NO855169L - Oljeadjuvert vaksine, og fremgangsmaate til dens fremstilling. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en oljeadjuvert vaksine, samt en fremgangsmåte til dens fremstilling.

Mange antigener er så lite immunogene, at de ved en engangs-injeksjon i et dyr ikke utløser noe målbart eller bare et lite immunsvar, således at det ikke uten videre kan anvendes som podningsstoff. Den antigene virkning kan for-sterkes, idet disse antigener anvendes sammen med en immun-stimulator eller adjuvans. De fleste inaktiverte virus- og bakterievaksiner inneholder av denne grunn adjuvanter.

Det er kjent å adjuvere vandige antigenoppløsninger ved emulgering med mineral- eller planteoljer.

Slike emulsjoner, spesielt mineraloljeemulsjoner, måles imidlertid lokalt dårlig. Derfor anvendes slike emulsjoner ofte intramuskulært for å frembringe en bedre målbarhet.

Da det imidlertid på injeksjonsstedet utvikler seg en steril absess, blir denne fremgangsmåten av kjøtthensyns-rettslige grunner i økende grad avvist ved nyttedyr. Videre er oljeemulsjonsvaksine forholdsvis viskose, hvorved om-gangen med dem er vanskeliggjort. 01jeinnholdet av slike vaksiner ligger vanligvis mellom 30 og 50 %. En nedsettelse av oljeinnholdet er ikke mulig, da vaksinen da ville bli pastaaktig og ikke mere kunne injiseres. Videre krever man for hver olje en for denne olje egnet spesifikk emulgator.

Det ble nå overraskende funnet at en kombinasjon av en olje med bestemte emulgatorer er egnet til adjuvering av vaksiner idet de omtalte ulemper ikke iakttas.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig en vaksine inneholdende en vandig antigenoppløsning, og en adjuvansemulsjon,karakterisert vedet innhold av en olje, et sorbitan-oleat, en forbindelse med formel I med en molekylvekt fra 4000 til 5500, idet a og c er statistisk like, og b betyr et slikt tall at vektsforholdet mellom oksyetylendelen og oksypropylendelen er 7:3 til 9:1, eventuelt et polyoksyetylensorbitanmonooleat, og eventuelt glycerol.

Oljen kan være en mineral- eller en planteolje. De adjuverende bestanddeler blandes fortrinnsvis med hverandre før tilsetningen til den vandige antigenoppløsning, og emulgeres med en vandig fase før de tilsettes antigenoppløs-ningen.

Sorbitan-oleatet er et mono- eller trioleat, fortrinnsvis

et monooleat.

Fortrinnsvis inneholder en slik vaksine en adjuvans-emulsjon, som inneholder 5-20 ml, fortrinnsvis 8-12 ml av en olje, fortrinnsvis mineralolje, 0,5-10 ml, fortrinnsvis 1-5 ml sorbitan-oleat, og 0,5-10 g, fortrinnsvis 1-4 g av en forbindelse med formel I på 100 ml.

Eventuelt inneholder denne videre 0,5-10 g, fortrinnsvis 0,5-4 g av et polyoksyetylensorbitan-monooleat, og eventuelt 0,5-10, fortrinnsvis 0,5-3 ml glycerol på 100 ml.

Volumforholdet mellom vandig antigenoppløsning til adjuvans-emulsjon kan utgjøre 0,5 til 2, fortrinnsvis 0,8 til 1,2.

Som mineralolje foretrekkes "Bayol" F eller "Marcol" 52. Det kan imidlertid også anvendes parafinolje, (ren, hvis Merck), "Drakeol" eller "Miglyol".

Antigenet kan fremfor alt være et virus-, bakterie-, celle-eller proteinantigen.

Som ytterligere immunstimulatoriske stoffer kan det tilsettes vandige adjuvanter som saponin og videre planteekstrakter, aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat, kaolin, bentonit, kiselgur eller kiselsyrer.

Adjuveringen ifølge oppfinnelsen bevirker en høyere immun-stimulasjon sammenlignet med fremgangsmåten i henhold til teknikkens stand.

Den dertil nødvendige mengde av adjuvans er mindre enn kjente fremgangsmåter. Det anvendes fortrinnsvis slike mengder at vaksinen er inneholdt inntil 15 ml adjuvans i 100 ml ferdig vaksine. Det kan imidlertid også tilsettes større mengder adjuvans.

