NO841497L - Fremgangsmaate for fremstilling av et protein a-igg preparat for bruk til behandling av kreft - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av immuno- og kjemoterapeutiske produkter for behandling av verter med kreft.

A. Tvungen elektroforese

Tvungen elektroforese er en teknikk hvorved en gammoglobulin-rik fraksjon adskilles elektroforetisk fra heparinisert helblod som sirkulerer i et utenomkroppslig kretsløp (1-5). Den generelle fremgangsmåten er den samme som den som anvendes ved kunstige nyrer og særlig ved blodelektrodialyse (6). Tvungen elektroforese (FFE) var opprinnelig tenkt som en elektroforetisk teknikk i stor skala for hurtig fraksjonering av biologiske materialer, hvilket gav adgang til rensingen av isoelektriske proteinbestanddeler (5). Funksjonerings-prinsippene for den tvungne elektroforesen er som følger: ved nøytral pH vil alle plasamproteiner med unntak av gammaglobulin forslutte seg i et elektrisk felt. Dette prinsippet brukes til å utvinne alle plasmaproteiner og til å adskille gammaglobulin. Det har vist seg å være et mer allsidig verk-tøy, egnet for undersøkelsene av en rekke elektro-kinetiske membranfenomener slik som elektrofiltrering og dens anvendelse til vannrensing (7)., elektroadsorbsjon av bakteriofager (8), blodelektrodialyser og den elektroosmotiske konsentrasjon og/eller avsalting av proteinoppløsninger (9). FFE kan utformes for "on-line"-drift og har vært brukt for å fjerne immunoglobuliner fra hunder for å forhindre eller forsinke avvisning etter nyreimplantasjon (10) . Bruken av denne innretningen i behandling av pasienter med kreft har ikke, såvidt oppfinneren kjenner til, vært gjort tidligere.

Under FFE samles det opp en effluent (EIE) som er rik på gammaglobulin,men som også inneholder plasmaproteiner (10).

Før den foreliggende oppfinnelse, har denne effluenten vært kastet uten noen ytterligere behandling. Den foreliggende oppfinnelse retter seg mot oppsamlingen av denne effluent

ved hjelp av FFE-innretningen, dens derpå følgende behandling

og tilbakeføringen til verten med kreft.

B. Protein A IgG komplekser

Protein A er en bestanddel i cellevegger til staphylococcus aureus Cowans I som reagerer med Fc-fragmentene i immunoglobuliner fra mange pattedyrarter hvorved det dannes immunkomplekser som fikserer komplement og bryter ned komplementbestanddeler (11-16). Ved tidligere undersøkelser på hunder med spontan bryst-adenocarcinoma, en utmerket modell på brystkreft hos menneske, ble plasma sirkulert over protein A bærende stafylokokker (SpA) som var immobilisert i et mikro-porøst membranfiltreringssystem og tilført plasma som kom fra en kontinuerlig plasma/celle-separator (17). Kort tid etter sirkulasjonen av et plasmavolum over protein A bærende stafylokokker, ble det observert at kreftceller døde etterfulgt av objektive tumorregresjoner. Disse virkninger ble ikke funnet når plasma ble sirkulert over stafylokokker uten protein A (17). Funnene av tumorregresjoner i dette eksperi-mentelle hundresystemet ble bekreftet i en uavhengig under-søkelse (18). Plasmaperfusjon ble så forfinet og lignende nekrolytiske tumorresponser ble funnet etter plasma-

perfusjon over renset protein A som var immobilisert i en grunnmasse av kollodium og trekull (protein A kollodium trekull, PACC (19) .

Denne form for terapi ble brukt på fem pasienter med bryst adenocarcinoma og akutte tumoriside reaksjoner bir iakttatt kort tid etter perfusjoner over PACC. Etter gjentatte behandlinger ble det observert objektive tumor-tilbakevendende virkninger hos fire av disse pasientene (20).

Tidligere undersøkelser på hunder og mennesker med spontan bryst adenocarcinoma viste (bl.a. ting) de følgende resultater når subjektet ble behandlet med plasma som hadde passert over immobilisert SpA eller PACC (17, 19, 20). Det hurtige angrepet av akutt smerte og synlige morfologiske endringer i brystvegg-tumorer etter utenomkroppslig perfusjon av små volumer plasma over PACC antyder at disse virkninger ble frembragt av faktorer som var generert i plasma etter passering over PACC (17, 19, 20). Fremgangsmåten ble forenklet teknisk ved å eliminere det til-knyttede utenomkroppslige sirkulasjonssystemet og istedet fikk små aliquoter med autologt eller homologt plasma, som tidligere var blitt samlet opp ved årelating, passere over PACC uten å være tilkoplet, etterfulgt av direkte infusjon

i pasienter (20). Pasienter som utelukkende var behandlet med den ikke tilkoplede plasmaperfusjon, viste akutt smerte med lignende morfologiske responser og tumortilbakevendende virkninger som de som ble observert ved det tilkoplede utenomkroppslige systemet (20). Videre var de tumoriside respons-ene både hos hunder og mennesker ledsaget av serologiske og immunohistokjemiske endringer, nemlig økte fastfase Clq-bindi og C5a nivåer, og minsking i C3 forbundet med avleiringer av IgG og C3 på tumorcellemembraner (17, 20, 21).

SpA har evnen til å binde seg til Fc området i IgG som ikke bare kan resultere i komplementaktivering og andre virkninger in vitro, men også kan gi virkninger in vivo som ligner immunreaksjoner tilveiebragt av antigen-antostoff komplekser. Noen av disse synes å omfatte komplement aktivert av SpA-IgG-komplekser i oppløsning. F.eks. ga SpA administrert i huden til normale menneskeindivider i doser så lave som 10 mikrogram blemme- og rødmereaksjoner påvist etter 30 minutter, og en senere reaksjon med maksimal intensitet etter 24 til 48 timer. På samme måte resulterte så lite som 10 mikrogram SpA gitt intradermalt til marsvin i en signifikant artus-lignende reaksjon og 300 - 400 mikrogram ga en blødningsreaksjon med maksimal intensitet etter 12 til 24 timer (22). Marsvin som var gitt 500 til 1000 mikrogram intrakardialt, led av alvorlig anafylaktisk sjokk som kunne forhindres ved på forhånd å gi angihistaminer. Heczko et al (23) fant også at marsvin som var sensitivisert med så lite som 50 mikrogram SpA i fullstendig Freunds hjelpestoff, ga en forsinket reaksjon som var maksimal etter 2 4 timer, mens den samme dose gitt i fullstendig hjelpestoff eller i saltvann ga en artus-reaksjon som var maksimal etter 6 timer. I motsetning til menneske og marsvin, ga ikke andre arter med IgG som ikke utfeller SpA, hypersensitivitetsreaksjoner når de ble gitt SpA alene. Således oppviste kaniner som var gitt den enkle injeksjonen

