PL102460B1 - A method of producing the high protein bacterial mass by the isolation and breeding in laboratory conditions the relative methylotrophics - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wysoko¬ bialkowej masy bakteryjnej przez izolowanie i hodowanie w warunkach laboratoryjnych metylotrofów wzglednych.

Badania wykazaly, ze masa komórkowa bakterii, ze wzgle¬ du na zawartosc bialka i sklad aminokwasów, moze stano¬ wic cenna pasze. Masa komórkowa bakterii zawiera do 85% bialka surowego, tj. okolo 30% wiecej niz biomasa drozdzy, przy czym zawartosc metioniny, wynoszaca 1,5 do 2% su¬ chej masy, odbiega w znacznie mniejszym stopniu niz w bialku drozdzy od norm FAO (2,2%).

W ostatnich latach rosnie zainteresowanie wykorzysta¬ niem do celów paszowych bakteryjnych metylotrofów, wyizolowanych z populacji drobnoustrojów wystepuja¬ cych w blotach, wodach, glebie oraz stanowiacych zanie¬ czyszczenia powietrza, zdolnych do wzrostu na zwiazkach jednoweglowych.

Wsród bakteryjnych metylotrofów przemyslowych znaj¬ duja sie zarówno metylotrofy bezwzgledne, zdolne do wzros¬ tu wylacznie na metanie i metanolu, oraz metylotrofy wzgledne np. Protaminobacter rubrum, znane z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 764 476, które wprawdzie wykorzystuja metanol jako jedyne zródlo wegla, moga jednak rosnac na innych zwiazkach organicz¬ nych, takich jak glukoza i kwasy organiczne.

Przemyslowe szczepy, rosnace na metanolu jako jedynym zródle wegla i energii izolowano dotychczas z losowych próbek gleby, wody i powietrza, stosujac selekcje na podlo¬ zach, wzbogacanych w metanol. Przy czym selekcja ta dotyczy zarówno szybkosci wzrostu na metanolu, jak iwykorzystania go w produkcji biomasy. 33 Zawartosc bialka w biomasie bakteryjnej ulega wahaniom i zmniejsza sie znacznie w skutek zwiekszonej zawartosci glównie weglowodanów, a takze lipidów. U wielu.metylo¬ trofów przemyslowych, zawartosc bialka w masie komór¬ kowej obniza sluz. W warunkach niedostatecznego doplywu tlenu i glodu azotowego ilosc sluzu, otaczajacego komórki, moze byc tak znaczna, ze zawartosc bialka surowego spada do 45%.

Istnieje szereg patentów, w których przedmiotem . wynalazku bylo polepszenie skladu biomasy przez ekstrakcje samego bialka lub usuniecie skladników niebialkowych, a w tym kwasów nukleinowych (francuski opis patentowy nr 2 159 722, , opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3702283 francuski opis patentowy nr 2 117 329). Nie zwrócono jed¬ nak uwagi na fakt, ze straty, zwiazane z przeksztalcaniem wegla w skladniki niebialkowe, sa wynikiem zaburzen metabolizmu.

Celem wynalazku jest opracowanie szybkiej, rutynowej metody izolaqi metylotrofów bezwzglednych oraz dobór warunków hodowli laboratoryjnej, zapewniajacy najko¬ rzystniejszy sklad biomasy wyizolowanego szczepu.

Istota wynalazku polega na tym, ze ze scieków droz¬ dzowni izoluje sie, stosujac selektywnie dzialajace antybio¬ tyki i/lub sulfonamidy, szczep ZB18 J26 bakterii, nalezacy do rodzaju Pseudomonas lub otrzymane na drodze selekcji jego mutanty, takie jak ZB18 J26 Mut-15, po czym bakterie te namnaza sie w warunkach tlenowych na pozywce, za¬ wierajacej metanol jako jedyne zródlo wegla.

Metylotrofów wzglednych poszukiwano w oczyszczalni 102 460.:.%¦$/ 102 460 biologiczne} scieków w przemysle spozywczym. Oparto sie przy tym na przypuszczeniu, ze metylotrofy wchodza w sklad mikroflory, rozwijajacej sie w nasyconych metanem i napowietrzanych pojemnikach, do których doprowadzane sa scieki po beztlenowej fermentacji metanowej w oczysz¬ czalni w drozdzowni.