Vanligvis er det nok med enkel rysting av en vandig antigen-oppløsning ved adjuvansblanding ifølge oppfinnelsen for å

få en stabil emulsjon.

Vaksinen kan inneholde vanlige hjelpe- eller tilsetnings-stoffer .

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksem-pler.

Eksempel 1

Fremstilling av en adjuvert vaksine

0,5 ml parafinolje, kokeområde 190-240°C ("Bayol" F),

0,1 ml sorbitan-trioleat, molvekt ca. 1050,

0,1 ml polyoksyetylensorbitan-trioleat, molvekt ca. 1300, 0,2 ml av en oppløsning av 40 g av forbindelsen med formel 1, molvekt 4750, vektforhold oksyetylen/oksypropylen-del, 8:2, i 100 ml vann, og

0,4 ml glycerol ble blandet og til den dannede emulsjon settes langsomt 5 ml antigen (virus diarrhoe/mucosal disease-antigen) i vann og 3,7 ml fosfatpuffer koke-saltoppløsning (PBS) og blandes.

Den dannede vann-i-olje-emulsjon forblir stabil etter bland-ing .

Når i steden for "Bayol" F ble anvendt "Draceol", "Marcol" 52, parafinolje, (ren, hvit Merck), eller "Mygliol", oppsto likeledes stabile emulsjoner.

Virkning og tålbarhet

Vaksinen (hver gang 2 ml), ble administrert subkutant på kaniner. Som sammenligning tjente en vaksine, som inneholdt 5 ml antigenoppløsning og 5 ml Complete Freund's Adjuvans

(FCA).

Mens disse 3 uker etter applikasjon på injekssjonsstedene viste ca. 30 ml store hårdheter var hårdhetene ved den ifølge oppfinnelsen med "Bayol" F adjuverte vaksine bare ertestor.

I nøytralisasjonsprøven ble antistoffene bestemt mot VD/MD-virus. Titeren av sera fra kaniner som var blitt podet med FCA-inneholdende VD/MD-vaksine var 1:14 0 ifølge oppfinnelsen med "Bayol" F 1:500.

Eksempel 2

I eksempel 1 ble det i steden for VD/MD-antigen anvendt MKS-antigen. Vaksinen (hver gang 0,4 ml) ble applisert på mus. 3 uker deretter ble dyrene belastet med MKS-virus.

Da viser vaksinen en 50 % beskyttende dose (PD^q) på 4,3. Sammenligning: FCA-holdig MKS-vaksine 0,2 PD D ,.U..

Eksempel 3

Vaksine A 0,5 ml parafinolje "Marcol" 52

0,1 ml sorbitan-trioleat, molvekt ca. 1050, 0,1 ml polyoksyetylen-sorbitan-trioleat,

molvekt ca. 1300,

0,2 ml av en oppløsning av 40 g av forbindelsen med formel I, molvekt 47 50, vektforhold oksyteylen/oksypropylen-del 8:2 i 100 ml vann,

0,4 ml glycerol, og

0,5 ml saponin, 1 %-ig i vann,

ble blandet. Deretter ble det tilblandet 5,0 MKS-antigen og 3,2 ml PBS.

Vaksine B 5,0 ml FCA og

5,0 ml MKS-antigen.

Vaksine C Som vaksine A men uten saponin.

Med disss tre vaksiner ble mus immunisert og 3 uker etter podning belastes med infeksiøs MKS-virus. Resultatene var som følger:

Dette eksempel viser at ved tilsetning av saponin kan den immunstipulatoriske virkning av oljevaksinen dessuten økes betraktelig.

Eksempel 4

0,5 ml parafinolje, kokeområdet 190-240°C,

0,1 ml sorbitantrioleat, molvekt ca. 1050,

0,1 ml polyoksyetylen-sorbitan-trioleat, molvekt ca. 1300, 0,2 ml av en oppløsning av 4 0 g av forbindelsen med formel I, molvekt 4750, vektforhold oksyteylen/oksypropylen-

del 8:2, i 10 0 ml vann,

0,4 ml glycerol, og

8,7 ml PBS

ble blandet i en emulsjon, og applisert hver gang med 0,2

ml på mus s.c. 3 dager senere ble disse mus samt ubehandlede mus belastet med en dødelig dose MKS-virus eller V. cholerae. Mens alle ubehandlede dyr døde, overlevde av de som hadde fått oljeemulsjonen ved inngivning av

V.cholerae 50 % og av

MKS-virus 60 %.