av opptil 6 mg SpA og mus som var gitt fra 10 til 500 mikrogram, hverken tidlig anfall eller forsinkede reaksjoner (24, 25). Hos kaniner ble det imidlertid frembragt en direkte artus-reaksjon etter 5 til 10 timer ved administrering av 100 til 180 mg menneske IgG intravenøst etterfulgt etter 10 til 15 minutter av 0,025 til 21,5 mg SpA intradermalt,

og død på grunn av blødning var et faktum 18 til 24 timer etter intradermale injeksjoner av på forhånd dannede ut-fellinger mellom menneske IgG og SpA (24). Oppløselige komplekser mellom IgG fra kanin og 125^SpA ble hurtig tatt ut fra kretsløpet hos kaniner ved lever og milt, og opptil 49% merkede komplekser ble tatt opp in vitro under en passering av saltvann over kaninlever (25).

Det er kjent at SpA tilsatt til menneske-, marsvin-, kanin-eller svingeserum forårsaker svak til markert uttømming av komplementaktivitet avhengig av artene (26-29). Blandinger av SpA og normalt eller myeloma IgG eller Fc fragmenter fra menneske eller normalt marsvin IgG aggregert av SpA hadde en lignende virkning (30, 31). Komplekser mellom SpA og begge marsvinunderklasser IgG-^ og IgG2fikserte komplement, mens antigen-antistoff-komplekser omfattende IgG^ ikke gjorde det (30, 31). Når SpA ble tilsatt til helsera fra menneske, avtok titerne for de nye bestanddelene av komplement med unntak av C7 som ikke ble bestemt, med fra 30% (C8) til 85%

(C3) og optimal inhibering oppsto ved IgG overskudd. På forhånd fremstilte komplekser mellom SpA og Fc-fragmentet til et komplement som fikserer myeloma IgG^, fremstilt under be-tingelser for maksimum aktivitet, minsket den totale komplement-titeren med 64% og titeren for de enkelte bestanddelene med fra

4% til 99% (C3) (14). SpA inhiberte også binding av Cl til enten varme aggregert IgG eller IgG myeloma 1 proteinet, men hadde ingen virkning på bindingen av Cl til IgG (14). Ut-tømming av komplementaktivitet var avhengig av mengden av SpA i forhold til IgG. Etter hvert som dosen av SpA-serum økte, var det følgelig et maksimumnivå av komplementaktivering som avtok ved høye SpA-konsentrasjoner (14, 26, 28). Denne virkning ble fortolket slik at høye konsentrasjoner

av SpA inhiberte Cl-binding. Eksperimenter av Langone et al.

(32, 33, 34)klargjorde virkningen av SpA på antistoffaktivitet. Komplekser mellom IgG og SpA dannet ved relativt høye eller lave doser SpA, opptrådte på samme måte som autentisk IgG. SpA-IgG-komplekser fremstilt med den empiriske formel

( (IgG)2sPA)n opptrådte på samme måte som IgM med hensyn

til sinehemolytiske evner og med hensyn til måten de virket sammen med helt komplement eller renset Cl (34). Ved hjelp av fluoresenssluknings- og lysspredningsteknikker ble det påvist at Fc fra kanin hadde to bindingssteder for monovalent fragment B og at det ble dannet komplekser med to til fire molekyler av Fc-fragmenter bundet sammen ved hjelp av SpA (35). Videre forbedrer kompleksdannelse mellom IgG og SpA antistoffaffiniteter signifikant sannsynligvis på grunn av tilknytning'på flere steder (13).

Polymorfonukleære leukosytter hos menneske omslutter hurtig

og nedbryter uoppløselige komplekser fremstilt av menneske IgG og SpA (36, 37) og hvite blodceller avgir histamin i nærvær av SpA (38). Graden av fagocytose er avhengig av SpA dosen og var optimal avhengig av de dannede utfellingene, og den ekvivalente frigjøringen av myeloperoksidase samsvarte, med fagocytose av komplekser. 125-j. merket IgG ble brukt til å vise at opptak var avhengig av konsentrasjonen av neuro-filer, Egenskapene til kompleksene, inkubasjonstiden og nærværet av serkumfaktorer (36).

Foreliggende oppfinnelse viser at protein A-IgG-komplekser dannes etter plasmaperfusjon over PACC. Lignende komplekser fremstilt ved inkubering av protein A med IgG eller serum i forskjellige molare forhold og deretter gitt intravenøst til tumorbærende verter har resultert i tumoricide reaksjoner og tumorregresjoner. Dette utgjør et nytt produkt for bruk ved behandling av kreft.

C: og alkalisering

Det har gjennom mange år vært anerkjent at det å utsette antigen-antostoff-komplekser, enten de er naturlig fore-kommende eller kunstig fremstilte, for ekstreme forhold med hensyn til pH på enten den sure eller alkaliske side vil hovedsakelig resultere i deres fullstendige oppløsning i deres respektive bestanddeler. Det å utsette kunstig fremstilte komplekser av serumalbumin-antiserumalbumin

fra okse for sur pH resulterer i adskillelse i de respektive bestanddeler slik det først ble demonstrert av Campbell et al.

(39). Dette konseptet har vært anvendt på immuologiområdet for å isolere antigener og antistoffer som er til stede i form av et immunkompleks. Fremgangsmåten for adskillelse av antistoffer fra antigen-antistoffkomplekser ved surgjøring og antistoffisolering etter antigenfjerning ved ultrafiltrering ved lav pH ble beskrevet av Sjøgren et al. (40)

i et system med tumor fra mus. Senere ble det funnet potensielt cytotoksiske antistoffer rettet mot antigener med tilknytning til leukemi i serum under det aktutte stadiet av akutt myelogen leukemi. Etter ultrafiltrering ved lav pH var signifikante komplementavhengig cytotoksisitet påvisbar i de fleste av de undersøkte sera (41). Dertil isolerte Dorsett et al. (42) tumorspesifike antistoffer fra utskillelse av ovariecarcinoma fra eggstokkene ved hjelp av saltutfelling og deretter inkubering ved pH 2,8 etterfulgt av nøytralisering av prøvene ved sakte tilsetning av natrium-hydroksyd. Frigjorte antistoffer ble prøvet ved hjelp av indirekte immunofluoresens og oppviste vesentlig økning

i titer. Konseptet ved alkalisering av oppløsninger for å adskille immunkomplekser ble opprinnelig beskrevet av Kabat og Mayer (43) og har vært brukt for dette formål i mange år.

