CH627925A5 - Procedimento per rimuovere le micotossine da farine di semi vegetali. - Google Patents
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Description
La presente invenzione concerne un procedimento per rimuovere le micotossine da farine vegetali.
La contaminazione da parte di micotissine di alimenti e mangimi può rendere tali prodotti pericolosi; infatti i meta-boliti dei funghi mostrano un ampio spettro di manifestazioni tossiche acute e croniche, tra cui effetti cancerogenici e tetratogenici.
Tra le diverse tossine isolate dai vari microorganismi patogeni, le aflatossine, scoperte nel 1960, rivestono particolare importanza per la loro elevata attività biologica.
II fattore tossico anatossina è stato isolato da colture di Aspergillus flavus; questo micromiceto è il maggiore responsabile della contaminazione di diversi semi vegetali, quali arachide, frumento, granoturco, mais, girasole, colza ed altri.
La classe delle aflatossine è costituita da più sostanze tutte chimicamente affini, che arrivano in certi casi fino ad un numero di 10-12; quattro composti indicati come aflatos-sina B2 Gj G2 risultano sempre presenti. I metaboliti Bx e Gj sono dei difurano-cumarin derivati, mentre B2 e G2 sono i rispettivi diidro-derivati. L'aflatossina Bj è il composto dotato di maggior tossicità ed è anche il componente principale della miscela (intorno al 45%).
Metodi per la rimozione e l'inattivazione di questi composti dai prodotti contaminati sono stati messi a punto da diversi autori, ma tutti questi processi diminuiscono il potere nutritivo della farine [H. K. Gardner et al. J. Amer. Oil Chem. Soc. 48 (2) 70-73 (1971)].
Il procedimento per rimuovere le micotossine da farine vegetali è caratterizzato nella rivendicazione 1 precedente.
Il procedimento definito nella rivendicazione 1 impiega dunque un solvente di natura organica con almeno un gruppo polare: tale solvente deve essere saturato con una soluzione acquosa contenente un elettrolita di natura acida, scelto tra gli acidi organici ed inorganici o i sali acidi degli stessi. L'elettrolita aumenta la solubilità delle micotossine nella soluzione idroalcolica facilitandone la rimozione.
L'estrazione viene preferibilmente realizzata in un intervallo di temperatura da 4°C alla temperatura di inizio denaturazione delle proteine, con un rapporto soluto/solvente da 1:2 a 1:50, oppure anche per percolazione esaustiva della soluzione estraente con un pH variabile da 2,0 a 6,0.
Per illustrare alcuni esempi di esecuzione ci si riferirà nel seguito all'estrazione delle aflatossine Bt e B2 da una farina di arachide proveniente dall'industria olearia. È evidente che il procedimento come definito dalla rivendicazione 1 può essere anche applicato vantaggiosamente ad altre farine vegetali inquinate da aflatossine o da altre micotossine con struttura simile o comunque solubili nel solvente composito sopra definito come ad esempio la classe delle ocratossine metaboliti dell' Aspergillus ochraceus e Pénicillium viridica-tum.
Per realizzare gli esempi di esecuzione si sono impiegati i seguenti materiali e seguiti i metodi più sotto elencati.
Materiali
I campioni di aflatossine Bj e B2 grado A erano forniti dalla Calbiochem. Il supporto di gel di silice per l'analisi cromatografica su strato sottile era MN Silica gel, G-HR della Macherey, Nagel & Co. L'eluente impiegato era una soluzione di cloroformio: acetone (90 : 10).
L'alcool n-butilico ed il n-esano erano forniti dalla Carlo Erba come solventi RPE (Reattivo Puro Erba).
L'acido cloridrico era della Merck.
Metodi
Il dosaggio delle aflatossine Bx e B2 è stato effettuato secondo il metodo AOAC (Association Officiai Analytical Che-mists) 26.001 26.020, llth Edition (1970).
Il saggio per il riconoscimento rapido delle aflatossine Bj e B2 è stato effettuato secondo il metodo riportato da L. M. Seitz e H. E. Mohr, Cereal Chemistry, 51 (4), 487 (1974).
