CN110669674B - 一种反硝化真菌菌株及其分离方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环境微生物领域。具体地，本发明涉及一种异养好氧反硝化的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)真菌菌株，其于2019年4月28日保藏于湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019306。所述真菌菌株具有脱氮能力的生物活性，能够在有机碳源条件下通过异养好氧反硝化作用使水基溶液脱氮，从而用于处理生活废水中的亚硝酸氮和硝酸氮。在脱氮过程后，未检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。

Description

一种反硝化真菌菌株及其分离方法和用途
技术领域
本发明涉及环境微生物领域。具体地，本发明涉及一种反硝化的真菌菌株，特别涉及一种可大量消耗硝氮和/或亚硝氮的反硝化的真菌菌株。
背景技术
含氮废水是目前环境污染治理中的重大问题，去除水体中的氮在控制水体富营养化方面起到关键作用。生物脱氮是目前被公认为废水脱氮中高效低耗的方法之一。传统的氨氮废水处理方法是通过硝化作用和反硝化作用，两者组合将氨氮转化为氧化亚氮气体。
异养反硝化真菌易于培养，生长增殖速度较快，利用底物的范围广，稳定存在于废水生物脱氮系统中。因此采用异养反硝化菌来开发设计简捷的废水脱氮新的工艺，能够实现生物脱氮新工艺的快速启动和稳定运行，不仅提高脱氮效率，降低运行成本，还有望克服传统处理工艺中存在的问题，实现废水高效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题作出贡献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有脱氮生物活性的反硝化真菌菌株。更具体地，本发明提供一种可用于处理水基溶液、特别是含氮废水中硝氮和/或亚硝氮的真菌菌株。
本发明人通过将雅浦海底沉积物在以硝氮和/或亚硝氮为氮源的富集培养基中培育，随后进行分离、纯化和鉴定，得到一个杂色曲霉(Aspergillus versicolor)菌株，并且发现该菌株具有脱氮生物活性，可以通过异养好氧反硝化使水基溶液脱氮。在脱氮过程中，没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。由此，完成了本发明。
因此，在第一方面，本发明提供了一种真菌菌株，所述真菌为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，所述菌株于2019年4月28日保藏在湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M 2019306。
在第二方面，本发明提供一种真菌菌株用于消耗硝氮和/或亚硝氮的用途。
在第三方面，本发明提供一种使水基溶液脱氮的方法，所述方法包括：使根据本发明第一方面的真菌菌株在适合与水基溶液中硝氮和/或亚硝氮反应的反应条件下与水基溶液中硝氮和/或亚硝氮接触。
在一个实施方案中，所述反应条件包括在含有硝氮和/或亚硝氮的水基溶液、优选含有硝氮和/或亚硝氮的废水中，在有机碳源存在下，在好氧条件下，温度为24℃至28℃、优选为25℃，以及pH为7.0至7.5，优选为7.2。
在第四方面，本发明提供一种获得异养好氧反硝化的杂色曲霉(Aspergillusversicolor)真菌菌株的方法，其包括：在以硝氮和/或亚硝氮为氮源的富集培养基中孵育含杂色曲霉样本，直至观察到菌丝，以进行富集；优选地，所述富集可以进行一次或者多次例如两次、三次。
在一个实施方案中，所述富集培养基C/N的摩尔比例范围为7至9，更优选为8。
在一个实施方案中，所述富集培养基1L包含：NaNO3 1.0g至1.4g或NaNO2 0.8g至1.2g、CH3COONa·3H2O 7.0g至8.0g或者对应量的CH3COONa、K2HPO4·3H2O 7.5g至8.0g或对应量的K2HPO4、KH2PO4 1.2g至1.7g、MgSO4·7H2O 0.05g至0.1g或对应量的MgSO4、NaCl 30g至35g、微量元素配方2mL，用蒸馏水补至1L，其中所述微量元素配方1L包含：Na2EDTA63.7g、ZnSO4·7H2O 3.9g或对应量的ZnSO4、CaCl2 5.5g、MnCl2·4H2O 5.06g或对应量的MnCl2、FeSO4·7H2O 5.0g或对应量的FeSO4、Na2MoO4·2H2O 1.0g或者对应量的Na2MoO4、CuSO4 1.01g、CoCl2·6H2O 1.61g或者对应量的CoCl2，用蒸馏水补至1L。
