano metoda AOAC 26 001—26 020.

Przyklad I. Ekstrahowanie aflatoksyn Bt i B2 z odolejonej próbki maki z orzeszków ziemnych metoda Seitz-Mohr. Poczatkowy sklad odolejonej maki z orzeszków ziemnych: zawartosc wilgoci 8,4% zawartosc w przeliczeniu na sucha substancje: proteiny 56,7% lipidy mniej niz V °/o surowewlókna 5,lP/o V 100 g maki o powyzszym skladzie mieszano energicznie w kolbie z 1500 ml mieszaniny roz¬ puszczalników w ciagu 16 minut w temperaturze pokojowej po czym odsaczono przy uzyciu pompy filtracyjnej i pozostalosc ponownie ekstrahowano 1500 ml swiezego rozpuszczalnika. Czynnosci te powtarzano razem 7 razy i ostateczna pozostalosc wysuszono w strumieniu azotu w, ciagu 3 godzin. 50 g otrzymanej maki pozbawionej toksyn pod- M dano próbie metoda Seitz-Mohr w celu oznacze¬ nia aflatoksyn i taka sama ilosc maki nie podda¬ wanej ekstrakcji badano równolegle. Na plytce do analizy cienkowarstwowej umieszczono po 25 mi- krolitrów roztworu w mieszaninie benzenu z ace- *• tonitrylem /98:2/ wyjsciowej maki, maki poddanej ekstrakcji i 4 wzorców aflatoksynowych, zawiera¬ jacych odpowiednio 10, 20, 30 i 50 czesci aflatoksyn Bj i B2 na 1 miliard. Wzorce te przygotowywano rozpuszczajac aflatoksyny Bx i B2, jakosc. A, w 41 mieszaninie benzenu z acetonitrylem /9S:2/ tak, aby otrzymac ostatecznie stezenie okolo 1 mikro- gram/ml. Stezenie faktyczne mierzono nastepnie metoda spektrofotometryczna wedlug AOAC 26 011'.

Plytke eluowano w ciagu 10 minut mieszanina 50 chloroformu z acetonem /90:lO/ i nastepnie doko¬ nywano odczytu w swietle nadfioletowym o duzej dlugosci fali. Przy badaniu plytki w miejscach próbek maki byly widoczne 2 charakterystyczne plamy o niebieskiej fluorescencji i o wartosci Rf 58 odpowiadajacej wzorcom aflatoksyn B1 i B2. Plamy odpowiadajace próbce nie poddanej ekstrakcji byly znacznie bardziej intensywne niz wzorce i najwyzszym stezeniu, natomiast plamy odpowiada¬ jace próbce maki ekstrahowanej zgodnie z wyna- *° lazkiem mieszanina rozpuszczalników mialy flu- orescencje o natezeniu odpowiadajacym fluorescen¬ cji wzorca o najnizszym stezeniu, to jest 10 czesci/ /miliard. n Przyklad II. Ekstrakcja i dozowanie afla-102 998 6 toksyn B: i B2 z próbki odolejonej maki z orzesz¬ ków ziemnych metoda AOAC 26 0011—2i6 020. 100 g maki z orzeszków ziemnych o skladzie po¬ danym w przykladzie I, miesza sie energicznie w kolbie z 1500 ml mieszaniny rozpuszczalników w ciagu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym odsacza i pozostalosc ekstrahuje sie ponownie 1500 ml swiezego rozpuszczalnika. Operacje te powtarza sie lacznie 7 razy, po czym ostateczna pozostalosc suszy sie w strumieniu azotu w ciagu 3 godzin. 50 g otrzymanej maki pozbawionej toksyn, maja¬ cej sklad podany w przykladzie I, podaje sie prób¬ ce dozowania aflatóksyn metoda AOAC 26 001— —26 020, mieszajac wyekstrahowane próbki w 0,5 ml mieszaniny benzenu z acetonitrylem 98:2. W identyczny sposób bada sie make nie poddana ekstrakcji. Nastepnie na plytce majacej warstwe zelu krzemionkowego MN, G-HR firmy Machery, 0 grubosci 0,3 mm, umieszcza sie nastepujace próbki: '1. Próbka zakazona aflatoksynami.