Surgjøringen eller alkaliseringen av avløpsvæsker fra tvungen elektroforese eller tumorbærende plasma og dens bruk i behandlingen av kreft slik det vil bli beskrevet her, har såvidt oppfinneren kjenner til ikke tidligere vært utført eller rapportert.

D. Tumorimmun globulin

Immunoglobulinbruk i klinisk medisin begynte mee bruken av antitoksiner ved Behring og Kitasato (44) og utviklet seg til den kliniske bruken av antitoksiner fra dyr ved profil-oksen av sykdom hos menneske. Bruken av menneske-immunoglobulin preparater for passiv immunisering begynte med undersøkelsene av McKhann og medarbeidere (45, 46) som brukte ammoniumsulfat for å isolere globulinfraksjoner fra morkakeekstrakter. I 1936 ble disse fraksjonene, som viste seg å være effektive for å forhindre eller modifisere meslinger, referert til som immunglobulin (human) (47). Hovedfremskrittet på området kom ved utnyttingen av kald etanol til fraksjoneringen av immunoglobuliner fra menneskeplasma og påvisningen av at fraksjoner II, dvs. immunserumglobulin var effektive til profilaksen av meslinger (48, 49) og hepatitt (50, 51) likesåvel som'til behandlingen av immunologiske ufullkommenheter (47). Utviklingen av immuno-globulinbruken i De forente Stater har for en stor del bestått i innføringen av spesifike immunglobuliner. Produkter slik som stivkrampe-immunglobulin, anti-D globulin og immungolublin mot hundegalskap innehar en forholdsvis sikker status i klinisk medisin. Det nyeste av disse produktene er hepatittisk B globulin og enda flere slik som varicella-zoster immunglobulin er under utforskning. Det finnes nå

preparater for intravenøs bruk av gammaglobulin som om-

fatter de reduserte og alkylerte, de saltfraksjonerte,

beta propiolaktonbehandlede og de pH 4 behandlede preparater (52-57). Disse preparatene har vist seg å være virknings-fulle og har alle vist en stor variasjon av bivirkninger. Bivirkningene synes å reduseres vesentlig ved pH 4 behandling og en indikasjon forelå om at bivirkninger kunne unngås ved sakte infusjon. Ideelle egenskaper hos gammaglobulin omfatter fraværet av fragmenteringen, fraværet av både aggregering og IgA, og stabilitet hos preparatet. Det bør være egnet for bruk enten intramuskulært eller intravenøst og ikke ha noen hepatitis risiko.

Bruken av tumorspesifike antistoffer for spesifik aktiv immunoterapi har utviklet seg i de følgende retninger.

Prøver med fremmedsera har vært utført og krever administrer-ingen av fremmedprotein i en forlenget periode med dertil hørende risiko for allergiske reaksjoner. Ikke desto mindre hadde Lindstrøm i et tidlig forsøk enkelte kliniske responser på administrering av sera fremstilt i kaniner etter immunisering med myeloid leukemi celler (58). DeCarvalho fremstilte hyperimmun gammaglobulin i hester mot antigener adskilt fra norame antigener i tumorvev ved utfelling av de sistnevnte ved hjelp av antistoffer mot normalt vev. Tretten av 15 leukemi pasienter hadde ved foreløpige tilbakeganger i syk-domsbildet som varte fra 4 uker til 29 måneder etter å ha fått immunserumglobulin (59) . Sekla og kolleger var ikke i stand til å frembringe foreløpig tilbakegang i sykdommen hos fem pasienter ved hjelp av heterologe immunglobuliner fremstilt på en litt forskjellig måte (60). Tsirimbas et al. behandlet fem pasienter med kronisk lymfeleukemi med anti-lymfosyt serum fra hest. Hos 3 av 5 pasienter falt antallet perifere celler til omtrent 40% av den opprinnelige verdien (61). DeCarvalho så objektive bevis for respons hos pasienter med fast tumor ved bruk av globuliner fremstilt som for leukemiene (59). Marsh et al. administrerte et antitumor serum fra kanin til pasienter med en rekke forskjellige faste tumorer (62) . De så ingen klinisk virkning selv om antistoff ble selektivt lokalisert ved autopsi i områder med sarcomaceller. I et nyere forsøk hvor det ble bruk serum fremstilt fra melanoma-immuniserte sjimpanser, iakttok forskerne akutt død som følge av invollssykdom hos to av tre pasienter selv om tilbakegangene var ufullstendige og ble gjort komplekse på grunn av dødelig thrombocytopenia hos en paseient (63).

Også allogene sera har vært undersøkt med hensyn til deres terapeutiske virkning på leukemi. Flere forskere har for-søkt å behandle leukemier og lymphomas med sera som inneholder antistoffer mot menneske lymfosytter. I en under-søkelse av Laslow et al. (64) ble antilymfosyttplasma fremstilt ved å immunisere normale individer mot normale lymfosytter. IgG ble så adskilt fra dette plasma og gitt til tre pasienter med kronisk lymfosyttleukemi. Hos hver pasient var det en forbigående lymphopenia og minsking i størrelsen på lymfeknuter etter infusjon. Djarassi behandlet fi-re pasienter med akutt lymfosyttisk leukemi med serum fra en pasient med thalassemia major som var blitt gjort sensi-tiv mot både granulosytter og lymfosytter fra mange individer. Hos alle fire pasienter sank antallet perifere hvite klodlegemer (65). Herberman administrerte serum ned cytotoksiske antistoffer fra en kvinne med flere graviditeter til syv pasienter med lymfoproliferative sykdommer. Pasientene hans svarte med fall i lymfosytt- og platelet antallene gjennomsnittlig 48,8% til 25,5% av verdiene før behandlingen som varte i en dag. To av de fem pasientene hadde svinn av perifert lymfevev. To av fire pasienter hadde mindre bivirkninger slik som feber cg frysninger og to hadde ånde-drettsbesvær (66). Allogene sera hvor donorene forsettlig var blitt immunisert mot tumorceller har også vært undersøkt.Brittingham og Chaplin immuniserte en normal donor med leukosytter fra en pasient med kronisk myelosyttisk leukemi. Det normale individet ble så på nytt immunisert 3 år senere med helblod fra en annen pasient med kronisk myelosyttisk leukemi. Antileukosytt-antistoffet som var aktivt mot donor-celler oppstå i det normale individet. Gammaglobulin ble holdt fra denne donor og denne donors plasma ble administrert til de pasienter med leukemi hvis celler var blitt brukt til re-immunisering. Der var ingen åpenbar nyttig viskning på pasientens sykdom (67). Skirkovich og medarbeidere immuniserte pasienter med leukemiceller fra andre pasienter. Åtte til 15 dager etter immunisering ble plasma byttet to til tre ganger mellom donorpar av pasientene. Seks par barn ble behandlet og tre fullstendig og fem delvis hematologiske remisjoner ble observert. Syv av disse pasientene som svarte på behandlingen, hadde fått steroid terapi såvel som cyto-statisk terapi, men en fullstendig remisjon ble oppnådd med immunoterapi alene (68). Remisjonsplasma hadde også vært gitt for passiv terapi. Skirkovich og medarbeidere samlet opp autologe plasma og leukosytter tidlig under remisjon og administrerte disse til pasienter på senere stadier av remisjon. De hadde en fornemmelse av at remisjonsvarigheten ble forlenget ved denne manøver (69) . Ngu som brukte senere remisjonssera fra pasienter med Burkitts lymphoma frembragte regresjoner hos pasienter med aktive sykdommer (70) . Serum fra pasienter med regresjon av malignant melanoma har av og til indusert regresjon når det ble administrert til andre pasienter.