在一个实施方案中，所述方法还包括：在适合用于分离杂色曲霉的分离培养基中培养富集得到的真菌；以及将在分离培养基中分离得到的菌落在纯化培养基中培养；所述分离培养基为寡营养的真菌培养基，所述纯化培养基是全营养的真菌培养基，所述真菌培养基可以为例如马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、察氏培养基(CDA)、麦芽浸出液琼脂培养基(MEA)、酵母麦芽糖琼脂培养基(YM)或沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括采用ITS序列(SEQ ID NO:1)对纯化得到的真菌进行鉴定。
在第五方面，本发明提供一种真菌菌株，所述真菌为杂色曲霉(Aspergillusversicolor)，是通过上述的方法获得的。
综上，本发明提供一种生长增殖速度快、易于培养、生产成本低、并且具有生物脱氮活性的异养反硝化的杂色曲霉真菌菌株。该异养反硝化真菌菌株能够持续地消耗含有硝氮和/或亚硝氮的水基溶液如废水中硝氮和/或亚硝氮，由此提供一种高脱氮效率、环保、无二次污染、低成本、易操作的废水处理的新工艺。因此，本发明的异养反硝化的杂色曲霉真菌菌株能够实现对废水进行高效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题提供新的解决方案。
附图说明
图1是根据本发明的曲霉菌株GA8的菌落形态特征。
图2是根据本发明的曲霉菌株GA8在显微镜下的菌丝形态特征。
图3是根据本发明的曲霉菌株GA8在以NO2 -为唯一氮源的培养基中产生N2O的7天浓度曲线图。
图4是根据本发明的曲霉菌株GA8在分别以硝酸钠和亚硝酸钠为唯一氮源的模拟废水中硝酸钠和亚硝酸钠的七天浓度曲线图。
具体实施方式
下面对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明技术方案进行修改。
如上所述，本发明人通过将雅浦海底沉积物在以硝氮和/或亚硝氮为氮源的富集培养基中培育，随后进行分离、纯化和鉴定，得到一个杂色曲霉(Aspergillus versicolor)菌株，并且发现该菌株具有脱氮生物活性，可以通过异养好氧反硝化使水基溶液脱氮。在脱氮过程中，没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。
因此，在第一方面，本发明的真菌菌株提供了一种真菌菌株，所述真菌为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，所述菌株于2019年4月28日保藏在湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M 2019306。
如上文和下文所述，该菌株是采用雅浦海底沉积物和富集培养基获得的。具体地，使采用雅浦海底沉积物在以硝氮(例如硝酸钠)和/或亚硝氮(例如亚硝酸钠)为氮源的富集培养基中培育一段时间，例如20-25天，直至长出明显的菌丝，即完成富集。随后对所富集出来的真菌进行分离、纯化和鉴定，由此得到上述保藏菌株。
在第二方面，本发明涉及本发明第一方面的真菌菌株用于消耗硝氮和/或亚硝氮的用途。
如本文实施例部分所证实，本发明人发现，在进一步将分离并纯化出来的杂色曲霉放入反硝化检测培养基(以亚硝酸钠为唯一氮源)进行培养时，发现本发明的保藏菌株成功地将硝酸和亚硝酸转化为氧化亚氮N2O。并且，进一步检测模拟废水中亚硝氮和/或硝氮的消耗情况，发现本发明的保藏菌株成功且高效地降低了模拟废水中亚硝氮和硝氮的含量/浓度。
通过上述方式获得的真菌可以用于脱氮，具体地，通过消耗亚硝氮和/或硝氮来脱氮。
在第三方面，本发明涉及一种使水基溶液脱氮的方法，所述方法包括：使本发明第一方面的真菌菌株在适合与水基溶液中硝氮和/或亚硝氮反应的反应条件下与水基溶液中硝氮和/或亚硝氮接触。