W selekcji metylotrofów z populacji wyjsciowych po¬ slugiwano sie zwiazkami przeciwgrzybicowymi i zwiazkami o dzialaniu przeciwbakteryjnym, takimi jak antybiotyki lub sulfonamidy, które eliminujac grzyby i drobnoustroje Gram dodatnie i Gram ujemne, nie wykazujace cech metylotrofów, przyspieszaja uzyskanie jednorodnych szcze¬ liw.

Dzieki zastosowaniu antybiotyków, takich jak penicylina, oksacyclina, streptomycyna czy crUc^amfenikol, na które metylotrofy sa stosunkowo malo wrazliwe (maksymalne stezenie hamujace MIC wynosi odpowiednio 1000 jedn/ml oraz 250, 100, 30 //g/ml), wzglednie dodatkowo polifun- giny — antybiotyku polienowego typu nystatyny — o prze- ciwgrzybicowym dzialaniu, uzyskuje sie wielokrotne za¬ geszczenie metylotrofów: po 4—5 pasazach na podlozach, zawierajacych metanol w wysokim stezeniu, otrzymuje sie morfologicznie nie rózniace sie kolonie, które' nastepnie oczyszcza sie przez klonowanie.

W pracach nad izolowaniem metylotrofów przemyslo¬ wych nie bez znaczenia jest równiez fakt znacznej odpornosci na karbeniciline MIC 60—100 ug/ml). Bardzo znaczna wrazliwosc na ten antybiotyk wykazuja bowiem patogenne gatunki rodzaju Pseudomonas.

W wyniku dalszych etapów selekcji na podlozach stalych i plynnych wyodrebniono szczepy o czasie generacji, skróconym z 420 minut do okolo 180 minut, przy jedno¬ czesnym okolo 17-krotnym zwiekszeniu szybkosci utle¬ niania metanolu (10 nmoli 02/min/mg s.m. do 171 nmoli 02/min/mg s.m.). Szczepy te rosna na metanolu w stezeniu do 2%, a oddychaja przy stezeniu do 10%.

Ponizej podano ogólna mikrobiologiczna charakterystyke szczepu ZB18 J26 Mut-15, uzyskanego droga selekcji ze szczepów, wyizolowanych z biologicznej oczyszczalni scieków. Szczep ten jest przechowywany w Instytucie Przemyslu Fermentacyjnego.

Wzrost: zródlowegla metanol, etanol, octan, pi- rogronian, bursztynian, cytrynian, alanina, argi- nina, bulion odzywczy zródloazotu sole amonowe, mocznik, aminokwasy, brak wzrostu na azotanach witaminy brak zapotrzebowania na witaminy Ksztalt komórek pojedyncze, ruchliwe pa¬ leczki (0,5 x 1,3 fan) o jed¬ nej biegunowej rzesce (3,5 fan) Spory brak Zabarwienie rózowe na podlozu z meta¬ nolem, bialo-zóltawe Barwienie Grama ujemne Kolonie okragle, gladkie, o rów¬ nych brzegach, plaskie, przezroczyste we wczesnym stadium, pózniej bialawe o srednicy 2—3 mm po 4—5 dniach Temperaturawzrostu 10—42°C ZakrespH 4,5—8,5 Uplynnianie zelatyny uplynnia Reakcjakatalazowa dodatnia Reakcjaoksydazowa dodatnia (test Kovacsa) B-hydroksymaslan nie gromadzi sie • (test spektrofotometryczny Law'a i Slepecky'ego) Redukqaazotanów ujemna, io Dwuhydrolaza argininy ujemna- Tworzenie otoczki sluzowej dodatnie j Dla szczepu znamienne jest równiez wytwarzanie wita¬ miny B2, przechodzacej do podloza w ilosci do 0,2 //g/ml oraz drugiego barwnika fluoryzujacego o maksimum fluore- scencji przy 420 urn. Synteze witaminy Bz potwierdzono metoda mikrobiologiczna, stosujac Lactobacillus casei ATCC7469.

Taksonomia metylotrofów napotyka na wiele kontro¬ wersji. W ostatnim VIII wydaniu Bergey's mannual of determinative bacteriology (1974) drobnoustroje, rosnace wylacznie na zwiazkach jednoweglowych — metanie i me¬ tanolu — zostaly wyodrebnione jako osobna rodzina Mety- lomonadaceae.