Forskere har forsøkt på å utnytte spesifisiteten til antistoff til å overlevere andre cytotoksiske materialer direkte til tumorcellen i modellforsøk på dyr. Klorambucil og dauno-mycin har blitt bundet til antitumor antistoffer (72, 73)

og antistoffer har også vært merket med radioaktive isotoper slik som 131^(74). Det har også vært konjugert toksiner slik som difteri (75) og enzymer med cytotoksisk potensiale (76). En mulig synergistisk virkning mellom antistoff og kjemoterapi er blirr beskrevet av Segerling et al. og viser at marsvin hepatoma celler som vanligvis er motstandsdyktig

mot dreping av antistoff og komplement, gjøres følsomt etter behandling med kjemoterapeutiske midler (77).

Selv om det er åpenbart at det har vært gjort mye arbeide tidligere med hensyn til administrasjonen av immunglobulin-preparater til tumorbærende dyr og mennesker, har resultatene av disse eksperimentene vært blandede. For det første bør det legges merke til at disse behandlingene ikke har vært konsekvent effektive til å behandle tumoren. Det har vært anvendt en rekke forskjellige typer behandlinger som varierer fra bruken av pasientens eget serum og til bruken av serum fra andre pasienter med lignende sykdommer og helt til bruken av sera fra dyr av forskjellige arter. I den senere tid har det vært gjort forsøk på å behandle pasienter ved å

bruke monoklonale antistoffer generert i mus mot den bestemte tumoren som ikkehas av pasienten. Disse forskjellige forsøkene er bevis på den generelle mangel på suksess i de tidligere teknikker, slik det er åpenbart i publikasjonene nevnt ovenfor. I motsetning til de blandede resultater oppnådd i den tidligere kjente teknikken, er det tumorforbundne immunglobulinpreparatet ifølge foreliggende oppfinnelse i stand til å gi konsekvent tumorisid virkning når det injiseres i tumorbærende verter, både mennesker og dyr. Videre omfatter frembringelsen av disse materialer signifikant færre komplikasjoner enn ved den tidligere kjente teknikk etter som et hvert immunglobulin er holdt fra et hvert medlem av arten kan brukes, hvilket materiale lett kan erholdes ved (f.eks.) å isolere plasma fra verter som har immunkomplekser som inneholder det ønskede antistoff, eller erholde antistoffet fra Cohn-fraksjonering av plasmaet erholdt fra verten. Teknikkene som her åpenbares gir anledning til fremstilling

av en mye mer rikelig kilde av generelt effektive tumor-reagenser enn det som på noen mulig måte kunne ha blitt fremstilt ved hjelp av de tidligere kjente teknikkene.

Vi beskriver her et nytt tumorimmunglobulin erholdt fra

serum hos tumorbærende verter samt en fremgangsmåte for å fremstille det. Dette stoffet oppviser tumoriside virkninger når det administreres til verter med kreft.

E. Komplementaktivering

Komplementsystemet hos menneske består av et mangfoldig

forråd av plasmaproteiner. I alt mer enn 20 bestanddeler deltar i velordnede reaksjonssekvenser som eventuelt resulterer i komplementaktivering. Oppsamlet bevismateriale understøtter påstanden at komplementsystemet tjener som et fundamentalt element i forsvarmekanismen hos normale verter og som en konsekvens derav er komplementaktivering vanlig-

vis forbundet med en rekke patologiske tilstander (78, 79, 80). Det er to hovedmåter betenget det klassiske og det alternative sporet hvorved komplement aktiveres. Disse to sporene kan generelt skilles fra hverandre ved fremgangsmåten hvorved injisiering oppstår. Uansett måten for komplementaktivering er det omdannelsen av den viktige C3-bestanddelen til et C3a og C3b fragment som signaliserer den endelige aktiver-ingen. Som et resultat av aktivering etter det klassiske eller alternative sporet, dannes en C3 konvertase. C3-omdannelse gir opphav til dannelsen av et enzymkompleks

(C5 konvertase) som deretter igjen spalter C5 hvorved det

fåes fragmentene C5a og C5b. C5a går deretter i oppløsning mens C5b delen av molekylet spiller en viktig rolle for inisiering av dannelsen av det lytiske membranangreps-komplekset.

C3a og C5a er molekyler betegnetanaphylatoxiner og er ekstremt potente bioaktive stoffer som spiller en nøkkel-rolle som mellomprodukter i den akutte betennelsesresponsen (81, 82). Både C3a og C5a deler visse spasmogene egenskaper idet C3a er effektiv i det nanomolare konsentrasjonsområdet og C5a i det subnanomolare konsentrasjonsområdet (83). Det er påvist at begge faktorer øker vaskulær permeabilitet (84, 85) samt induserer frigivelse av histamin fra bindevevceller (86). C5a er en kjemotaktisk faktor og dette glykopolypeptid synes å være en hovedoverfører av nøytrofilt indusert be-tennelse (87). Flere mekanismer antas å være effektive for å begrense den bilogiske aktiviteten av anaphylatoksiner.

En serumeksopeptidase fjerner effektivt en essensiell C-ende arginylrest fra anaphylatoksinmolekylene og setter faktisk både C3a og C5a ute av stand til spasmogen handling innen sekunder etter at de er blitt frigitt til kretsløpet (88). Produktet C5a des Arg beholder likevel en evne til å fremme kjemotaksis (89).

C3a er et enkeltkjedet polypeptid med 77 aminosyrerester

og har en molekylvekt på 9000. C5a anafylatoksin fra menneske er et enkeltkjedet glykopeptid med 74 aminosyrerester som inneholder en enkel oligosaccharidenhet knyttet til asparaginresten i posisjon 64. Den samlede molekylvekt for polypeptidet og oligpsaccharidresten er 11.000 (90, 91).