Dette viser at med disse preparater oppnås en immunstimul-ering som ikke beror på en dannelse av antilegemer som imidlertid manifisterer seg i en øket resistens overfor øvrige virus- og bakterieinfeksjoner (paraimmunitet).

Eksempel 5

Fremstilling av en adjuvert vaksine

0,5 ml parafinolje, kokeområde 190-240°C ("Bayol" F),

0,1 ml sorbitan-monooleat, molvekt ca.1050.

0,1 ml polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, molvekt ca.1300, 0,2 ml av en oppløsning av 50 g av forbindelsen med formel I, molvekt 4750, vektforhold oksyetylen/oksypropylen-del 8:2 i 100 ml vann,

ble blandet og til den dannede emulsjon ble det satt 5 ml antigen (virus diarrhoe/Mucosal disease-antigen) i vann og 4,1 ml fosfatpuffer i en kokesaltoppløsning (PBS) og blandet.

Den dannede vann-i-olje-emulsjon forble stabil etter sentri-fugering.

Når det i steden for "Bayol" F ble anvendt "Drakeol", "Marcol"

52, parafinolje (ren, hvit, Merck) eller "Mygliol", oppsto likeledes stabil emulsjon.

Virkning og holdbarhet

Vaksinen (hver gang 3 ml) ble administrert subkutant på kaniner. Som sammenligning tjente en vaksine som inneholdt 5 ml av antigenoppløsning og 5 ml Complete Freund's Adjuvans

(FCA).

Mens denne 3 uker etter applikasjon ired injeksjonsstedet viste ca. 30 ml store hårdhetsdannelser, var hårdhetsdannel-sen ved den ifølge oppfinnelsen med "Bayol" F adjuverte vaksine bare ertestor.

I nøytralisasjonsprøve ble antistoffene bestemt mot VD/MD-virus. Titeren av serumet fra kaniner som var blitt podet med FCA-holdig VD/MD-vaksine var 1:14 0 ifølge oppfinnelsen med "Bayol" F 1:500.

Eksempel 6

I eksempel 5 ble det i steden for VD-MD-antigen anvendt MKS-antigen. Vaksinen (hver gang 0,4 ml) ble applisert på mus. 3 uker deretter ble dyrene belastet med MKS-virus. Der-ved viser vaksinen en 50-% beskyttende dose (PD5Q) på 4,3 Sammenligning: FCA-holdig MKS-vaksine 0,2 PDb ,.U-.

Eksempel 7

Vaksine A 0,5 ml parafinolje "Marcol" 52,

0,1 ml sorbitan-monooleat, molvekt ca. 1050, 0,1 ml polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, molvekt

ca. 1300,

0,2 ml av en oppløsning av 40 g av forbindelsene med formel I, molvekt 4750, vektforhold oksyteylen/oksypropylen-del 8:2 i 100 ml vann, og

0,5 ml saponin, i %-ig i vann,

ble blandet. Deretter ble det tilblandet 5,0 ml MKS-antigen og 3,6 ml PBS.

Vaksine B 5,0 ml FCA og

5,0 ml MKS-antigen.

Vaksine C: Som vaksine A men uten saponin.

Med disse tre vaksiner ble mus immunisert og 3 uker etter podning belastet med infeksiøs MKS-virus.

Resultatene var som følger:

Dette eksempel viser at ved tilsetning av saponin kan den immunstimulerende virkning av oljevaksinen dessuten økes betraktelig.

