NO831762L - Farmasoeytiske preparater. - Google Patents

Description

Foreliggende opp åfinnélse angår seskviterpenlaktoner og seskviterpenlakton-holdige planteekstrakter og preparater for farmasøytisk bruk, og -spesielt ekstrakter og preparater som er brukbare ved behandling av migrene og forskjellige artritiske og bronkialforfrold..

Hyppigheten av fn|grene sies å ligge i området 12%

av befolkningen. De nøyaktige- årsaker er ikke fastslått, men visse e lementer er vel dokvimentert..

Neurohumorale og%*lokale hormon- (autacoid) fak-

torer slik som noradrenalin, 5-hydfoksytryptamin (serotonin), histamin og prostaglandiner er implisert i migrene idet de sannsynligvis visker på det cerebrovaskulære nivå.

Det er mange tegn som antyder at en forstyrrelse

av blodkardiameteren er involvert i' migreneprosessen. Rap-porter har således vist en.-: sammentrekning av cerebral cortical-karene fulgt av en dilatering under et migreneangrep. Vaso-konstriksjonen antas å skyldes frigivelsen av aminer slik som noradrenalin fra neuroner og 5-hydroksytryptamin fra blodplater. Histamin frigis også fra vertsceller og spiller en viktig rolle i migrenevårianten som kalles "cluster-hodepine" (migrenøs neuralgi). Medikamenter med antinor-adrenalin-, anti-5-hydroksytryptamin- og antihistamin-aktivi-teter benyttes alle for å lette migrenesymptomer. Antydning-er om at prostaglandiner (PG), slik som PGE2, PGF2a, PGI2prostacyklin) og tromboxan A ér involvert kommer fra det faktum at ikke-steroide anti-ihflammatoriske medikamenter slik som aspirin, som virker vé„d å inhibere syntesen av prostaglandiner, er meget effektive både for profylakse og akutt behandling av migrene.

Hva angår artritiske forhold, impliserer under-trykkelse av prostaglandinsyntesen ved ikke-steroide anti-inflammatoriske medikamenter slik som aspirin eller indometa-cin sterkt prostaglandiner som inflammasjonsmediatorer, i det minste når det gjelder reumatoid artritt. Prostaglandin-lignende stoffer er tilstede i inflammatoriske perfusater i forsøksdyr. E-prostaglandinene i lave konsentrasjoner er sterke potensiatorer for de smertedannende egenskaper hos andre agonister slik som histamin, 5-hydroksytryptamin og plasmakinin (f. eks. bradykVinin.):, såvel som andre trekk ved inf lammatorisk respons 'slijc! som øket vaskulærpermeabilitet, erytema, akkumulering av ftyite .'celTer og plateaggregering.

Pasienter med bronkialastma og kronisk bronkitt lider under gisping og pusjtévåir/skef.. Dette skyldes en bron-kialinnsnevring på grunn åjlf spjasmefe i den glatte bronkial-muskel eller pa grunn av klebrige sekreter eller hyppigst på grunn av en kombinas jori|-)'av ,'Segge- deler . Den nøyaktige grunn til bronkokonstriksj'Qnen; ved astma er ikke helt ut belyst, men det antas at endogene neurohumorale og autacoide spasmogener slik som ace tyÆ'kol:-i:n, 5-hydroksy tryptamin (serotonin), histamin, noe prostagiåndiner og leukotriener kan være involvert. Allergiske reiksjoner til stoffer i inhalert støv eller de som absorberes fxa matvarer kan manifesteres ved bronkokonstriks jon av --ur tica r ia; ( "nettle-rash" ) eller sirkulatorisk kollaps forårsaket av frigiving av histamin eller andre endogene stoffer.

•'•Vi'

Medikamenter med;-:-spa-smolytisk virkning slik som aminofyllin benyttes for å".behåndlé bronkospasmer. Medikamenter med anti-histaminaktivi'tet benyttes også mot astma og for gisping eller andre.'■ symptomer i forbindelse med allergiske fenomener slik som høyfeber.

Det har vært kjent r!'.mang'é år at seskviterpenlaktoner er tilstede i planter, f-yeks.-' i familien Compositae

(se Yoshio, Mabry og Timmer-manri i "Sequiterpene Lactones, Chemistry, NMR and Plant pistr^butibn", University of Tokyo Press 1973). <

Av disse planter;':har'. Tanaceturn parthenium (tidligere kalt Chrysanthemum parthenium) vært holdt frem i herbal-medisinen som en mulig effektiv behandling for migrene ved inntak. Intet seriøst medisinsk studium av denne behandling mot migrene synes å ha vært publisert, heller ikke har det vært noen betraktninger om hvilken bestanddel eller hvilke bestanddeler i planten som kunne være involvert i denne på-ståtte effektivitet.

