NO871501L - Fremgangsmaate for paavisning og telling av sulfatreduserende bakterier. - Google Patents

Abstract

ELISA metode for påvisning og telling av sulfatreduserende bakterier i en gitt prøve. Metoden omfatter hvert eller begge av trinnene for immobilisering av bakterieceller på en bæreinnretning ved tilføring av et immobiliserende middel valgt fra en titanhydroksyd-suspensjon og en zirkoniumhydroksyd-suspens jon og blokkering av ikke-spesifikke bindingssteder med et blokkerende middel omfattende en kaseinbuffer.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for påvisning og telling av sulfatreduserende bakterier og spesielt vedrører oppfinnelsen en enzymbundet-immunosorbent-testmetode

(ELISA).

Sulfatreduserende bakterier har dette navn fordi bakteriene får sin energi ved å redusere sulfationer i omgivelsene til sulfidioner. Det er denne evnen hos bakteriene som gjør tilstedeværelsen av sulfatreduserende bakterier i visse omgivelser til et problem.

En industri hvor tilstedeværelsen av sulfatreduserende bakterier i bestemte områder kan være særlig problematisk, er oljeindustrien. Sulfatreduserende bakterier vokser i vann-basen i oljebærende lag og leirskifer, i boreslammet som anvendes for oljeundersøkelser og i sjøvann, som anvendes for a fylle pilarene til oljeriggene for å øke deres stabilitet og for å fylle ballasttankene. Dessuten formerer bakteriene seg raskt i slike omgivelser. Sulfidionene som er dannet som et resultat av at sulfatreduserende bakterier reduserer sul-fationene som vanligvis er tilstede i sjøvann, kan imidlertid forårsake korrosjon i rørverket og i selve plattformen og kan "surgjøre" oljen som fremstilles og lagres på en oljerigg. Det er derfor svært viktig at sulfatreduserende bakterier i umiddelbar nærhet av en oljerigg elimineres så langt det er mulig, og, for å oppnå dette, er biocider vanlig anvendt.

For å undersøke om et biocid har vært effektivt, er det imidlertid nødvendig å ta prøver fra forskjellige deler av en oljerigg og deretter bestemme antall sulfatreduserende bakterier, dersom der er noen, i hver prøve.

Inntil nylig, var den mest vanlig anvendte metoden for påvisning og telling av sulfatreduserende bakterier en mest sann-synlig antalls-test som omfatter en rekke serumflasker inneholdende 9 ml Postgate's B medium eller et annet passende medium som er blitt holdt under en inert gassatmosfære og sterilisert, idet man inokulerer en første flaske med 1 ml av prøven ved anvendelse av en steril engangssprøyte, rysteor den første flasken kraftig og fjertnæ<p>rderetter1 ml fra denne flasken for å inokulere en annen flaske. Denne fortynnings-prosedyren ble gjentatt inntil man oppnådde en fortynning på 10^ og tre til fem parallelle prøver av hver fortynning ble fremstilt. Flaskene ble inkubert ved en temperatur fra 5°C til romtemperatur i 14 døgn. Alle flasker som viste sort-farging av innholdet innen denne tid ble regnet for å være positive, dvs. at bakterier var til stede. Antall sulfatreduserende bakterier som var tilstede ble deretter anslått ved å referere til tabeller for det mest sannsynlige antall.

Den ovennevnte metoden er anbefalt av "National Association of Corrosion Engineers task group". Det er imidlertid også mulig å anvende lignende tester for å anslå det mest sannsynlige antall bakterier, ved å anvende forskjellige flytende medier. Alle slike tester for å bestemme det mest sannsynlige antall bakterier og som anvender flytende medier, virker på samme måte, dvs. at det flytende vekstmediet inneholder en passende komponent som forandrer farge som svar på biprodukt-ene som fremstilles ved hjelp av de sulfatreduserende bakteriene, og dermed muliggjør en identifisering av positive

prøver. Slike metoder har imidlertid en rekke mangler.