在一个具体实施方案中，所述反应条件可以包括在含有亚硝氮和/或硝氮的水基溶液，在有机碳源存在下，在好氧条件下，温度为24℃至28℃，以及pH为7.0至7.5。
在一个优选的实施方案中，所述含有亚硝氮和/或硝氮的水基溶液可以为含有亚硝氮和/或硝氮的废水。
在另一个优选的实施方案中，温度可以为25℃。
在又另一个实施方案中，pH可以为7.1、7.2、7.3、7.4或7.5；优选地，pH可以为7.2。
在第四方面，本发明提供一种获得异养好氧反硝化的杂色曲霉真菌菌株的方法，其包括：在以硝氮和/或亚硝氮为氮源的富集培养基孵育含杂色曲霉样本，直至观察到菌丝，以进行富集。
在一个优选实施方案中，所述富集可以进行一次或者多次例如两次、三次。
在一个优选实施方案中，富集培养基中的C/N的摩尔比例范围可以为7至9，优选为8。
在一个具体实施方案中，所述富集培养基1L可以包含：NaNO3 1.0g至1.4g、CH3COONa·3H2O 7.0g至8.0g或者对应量的CH3COONa、K2HPO4·3H2O 7.5g至8.0g或对应量的K2HPO4、KH2PO4 1.2g至1.7g、MgSO4·7H2O 0.05g至0.1g或对应量的MgSO4、NaCl 30g至35g、微量元素配方2mL，用蒸馏水补至1L。
在另一个具体实施方案中，所述富集培养基1L可以包含：NaNO2 0.8g至1.2g、CH3COONa·3H2O 7.0g至8.0g或者对应量的CH3COONa、K2HPO4·3H2O 7.5g至8.0g或对应量的K2HPO4、KH2PO4 1.2g至1.7g、MgSO4·7H2O 0.05g至0.1g或对应量的MgSO4、NaCl 30g至35g、微量元素配方2mL，用蒸馏水补至1L。
在一个进一步的具体实施方案中，其中所述微量元素配方1L可以包含：ZnSO4·7H2O 3.8g至4.0g或对应量的ZnSO4、CaCl2 5.3g至5.7g、MnCl2·4H2O 5.0g至5.1g或对应量的MnCl2、FeSO4·7H2O 4.8g至5.2g或对应量的FeSO4、Na2MoO4·2H2O 0.8g至1.2g或对应量的Na2MoO4、CuSO4 0.9g至1.1g、CoCl2·6H2O 1.5g至1.7g或对应量的CoCl2、Na2EDTA 61g至66g，用蒸馏水补至1L。其中Na2EDTA是一种螯合剂，起保护微量元素的作用。
在一个优选实施方案中，1L微量元素配方可以包括：ZnSO4·7H2O 3.9g或对应量的ZnSO4、CaCl2 5.5g、MnCl2·4H2O 5.06g或对应量的MnCl2、FeSO4·7H2O 5.0g或对应量的FeSO4、Na2MoO4·2H2O 1.0g或对应量的Na2MoO4、CuSO4 1.01g、CoCl2·6H2O 1.61g或对应量的CoCl2、以及Na2EDTA 63.7g。
在一个优选的实施方案中，所述富集培养基可以同时包含NaNO2和NaNO3。
在一个优选实施方案中，经配制的富集培养基还经历灭菌步骤，所述灭菌是本领域技术人员熟知的，例如通过高温高压灭菌。更优选地，经配制的富集培养基在经历灭菌、冷却后加入抗生素以抑制富集过程的细菌生长。所述抗生素优选地为氨苄青霉素、氯霉素或其组合。在富集培养基中，所添加的抗生素的浓度100μg/mL。
在一个实施方案中，所述方法还包括：在适合用于分离杂色曲霉的分离培养基中培养富集得到的真菌。
所述分离培养基为寡营养的真菌培养基，所述真菌培养基可以为例如马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、察氏培养基(CDA)、麦芽浸出液琼脂培养基(MEA)、酵母麦芽糖琼脂培养基(YM)或沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)。各真菌培养基的全营养成分可以如下表1所示。
表1.真菌培养基的全营养成分
Figure BDA0002170001960000061
Figure BDA0002170001960000071
在一个优选实施方案中，所述分离培养基为寡营养的PDA培养基或SDA培养基。
在本文中，所谓“全营养”是指本领域惯用的培养基所包含的全部营养成分，例如从Thermo Fisher Scientific公司商购得到的Oxoid品牌的CMA干粉制剂，根据该商品的说明书中所示比例配制得到的CMA培养基所包含的营养成分。所谓“寡营养”是相对于本领域惯用的培养基所包含的全部营养成分而言，例如通过稀释等手段使得培养基中营养成分的浓度低于全营养的真菌培养基的浓度。