For mange år siden ble det angitt at seskviterpen-

■ :ir' i:- f''

laktonene partenolid og santamarin^kan ekstraheres fra den nevnte plante (også kar lt nratré' It m■*) vé.d bruk av lett petroleum hhv. kloroform (se Sofm e&al' Coll. Czech. Chem. Comm.,

(1961), 26 , 803 og Romo et^al ;j iTetrahedron, (1965), 21 , 1741).

<j,

I disse publikasjoner var ^det ^'ngeri indikasjon på noen mulig medisinsk bruk for seskviterperilaktonene.

En viss cy to toksisk \åktiv'itet for partenolid og flere rndre seskvi terpenla"'ktorier er også angitt for en tid

/i':£v Jf'1-

siden (se Lee et al, i CaiVee r ./Research, (1971), 31 , (1649).

*v -ir

Det er imidlertid ingen ari'jtydri'ing i. denne artikkel at noe seskviterpenlakton eller ep. ekstrakt inneholdende forbind-eisen kan være brukbar vedvbehandling av migrene, artritt eller bronkial til stander,

'fit.

I den senere tidner {det vist at visse seskviterpenlaktoner er potente inhibitorer for;, carrageenan-indsert ødem og kronisk ad juvant-indusert ar i t r i;t t hos gnagere (se Hall, Starnes, Lee og Waddell i .J:. Ptiarm^Sci., (1979), 68 , 537). Denne artikkel antyder imidlertid i;kke at noen seskviterpen-alktoner har farmasøytisk aktivitet* mot noen forhold, og slett

'• *' v& -

ikke mot migrene. :,,

Ved gjentatt selektiy ekstrahering av matrem-materialer og utstrakt in ,;yitro-prøying av ekstraktene på biologisk virkning, spesielt spasmqlytisk virkning i glatt-muskelprøver, er det nu overraskende funnet at av de mange

..'•'V"'-'J: - fr

bestanddeler i planten har.}':visse av,; forbindelsene innenfor omradet seskviterpenlaktoner som erv tilstede egenskaper som er sterkt indikerende på éf.fektivitet ved behandling av migrene. Dette er spesielt-- oy-erraskende fordi eksistensen av noen slike f orbindelser-; i plantene har vært kjent i mange år mens det allikevel ikke har vært'noen beskrivelse eller forslag noe sted i litteraturen at de kan ha noen brukbar virkning mot migrene. Videre foreslår i det minste noen av rapportene om bruk av matrem ved behandling av migrene å inn-ta en vandig ekstrakt av planten som en "te". Dette peker bort fra seskviterpenlaktoner som aktive bestanddeler fordi det er usannsynlig at de kan ekstraheres fra platen ved denne metode.

'W ,1.

Indikasjonene erislik '<at>:.forbindelsene sannsynlig-■ $ . $ Y

vis ogsa er effektive ved#behåndling ikke bare av migrene, men også av bronkiala stma.if&g ■ år tr itiske forhold slik som reumatoid artritt, ostéoartr itit og-beslektede artritter. Dette kunne ikke forutsies*; f ra-'den hel t urelaterte cytotok-siske virkning som angis a<y>Le^é et al ovenfor.

'■■■''i> 'lp-Oppfinnelsen'tilyei^bringer i henhold til ett trekk en sesl.viterpenlakton-holdlg .ekstrakt for farmasøytisk bruk, spesielt ved behandling av/,'migrene., astma eller artritiske

v*S' si-

tilstander som er en seskv?£ter^.penlakton-holdig ekstrakt fra planten Tanacetum parthenium beretter kalt "matrem") utvunnet derfra ved ekstrahéringi^med et organisk oppløsnings-,

middel som er i det vesen tjl ige/t; ikke-polart, f. eks. lett petroleum, heksan, kloroform elder Vén olvje, f.eks. en mettet eller umettet langkjedet (f ieks/^C^j^) "'-hydrokarbon eller en fett-syre, f.eks. en kommersielt ti-lg je;ngelig vegetabilsk eller animalsk olje slik som .kokosoÉ|e, spyabønneolje, en fiske-olje, derivater derav slik*som^.polypksyetylerte fettsyrer, rekonstituerte glyserider .og estere, f.eks. sorbitanestere av de ovenfor angitte forbindelser

De seskviterpenLaktQri-ho^'dige ekstrakter kan oppnås ved blanding av tørr pulveriserte matremblader med det ikke-polare oppløsningsmiddel-Sg å sette blandingen hen for a tillate at ekstraheringeri skjer...- Alternativt kan det tørre pulver ekstraheres x'- 1''utstrakt*.'grad med det ikke-polare

<.- ■ •<>' : 3?s

organiske oppløsningsmiddel, .f^eks i en Soxhlet-apparatur.