Et av hovedproblemen med slike metoder er at sulfatreduserende bakterier erfaringsmessig er vanskelig å dyrke, således at ikke alle synlige bakterier i prøven vil overleve og pro-dusere tilstrekkelige biprodukter slik at de kan påvises, og ikke-synlige bakterier som er tilstede vil ikke bli påvist i det hele tatt. På grunn av vanskelighetene i forbindelse med dyrking av sulfatreduserende bakterier, kan det også ta flere døgn for bakteriene å fremstille tilstrekkelige biprodukter for å oppnå en fargeforandring og, det anbefales at behold-erne oppbevares i 1 mnd. før et negativt resultat, dvs. totalt fravær av sulfatreduserende bakterier, fastslåes. Dette gjør metoden svært tidskrevende og av liten praktisk nytte når det kreves en dag-til-dag-måling. Dessuten vil ikke alle typer av sulfatreduserende bakterier vokse i et spesielt vekstmedium, noe som betyr at antall flasker som viser en positiv fargeforandring sannsynligvis vil være lavere enn det det i virkeligheten skulle være. Et av pro-blemene i forbindelse med denne metoden og med alle tester av denne type som vedrører det mest sannsynlige antall bakterier, er at antall bakterier tilstede til sist bestemmes ut fra standard sannsynlighetstabeller på grunnlag av antall positive resultater oppnådd i alle fortynningene og derfor, dersom et unormalt lavt antall positive resultater oppnås ved en fortynning, vil det endelige antall reduseres selv om det lave antall positive resultater kan ha vært fullstendig feil. Det faktum at sulfatreduserende bakterier erfaringsmessig er vanskelig å dyrke, gjør denne testen enda mere ømfintlig overfor feil på dette grunnlag.

Det vil klart være ønskelig å tilveiebringe en fremgangsmåte for påvising og telling av sulfatreduserende bakterier som ikke lider av de ovennevnte ufordelaktigheter, dvs. en fremgangsmåte som er relativ hurtig og tillater direkte bestem-melse av antall sulfatreduserende bakterier som er tilstede, uavhengig av type eller om bakteriene er synlige eller ikke.

I de siste ti årene, er ELISA teknikker blitt utviklet som muliggjør at forskjellige bakterier påvisesog studeres lett-ere enn ved hjelp av vanlige anvendte metoder og kvantitative ELISA teknikker er utviklet for telling av slike bakterier. En typisk kvantitativ ELISA metode innebærer at forskjellige fortynninger av en prøve og standarder som inneholder et kjent antall bakterieceller tilføres til en passende bæreinnretning, dvs. en mikrotiter-plate, hvorpå cellene på bæreinnretningen immobiliseres og et antiserum overfor de aktuelle bakteriene tilføres, et antistoff som er konjugert til et enzym tilføres, et enzymsubstrat tilføres og en passende reaksjons-terminator tilføres hvorpå absorbansen for prøven og standardene bestemmes ved en bestemt bølgelengde i f.eks. en mikrotiter-plateavleser.

Slike kvantitative ELISA metoder har vist seg å ha en sensi-tivitet og spesifisitet som kan sammenlignes med radioimmuno-assays og immonofluorescens-assays, men de er mye mer fordel-aktige enn slike metoder. På grunn av den tiden som imidlertid kreves for å gjennomføre nødvendig inkubasjon og vaske-trinn mellom trinnene som er angitt over, vil det enda ta omtrent to døgn å utføre slike metoder. Dessuten er nøy-aktigheten av de oppnådde resultatene sterkt påvirket av effektiviteten når det gjelder immobilisering av cellene som tilføres bæreinnretningen, da alle cellene som ikke er immobilisert rett og slett vil bli vasket bort i det første vasketrinnet hvormed antall celler som påvises i testen reduseres og man oppnår et kunstig lavt resultat. Nøyaktig-heten av resultatene påvirkes også av tilstedeværelsen av ikke-spesifikk binding av antiserumet og et annet antistoff (bundet til et enzym) til immunogenet og direkte til bæreinnretningen. Blokkerende midler, slik som Tween 20, er blitt anvendt i fortynningsbufferne og vaskemidlene i et forsøkt på å blokkere disse ikke-spesifikke bindingsstedene. Slike vanlig anvendte blokkeringsmidler har imidlertid ikke vist seg å være fullstendig effektive.

I følge den foreliggende oppfinnelse har man tilveiebragt en ELISA metode for påvisning og telling av sulfatreduserende bakterier i en gitt prøve, som omfatter (a) immobilisering av bakterieceller på en bæreinnretning ved tilføring av et immobiliserende middel valgt fra en titanhydroksyd-suspensjon og zirkoniumhydroksyd-suspensjon; og/eller (b) blokkering av ikke-spesifikke bindingssteder ved at immobiliserte celler behandles med et blokkerende middel omfattende en kaseinbuffer.