Ved tidligere undersøkelser på mennesker ble det observert at serumnivåene av C5a (og beslektede bestanddeler) ble forhøyet kort tid etter plasmaperfusjonen over kollodium trekull med protein A (21). Nærværet av C5a var forbundet med perifer vasodilatasjon og nærværet av mellomromsvæske (20, 21). I et tilfelle var der bevis for opphopning av blod i lunger på det tidspunktet C5a ble påvist (21). Videre ble det observert at akutte tumoriside reaksjoner hos disse pasientene var forbundet med tilsynekomsten av væskefyllte vesikler over kutanøse tumorsteder som inneholdt polymorfonukleære leukosytter (20) . Etter som C5a er kjent for å gi enøkning i vaskulær permeabilitet og vasodilatasjon og er kjemotaktisk for nøytrofile, kan det bidra til de observerte fysiologiske virkninger etter protein A perfusjon og kanskje forbedre innstrømningen av sirkulerende tumoriside faktorer i tumorøse steder.

Kassel et al. har vist at særlig administrasjonen av ren

C5 til leukemiske mus resulterte i signifikante leukemiske regresjoner (92). AKR mus med spontan leukemi fikk inn-sprøytet normalt serum fra en rekke arter. Leukemiceller ble ødelagt med serum fra stammer av mus som hadde hele spekteret av komplementbestanddeler, men ikke med serum fra murine stammer med genetisk bestemt mangel på C5. Serum fra marsvin, hester og mennesker forårsaket også ødeleggelse av leukemiceller. I det følgende gjengis meka-nismene for hvordan C5 ga ødeleggelse av leukemiceller i AKR mus: (a) C5 kan ha en direkte virkning på leukemiceller ved å tilveiebringe et manglende komplementledd som tillater cytotoksiske antistoff fremstilt av verter og indusere cellelyset, (b) C5 reagerer på et sted forskjellig fra leukemicelleoverflater, f.eks. med antigen-antistoff komplekser i blodet eller nyren og forårsaker derved frigivelsen av lymfokiner som selv frembringer ødeleggelse av leukemiceller, (c) den anti-leukemiske virkningen av C5 er uavhengig av på forhånd eksisterende immun-respons hvilket tyder på en annen mekanisme for spesifikk avliving av leukemiceller.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et tumor-tilknyttet immunglobulinpreparat som er nyttig i seg selv eller i kombinasjon med andre former for behandling av kreft. Immunglobulinene i plasma fra individet som skal behandles eller fra andre tumorbærende dyr av den samme arten (in-kubert mennesker), kan ifølge oppfinnelsen behandles for o

a:

a) spalte eller skille immunglobuliner som er i omløp fra de oppløselige tumorantigenene som er i omløp

og som de har dannet komplekser med;

og

b) samle disse frigjorte immunglobuliner for å fremstille et materiale med forøket tumorisid virkning

når det injiseres i den tumorbærende verten.

Det bør legges merke til at dette spaltingstrinnet kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst av en rekke kjente spaltingsteknikker, omfattende en vesentlig variasjon av pH fra den som normalt foreligger i serumet, en stor endring i ionestyrken (slik som ved tilsetning av salter), opp-varming eller lignende, forutsatt at spaltingsteknikken som anvendes må være god nok til å separere immunkomplek-sene som er i omløp i det ønskede immunglobulin og det oppløselige tumorspesifikke antigenet uten i noen vesentlig grad å denaturere det ønskede immunglobulin.

En foretrukket teknikk som har vært anvendt for å bevirke denne spaltingen, er behandlingen av det erholdte immun-komplekset med syre eller base under spaltingsbetingelser i en tilstrekkelig lang tid til effektivt å spalte kompleksene. En pH i området fra ca. 3,2 til 1,5 er, slik det er anerkjent innen teknikken, vanligvis tilstrekkelig til å forårsake denne spalting. Tidsintervaller som ville antas å være virksomme for denne spalting varierer fra omtrent 2 minutter og opptil så lenge som 8 timer eller lengre om ønsket. Oppfinneren har funnet at behandling med syre for å senke pH til omtrent 2,5 i løpet av ca. 5 minutter, etterfulgt av en hurtig nøytralisering til omtrent pH 7,4, er brukbart for å fremstille det ønskede materiale. Dersom det anvendes en alternativ spaltings-teknikk, kan det være nødvendig etterpå å behandle mate-rialet for å forårsake den ønskede aggregering av immun-globulinet, dersom imidlertid syrebehandlingen må brukes, oppstår aggregeringen i det vesentlige samtidig under behandlingen.

Protein A-immunglobulin komplekser kan oppnås i et bredt område av effektive forhold mellom protein A og immunglobulin, idet det eneste kriteriet er at komplekset skal være virksomt ved behandlingen av tumorer. Disse forhol-dene kan variere fra 1:1000 protein A/globulin opptil 1:2 protein A/globulin. Forhold på omtrent 1 til 100 er funnet å være særlig effektive. Disse kompleksene kan passende

erholdes ved utfelling slik det er kjent innen teknikken.

En brukbar utfellingsteknikk er ved. å bruke slike materialer som er kjent for fagmenn. Disse immunglobuliner kan selvfølgelig være monoklonale antistoffer som er fremstilt i mus eller andre dyr mot den bestemte tumor hos verten eller mot den samme typen tumor hos andre medlemmer av den samme dyrearten.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles et tumor-tilknyttet immunglobulinpreparat med tumorisid virkning og som stammer fra plasmaet til en tumorbærende vert som omfatter hovedsakelig IgG og IgM, og som har titere for tumortilknyttede antistoffer på minst det dobbelte av serum fra vertene, forøket Clq-binding i fraksjoner som sedimen-terer over 7S ved gradientanalyse av sukrosedensitet, økning i uvirksomt volum og minsking i proteiner som omfattes av fraksjoner på Sephadex G-200 i sammenligning med serumet. Dette fremstilles fra sera hos tumorbærende verter ved

å utsette dette enten for en vesentlig økning eller senk-ning av pH i forhold til normalt plasma i en virksom spalt-ingsperiode.

Sammenlignet med ubehandlet serum har tumorimmunplasma forøkede titere for tumortilknyttede antistoffer, forøket Clq-binding i tungt sedimenterende fraksjoner og forøkede protein-nivåer som kromatograferes i uvirksomt volum på G-200 sammen med minskede nivåer av de fraksjonene som omfattes.

Surgjorte tumorbærende sera.