La lettura fluorimetrica delle macchine su strato sottile relative alle aflatossine Bj e B2 e dei campioni di riferimento è stata eseguita con un Chromato-Vue e Long Wave U. V. della Ultra-Violet Products Inc. San Gabriel California (USA).
Il solvente di estrazione per le micotossine era costituito da una soluzione di alcool n-butilico contenente acido cloridrico 0,5 . IO"2 N, pH 2,50 addizionato nel rapporto 9:1 volume/volume. Tale rapporto non deve essere inteso limitativo e può variare in funzione del pH fino a completa saturazione del solvente con la soluzione acquosa contenente l'elettrolita.
La farina di semi di arachide proveniente dall'impianto industriale di estrazione dell'olio viene polverizzata con un macinino della Bühler a gradazione 3 e aggiunta alla miscela solvente nel rapporto 1/15 peso/volume per la durata di 15' a temperatura ambiente sotto agitazione. La sospensione viene filtrata sotto vuoto su buchner utilizzando una carta da filtro Whatman n. 3. Sul residuo si ripete l'estrazione con la miscela solvente per più volte di seguito nel modo sopra descritto.
Terminate le estrazioni la farina viene essiccata in corrente d'azoto per almeno tre ore e su questo materiale si effettua un saggio di riconoscimento rapido delle aflatossine Bt e B2 secondo il metodo di Seitz e Möhr. Il dosaggio delle aflatossine si effettua invece con il metodo AOAC 26.001 -ï- 26.020.
Esempio 1
Estrazione delle aflatossine B1 e B2 da un campione di farina di arachide disoleata e riconoscimento con il metodo di Seitz e Möhr
Composizione iniziale delle farine di arachide di estrazione
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Umidità 8,4%
sul secco:
— proteine 58,7%
— lipidi <1 %
— fibra grezza 5,1%
100 g di farina sono mescolati in beuta con 1500 mi di miscela solvente per 15' a temperatura ambiente sotto vigorosa agitazione. Si filtra con pompa ad acqua e sul residuo si ripete l'estrazione con altri 1500 mi di solvente fresco. Questo trattamento viene effettuato di seguito per complessive sette estrazioni. Il residuo finale viene quindi essiccato in corrente d'azoto per tre ore.
50 g della farina detossicata vengono quindi trattati secondo il metodo di Seitz e Mohr per il riconoscimento delle aflatossine. Una identica aliquota di farina di arachide non trattata è sottoposta alla metodica sopra descritta.
Su lastrina a strato sottile si caricano 25 [il di una soluzione in benzene: acetonitrile (98 : 2) del campione di farina di arachide iniziale e trattata e quattro standards di aflatossine e B2 che contengono rispettivamente 10, 20, 30 e 50 parti per bilione (p.p.b.). La preparazione degli standards è stata effettuata diluendo opportunamente l'aflatossi-na Bj e B2 grado A in una soluzione di benzene: acetonitrile (98 : 2) in modo da ottenere una concentrazione finale pari a circa 1 y/nil. La concentrazione effettiva era quindi determinata per via spettrofotometrica secondo il metodo del-l'AOAC 26.011.
La lastrina viene fatta eluire per 10' in cloroformio:acetone 90 : 10 e quindi letta sotto luce uttravioletta ad elevate lunghezze d'onda.
All'esame della lastrina, nel campione di partenza erano visualizzate due caratteristiche macchie a fluorescenza bleu con Rf corrispondenti a quelli degli standards di aflatossine Bt e B2. Le macchie relative al campione non trattato possedevano una intensità molto superiore allo standard più concentrato; mentre le macchie del campione sottoposto al processo estrattivo con la miscela solvente aveva una intensità di fuorescenza paragonabile alla più bassa concentrazione delle soluzioni standards, cioè pari al 10 p.p.b.
Esempio 2
Estrazione e dosaggio delle aflatossine B1 e B2 da un campione di farina di arachide proveniente dall'Industria olearia secondo il metodo AOAC 26.001 26.020
100 g di farina di arachide di composizione identica a quella dell'esempio 1 sono mescolati in beuta con 1500 mi di miscela solvente per 15' a temperatura ambiente sotto vigorosa agitazione. Si filtra con pompa ad acqua e sul residuo si ripete l'estrazione con altri 1500 mi di solvente fresco. Questo trattamento viene effettuato di seguito per complessive sette estrazioni ed il residuo finale viene essiccato in corrente d'azoto per tre ore.
