NO870008L - Bruk av tumornekrosefaktor som vektregulator. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er gjennomført med støtte fra USA's regjering under bevilgning GM 25821, gitt av det nasjonale he 1 se ins t i tut t. De Forente Staters regjering har visse rettigheter i forbindelse med oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår kontroll av lipidmetabolismen ved bruk av tumornekrosefaktor TNF. Spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å kontrollere sterk fedme eller fettsyke ved administrering av TNF.

Kontroll av sterk fedme er blitt et problem i utviklede kulturer på tross av det spektrum av sult som ofte dominerer deler av den mindre teknologisk fremskredne verden. Hovedtil-nærmelsen for de mindre enn vellykkede tilnærmelser som har vært benyttet i et forsøk på å kontrollere for høy kroppsvekt, er utvilsomt velkjente for de fleste. Løsningene ligger fra redusert næringsforbruk til ofte en ukritisk bruk av farmasøytika ment primært for andre formål, men som synes å ha en bivirkning med en noe ugjennomsiktlig mekanisme som resulterer i vekttap. Kort sagt forblir det millioner av mennesker som ønsker å redusere kroppsvekten uten deprivasjon og uten risiko for uønskede og eventuelt usunne bivirkninger.

Selvfølgelig er ikke alle vekttap nødvendigvis ønskelige. Således er vekttapet som skyldes kronisk katabolisk tilstand, kalt kakeksi, utviklet under infeksiøse eller ondartede sykdommer, et handikap å overvinne og er ofte direkte fatalt. Generelt er imidlertid kakeksi antatt å være en normal respons på infeksjon, og er uønsket kun når den tillates å skride frem uten den riktige kontroll. Katabolismen karakte-riseres ved en netto nedbrytning av lipider i adiposeceller, og det er antatt at denne uønskede balanse i det minste delvis er et resultat i cellenes manglende evne til å syntetisere tilstrekkelige mengder lipogene enzymer.

Et råproteinekstrakt fra media av endotoksin-stimulerte makrofager, kalt "kakektin", har vist seg å indusere indisier på kakeksi i vevkultur (Torti, F., et al. "Science" (1985) 229: 867-869), og antistoffer dyrket derimot har vist seg å beskytte mus fra noen av virkningene av E. coli lipopolysakk-aridendotoksin (Beutler, B., et al. ibid, s. 869-871).

Det er nu vist at tumornekrosefaktor, TNF, spesifikt endrer adipocyters karakteristika i vevkultur på en måte som antas å være en modell for minst en del av kakeksi-prosessen. Senere arbeider har antydet at kakektin og nativ TNF som opprinnelig ble oppnådd fra sera av endotoksinbehandlede mus, og som nu er tilgjengelige i rekombinant form, har den samme primære struktur. I henhold til dette er TNF et brukbart materiale for vektkontroll ved stimulering av denne katabolske reaksjon under kontrollerte tilstander og under omstendigheter der slik stimulering er ønskelig. Det er også mulig å kontrollere uønsket vekttap ved nøytralisering av TNF.

Oppfinnelsen tilveiebringer en definert farmasøytisk tumor-nekrosef aktor , TNF, som er istand til å stimulere den fysiologiske tilstand i forbindelse med kakeksi. Kontrollen av vekt hos adipøse personer gjennomføres derved ved bruk av et materiale som stimulerer en naturlig fysiologisk respons mot infeksjoner under tilstander der slik stimulering kan reguleres og kontrolleres.

I henhold til dette angår oppfinnelsen i et aspekt en fremgangsmåte for å kontrollere for sterk fedme ved administrering av TNF. I et annet trekk angår oppfinnelsen kontroll av kakeksi i cancer- eller infeksjonssyke pasienter ved å tilveiebringe antistoffer for nøytralisering av TNF. I andre trekk angår oppfinnelsen farmasøytiske preparater til bruk ved vektreduskjon og som inneholder TNF som en aktiv bestand-del, og immunoglobulinpreparater brukbare ved nøytralisering av TNF. Figur 1 viser nukleotidsekvensen som koder humanmaturt TNF og den derfra avledede aminosyresekvens. Figur 2 viser akkumuleringen av adiposeinduserbare mRNA i maturerende adiposeceller og reguleringen av syntesen av slik mRNA i nærvær og fravær av TNF. Figur 3 viser depresjonen av eksprimer ingen av adipose-stimulerte gener på grunn av TNF. Figur 4A og 4B er fotografier av mature adiposeceller med og uten TNF.