Klasser av seskyate r^en låk ton er som inkluderer forbindelser som søkeren finner sannsynlige som effektive mot én eller flere av migrene ^.r-a st rna og artritiske tilstander er germakranolider og guaianolider, inkludert pseudoguaiano-lider, spesielt de seskviterpenlaktoner som har en a-metylen-substituent i laktonringen. Ekstrakten kan inneholde et antall seskviterpenlaktoner slik som disse.

Et germakranolid som kan ekstraheres fra matrem er partenolid med formelen:

og søkeren finner at denne$'fo'rb;in deise og ekstrakter fra matrem som inneholder den spes|:elt--vfeannsynlig er effektiv mot migrene, astma og forsk-jell-ige^artr itiske tilstander. Et annet germakranoli;d og.'matremekstrakter inne-•-($. Cr' X holdende det som sannsynligvis;i;er Affektivt har formelen

Denne forbindelse er--oppnådd ved ekstrahering fra

fl^

matrem med et ikke-polart//pppl-øsningsmiddel og den antas nettopp å være isolert; $tøkérén kaller den "chrysanthemonin". Forbindelser svnes ikke a -.være beskrevet noe sted i litte-råturen. Æ- lV

Søkeren har også-'hydrolyse r t chysanthemonin for

å oppnå en forbindelse -med;--fommelen:

i. i. v

Slik det skal' forklares nedenfor, er det sannsyn-lig at disse vil være spe si el £]] ef f ektive forbindelser.

Spesielle gua ianbl id"e r og matremekstrakter inneholdende disse som søkeren; antar vil være effektive har de respektive formler:

m■-■■>■-■

<.>f<->

Disse forbindelser er o.ppri-add :*yed ekstrahering fra matrem

Si

med et ikke-polart oppløsningémiddel og de antas a være isolert for første gang. 4S,øke,ren kaller dem "partholide" (3) og "chrysanthemolidé" .;;;(:4) ,'-.v(Forbindelsene synes ikke a være beskrevet i 1 it tera turen

Et annet in ter e ^an t|i; g u a ia no1 id som søkeren har ekstrahert fra matrem er q^ryqartemin A med formelen:

Søkeren finner 6'gså '' åt denne forbindelse og matremekstrakter inneholdende1'-den|fsannsynligvis vil være effektive mot migrene, astma og^artritiske tilstander.

I henhold til et' anriét trekk tilveiebringer oppfinnelsen et s e s k v i t e r p e n1ak ton p r e pa r a t for farmasøytisk an-vendelse og som inneholde ir-H f' k.

(a) et germakranolid'£som inneholder minst to germakrankjerner i molekylet, eller^

:iv ■■' H

(b) et guaianolid som har•en oksygenfunksjonalitet •i 10-stilling i guaiank.jernen•■''oppnådd f.eks. ved epoksy bundet til et karbonatbm nær nBvnt.éi 10-stilling, eller en hydroksyl-, eter- eller- ester.gruppc, eller farmasøytisk akseptable derivater derav. - ■

Oppfinnelsen tilveiebringer i tillegg et slikt

germakranolid (a) og guaianolid (b) per se, eller et farma-søytisk akseptabelt derivat derav, og inkluderer alle race-miske blandinger og individuelle isomerer av slike forbinde1 ser.

Fordi germakanolidene (a) , f.eks. dimerer og tri-merer, har mer enn én germakrankjerne, hver av hvilke for trinnsvis bærer én eller filere^ funksjonelle substi tuenter, er etter søkerens mening åÅlé-^sannsynligvis mere effektive

C-

enn germakranolider so'm irineholder en enkelt germakrankjerne. Således hevdes d.jp|j. åt^ de kan inngis i lavere doser-ingsnivåer for å oppnå sammenlignbar virkning.

Tilsvarende guaianol&der har multippel funksjona-litet slik som de (b) somvftar|>'•'.o>-ksygenfunksjona1 itet i 10-stilling og søkeren antar^at disse sannsynligvis er mere effektive enn guaianolider^utén slik multippel funksjona-litet.

Spesielt foretrukne ^germakranolider er trimeren chrysanthemonin (5) beskrevet-'ovenfor og dimeren (6) som oppnås ved hydrolyse åv denne ,^iog farmasøytisk aksepterbare derivater av disse forbindelser.

Spesielt foretrukne ^guaianolider er partholide

og chrysanthemolide med de'respektive formler (3) ' og (4) som angitt ovenfor og farmasøytisk akseptable derivater av disse forbindelser.