Det er særlig foretrukket at en titanhydroksyd-suspensjon anvendes som immobiliserende middel og det er også foretrukket at volumet av det anvendte immobiliserende middel med hensyn til hver prøve er 1/5 av volumet av prøven. Foretrukket, omfatter kaseinbufferen 10 mM/1 tris (hydroksymetyl) aminometan i hydroklorid med pH 7,6, inneholdende 154 mM/1 natriumklorid og 0,5% (w/v) kasein. Kaseinbufferen kan også inneholde det antimikrobielle middel Thimerosal (Sigma Chemical Company Ltd., Poole, Dorset), foretrukket i en konsentrasjon på 0,02% (w/v).

Det er også foretrukket at bæreinnretningen er en mikrotiter-plate.

Anvendelsen av en titanhydroksyd-suspensjon, eller en zirkoniumhydroksyd-suspensjon som immobiliserende middel for sulfatreduserende bakterieceller, har vist seg å være langt mere effektivt enn konvensjonelt anvendte immobiliserende midler. Således har titanhydroksyd vist seg å være særlig fordelaktig idet titanhydroksyd har vist seg å immobilisere omtrent 95% av bakteriecellene som er tilstede i prøven. Dessuten, på grunn av den større effektiviteten av disse immobiliserende midlene, kan inkubasjonstiden som kreves ved de ulike trinnene i prosedyren reduseres betraktelig sammenlignet med vanlig anvendte ELISA teknikker. F.eks., når man anvender titanhydroksyd, er den initielle inkubasjonsperioden som følger umiddelbart etter tilføring av det immobiliserende middel, bare 30 min., mens en inkubering over natten normalt kreves ved vanlige anvendte ELISA metoder.

Innledende forsøk, hvori vanlig anvendte reagenser, som anvendes ved vanlige ELISA teknikker, ble tilført til sulfatreduserende bakterier, hadde et svært høyt antall ikke-spesifikke bindinger som forårsaker høye bakgrunns-absorp-sjonsavlesninger. Anvendelse av en kaseinbuffer, som, skjønt den allerede er kjent, aldri har vært anvendt tidligere i forbindelse med ELISA teknikker som omfatter bakterier, er funnet å eliminere dette problemet i stor grad. Man tror at kaseinbufferen er et spesielt effektivt blokkerende middel fordi det er heterogent og det er derfor i stand til å blok kere flere ikke-spesifikke bindingssteder enn vanlig anvendte blokkerende midler.

En betydelig forbedring i nøyaktigheten av resultatene sammenlignet med vanlige anvendte ELISA teknikker kan oppnås enten utelukkende ved anvendelse av en titan- eller zirkoniumhydroksyd-suspensjon som immobiliserende middel eller utelukkende ved anvendelse av en kaseinbuffer som blokkerende middel. Anvendelsen av begge disse suspensjonene sammen har imidlertid vist seg å være svært fordelaktig.

Et utførelseseksempel for den foreliggende oppfinnelse er vist i det følgende.

EKSEMPEL

( a) Fremstilling av materialer

Femten stammer av sulfatreduserende bakterier ble oppnådd fra "the National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland, AB9 8DG". Disse er vist i følgende tabell: Hver stamme ble deretter anvendt for å fremstille en homolog sulfatreduserende bakterieantigen-løsning som følger: Først ble stammen dyrket i et Postgate's medium C (Postgate, 1984) i en batchkultur. Etter fem døgn/ ble cellene høstet ved sentrifugering ved 2600xg i 30 min. ved 4°C og resus-pendert i fosfatbufret saltoppløsning (PBS), inneholdende 0,14 M/l natriumklorid og 25 mM/1 fosfatbuffer med pH 7,4, og sentrifugert. Den oppnådde celle-pellet ble deretter resus-pendert i PBS og en liten prøve ble tatt ut hvorfra cellekonsentrasjonen ble anslått ved anvendelse av et haemocyto-meter. Cellekonsentrasjonen ble deretter innstilt til omtrent 10 9celler per ml PBS.