Def inis. 1 oner

Som bruk heri, henviser "tumor nekrosefaktor", TNF, til en aminosyresekvens som typifiseres ved det som vises i fig.l, og som er istand til selektiv cytotoksisitet mot tumorceller. Sekvensen i fig. 1 er avledet fra et human-cDNA, men TNF kodet av andre pattedyrarter kan vise den krevede aktivitet. Gjenvinning og reduksjon av denne sekvens er beskrevet i detalj av Wang, et. al. "Science" (1985) 228:149.

En TNF aminosyresekvens må, for å passe til denne definisjon, være aktiv ved in vitro cytotoksisistetanalyse basert på den kontinuerlige murine konnektive vevcellelinje L-929 som beskrevet nedenfor. Det erkjennes at denne definisjon for TNF-aktivitet ikke er nøyaktig den samme som det som er gitt i beskrivelsen som fastslår denne term av Carswell, et al. "Proe Nati Acad Sei" (USA) ( 1975) 72:3666. Imidlertid gir denne aktivitet som bekreftet ved in vitro cytotoksisitets-analyse mot humantumorceller en tilstrekkelig forsikring på brukbarhet at kvalifiseringen som en tumornekrosefaktor for mennesker ved bruk av denne analyse, er rettferdiggjort; cytotoksisitet mot L-929 generaliserer mot humantumorer. Det er også forventet at det er en vesentlig overlapping mellom faktorer som er aktive i den spesifiserte cytotoksisitets-analyse og den in vivo-analyse som trekkes opp av Carswell. TNF-proteinet ifølge oppfinnelsen kan, avhengig av pH-verdiene i omgivelsene hvis det foreligger suspendert eller i oppløsning, eller avhengig av omgivelsene hvis det foreligger krystallisert eller utfelt i fast form, foreligge i form av farmasøytisk akseptable salter eller kan være i nøytral form. De frie aminogrupper i proteinene er selvfølgelig i stand, til å danne syreaddisjonssalter med f.eks. uorganiske syrer som salt-, fosfor- eller svovelsyre; eller med organiske syrer slik som f.eks. eddik-, glykol-, rav- eller mandelsyre. De frie karboksylgrupper er istand til å danne salter med baser inkludert uorganiske baser slik som natrium-, kalium- eller kalsiumhydroksyder, og slike organiske baser som piperidin, glukosamin, trimetylamin, kolin og kaffein. I tillegg kan proteinet modifiseres ved kombinasjon med andre biologiske stoffer slik som lipider og sakkarider, eller ved side-kjedemodifi sering slik som acetylering av aminogrupper, fosforlering av hydroksylsidekjeder eller oksydasjon av sulfhydrylgrupper. Alle disse modifikasjoner ligger innenfor definisjonens ramme så lenge TNF-aktiviteten bibeholdes.

Til slutt skal det være klart at den primære aminosyresekvens som vises i figur 1 kun er illustrerende og at tilsvarende sekvens resulterer i proteiner som har i det vesentlige ekvivalent eller forbedret aktivitet sammenlignet med det som angis i figur 1. Disse modifikasjoner kan være tilsiktede, slik som f.eks. oppnådd ved sete-rettet mutagenese, eller kan være tilfeldige slik som de som oppnås ved muteringer i verter som er TNF-produsenter. Alle disse modifikasjoner er inkludert sålenge TNF-aktiviteten som angitt ovenfor, bibeholdes.