Eksempel 8

0,5 ml parafinolje, kokeområde 190-240°C,

0,1 ml sorbitan-monooleat, molvekt ca. 1050,

0,1 ml polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, molvekt ca. 1300, 0,2 ml av en oppløsning av 4 0 g av forbindelsen av formel I, molvekt 4750, vektforhold oksyetylen/oksypropylen-del, 8:2 i 100 ml vann, og

9,1 ml PBS,

ble blandet til en emulsjon og applisert mus hver gang 0,2 ml s.c. 3 dager senere ble disse mus samt ubehandlede mus belastet med en dødelig dose MKS-virus, eller V. cholerae. Mens alle ubehandlede dyr døde, overlevde av de som hadde fått oljeemulsjonen ved inngivning av

V cholerae 50 %, og av

MKS-virus 60 %.

Dette viser at også ved disse preparater oppnås en immun-stimulering som ikke beror på en dannelse av antilegeme,

som imidlertid manifisterer seg ved en øket resistens overfor dødelig virus- og bakterieinfeksjoner (paraimmunitet) .

Eksempel 9

Vaksine A 0,5 ml parafinolje, "Marcol" 52,

0,025 ml sorbitan-monooleat, molkvekt ca. 1050, 0,025 ml polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, molvekt ca. 1300,

0,5 ml av en oppløsning av 40 g av forbindelsen med formel I, molvekt 4750, vektforhold oksyetylen/oksypropylen-del, 8:2 i 10 0

ml vann,

ble blandet, deretter ble det tilblandet 5,0 ml MKS-antigen og 3,95 ml PBS.

Vaksine B 0,5 ml parafinolje, "Marcol" 52,

0,025 ml sorbitan-monooleat, molvekt ca. 1050, 0,025 ml polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, molvekt ca. 1300,

0,5 ml av en oppløsning av 40 g av forbindelsen med formel I, molvekt 4750, vektforhold oksyetylen/oksypropylen-del 8:2 i 100 ml vann.

0,4 ml av en suspensjon av 20 g kiselgur ("Filtercel") i 100 ml 0,1 molar fosfatpuffer pH 7,3.

ble blandet, deretter ble det tilblandet 5,0 ml MKS-antigen og 3,2 ml PBS.

Ved disse to vaksiner ble mus immunisert og 3 uker etter podning belastet med infeksiøs MKS-virus.

Resultatene var som følger:

Dette eksempel viser at ved tilsetning av kiselgur kan den immunstimulatoriske virkning av oljevaksinen dessuten økes.

Claims (7)

1. Vaksine, inneholdende en vandig antigenoppløsning, og en adjuvans-emulsjon, karakterisert ved et innhold av en olje, et sorbitan-oleat, en forbindelse med formel I

med en molekylvekt fra 4000 til 5500, idet a og c er statistisk like, og b betyr et slikt tall samt vektforholdet mellcm oksyetylendelen og oksypropylendelen er 7:3 til 9:1, eventuelt en polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, eventuelt glycerol, og eventuelt ytterligere adjuvanter.

2. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder adjuvans-emulsjon som inneholder 5-20 ml, fortrinnsvis 8-12 ml av en olje, fortrinnsvis mineralolje, 0,5-10 ml, fortrinnsvis 1-5 ml sorbitanoleat, og 0,5-10 g, fortrinnsvis 1-4 g av en forbindelse ned formel I på 100 ml.

3. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder en adjuvans-emulsjon som inneholder 0,5-10 g, fortrinnsvis 0,5-4 g av et polyoksyetylensorbitan-monooleat, og eventuelt 0,5-10 ml, fortrinnsvis 0,5-3 ml glycerol; på 100 ml.

4. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at volumforholdet mellom vandig antigenoppløsning og adjuvansemulsjon utgjør 0,05 til 0,3, fortrinnsvis 0,1 til 0,2.

5. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre inneholder et mineralsk adjuvans, saponin, og/ eller et som adjuverende kjent planteekstrakt.

6. Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at til en antigen-oppløsning settes en olje, et sorbitan-oleat, en forbindelse med formel I, eventuelt et polyoksyetylensorbitan-monooleat, eventuelt glycerol og eventuelt et mineralisk adjuvans, saponin, og/eller et som aktiverende kjent planteekstrakt .

7. Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at oljen sorbitan-oleatet, forbindelsen med formel I, eventuelt polyoksyetylen-sorbitan-monooleat, eventuelt glycerol og eventuelt i mineralsk adjuvans saponin og/eller et som adjuverende kjent planteekstrakt blandes med hverandre og emulgeres med en vandig base før det settes til antigenoppløsningen.