De femten stammene av sulfatreduserende bakterier som er angitt over, ble også anvendt for å danne antiserum i hvite kaniner av type New Zealand som følger. Først ble kaninene tappet for pre-immunt serum og deretter ble de injisert med 1 ml av en suspensjon av en eneste stamme av sulfatreduserende bakterieceller med en konsentrasjon pa 10 9 celler per ml i PBS, blandet med et likt volum av Freund's fullstendige hjelpestoff. Kaninene ble reinokulert 10 døgn og 20 døgn etter den første injeksjon, men med en cellesuspensjon som var blandet med Freund's ufullstendige hjelpestoff. Det ble tatt blodprøver av kaninene etter 27 døgn og deretter hver uke. Dersom nivået av oppnådde antistoff gikk ned, ble kaninen gitt en ytterligere injeksjon av celler i Freund's ufullstendige hjelpestoff og deretter tappet for blod hver uke fremover. Alle blodprøvene ble tatt fra randvenen i øret. Blodprøvene fikk koagulere over natten ved 4°C og serumet ble lagret ved -20°C.

Antistoff-titeret for hvert antiserum ble bestemt ved hjelp av agglutinasjoner for hele celler i mikrotiter-plater som følger. Først ble 50^ul PBS tilsatt til hver brønn. Deretter ble hvert antiserum fbrtyrnet to ga-ga: i serie 21 ganger og det ufortynnede antiserum og hver fortynning ble individuelt og separat tilsatt til 22 påfølgende brønner for dermed å

oppnå en 22 brønnserie medøkende fortynning av antiserum.

50^ul av den homologe sulfatreduserende bakterieantigen-suspensjonen, fremstilt som beskrevet over, og med en konsentrasjon på 10 9 celler per ml i PBS, ble deretter til-

satt til hver brønn og platene ble tildekket og inkubert ved 4°C over natten. Platene ble deretter undersøkt og antistoff -titeret ble beregnet til å være den resiproke verdi av den siste to-ganger fortynning som viste agglutinasjon.

Polyvalente antiserum-løsninger ble deretter fremstilt ved å innstille agglutinasjons-titeret av antiserumet for hver stamme til 4096 og deretter blande like mengder av antiserumet av de utvalgte stammer.

En suspensjon av titanhydroksyd ble fremstilt ved at 40 ml destillert vann ble tilsatt til 2 g titanklorid hvorpå 5 M ammoniakkløsning ble tilsatt dråpevis med kontinuerlig omrør-ing inntil man oppnådde en pH-verdi på 7,0-7,2. Den dannede titanhydroksyd-suspensjonen ble deretter vasket 3 ganger med 1000 ml 0,85% (w/v) saltvann, hver gang ved blanding og bort-' suging, og den oppnådde suspensjon ble lagret i en flaske med skrukork i mørket inntil den skulle anvendes.

( b) ELISA metode

Prøvene som skulle undersøkes ble ekstrahert ved sentrifugering og re-suspendert i en 0,85% (w/v) natriumklorid-løsning. Prøvene og standardene ble deretter fortynnet til forskjellige konsentrasjoner i en 0,85% (w/v) natriumklorid-løsning og tilført til brønnene på mikrotiter-platene. For å immobilisere cellene, ble 50^ul av titanhydroksyd-suspensjonen tilsatt for hver 100^ul prøve eller standard som ble til-ført til brønnene og platene ble deretter rystet i 30 min. ved romtemperatur (20-24°C). Platene ble rystet for å

holde titan-hydroksydet i løsning og dermed øke effektiviteten av reaksjonen. Etter inkubasjons-perioden, ble platene vasket 3 ganger, hver gang i 3 min., i en kaseinbuffer som

inneholdt 10 mM/1 tris (hydroksymetyl) aminometanhydroklorid (tris-HCl) med pH 7,6, inneholdende 154 mM/1 natriumklorid og 0,5% (w/v) kasein (Hammarsten grad).

Et polyvalent antiserum til stammen 1, 2, 9, 10, 11, 13 og 14 av de sulfatreduserende bakterier som er angitt over, ble tatt og fortynnet 1:250 i kaseinbuffer. 150^ul av det fortynnede antiserum ble deretter tilført til brønnene på hver plate og platene ble inkubert ved 55°C i 90 min.

Etter inkubering, ble platene igjen vasket i kaseinbuffer 3 ganger, hver gang i 3 min.