50 g della farina detossicata della stessa composizione riportata nell'esempio 1 sono trattati secondo il metodo AOAC 26.000 26.020 per il dosaggio delle aflatossine, che una volta estratte vengono solubilizzate in 0,5 mi di una soluzione di benzene:acetonitrile 98 : 2. Una identica quantità di farina di arachide non trattata è sottoposta alla metodica AOAC sopracitata.
Su lastrina stratificata con 0,3 mm di MN-Silica Gel G-HR della Machery sono stati caricati i seguenti campioni:
627925
1) Campione contaminato da aflatossine
Sono depositati 3,5 e 7 (il della soluzione in benzene-acetonitrile 98 : 2 del campione di farina di arachide contaminato e 5 (il della soluzione standard di aflatossina Bj insieme a 5 (il del campione contaminato.
2) Standards
Sono depositati 3,5 e 7 jaI di una soluzione standard di aflatossina Bt 1 y/ml.
3) Campione detossicato
Sono depositati 5,10 e 15 [il della soluzione in benzene: acetonitrile 98 : 2 del campione di farina di arachide detossicata e 5 (il della soluzione standard di aflatossina Bx insieme a 5 (il del campione decontaminato.
L'eluente utilizzato per la cromatografia era costituito da cloroformio ed acetone nel rapporto 90 : 10 per la durata di 40', corrispondente ad una corsa del fronte del solvente di 12 cm.
Dalla lastrina visualizzata con lampada U. V. della Chro-mato-Vue a «long-wawe» si ricavano le seguenti informazioni:
1) Campione contaminato da aflatossine
La macchia bleu di fuorescenza in corrispondenza ai 3 (il del campione iniziale diluito 5 volte presentava identica intensità ed Rf di quella dei 5 (il di standard di aflatossina Bj.
Per risalire alla quantità espressa in parti per bilione (p.p.b.) di aflatossina Bt contenuta nella farina iniziale, è stata applicata la seguente formula, riportata dalla metodica AOAC 26.020:
S.Y. V
(ig X kg = (1)
X.W
S =
(il di standard Bj
Y =
concentrazione dello standard Bj
V =
|xl della diluizione finale del campione
X =
del campione depositato che danno la stessa inten
sità di fluoerescenza dello standard Bj w =
g di campione di farina impiegati per l'analisi
Pertanto si ricava:
5.1.2500
(xg X kg = = 417 ppb (0,42 ppm).
3.10
3) Campione detossicato
La macchina bleu di fluorescenza in corrispondenza ai 15 (il del campione detossicato presentava la stessa intensità ed Rf di quella dei 3 |xl di standard di aflatossina Br
Per calcolare le parti per bilione (p.p.b.) di aflatossina Bj residua nella farina di arachide detossicata, è stata applicata la relazione (1):
3.1.500
[ig X kg = = 10.0 ppb (0,01 ppm)
13.10
da cui si ricava un contenuto residuo in aflatossina Bj pari al 2,5% dell'iniziale.
La stessa metodica è stata applicata con standards di aflatossina B2 ottenendo ugualmente un contenuto residuo di B2 del 2,5 % rispetto all'iniziale.
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
V
Claims (7)
1. Procedimento per rimuovere le micotossine da farine vegetali caratterizzato dal comprendere l'operazione di trattare tali prodotti vegetali con un solvente composito costituito da un solvente organico contenente almeno un gruppo polare e da una soluzione acquosa di un elettrolita avente natura acida.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che si opera con un rapporto soluto : solvente variabile da 1:12 ad 1:50 (peso/volume).
2
RIVENDICAZIONI
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il pH della soluzione acquosa di elettrolita varia da 2,0 a 6,0.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'operazione viene condotta a temperature variabili da 4°C fino alla temperatura di denaturazione delle proteine.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il solvente organico è l'alcool n-butilico.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che l'elettrolita è l'acido cloridrico.
7. Uso del procedimento definito dalla rivendicazione 1 per rimuovere sostanze tossiche del tipo delle aflatossine e micotossine da farine di semi vegetali.
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| GB1539903A (en) | 1979-02-07 |
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