F.eks. er det funnet at et mutein som mangler de første fire aminosyrer ved N-terminus i sekvensen som vises i fig. 1 (Val-Arg-Ser-Ser ) har en spesifikk aktivitet som er flere ganger høyere enn TNF med den viste struktur. I henhold til dette, inkluderer definisjonen av TNF spesifikt denne av-kappede form. I tillegg har muteiner som mangler de N-terminale ti eller færre aminosyrer, tilsvarende forbedret aktivitet, og det synes som om mangler på opptil 10 amino syrer fra N-terminus ikke ødelegger men tvert imot forbedrer den biologiske aktivitet.

Derfor inkluderer definisjonen av TNF slik den her gjelder, spesifikt proteiner med en aminosyresekvens i det vesentlige ekvivalent med den som vises i figur 1, men som mangler 1-10 aminosyrer ved N-terminalsekvensen som vist i figuren.

Også effektive er cysteinfattig muteiner av TNF i figur 1. Generelt resulterer nøytralaminosyreerstatninger av cysteinet i posisjon 69 eller 101 eller begge deler, i aktive TNF-proteiner. Nøytralaminosyreerstatning inkluderer ala, ser, val o.l., fortrinnsvis ser. Disse muteiner kan også modifiseres for å oppnå avstumpede former som kan bibeholde TNF-aktivitet og som kan ha forbedret spesifikk aktivitet in vitro og in vivo.

Som en bemerkning skal det opplyses at når spesielle peptider spesifiseres vil proteinet som har aminosyresekvensen metallene 1-157 i figur 1 benyttes som referanse og kalles, muligens tilfeldig valgt, mTNF (matur-TNF). Alle andre spesifikke proteiner med homologitet med NTF og som viser NTF biologisk aktivitet, vil kalles "muteiner" av NTF, og vil angis med henblikk på deres forskjeller fra mTNF ved bruk av nummereringen av restene som er vist i figuren. For eksemplel vil muteiner som har erstatninger for cystein i posisjon 69 angis ved bruk av den substituerte rest og posisjonsnummeret, f.eks. peptider med et serin i stedet for cystein i posisjon 69, kalles ser^g TNF. Muteiner som f.eks. mangler tre N-terminale aminosyrer sammenlignet med proteinet vist i figur 1, kalles V3TNF. Der begge de foregående endringer er gjennomført, kalles muteinet V3ser£,gTNF.

Spesielt foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsens TNF inkluderer T2ser6gTNF, V2ser10iTNF, V2ser6gser101<T>NF, og de tilsvarende V3-, V4-, V5-, V6-, V7-, V8-, og V10-cystein-manglende muteiner. Spesielt foretrukket er VSser^gTNF,

V8ser101TNF, VSser^gser ±0l og v^se<r>^<g>TNF, T4ser10lTNF°S v"4ser5gserioiTNF •

Ikke alle muteiner av mTNF fremstilles rekombinant eller tilsiktet. Således har nativ HL-60 cellesekretert TNF mindre forskjeller fra mTNF i de kjente posisjoner av primærstruk-turen, selv om begge proteiner viser TNF-aktivitet. Spesifikt har den deduserte sekvens fra fiur 1 et ytterligere par serinrester efter serinet i posisjon 1 sammenlignet med HL-60 avledet TNF før homologien opptas som vist mellom posisjonene 4-12 i det HL-60 avledede proteinet og posisjonene 6 til 14 i den deduserte sekvens. I tillegg er posisjonene 13 of 14 i det HL-60-avledede protein Val-Ser; de tilsvarende posisjoner 15 og 16 til den deduserte sekvens er His-Val.

Fremsti11ingsmåte

De TNF som kan benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan mest hensiktsmessig fremstilles ved å benytte rekombinante metoder. Detaljerte beskrivelser av måter for fremstilling av rekombinant TNF er angitt i Wang, et al. Science (supra). I dette henseende er forskjellige DNA-sekvenser som koder TNF deponert i "American Type Culture Collection", Rockville, MD". Disse DNA-ekvenser inkluderer de som er inneholdt i pE4 som rommer human cDNA-innskuddet ATCC #39894); pAW711 som er en eksprimeringsvektor egnet for prokarioter som koder TNF i figur 1 (ATCC #39918) og pAW736, en ekspr imer ingsvektor som koder V4-muteinet av mTNF (ATCC #53092). Vektorer egnet for eksprimering av andre TNF muteiner (V10, V9, V6, W og V8) er deponert som ATCC nr. 53161, 53162, 53163, 53164 henholdsvis 53165.