Geite-anti-kanin IgG som var konjugert til pepperrot-peroksyd (Sigma Chemical Company Ltd., Poole, Dorset) ble fortynnet 1:500 i kaseinbuffer og 150^ul av denne løsningen ble tilsatt til brønnene på platene. Platene ble deretter inkubert ved 37°C i 2 timer. Etter inkubering, ble platene vasket 4 ganger, hver gang i en periode på 3 min., i PBS inneholdende 0,14 M/l natriumklorid og 25 mM/1 fosfatbuffer med pH 7,4. Kaseinbufferen kunne ikke anvendes i dette siste vasketrinnet, fordi kaseinbufferen er kollodial og dette ville derfor interferere med absorpsjons-avlesningen i det endelige trinn i metoden (se under).

Et passende enzymsubstrat ble deretter fremstilt ved å opp-løse 1,009 g 3, 3', 5, 5'-tetrametylbenziden i 100 ml dimetylsulfoksyd, idet 10 ml av denne løsningen ble tilsatt til 1 1 0,1 M/l natriumacetat-sitronsyrebuffer med pH 5,5 og tilstrekkelig hydrogenperoksyd ble tilsatt for å oppnå en konsentrasjon på 1,3 mM/1 hydrogenperoksyd i sluttløsningen. 200 ^ul'av denne ble deretter tilsatt til platene og platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur for å oppnå f argeutvikling.

50 ^ul 12,5% (v/v) svovelsyre ble deretter tilsatt til platene for å avbryte reaksjonen. Løsningene i hver plate ble deretter overført til en ren, ubrukt plate og absorpsjon en av prøvene og standard-løsningene ble deretter avlest ved en bølgelengde på 450 nm ved anvendelse av en mikrotiter-plateavleser. Overføring av test-løsninger til en ren plate var nødvendig, fordi titanhydroksyd-suspensjonen som anvendes for å immobilisere cellene har en tendens til å danne en film på brønnene som kan interferere med absorpsjons-avlesningen.

Antall sulfatreduserende bakterier i prøveløsningene ble bestemt ved å sammenligne absorpsjonen av prøveløsningene med den for standardløsningene.

ELISA metoden i henhold til oppfinnelsen som er vist i ovennevnte eksempel, muliggjør at så få som 50 celler per ml prøve kan påvises og telles, og testen kan utføres i løpet av 6 timer noe som muliggjør at testen kan gjennomføres i løpet av en enkelt arbeidsdag, selv med innledende ekstraksjoner av prøvene.

Således er metoden i henhold til oppfinnelsen hurtigere og mere nøyaktig enn vanlige ELISA teknikker og mye hurtigere og mere sensitiv enn de vanlig anvendte testene som bestemmer det mest sannsynlige antall.

Selv om metoden som er beskrevet i eksempelet anvender hele celler av de sulfatreduserende bakteriene, kan metoden like-ledes utføres ved anvendelse av sonikerte celler.

Claims (8)

1. ELISA metode for påvisning og telling av sulfatreduserende bakterier i en gitt prøve, karakterisert ved trinnene: (a) immobilisering av bakterieceller på en bæreinnretning ved påføring av et immobiliserende middel valgt fra en titanhydroksyd-suspens jon og en zirkoniumhydroksyd-suspensjon; og/ eller (b) blokkering av ikke-spesifikke bindingssteder ved at bæreinnretningen behandles med et blokkerende middel omfattende en kaseinbuffer.

2. ELISA metode som angitt i krav 1, karakterisert ved at det immobiliserende middel er en titanhydroksyd-suspensjon.

3. ELISA metode som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at volumet av det immobiliserende middel som anvendes med hensyn til hver prøve er halvparten av volumet av prøven.

4. ELISA metode som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at kaseinbufferen omfatter 10 mM/1 tris (hydroksymetyl) aminometanhydroklorid med pH 7,6 inneholdende 154 mM/1 natriumklorid og 0,5% (w/v) kasein.

5. ELISA metode som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at kaseinbufferen inneholder Thimerosal.

6. ELISA metode som angitt i krav 5, karakterisert ved at konsentrasjonen av Thimerosal i kaseinbufferen er 0,02% (w/v).

7. ELISA metode som angitt i krav 1-6, karakterisert ved at bæreinnretningen er en mikrotiter-plate, rør, seng, sil, stav eller pute.

8. ELISA metode, karakterisert ved at metoden i alt vesentlig er beskrevet i del (b) i det ovennevnte eksempel.