在一个优选实施方案中，分离培养基含有全营养培养基10％至50％、优选为15％至40％，例如20％、25％、30％或35％，更优选为20％的营养。这是为了模拟海洋环境，刺激长期在寡营养环境中生存的真菌的生长。
在一个实施方案中，所述在分离培养基中培养的条件可以包括：在好氧条件下，温度为24℃至28℃，所述分离培养基的pH为7.0至7.5，培养20天至25天。
在一个进一步的实施方案中，所述分离培养基的pH可以为7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。
在一个优选实施方案中，所述在分离培养基中培养的条件可以包括：在好氧条件下，温度为25℃，所述分离培养基的pH为7.2，培养20天至25天。
在一个优选实施方案中，所述在分离培养基中培养可以重复一次或者多次，例如重复2、3、4或5次，优选重复2至3次，直到有明显的菌丝生长出来。所述在分离培养基中培养优选地重复2次。
在一个实施方案中，所述方法还将在分离培养基中分离得到的菌落在纯化培养基中培养。
在一个具体实施方案中，所述纯化培养基是选自例如PDA、CDA、MEA、YM或SDA的全营养的真菌培养基。
在一个优选实施方案中，所述纯化培养基是全营养的PDA培养基。
在一个优选实施方案中，所述纯化步骤可以重复一次或多次，例如重复2、3、4或5次，优选重复2至3次，直到得到含有绒毛状菌株的菌落。
经富集、分离、然后纯化，得到1株脱氮效果较好(即反硝化作用较好)的菌株。该曲霉菌株在固体平板培养基上呈现的的菌落形态特征如图1所示：菌落为圆形，质地疏松，呈绒状。菌落最初为白色，后正面中间部分为绿色，边缘白色，背面中间绿色，边缘白色。图2进一步示出了该菌株在显微镜下的菌体形态特征，从该图中可以看出：该菌株的菌丝发达，有分枝，无色；分生孢子梗较短或稍弯曲。
在一个进一步的实施方案中，所述方法可以包括采用ITS序列(SEQ ID NO:1)对纯化得到的真菌进行鉴定。
为了进一步确认所得到的真菌即为杂色曲霉，提取所获得菌株的DNA。把提取的DNA采用引物ITS4(SEQ ID NO:2：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS5(SEQ ID NO:3：5′-TCCTCCGCTTATTGATAGC-3′)并用PCR技术扩增得到ITS序列(SEQ ID NO:1)，并将该序列与NCBI数据库中的相应序列进行序列比对，以相似度为≥97％，优选为98％至100％标准确定该真菌的种属关系。结合上述形态学检测结果以及该ITS鉴别，发现本发明人得到的菌株即为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，其被命名为GA8。
综上，本发明提供一种具有生物脱氮活性的异养反硝化的杂色曲霉真菌菌株，其易于培养，生长增殖速度快，利用底物的范围广，因此生产成本低廉。该异养反硝化的杂色曲霉真菌菌株能够稳定存在于含有硝氮和/或亚硝氮的水基溶液如废水中，并持续地消耗其中硝氮和/或亚硝氮，由此提供一种废水处理的新工艺。该工艺不仅具有提高的脱氮效率、环保、无二次污染，而且低成本、易操作。因此，本发明的异养反硝化的杂色曲霉真菌菌株能够实现对废水进行高效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题提供新的解决方案。
下文中，结合示例性的实施方案会更详细地描述本发明。然而，本文公开的示例性的实施方案仅出于示例的目的，而不应该被认为旨在解释本发明的范围。
实施例1.菌株分离和纯化
配制富集培养液I(以NO3 -唯一氮源)。1L经配制的富集培养基包括：1.0g NaNO3、7.85g CH3COONa·3H2O、7.9g K2HPO4·3H2O、1.5g KH2PO4、0.1g MgSO4·7H2O、30g NaCl、2mL微量元素配方，蒸馏水补足至1L。其中，微量元素配方是1L中含有：63.7g Na2EDTA、3.9gZnSO4·7H2O、5.5g CaCl2、5.06g MnCl2·4H2O、5.0g FeSO4·7H2O、1.0g Na2MoO4·2H2O、1.01g CuSO4、1.61g CoCl2·6H2O、用蒸馏水补至1L。pH值调节至7.2。在将配制得到的培养液灭菌，并在冷却之后加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素(用于抑制样品中的细菌的生长)，混合均匀制得富集培养液I。