I tilegg til rekombinant reduserte stoffer kan TNF ekstrah-eres fra naturlige kilder slik som human- eller annet pattedyrvev, eller fra human- eller andre pattedyravledede cellelinjer. Kilden for proteinet er selvfølgelig uvesentlig for oppfinnelsens gjennomføring, bortsett fra at den kan ha innflytelse på spesifikke doseringsnivåer og administrerings-ruter.

Formulering og administreringsmåte

For å bevirke den ønskede lipidmobilisering som oppnås ved administrering av TNF, kan de aktive bestanddeler formuleres til et antall aksepterbare midler, velkjente i denne teknikk. Karakteristisk blir TNF administrert ved injeksjon, enten intraperitonialt eller intravenøst. Ved egnet formulering kan det imidlertid være mulig å oppnå preparater som kan administreres topisk eller oralt, eller som kan være istand til transmisjon gjennom mykøse membraner.

Avhengig av arten av preparatet og administreringsmetoden kan preparatet foreligge i flytende eller fast form. For faste preparater inklukderer konvensjonelle bærere f.eks. farma-søytiske kvaliteter av manitol, laktose., stivelse, cellulose, magnesiumkarbonat o.l. TNF kan formuleres som et suppositorium f.eks. ved bruk av polyalkylenglykoler som bærer. Flytende preparater kan fremstilles ved oppløsning eller dispergering av TNF og eventuelle tilsetningsstoffer i en bærer, slik som f.eks. vann, saltoppløsning, vandig dekstrose osv. Hvis ønskelig kan preparatet også inneholde mindre mengder ikke-toksiske hjelpestoffer slik som fukte-eller emulger ingsmidler, pH-buf f ermidler o.l. Aktuelle metoder for fremstilling av doseringsformer er kjente eller vil være åpenbare for fagmannen. Preparatene vil i ethvert _tilfelle inneholde en mengde TNF effektiv til bevirkning av den ønskede lipidmobilisering.

En foretrukket administreringsmetode av dette protein er ved injeksjon, oftest intraperitoneal eller intravenøs injeksjon. Stoffet som skal injiseres kan fremstilles enten som en flytende oppløsning eller en suspensjon eller i en form som er egnet for rekonstituering.

Doseringen og administreringsmetoden vil selvfølgelig avhenge av nivå av den lipidmobilisering som ønskes, objektets natur, og legens bedømmelse. Generelt ligger imidlertid effektive doser innen området 0,2-2 jjg TNF pr. kg. kroppsvekt pr. dag så lenge administrering kreves. Dette området representerer selvfølgelig et bredt anslag da de ovenfor angitte faktorer er av stor betydning for bestemmelse av optimale doseringsnivåer.

I det aspekt ved oppfinnelsen som angår nøytralisering av TNF i kakeksiske pasienter benytter foretrukne utførelsesformer for nøytralisering av aktiviteten til TNF polyklone eller monoklone antistoffer. Disse nøytraliserende antistoffer benyttes fortrinnsvis som en tilleggsbehandling sammen med andre cytotoksiske medikamenter hos kreftpasienter. F.eks. kan metotrexat administreres til en pasient for å drepe tumoren, fulgt av antistoffpreparatet for å nøytralisere TNF for å forhindre vekttap.

Polyklone antistoffer fremstilles mot TNF ved å benytte konvensjonelle prosedyrer ved å injisere renset TNF til en egnet vert, slik som kaniner eller mus, og så å høste høytitersera. Fremstilling av polyklone preparater følger generelt de nu kjente prosedyrer i henhold til Kohler og Millstein.

Eksempel

De følgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen uten å begrense den.

Preparat A: Fremstilling av kakektin

Kakektin ble benyttet som en kontroll i de følgende eksempler. Forbindelsen ble fremstilt fra de kondisjonerte media av endotoksinstimulerte makrofager som beskrevet av Kawaskami, M. , et al. Proe Nati Acad Sei (USA) (1982) 79:912; Pekala, P.H., et al. (ibid 1983) 80:2743.