Natomiast taksonomia wzglednych metylotrofów opiera sie na ogólnych morfologicznych i fizjologicznych kryte¬ riach klasyfikaqi. Na tej podstawie wyizolowany przez nas szczep wzglednego metylotrofa zaliczono do rodzaju Pseudomonas.

Pseudomonas ZB18 J26 namnaza sie w temperaturze io—42°C, najkorzystniej 30—35 °C, przy pH srodowiska 4,5—8,5, najkorzystniej 6,5—7,5, na pozywce mineralnej, zawierajacej jony NH4, K, Na, Mg, mikroelementy oraz metanol. Pozywke ta szczepi sie inokulum w ilosci 5—10%.

Jeden litr pozywki zawiera 0,5—2,0 g fosforu; 1,0—2,5 g sodu; 0,2—0,5 g potasu; 0,01—0,05 g magnezu; 3—20 mg zelaza; 0,1—1,0 mg wapnia; 0,04—0,08 mg cynku; 0,04— —0,08 mg miedzi; 0,04^-0,08 mg kobaltu; 0,1—0,3 mg manganu; 0,1—0,3 mg molibdenu. Przy czym zawartosc w pozywce wegla i azotu, wyrazajaca sie stosunkiem C/N, 40 wynosi 15—20. Do pozywki tej dodaje sie sukcesywnie metanol, utrzymujac jego stezenie w granicach0,2—1 %.

Stwierdzono, ze zwiekszenie ilosci dodanego zelaza w stosunku do innych mikroelementów obniza ilosc wytwo¬ rzonego pozakomórkowego sluzu, podnoszac tym samym « procentowa zawartosc bialka. Wysokie stezenie jonów wapniowych w wodzie wodociagowej, dochodzace do 190 mg/litr, powoduje wytracanie jonów fosforanowych, uniemozliwiajac pobieranie ich przez komórki. W tym stanie okazalo sie niezbedne usuwanie jonów wapnia przez 50 dejonizacje lub wiazanie przez zwiazki chelatujace.

Uzyskana biomasa zawiera 4% weglowodanów, oznaczo¬ nych metoda antronowa i 80% bialka surowego, o naste¬ pujacym skladzie aminokwasowym w przeliczeniu na 16 g N.

Alanina 5,4 55 Walina 5,0 Glicyna 4,0 Izfleucyna 3,4 Leucyna . 5,7 Prolina 2,7 60 Treonina 3,3 Seryna 2,3 Hydroksyprolina 0,06 Fenyloalanina 2,3 Kwas asparaginowy 4,8 95 Kwas glutaminowy 6,65 Lizyna 4,6 Metionina .1,7 Tyrozyna — Tryptofan — Podane ponizej przyklady omawiaja szczególowo sposób izolacji i syntezy masy bakteryjnej w warunkach labora¬ toryjnych.

Przyklad I. Pobrane próbki z osadów komorowych biologicznej oczyszczalni scieków drozdzowni zawieszano w podlozu o nastepujacym skladzie w 1 1 wody destylo¬ wanej : (NH4)2S04 — 1 g; Na2HP04 —2,1 g; NaH2P04 — 0,9 g; MgS04-7H20 —0,1 g; KC1 — 0,04 g; CaCl2 — 0,015 g; FeS04 • 7H20 — 1,0 mg; CuS04 • 5H20 — 5 fig; H3B04 — 10 fig; MnS04 • 5H20 — 10 fig; ZnS04 • 7H20 — 70 ug; Mo03 —10 ug; pH podloza 7,2. Metanol wprowa¬ dzono w stezeniu koncowym 1,5%. Hodowle prowadzono przez 5 dni, dodajac metanol w ilosci 0,5% po trzecim dniu hodowli. W dalszych czterech pasazach na podlozach plynnych z metanolem dodawano antybiotyki: penicyline — 1000 jedn/ml, streptomycyne — 100 //g/ml i polifungine —20 ug/ml. Hodowle prowadzono na wytrzasarce obroto¬ wej w temperaturze 30 °C w 500 ml kolbach. W pasazu trzecim i czwartym zastosowano podloze, jak w przykladzie II, utrzymujac stezenie metanolu w granicach 1,0—1,5%.