9 ml/kg av autologe sera eller plasma fra tumorbærende verter surgjøres til pH 2,5 ved dråpevis tilsetning av ION HC1 og holdes i 5 min. ved 27°C. Serumet nøytralise-res deretter hurtig til pH 7,4 ved tilsetning av ION NaOH og sentrifugeres ved 1500 x g i 30 minutter ved 4°C. Super-natantserumet fjernes deretter og gis intravenøst med en hastighet på 1 ml/min.

Endringer, i hovedbestanddelene i menneskeplasma etter sur-gjøring og hurtig nøytralisering ved hjelp av den ovenfor nevnte fremgangsmåte er gjengitt nedenunder i tabell IA. Det vil ses at det er en reduksjon av totalt protein og globulinfraksjonen samt i fibrinogen, mens andre para-metre forblir i det vesentlige uendrede. Tabell IB viser reduksjoner i menneske-immunoglobuliner G, M og A etter behandling av pias med syre.

Autologt surgjort serum fra tumorbærende verter oppviser en signifikant økning i tumortilknyttede antistoffer målt ved indirekte immunofluoresens under anvendelse av hver hunds egen tumor som substrat (tabell II) •

♦Tallene angir sluttfortynninger som ga sera med positiv

fluoresens mot hundens eget tumorsubstrat.

Endringer i tumortilknyttede antistoffer i sera fra hunder med brystcarcinoma etter surgjøring ble undersøkt i en radioaktiv immunologisk analyse hvor en vevskulturlinje av hunde-brystadenocarcinoma ble brukt som sikremål og 125-j- protein A som indikator for å påvise cellebundet hunde IgG. I 10 under-søkte sera resulterte surgjøring til pH 2,5 etterfulgt av hurtig nøytralisering i økninger i tumortilknyttede bidnings-nivåer på 120 63% (S.D.) over verdiene for ubehandlet serum.

Analyse med Sephadex G-200 kromatografi av helserum fra

et menneske med brystadenocarcinoma før og etter surgjøring viste følgende: (a) surgjort serum oppviste storøkning i volum uvirksomt protein og en relativ reduksjon i protein i den undersøkte fraksjonen sammenlignet med ubehandlet serum, (b) tumor-tilknyttet binding målt ved radioaktiv immunologisk analyse viste 948% økning i den undersøkte fraksjonen og 134% økning i volum av uvirksom fraksjon sammenlignet med ubehandlet serum.

Analyse av surgjort helserum etter sucrosedensitets

gradient ultrasentrifugering viste at Clq-bindings nivåene ble øket opptil 400% i fraksjoner større enn 7S sammenlignet med ubehandlet serum. Følgelig synes det som

om surgjøring av tumorbærende serum gir en økning i tumortilknyttede antistoffer og frembringelsen av proteiner med høy molekylvekt.

Surgjort serum i behandling av spontane tumorer

Autologe surgjorte sera fra tumorbærende hunder gis sammen med zymosanaktivert normalt hundeserum på den første dag og på nytt innen 24 timer senere (andre dag). Dyret får hvilke på den tredje dag. På den fjerde dagen gis cyklofosfamid intravenøst (behandlingsmåte 2, tabell XVIII). Resultatene av denne behandling på fem hunder er vist i tabell III. En virksom variasjon som gir svært betydelige tumoriside virkninger er som følger: L-asparginase og cyklofosfamid gis til verten på den første dagen og når maksimum regresjon av tumoren er oppnådd, gis zymosanaktivert normalt hundeserum (100 ml) og på forhånd behandlet autologt plasma (9 ml/kg) som er surgjort og alkalisert, og L-asparginase og cyklofosfamid administreres på den følgende dagen. Resultatene er gjengitt i den følgende tabell IV.

Bruken av det fremstilte produkt alene eller i kombinasjon med forskjellige kjemoterapeutiske midler, har resultert i svært sterke tumoriside reaksjoner og tumorregresjoner hos hunder med forskjellige spontane tumorer.

Selv om angitte eksempler gjelder, er for spontane tumorer hos hunder, bør det forstås at disse tumorene utgjør aner-kjente og utmerkede modeller for sine motsvarigheter hos mennesker. Den vellykkede terapien i hundemodellen med protein-kollodium-trekull systemet (17, 19) ble nylig over-ført til mennesker hvor det ble oppnådd objektive tumorregresjoner hos fire av de fem første behandlede pasientene (20). Følgelig antas de her gjengitte data for hunder med tumorer å forutsi vellykkede resultater også når samme fremgangsmåtene og preparatene anvendes på mennesker med spontane tumorer.

Selv om foreliggende oppfinnelse har vært beskrevet spesielt med hensyn til bruken av syrebehandling som adskillende teknikk, vil det forstås at andre ekvivalente, kjente adskillingsteknikker, som beskrevet ovenfor, lett kan brukes slik det vil forstås av en fagmann på området.

REFERANSER

1. Bier, M., In Electrophoresis, (utg. M. Bier), Academic

Press, New York, New York, 1959, s. 263

2. Bier, M., In Membrane Process for Industry, Southern

Research Institute, Birmingham, Ala., 1966, s. 218.

3. Bier, M., Sixth Intern. Congress Biochem., New York, 1964 .

4. Bier, M., Science 125:1084, 1957.

5. Hanning, K., In Electrophoresis, vol. II, Academic

Press, New York, New York, 1967, s. 423.

6. Bier, M., Brucknew, G.C. og Roy, H.E., Trans. Amer.

Soc. Artif. Int. Organs 13:227, 1967.

7. Bier, M. og Mourlek, S.P., In Proe. Third Annual American

Water Resources Conference, 1967,s. 524.

8. Bier, M. , Bruckner, G.C, Cooper, F.C. og Roy, H.E., Concentration of Bacteriophage by Electrophoresis in Transmission of Viruses by Water Route, New York, 1967, s. 57. 9. Bier, M., In Symposium on Electrodialysis, Electrochemical Society, Boston, Mass., 1968. 10. Bier, M., Beavers, D.C., Merriman, W.G., Merkel, F.K., Eisenman, B. og Starzl, T.Z., Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs, vol. XVI, 1970.

11. Forsgren A., Sjoquist J., J. Immunol. 1966, 97:822.

12. Kronvall G., Frommel D., Immunochem. 1970, 7:124.

13. Kessler, S.W., J. Immunol. 1975, 115:1617.

14. Stalenhem G., Gotze 0., Cooper N.R., Sjoquist J.,

Muller-Eberhard, H.J., Immunochem. 1973, 10:501.

15. Vallota, E..H., Muller-Eberhard, H.J., J. Exp. Med.

1973, 137:1109.