Eksempel 1; Virkningen av TNF på adipose- induserbare mRNA-nivåer

En in vitro-model for studium av abnormal metabolisme til kakeksi er utviklet ved bruk av en stabil adipogen cellelinje, TA1 , som beskrevet av Chapman, A.B. J. Biol Chem

(1984) 259:15548-15555. Disse celler utvikler en adipocytisk morfologi omtrent 3 dager efter komfluens i vevkulturmono-sjikt, og viser, parallelt med denne morfologi, eksprimering av forskjellige gener. Visse proteiner og enzymer er tilstede kun i differensierte adipocyter og er ikke tilstede eller tilstede kun i upåvisbare nivåer i de ikke-differensierte forløpere. Disse proteiner ansees å være produkter av "adiposeinduserbare gener" og deres mellomliggende mRNAer.

Gener for hvilke ekprimering først er påviselig efter differensiering er identifisert. De er kalt klonene 1, 10, 28, 47 og GPD (Chapman, A. B. et al. supra). Deres eksprimering skyldes åpenbart transkripsjonen aktivering.

Derfor er et mål av betydningen av forbindleser på adipocyter deres virkning på nivåene av adiposeinduserbar nRNA.

I denne analyse ble den ovenfor angitte stabile adipogene cellelinje TA1 dyrket fra prekonfluens til 24 dager efter konfluens. TNF, fremstilt ved dyrking av pAW711 transformert E. coli og indusering av eksprimeringen av TNF som beskrevet i US-SN 760.661, supra, ble tilsatt til cellekulturene fra prekonfluens til 6 dager efter.

I større detalj, ble TAl-celler, avledet fra 5-azacytidin-behandling av 10 T1/2C18 celler (Resnikof. C, et al. Cancer Res (1973) 333231-3231-3238; Taylor, S.M., et al. Cell (1979) 17:771-779 )dyrket i Eagel's basalmedium supplert med 10$ varmeinaktiverte fetal kalveserum. 10~^- M deksametason var tilstede i media for de første 3 dager efter konfluens, og 5 jjg/ml storfeinsulin de første 6 dager efter konfluens. Rekombinant TNF (10-30 ng/ml) ble først tilsatt til preadipocytkulturer 2 dager før konfluens. (Tilsetning av denne mengde inhiberer 90 lipoproteinlipaseaktivitet i dyrkede adipocyter.) Cellene ble matet med resupplementering av TNA på dag 0 (konfluens) og dag 3. Cellene ble høstet dag 6.

Total RNA ble isolert i henhold til Chirgwin, J.M., et al, "Biochemistry (1979) 18:5294-5299, og påført på nitrocellulose i en flekk-blotapparatur (BRL). Nick translaterte cDNA-kloner av adiposeinduserbare gener (kalt klonene 1, 10 og 47) og glyserolfosfatdehydrogenese (GDH) ble benyttet for å probe filterne under hybridiseringsbetingelser som beskrevet av Chapman, A.B., et al, J. Biol Chem (1948) (supra). Filtrene ble vasket og eksponert til XAR 5 film ved -70° C med en intensiverende skjerm.

Resultatene er vist i venstre spalte i figur 2, merket med "stabil tilstand". Det er klart fra disse resultater at TNF-behandlingen forhindrer akkumulering av adiposeinduserbar mRNA. Disse resultater er sammenlignbare med de som ble oppnådd når 10 pl/ml kakektin ble benyttet for TNF.

Lipidakkumulering ble også fullstendig inhibert av kakektin eller TNF, og TAl-cellekulturer behandlet med disse forbind-elser er opprettholdt i helt opptil 23 dager uten opptreden av nøytralt lipid, påvist ved olje rød 0 farving. Ved fjerning av kakektin eller TNF fra mediet, vendte dog adipocytmorfologien tilbake slik det skjer ved eksprimering av adiposeinduserbare gener. Det ble også vist at TNF- eller kakektinbehandling av preadipocytkulturer ikke påvirket celleveksten eller levedyktigheten, bestemt ved celletelling og<3>H-tymidininnarbeiding, såvel som ved trypanblå eksklusjon og klonalvekstanalysé i henhold til Ham. R.G., et al. "Cell Culture Methods for Molecular and Cellular Biology" Barnes, New York (1984) 1:3-21.