富集培养。把雅浦海底沉积物样品稀释10-1，然后吸取稀释后的样品1mL，打入到上述富集培养液I中，并在25℃、氧气充足的条件下震荡培养。待有明显的菌丝成长时，在抽取有菌丝的培养液1mL，打入到新的富集培养基I中，再次以相同的条件进行二次富集培养。富集培养总共需要大概20至25天，此时有明显的菌丝生长出来，即为富集完成。
分离与纯化。准备20％营养的PDA分离培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，其包含马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g和琼脂粉15.0g。该分离培养基中还含有100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素。吸取二次富集培养的含NO3 -的富集培养液I涂布在20％营养的培养基平板上，然后把平板上的液体涂布均匀，25℃下培养待有明显的菌落长出时，挑取个菌落菌丝接种在PDA培养基中，得到纯种的真菌。
实施例2.菌株分离和纯化
配制富集培养液II(以NO2 -唯一氮源)。1L经配制的富集培养基包括：0.85g NaNO2、7.85g CH3COONa·3H2O、7.9g K2HPO4·3H2O、1.5g KH2PO4、0.1g MgSO4·7H2O、30g NaCl、2mL微量元素配方，蒸馏水补足至1L。其中，微量元素配方是1L中含有：63.7g Na2EDTA、3.9gZnSO4·7H2O、5.5g CaCl2、5.06g MnCl2·4H2O、5.0g FeSO4·7H2O、1.0g Na2MoO4·2H2O、1.01g CuSO4、1.61g CoCl2·6H2O、蒸馏水补足至1L。pH值调节至7.2。在将配制得到的培养液灭菌，并在冷却之后加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素(用于抑制样品中的细菌的生长)，混合均匀制得富集培养液II。
富集培养。除使用含NO2 -的富集培养液II之外，其他条件和步骤与制备实施例1相同。
分离与纯化。除使用含NO2 -的富集培养液II之外，其他条件和步骤与制备实施例1相同。
实施例3.真菌的生物学鉴定
真菌的生物学鉴定主要是对其真菌的菌丝的显微结构进行鉴定，具体步骤如下：
首先配制玉米粉琼脂培养基(CMA，见表1)，并用配制好的该培养基倒板，在倒平板时尽量薄一点。用接种环挑取一环菌落，并在培养基上“之”字型划线。在划过线的培养基中用手术刀切出两个长方形培养基，并把它取出来，放上盖玻片后在25℃的恒温箱里培养7天。将培养皿放在倒置显微镜(Olympus IX51)，找出有代表性的菌落，并拍摄照片。
图1示出了该曲霉菌株GA8在固体平板培养基上呈现的菌落特征：菌落为圆形，质地疏松，呈绒状；菌落最初为白色，后正面中间部分为绿色，边缘为白色，背面中间为绿色，边缘为白色。图2示出了该曲霉菌株GA8在显微镜下的菌体形态特征，从该图中可以看出：该菌株的菌丝发达，有分枝，无色；分生孢子梗较短或稍弯曲。
实施例4.基因序列分析
对已经得到纯种的真菌，刮去菌丝，利用FastDNATM SPIN Kit for Soil试剂盒提取菌种的DNA。提取的DNA在热循环仪上通过ITS4(SEQ ID NO:2：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS5(SEQ ID NO:3：5′-TCCTCCGCTTATTGATAGC-3′)的引物扩增基因组的ITS序列，其序列的长度大约是600bp。扩增好的ITS序列(SEQ ID NO:1)的PCR产物委托上海美吉测序公司公司进行26SrDNA-ITS区基因序列分析，测序成功后对真菌的ITS序列用BioEdit软件去除多余序列，保留波峰较整齐部分的序列，然后对真菌的ITS序列进行Blast分析比对，根据序列相似度98％至100％为标准来确定真菌种属地位。结合在实施例3观察到的形态和显微菌丝结构，鉴定该菌株为曲霉属的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，于2019年4月28日保藏在湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M 2019306。