16. Stalenham, Castensson, S., FEBS Letters 1974, 14:79.

17. Terman, D.S., Yamamoto, T., Mattioli, M., Cook, G., Tillquist, R., Henry, J., Poser, R., Daskal, Y.,

J. Immunol. 1980 124:795. 18. Holohan, T., Bowles, C, Deisseroth, A., Proe. Am.

Assoc. Cancer Res., Am. Soc. Clin. Oncol. 21:241 abstract. 19. Terman, D.S., Yamamoto T., Tillquist, R.L, Henry,J.F., Cook, G.L. Silvers, A., Shearer, W.T., Science 1980, 209:1257. 20. Terman, D.S., Young, Y.B., Shearer, W.T., Ayus, C, Lehane, D, Mattioli, C, Espada, R., Howell, J.F., Yamamoto, T., Zaleski, H.I., Miller, L., Frommer,

P., Fedlman, L., Henry, J.F., Tillquist, R., Cook, G.,

Daskal, Y.; N. Engl. J. Med. 1981, 305:1195.

21. Young, J.B., Ayus, J.C., Miller, L.K., Webster, R.O, Miller, R.R., Terman, D.S.: Circulation 1981, 64:325

abstract.

22. Martin, R.R., Crowder, J.G., White, A.J., J. Immunol. 99, 269, 1967. 23. Gustafsen, G.T. Stalenheim, G., Forsgren, A., Sjoquist,

J., J. Immunol. 100, 530, 1968. 24. Heczko, P.B., Grov, A., Oeding, P., Acta Pathol.

Microbiol. Scand. Section B, 81, 731, 1973.

25. Gustafsen, G.T., Sjoquist, J., Stalenheim, G.,

J. Immunol. 98, 1178, 1967. 26. Masuda, S. og Kondo, I., Microbiol. Immunol. 23, 1223, 1979 . 27. Kronvall, G. og Gewurz, Clin. Exp. Immunol. 7, 211, 1970 . 28. Stalenheim, G., Acta. Pathol. Microbiol. Scand.

Section B, 79, 665, 1971. 29. Sjoquist, J. og Stalenheim, G., J. Immunol. 103, 467, 1969 . 30. Stalenheim, G., Gotze, O., Cooper, N., Sjoquist, J.,

Muller-Eberhard, H., Immunochemistry, 10, 501, 1973.

31. Stalenheim, G., Malmheden-Ericksson, I, FEBS Lett.

14 82, 1971. 32. Stalenheim, G. og Castensson, S., FEBS Lett. 14, 79, 1971. 33. Langone, J.J., In Methods in Enzymology, Academic

Press, Inc. N.Y., 70, 356, 1980.

34. Langone, J.J., J. Immunol. Methods. 34, 93, 1980c.

35. Langone, J.J., Boyle, MDP, Borsos, T., J. Immunol. 121, 333, 1978. 36.Lancet D., Isenman, D., Sjodahl, J., Sjoquist, J.,Pecht, I., Biochem. Biophys. Res. Commun. 85, 608, 1978 . 37. Hallgren, R. og Stalenheim, Immunology, 30, 755, 1976. 38. Hallgren, R. og Stalenheim, G:, Immunology, 35, 13, 1978. 39. Martin, R.R. og White, A., J. Immunol. 102, 437, 1969. 40. Campbell, D.S., Luescher, E. ogLerman, L.S., Nati.

Acad. Sciences 37:575, 1951.

41. Sjogren, H.O., Hellstrom, I., Bansal, S.C. og Hellstrom,

K.E., Proe. Nati. Acad. Sciences, 68:1372, 1971.

42. Faldt R., Ankerst, J., Int. J. Cancer 26:309, 1980.

43. Dorsett, Ioachim, Stolback, Int. J. Cancer 16:779, 1975. 44. Kabat, E.A., Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry

CC, Thomas, Springfield, IL, 1948, s. 480.

45. Behring; Kitasato, Dtsch. Med. Wochenschr. 16:1113, 1890 .

46. McKhann, CF.; J. Infect. Dis. 52:268, 1933.

47. McKhann, CF., Green, A.A., Coady, H. J. Pediatr.

6:603, 1935. 48. Eley, R.C, Green, A.A., McKhann, CF., J. Pediatr. 8:135, 1936. 49. Stokes, J., Jr., Maris, E.P.; Gellis, S.S., J. Clin.

Invest. 23:531, 1944.

50. Ordman, C.W.; Jenning, C.G., Jr.; Janeway, C.A.,

J. Clin. Invest. 23:541, 1944.

51. Stokes, J.; Neefe, J.R., J.A.M.A. 127:144, 1945.

52. Gellis, S.S., Stokes, J., Jr., Brother, G.M., Hall, W.M., Gilmore, H.R., Beyer, E., Morrissey, R.A.,

J.A.M.A. 128:1062, 1945.

53. Bruton, O.C, Pediatrics 9 :722 , 1952.

54. Eibl, M., In Immunoglobulins; Characteristics and

Uses of IntravenousPreparations (utg. B.M. Alving,

J.S. Finalyson), U.S. Department of Health, and

Human Services, s. 23, 1979.

55. Ochs, H.D., In Immunoglobulins; Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (utg. B.M. Alving,

J.S. Finalyson), U.S. Department of Health, and Human

Services, s. 9, 1979.

56. Condie, R.M., In Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (utg. B.M. Alving,

J.S. Finalyson), U.S. Department of Health, and Human

Services, s. 179, 1979.

57. Skvaril, F., Barandun, S., In- Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (utg. B.M. Alving, J.S. Finalyson), U.S. Department

of Health, and Human Services, s. 201, 1979.

58. Seiler, F.R., In Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (utg. B.M. Alving, J.S. Finalyson), U.S. Department of Health,

and Human Services, s. 207, 1979.

59. Funakoshi, S., In Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (utg. B.M. Alving, J.S. Finalyson), U.S. Department of Health, and Human

Services, s. 219, 1979.

60. Lindstrom, G.A., Acta Med. Scand. Suppl. 22, 1, 1927.

61. de Carvalho, S., Cancer, 16, 306, 1963.

62. Sekla, B., Holeckova, E., Janele, J., Libansky, J.,

Hnevkovsky, O., Neoplasma 14, 641, 1967.

63. Tsirimbas, A.D., Pichlmayr, R., Horninung, B., Pfisterer, H., Thierfelder, S., Brendel, W. og

Stitch, W., Klin. Wschr. 46, 583, 1968.

64. Marsh, B., Flynn, L. og Enneking, W., J. Bone and

Joint Surgery 54A, 1367, 1972.

65. Parks, L.C., Smith, W.J., Beebe, B., Winn, L., Rafajko, R., Rolley, R. og Williams, G., Melville, Proe. Amer. Cancer Res. and Amer. Soc. Clin. Oncology 16, 134, 1975 . 66. Laszlo, J., Buckley, C.E. og Amos, D.B., Blood, 31, 104, 1968.