I henhold til dette viser resultatene at både kakektin eller TNF undertrykker den totale mengde adiposeinduserbare mRNA som er tilstede i adipocytene eller preadipocytene, uten negativt å påvirke resten av cellens metabolisme.

Eksempel 2: Inhibering av transkribering

At mRNA akkumuleringsinhibering transkripsjonelt reguleres ble vist ved nukleær transkripsjonsanalyser gjennomført som beskrevet av Vannice, et al, Proe Nati Acad Sei (USA) (1984) 81:4241-4245 og ved Israel, J. , et al. "J Biol Chem" (1984) 259:5400-5402, modifisert i henhold til Knight, et al (submitted) for adiposeceller.

På hvert datapunkt ble celler dyrket og behandlet i eksempel 1 avkjølt til 4°C og mediet ble aspirert og vasket med fosfatbuffret saltoppløsning. En ml hypotonisk buffer (20 nM Tris(HCl. pH, 4 mM MgCl2, 6 mM CaCl2, 0,5 mM ditiotreitol) ble tilsatt til platene. Efter 5 min. ble 1 ml lyseringsbuf-fer 0,6 M sukrose, 0,256 NP 40, og 0,5 mM ditiotreitol) tilsatt og cellene ble skrapet fra vevkulturplåtene. Efter Dounce homogenisering ble kjerner pellitisert ved 500 g, vasket en gang i resuspensj onsbuffer, repelletisert og så resupendert i buffer inneholdende 0,4 ml mM hver av ATP, CPT, GTP, 10% glyserol og lOjjg/ml BSA. Kjernene ble inkubert med en a-32P-UTP (600 Ci/mmol) ved en konsentrasjon på 2 pCi/ml i 40 minutter ved 45° under mild omrøring.

RNA ble høstet fra kjernene som beskrevet av Smith, et al. Cell (1978) 15:615-626 modifisert av Knight, et al (supra) og hybridisert til lineæriserte cDNAer som var påført på nitrocellulosefiltre og behandlet i 2 timer ved 80°C i en vakuumovn. Filterprehybridisering- og hybridiseringsbeting-elsene var i henhold til Friedman, R.L., et al, Cell (1984) 38:745-755, og hybridiseringene ble gjennomført i 3 dager ved 42°C ved ca. 15 x 10 26 cpm pr. reaksjonsblanding påført i 150 Ml volum til dotter av lineariserte enkeltstrengadipose cDNAer for klon 28, og cDNAet som koder P-aktin og det ikke- tilsvarende nøytrale plasmid pEMBL ble benyttet som sammen-ligninger, p-aktin cDNA-klonen var en gave fra P. Gunning og L. Kedes.

Resultatene er vist i høyre kolonne, i figur 2. De fire datapunkter er prekonfluens (PC), 4 og 24 timer efter TNF-tilsetning samt "kotroll", som representerer TA1 ubehandlet med TNF. Kolonnene A og E er respektive p<->aktin- og pEMBL-sammenligningsdotprobene; kolonne 28 representerer klon 28 dotproben. Disse resultater viser at transkripsjonssystemet inneholdt i kjernen undertrykkes med henblikk på kodingssekvensene for klon 28, som er karakteristisk for adiposeceller, men upåvirket med henblikk på kodingssekvensene for aktin. Tilsvarende resultater ble oppnådd da TAl-cellene ble behandlet med 10 jjI/ml kakektin. Derfor opererer TNF på samme måte som kakektin direkte på genomet for å undertrykke transkripsjon av adiposerelaterte sekvenser, men avbryter ikke andre genefunksjoner.