SEQ ID NO:1的序列如下：
Figure BDA0002170001960000111
Figure BDA0002170001960000112
Figure BDA0002170001960000121
实施例5.反硝化潜能检测
配制反硝化检测培养基(以亚硝酸钠为唯一氮源)：每1L H2O中含有蔗糖30g、NaNO21.62g、KH2PO4 1g、KCl 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g，pH为7.0至7.4。上述培养液装于厌氧瓶中，每500mL的厌氧瓶中分装200mL的上述培养液，分装完毕后灭菌(在培养基中加入抗生素以防止细菌生长)。需注意：该厌氧瓶中留有足够的氧气，使得反应在好氧条件下进行。
然后在灭菌之后的培养基中接种真菌GA8，之后对厌氧瓶进行密封。放入25℃的环境中以120r/min震荡培养7天，在第1至7天每天从厌氧瓶中取出20mL气体储存在储气袋中，通过气相色谱仪确定所产生氧化亚氮N2O的浓度(见表2)。根据菌株在培养基产生的氧化亚氮的浓度，作浓度曲线，并将其与空白培养基(第0天)的氧化亚氮浓度进行对比，由此判断菌种针对NO2 -的反硝化能力(见图3)。从表2和图3可以看出，本发明菌株GA8能够在好氧条件下较好地利用亚硝酸钠作唯一氮源进行反硝化活动，并将亚硝酸钠最终转化为N2O气体。菌株GA8具有较强的好氧反硝化能力，其中在培养第1至7天中，N2O气体的浓度持续增加。在第5天，N2O气体的浓度增加最多。
表2.N2O的7天浓度
Figure BDA0002170001960000131
实施例6.废水中NO3 -消耗检测
配制人工模拟废水，组成如下：每1000mL H2O中含有蔗糖9.782g、NaNO3 2.89g、K2HPO4 1g、KCl 1.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g，pH为7.0～7.4。
该人工模拟废水以硝酸钠为唯一氮源，氮的初始浓度为476.0mg/L，废水中的碳氮摩尔比为10。在该废水中接种真菌GA8，放入25℃的环境中以120r/min震荡培养。在该人工模拟废水中培养7天，每天采用紫外分光光度法(参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版))检测该废水中的硝酸盐浓度。
下表3中列出了该模拟废水的连续7天的硝酸盐的浓度。培养3天后，硝酸钠的浓度降解至262.40mg/L，消耗了44.9％的硝酸钠；培养4天后，硝酸钠浓度降至164.38mg/L，消耗了65.5％的硝酸钠；培养7天后，培养基中剩余的硝酸钠浓度为101.11mg/L，消耗了78.8％的硝酸钠。可见，培养3至4天时硝酸钠的消耗效率达到最大。图4示出了该模拟废水中硝酸盐浓度随着培养天数的变化图。
表3.废水中的硝酸钠的浓度(单位为mg/L)
Figure BDA0002170001960000141
由以上数据可以获知，本发明菌株GA8能够在好氧条件下较好地利用硝酸钠作唯一氮源进行反硝化活动，并将硝酸钠最终转化为N2O气体。菌株GA8具有较强的好氧反硝化能力，其中在培养第3天的反硝化速率最高，当天消耗了约28％的硝酸钠。
实施例7.废水中NO2 -消耗检测
配制人工模拟废水，组成如下：每1000mL H2O中含有蔗糖9.782g、NaNO2 2.346g、K2HPO4 1g、KCl 1.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g，pH为7.0～7.4。
该人工模拟废水以亚硝酸钠为唯一氮源，其初始浓度为476.0mg/L，废水中的碳氮摩尔比为10。在该废水中接种真菌GA8，放入25℃的环境中以120r/min震荡培养。在该人工模拟废水中培养7天，每天采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版))检测该废水中的亚硝酸钠浓度。