67. Djerassi, I., Clinical Pediatrics 7, 272, 1968.

68. Herberman, R.B., Oren, M.E., Rogentine, G.N. og

Fahey, J.L., Cancer 28, 365, 1971.

69. Brittingham, T.E. og Chaplin, H., Cancer 13, 412, 1960. 70. Skurkovich, S.V., Kisljak, N.S., Machonkova, L.A. og

Begunenko, S.A., Nature 223, 509, 1969.

71. Skurkovich, S.V., Makhaonova, L.A., Reznichenko, F.M. og Chervonskiy, G.I., Blood 33, 186, 1969.

72. Ngu, V., Brit. Med. J. 1, 345, 1967.

73. Ngu, V., Brit. Med. J. 1, 345, 1967.

74. Levy, R., Hurwitz, E., Maron,.R. og Sela, M.,

Cancer Res. 35, 1182, 1975.

75. Vial, A.B. og Callaham, W., Cancer 10, 999, 1957.

76. Moolton, F.L. og Cooperband, S.R., Science, 169, 68, 1970.

77. Parker, C.W., Pharmacol. Rev. 25, 325, 1973.

78. Segerling, M., Ohanian, S.H. og Borsos, T.,

Cancer Res. 35, 3195, 1975. 79. Ruddy, S., Gigli, I., Austen, K.F., N. Engl. J. Med. 287:489, 545, 592, 642, 1972. 80. Wilson, M.R., Arroyaye, C.M., Nakamura, R.M., Vaughn,

J.H., Tan, E.M., Clin. Exp. Immunol 26:11, 1976.

81. Verhaeqen, H., DeCock, W., DeCree, J., Verbruggen, F.: Cancer 38:1608, 1976.

82. Ryan, G.B., Majno, G.: Am. J. Pathol. 86:183, 1977.

83. Hugli, T.E., Muller-Eberhard, H.J.: J. Exp. Med. 127:371, 1968. 84. Cochrane, C.G., Muller-Eberhard, H.J., J. Exp. Med. 127;371, 1968.

85. Lepow, I.H., Willm-Kretschmer, K., Patrick, R.A.,

Rosen, R.S., Am. J. Pathol 61:13, 1970.

86. Vallota, E.H., Muller-Eberhard, H.J., J. Exp. Med. 137:1109, 1973. 87. Johnson, A.R., Hugli, T.E., Muller-Eberhard, H.J.,

Immunology 28:1067, 1975.

88. Hugli, T.E., "The Chemistry and Physiology of Human Plasma Proteins." New York: Pergamon Press, 1979, s . 225 . 89. Bokisch, V.A., Muller-Eberhard, H.J., J. Clin Invest, 49:2427, 1970.

90. Chenoweth, D.E., Hugli, T.E., J. Immunol 124:1517,

1980 .

91. Hugli, T.E., J.Biol. Chem. 250:8293, 1975.

92. Fernandez, H.N., Hugli, T.E., J. Biol. Chem, 253:6955, 1978 . 93. Kassel, R.L., Old, L.J., Carswell, E.A., Fire, N.C., Hardy, W.D., J. Exp. Med. 138, 925, 1973.

94. Cohn, E.J., J. Amer. Chem. Soc. 68:459, 1946.

95. Kistler, P. og Nitschmann, H.S-., Vox Sang 7 :414 , 1962 . 96. Killingsworth, L.M. og Savoy, J., 1972 Manual nephelo-metric methods for immunochemical determination of immunoglobulins IgG, IgA and IgM in human serum Clin Chem 18:335. 97. Mancini, G., Carbonara, A.O. og Heremans, J.F., 1965 Immunochemical quantitation of antigens by single readial immunodiffusion. Immunochem. 2:235. 98. Romer, J., Gardi, A. og Kistler, P., 1979, Assay of anticomplementa activity in solutions of immunoglobulins. Develop. Biol. Standard 44:147. 99. Laemmli, U.K. 1970 Cleavage of structural proteins during assembly of the head of backteriophage T4.

Nature 232:52.

100. Ishiyama, H., Okuyama, K., Masuda, K. og Yasuda, J.,

1978 Effects of human immunoglobulin preparations on Fc rosette formation between anti-D coated erythro-cytes and lymphocytes. Z. Immun.-Forsch. 154:387.

101. Webster, R.O. og Henson, P.M., 1978 Rapid micromeasure-ment of neutrophil exocytosis. Inflammation 3:129.

102. Anderson, D.C., Edwards, M.S. og Baker, C.L., 1980

Luminolenhanced chemiluminescence for evaluation of type III group B streptococcal opsonins in human sera.

J. Infect. Dis. 141:370.

103. Johnston, R.B., Jr., J.E. Lehmeyer og Guthrie, L.A.,

1976 Generation of superoxide anion and chemiluminescence by human monocytes during phagocytosis in contact with surface bound immunoglobulin G.J. Exp.

Med. 143:1551.

104. Levy, P.C., Shaw, G.M. og LoBuglio, A.F., J. Immunol.

vol. 123, Nr. 2, 594, 1979.

105. Koren, H.S. og Williams, M.S., J. Immunol. Vol. 121,

No. 5, 1956, 1978.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein A-IgG preparat som har de følgende egenskaper: (a) omfatter i overveiende grad tunge og lette igG-kjeder og protein A ved polyakrylamidgel-elektroforese, (b) identifiseres i tungt sedimenterende 7S eller større enn 7S-fraksjoner på sukrosedensitetsgradient med økt Clq-bindende virkning, (c) dissosierer i Clq-bindende fragmenter med lavere molekylvekt under sure betingelser, (d) er utfellbart med 5% polyetylenglykol eller ved andre kjente fremgangsmåter for utfelling av immunoglobuliner, (e) har anti-komplementær virkning, (f) inhiberer Fc-avhengig dannelse av lymfocytt-rosett, (g) induserer neutrofiler til å frigi myeloperoksidase, catepiner og superoksyd-anioner, (h) induserer hemagglutinering i hundeerytrocytter, (i) inneholder antistoffer som beholder sin antigen affinitet og har for relativt forøkede cytotoksiske evner i nærvær av komplement, og (j) gir tumoriside reaksjoner og tumorregresjoner når det infuseres i tumorbærende verter i forskjellige molare forhold til protein A-IgG komplekser, karakterisert ved at man isolerer protein A-IgG komplekset fra tumorbærende plasma etter perfusjon over immobulisert Staphylococcus aureus protein A ved utfelling over protein A-IgG komplekset fra plasmaet etter perfusjonen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man inkuberer protein A med IgG, og eventuelt isolerer det erholdte A-IgG kompleks.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender et IgG som har tumor-spesifisitet.