Eksempel 3: Virkning av TNF på mature adiposeceller

Da adipocyter hos voksne mennesker undergår liten eller Ingen proliferering, var det ønskelig å studere virkningen av TNF på mature adiposeceller. En prøve på 10-30 ng/ml TNF ble tilsatt til dag 6 adipocyt TAl-kulturer differensiert som beskrevet i eksempel 1. Total RNA ble isolert fra cellene på forksjellige tidspunkter efter TNF-eksponeringen, og påført på nitrocellulose med en dot-blot-apparatur. Filtrene ble probet med cDNAer med henblikk på GPD, klon 47 og klon 1, vasket, autoradiografert og avsøkt ved bruk av et Hoeffner GS300 densitometer festet til en rapporterende integrator. De oppnådde punkter ble normalisert for differanser i mengden påført RNA ved bruk av en cDNA-probe som totaliserte cellu-lært RNA. Figur 3 viser at maksimaleksprimering av GPD, eller klonene 1 eller 47, alvorlig inhiberes efter de første 6 timer i nærvær av TNF. Resultatene er tilsvarende for kakektin.

Nothern-blots, probet med klon 47 på forskjellige tidspunkter efter TNF behandlingen, viste at RNA hybridiserbart til denne klon forsvant hurtig efter TNF-administrering. For disse analyser ble 12 pg tilsammen av RNA bragt til en sluttkonsentrasjon på 2,2 M formaldehyd, 30% formamid, 10 mM NaH2P0I4, pH 7 og oppvarmet i 15 min. ved 56°C. Prøver ble elektrofor-sert i en 1% agaroseformaldehydgel med en sluttkonsentrasjon på 2,2 M formaldehyd, 20 mM MOPS, pH 7,0, 5,0 mM natriumace-tat og 1 mM EDTA. Gelene ble vasket i destillert vann i 3 minutter fulgt av to 30 minutters vaskinger i 10 mM NaP04, pH 7,4, og 1 mM EDTA, før overføring til cellulose, og hybridi-sering med lineærisert cDNA fra klon 47. Også her viste kakektinbehandlede celler tilsvarende resultater.

Det ble også vist at efter 4-6 dager TNF-eksponering mistet de fleste celler sitt nøytrale lipid. Efter at 10-30 ng/ml TNF var tilsatt, var 70-80 av cellene fylt med store lipid-dråper; 6 dager senere hadde mindre enn 10% celler identifi-serbare triglycerider på olje rød 0 flekker. Disse resultater er vist i figr 4A og 4B, som representerer ubehandlede og TNF-behandlede celler. Olje rød 0 flekken er så og si fullstendig forsvunnet fra cellene i figur 4B.

Sammenligning av disse resultater med de som er vist i figur 3, viser at endringer i adiposespesifiserte RNAer på grunn av TNF-behandling skjer hurtigere enn lipidmobilisering. Efter 6-24 timer efter tilsetning av TNF til mature TAl-lymfocyter observeres mer enn en 90%-ig reduksjon i disse RNAer; flere dager er nødvendig for at dette skal reflekteres i en reduksjon i lipidinnholdet.

Addendum: Cytotoksisk analyseprosedyre

Definisjonen av et protein som TNF avhenger av dens aktivitet i L-929-analysen. Denne analyse skal derfor beskrives her. L-929-analysesystemet er en forbedret hensiktsmessig in vitro-analyse som tillater hurtig måling av TNF-aktiviteten. Korrelasjonsgraden med in vivo tumor nekroseanalysen til Carswell er idag ukjent; i og med at den imidlertid benytter murintumorceller spesifikt, antas korrelasjonen å være høy. Det protein som er kalt lymfotoksin i EPO-publ ikas j on 0100641, gir også aktiviteten i denne analyse. Analysen tilsvarer i konsept den som er beskrevet i US-PS 4.457.916 som benytter murin L-M-celler og metylen blå farving. Imidlertid har L-929 analysen vist seg å korrelere (for HL-60-avledet TNF) med humantumorcellelinjecytotoksisitet.