下表4中列出了该模拟废水中连续7天的亚硝酸盐的浓度。培养3天后，亚硝酸钠的浓度降解至94.10mg/L，消耗了80.2％的亚硝酸钠；培养4天后，亚硝酸钠的浓度降至48.96mg/L，消耗了89.7％的亚硝酸钠；培养7天后，废水中剩余的亚硝酸钠的浓度为35.96mg/L，消耗了92.4％的亚硝酸钠。图4同样也示出了该模拟废水中亚硝酸钠浓度随着培养天数的变化图。
表4.废水中的亚硝酸钠的浓度(单位为mg/L)
Figure BDA0002170001960000151
由以上数据可以获知，本发明菌株GA8能够在好氧条件下较好地利用亚硝酸钠作唯一氮源进行反硝化活动，并将亚硝酸钠最终转化为N2O气体。该菌株具有较强的好氧反硝化能力，其中在培养第三天的反硝化速率最高，当天消耗了约70％的亚硝酸钠。
序列表
<110> 自然资源部第三海洋研究所
中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一种反硝化真菌菌株及其分离方法和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 535
<212> DNA
<213> 杂色曲霉(Aspergillus versicolor)
<400> 1
gatccgaggt cacctgaaga aatggttgga gacgtcggct ggcgcccggc cggccctagt 60
cgagcgggtg acaaagcccc atacgctcga ggaccggaca cggtgccgcc gctgcctttc 120
gggcccgtcc cccggggggg acgacgaccc aacacacaag ccgggcttga tgggcagcaa 180
tgacgctcgg acaggcatgc cccccggaat gccagggggc gcaatgtgcg ttcaaagact 240
cgatgattca ctgaattctg caattcacat tacttatcgc agttcgctgc gttcttcatc 300
gatgccggaa ccaagagatc cattgttgaa agttttgact gattttatat tcagactcag 360
actgcatcac tctcaggcat gaagttcagt agtccccggc ggctcgcccc cgagggggtt 420
ccccgccgaa gcaacagtgt taggtattca cgggtgggag gttgggcgcc cggaggcagc 480
ccgcactcag taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgact 535
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatagc 19

Claims (7)

1.一种真菌菌株，所述真菌为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，所述菌株于2019年4月28日保藏在湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M 2019306。
2.权利要求1所述的真菌菌株用于消耗硝氮和/或亚硝氮的用途。
3.一种使水基溶液脱氮的方法，所述方法包括：使根据权利要求1所述的真菌菌株在适合与水基溶液中硝氮和/或亚硝氮反应的反应条件下与水基溶液中硝氮和/或亚硝氮接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反应条件包括在含有硝氮和/或亚硝氮的水基溶液，在有机碳源存在下，在好氧条件下，温度为24℃至28℃，以及pH为7.0至7.5。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述含有硝氮和/或亚硝氮的水基溶液为含有硝氮和/或亚硝氮的废水。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述温度为25℃。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，所述pH为7.2。
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