Czas hodowli w drugim pasazu skrócono do 3 dni, a dalsze do dwóch dni. Do inokulacji 100 ml stosowano 0,1—0,5 ml hodowli z poprzedniego pasazu. W wyniku zastosowanej procedury na,plytkach agarowych otrzymywano jednorod¬ nie wygladajace kolonie, które poddawano dalszym etapom oczyszczania i selekcji.

Przyklad II. Inokulum szczepu Pseudomonas ZB18 J26 Mut-15 w ilosci 1% obj. (okolo 10 mg s.m.) wprowa¬ dzano do podloza, zawierajacego w 1 1 wody destylowanej: (NH4)2S04 — 3 g; KH2P04- 3,0 g; MgSO4-7H20- 0,1 g; oraz FeCl3 —20 mg; CaCl2 • 2H20 — 0,6 mg; ZNS04 • 7H20 — 0,18 mg; CuS04 • 5H20 — 0,16 mg; MnSO4-4H2O^0,5mg; CoCl2 • 6H20 — 0,18 mg; Na2Mo04 • 2H20 —«- 0,3 mg; oraz fosforan sodu, który podawano w stezeniu, gwarantujacym buforowa pojemnosc 0,04 M dla utrzymania pH hodowli na poziomie nie niz¬ szym niz 6,5. Hodowle prowadzono 48 godzin w 500 ml kolbach Ehrlenmayera w temperaturze 30 °C na wytrza¬ sarce obrotowej o 280 obr/min. Metanol dodawano w dwóch porcjach 1% przed inokulacja i 0,5% po 36 godzinach.

Otrzymano 4,5 g suchej masy bakterii o podanym skladzie 2 11 podloza przy wykorzystaniu metanolu 0,30. !46 6

Claims (9)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania wysokobialkowej masy bakteryj¬ nej przez izolowanie i hodowanie w warunkach laboratoryj- 5 nych metylotrofów wzglednych, znamienny tym, ze ze scieków drozdzowni izoluje sie, stosujac selektywnie dzialajace antybiotyki i/hib sulfonamidy, szczep ZB18 J26 bakterii, nalezacych do rodzaju Pseudomonas lub otrzymane na drodze selekcji jego mutanty, takie jak ZB18 J26 Mut-15, 10 po czym bakterie te namnaza sie w warunkach tlenowych na *pozywce, zawierajacej metanol jako jedyne zródlo wegla.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym,ze próbki do izolacji metylotrofu pobiera sie z osadów komorowych 15 biologicznej oczyszczalni scieków, po czym proces izolacji prowadzi sie na podlozach plynnych, wzbogacanych w metanol, do których dodaje sie antybiotyki i/lub sulfona¬ midy. 20

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do izolacji metylotrofów stosuje sie takie antybiotyki, jak peni¬ cylina, oksycylina, streptomycyna, chloramfenikol, poli- fungina oraz karbenicilina.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze bakterie 25 namnaza sie w temperaturze 10—42 °C, najkorzystniej 30—35 °C, przy pH srodowiska 4,5—8,5, najkorzystniej 6,5—7,5, z czasem generacji okolo 180 minut, na pozywce mineralnej, zawierajacej jony NH4, P04, K, Na, Alg, mikroelementy oraz metanol. 30

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze po¬ zywke szczepi sie inokulum w ilosci 5—10%.

6. Sposób wedlugzastrz. 4, znamienny tym, 2e stosuje sie pozywke, której 1 litr zawiera 0,5—2,0 g fosforu, 1,0—2,5 g sodu, 0,2—0,5 g potasu, 0,01—0,05 g magnezu. 35

7. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje . sie pozywke w której w 1 litrze mikroelementy stanowi 3—20 mg zelaza, 0,1—1,0 mg wapnia, 0,04—0,08 mg cynku, 0,04—0,08 mg miedzi, 0,04—0,08 mg kobaltu, 0,1—0,3 mg manganu, 0,l-*-0,3 mg molibdenu. 40

8. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke, w której zawartosc wegla i azotu, wyrazajaca sie stosunkiem C/N, wynosi 15—20.

9. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze metanol 45 dodaje sie do pozywki sukcesywnie, utrzymujac jego stezenie w granicach 0,2—1 %.