Umieszcza sie 3,15 i 7 mikrolitrów roztworu w mieszaninie benzenu z acetonitrylem 98:2 zakazo¬ nej maki z orzeszków ziemnych i 5 mikrolitrów wzorcowego roztworu aflatoksyny Bx razem z 5 mikrolitrami zakazonej próbki. 2. Wzorce.

Na plytce umieszcza sie 3,5 i 7 mikrolitrów wzorcowego roztworu aflatoksyny Bx o stezeniu 1 mikrogram/ml. 3. Próbka pozbawiona toksyn.

Na plytce umieszcza sie po 5; 10 i 15 mikrolitrów roztworu w mieszaninie benzenu z acetonitrylem 98:2 próbki maki z orzeszków ziemnych pozbawio¬ nych toksyn i 5 mikrolitrów wzorcowego roztwo¬ ru aflatoksyny B± wraz z 5 mikrolitrami próbki nie zakazonej.

Do eluowania stosuje sie mieszanine chlorofor¬ mu z acetonem 90:10 w ciagu 40 minut, co od¬ powiada przeplynieciu rozpuszczalnika na odleglosc 12 cm.

Obserwujac plytke za pomoca lampy nadfioleto¬ wej Chromato-Vue o duzej dlugosci fal, uzyskuje sie nastepujace wyniki. 1. Próbka zakazona aflatoksynami.

Plama o niebieskiej fluorescencji odpowiadajaca 3 mikrolitrom poczatkowej próbki rozcienczonej 40 45 pieciokrotnie wykazuje natezenie i wartosc Rf ta¬ kie same jak 5 mikrolitrów wzorca aflatoksyny Bi. Zgodnie z metoda AOAC 26 0i20 obliczona za¬ wartosc aflatoksyny Bt w wyjsciowej mace wy¬ nosi: S • Y • V S • 1 • 2500 mikrogramy na 1 kg= — X •W 3 • 10 ~~ =0,417 czesci/miliard we wzorze tym: S oznacza liczbe mikrolitrów wzorca B± Y oznacza stezenie wzorca Bx X oznacza liczbe mikrolitrów próbki, która daje natezenie fluorescencji takie jak wzorzec B1 V oznacza liczbe mikrolitrów po ostatecznym roz¬ cienczeniu próbki W oznacza liczbe gramów maki wzietej do analizy 3. Próbka pozbawiona toksyn.

Plama o niebieskiej fluorescencji odpowiadajaca mikrolitrom próbki pozbawionej toksyn ma na¬ tezenie i wartosc Rf takie same jak 3 mikrolitry wzorca aflatoksyny B^ W celu obliczenia pozostalosci aflatoksyny B± w mace pozbawionej toksyn stosuje sie wyzej po¬ dany wzór: Z• l • 500 mikrogramy na 1 kg= — —10,0 czesci/miliard • 10 co oznacza, ze zawartosc • aflatoksyny B± w mace poddanej procesowi wedlug wynalazku wynosi tyl¬ ko okolo 2,5°/o poczatkowej zawartosci.

Powtarzajac opisane próby z wzorcami aflatok¬ syny B2 otrzymuje sie make z orzeszków ziem¬ nych, w której zawartosc aflatoksyny Ba po zasto¬ sowaniu procesu wedlug wynalazku wynosi rów¬ niez okolo 2,5% wartosci pierwotnej.

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób ekstrahowania grzybiczych toksyn z od¬ olejonej maki z orzeszków ziemnych za pomoca mieszanego wodno-organicznego ukladu rozpusz¬ czalnikowego, znamienny tym, ze ekstrakcje pro¬ wadzi sie za pomoca mieszaniny n43utanolu i wod¬ nego roztworu kwasu solnego o wartosci pH 2,0— —6,0, przy czym stosuje sie temperature ekstrakcji nizsza od temperatury denaturacji protein zawar¬ tych w mace.