I det her beskrevne L-929 analysesystem, blir L-929 celler preparert overnatt som monosjikt i mikrotiterplater. Prøvene fortynnes to ganger på tvers av platen, UV-bestråles og tilsettes på de preparerte monosjikt. Kulturmediene i brønnene bringes så til 1 pg/ml aktinomycin D. Platene tillates inkubering i 18 timer ved 37° C og bedømmes så visuelt under mikroskop. Hver brønn gis en 25, 50 75 eller 100% bedømmelse som tilkjennegir graden av celledød i brønnen. En enhet TNF-aktivitet defineres som det resiproke av fortynningen der 50% avlivning skjer.

I tillegg ble en mer sensitiv versjon av denne analyse utviklet og som overvåker frigjøringen av<3>^S merkede peptider fra på forhånd merkede celler, når disse var behandlet med prøven og aktinomycin D. Denne versjon av analysen kan benyttes for å kvantifisere potensen, f.eks. for å bedømme den relative potens av oocyttranslatert materiale. Kort sagt blir aktivt voksende L-929-kulturer merket med<35>S metionin (200 pCi/ml) i 3 timer i metioninfrie media supplert med 2% dialysert fetal kalveserum. Cellene blir så vasket og bragt i 96 brønners plater, inkubert overnatt og behandlet den neste dag med to gangers fortynninger av prøver over lg/ml aktinomycin D. Kulturene ble .så inkubert ved 37°C i 18 timer. 100 pl supernatantmengder fra hver brønn ble så overført til en annen 96 brønners plate, syre (TCA) presipi-tert og høstet på glassfiberfiltre. Filtrene ble vasket med 95% etanol , tørket og tellet. En NP4ødetergenskontroli inkluderes I hver analyse for å måle maksimal frigivning av radioaktivitet fra cellene. Prosentualt<35>S-frigjøring blir så beregnet ved forholdet mellom differansen i telling mellom behandlede celler og ubehandlede kontroller, og differansen mellom NP4gbehandlede celler og ubehandlede kontroller, dvs. ved forholdet:

Høyere TNF-potens resulterer i høyere verdier av dette forhold.

Oppsummering

De foregående eksempler indikerer at TNF kan undertrykke metabolismen av adiposeceller. Denne aktivitet er også demonstrerbar for kakektin: se F.M. Torti, et al (supra). I henhold til dette forhindrer TNF eksprimering av gener som er ansvarlige for å produsere enzymer som er viktige med henblikk på lagring av fett og som kan benyttes for å kontrollere vekt.

Claims (11)

1. Bruken av tumornekrosefaktor (TNF) for fremstilling av et farmasøytisk preparat anvendelig for å bevirke vektreduksjon hos pattedyr.

2. Bruken av TNF for fremstilling av et farmasøytisk preparat som kan brukes for å undertrykke adiposecellemetabolisme.

3. Bruken av produktet ifølge krav 1 eller 2 der TNF har en aminosyresekvens i det vesentlige ekvivalent den til figur 1 (mTNF).

4. Bruken av produktet ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF er rekombinant TNF.

5. Bruken av produktet ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at TNF er valgt blant gruppen omfattende VITNF, V2-, V3- .... V10TNF.

6. Bruken av produkt ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF er valgt blant gruppen omfattende ser^ g <T> NF, Vser^ gTNF, V2ser6 g <T> NF, V3-V10ser6 <g> TNF.

7. Bruken av produkt Ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF er valgt blant se <r> 101 TNF, Vlser101 TNF, Vser10 i <T> NF, V3-, .... V10ser10i TNF.

8. Bruken av produkt ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF er valgt blant ser^ gse <r->L oiTNF' Vser^ gse <r>^ oi TNF» Vser^ gser^oi TNF, V3-, ....VlOser^ gser^ oiTNF.

9. Bruken av produkt ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF er valgt blant V8ser6 gTNF, V8ser10lTNF° S V8ser6 gser1 01TNF.

10. Bruken av produkt ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF er valgt blant gruppen omfattende V4serfcgTNF, V4ser^g^TNF og <T> 4ser£) <g> ser^ g1 TNF.

11. Bruken av produktet ifølge krav 1 eller 2 hvori TNF har N-terminalsekvensen: Val -Arg-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-Val-Ser-Val-Ala-Asn-Pro.