Farmasøytiske preparater .'.-som utgjør oppfinnelsen kan oppnås ved ekstraheririg frå matrem som beskrevet ovenfor eller alternativt kan-.'de f-remstilles syntetisk og/eller omdannes syntetisk til' farmasøytisk', akseptable derivater, hvilke preparater også ligger iinnerifor oppfinnelsens ramme.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et i det vesent-lige rent seskviterpenlakton fbr bruk ved behandling av migrene..'•„. 1?

En seskviterpenlaktqn-holdig ekstrakt eller et preparat ifølge oppfinnelsen kan oppnås fra matrem på føl-gende måte. >'.< ;;r'': Blader av matrem frysetørkes og pulveriseres deretter. Det tørre pulver blir utstrakt ekstrahert i en Soxhlet-apparatur med et organisk oppløsningsmiddel, f.eks. petroleter (dvs. lett petroleum) med kokeområde 60/40°C. Ekstraktet fordampes til tørr tilstand og kromatograferes, f.eks. på en silikagelkolonne. Eluering av kolonnen gjennom-føres ved å øke oppløsningsmidlets polaritet, f.eks. fra 100% petroleter med kokeområde 60/40° til 40% metanol i kloroform.

Fraksjoner samles og kombineres-ettersom det er hensikts-

■M-U>■ ■

messig med henblikk på derfes t"ynns'j ikt skromatograf i . De kombinerte fraksjoner prøves^på spasmolytisk aktivitet som beskrevet nedenfor. De frakks joner som viser 100% inhibering av agonister blir ytterligere |subf^aksjonert. Disse sub-traksjoner prøves deretterj:'. Eventuelt kan de aktive bestanddeler isoleres etter ...ytterligere rensing (vanligvis preparativ tynns j iktskroma£ogr(af i) '.■ De rene forbindelser

,$ e

kan omkrystalliseres fra egnede oppløsningsmidler og analy-seres ved spektroskopiske-teknilkker;, f.eks. 1H NMT, 13C NMR, massespektroskopi, infrarød spéktroskopi eller ultrafiolett

'f r,-' f

spéktroskopi. ;v-

Alternativt kan /en sfeskviterpenlakton-holdig ekstrakt eller et preparat if$lgé';Oppf innelsen oppnås fra matrem ved å blande de tørkede pu'l'veru'iser t.e blader fra planten med et ikke-polart oppløsningsrrviddel for å oppnå en suspensjon og å tillate blandingen å "stå';for å oppnå ekstrakt av ses-■1.. ■ ■

kviterpenlaktoner fra plari.feen .;;';'i 'f.

Suspensjonen kan^derettei?;. stabilieres ved bruk av egnede faste fettblandinger, med eller uten nærvær av bivoks eller andre mineral vokser ko±sloidalt sil isiumdiok syd , derivater av cellulose slik som karboksymetylcellulose og/eller naturlige gummier slik sonr'aga.r eller xantan, stivelser,

- hi jf*

stivelsesderivater oa andre egnede'karbohydrater, med eller

,. ■ Sft

uten tilsetning av fuktemi'dler,;';.slik,-som sorbitanfettsyre-estere og lee it in..' .4"'

Som et ytterligere'alternativ kan et rent seskvi-

' fl>

terpenlakton ifølge oppfinnelsen oppnås syntetisk ved en hvilken som helst av de standardmetoder for preparering av seskviterpenlaktoner, f.eks. ved fotolyse av et dienon

; ■ , ■*m-.

V, "I;

Disse epoksy.dér éan ..derefeiter separeres fra hver-andre hvis ønskelig..5$''

Andre metoder som ka-n. berfyttes for preparering av seskviterpenlaktoner inklu%ertitf'farmasøytisk akseptable derivater er beskrevet av Waddell :et a i." (J. Pharm. Sei. (1979) , 68, 715) .

De rene forbindelser kan deretter tas opp i preparater ifølge oppfinnelsen for farmasøytisk bruk ved konven-sjonelle prosedyrer.

Et preparat ifølge oppfinnelsen kan inngis som det er,' dvs. i form av en planteekstrakt eller et organisk syntetisk seskviterpenlakton alene, men blandes vanligvis med et farmasøytisk aksepterbart strekkmiddel. Preparatet kan omfatte ett eller flere ekistråfycter og/eller syntetiserte seskviterpenlaktoner. vp*

Der ekstrakten oppnå'?ved å tildanne en stabil suspensjon av tørket, pulverisert matremblad i et ikke-polart oppløsningsmiddél, ;||an fet preparat ifølge oppfinnelsen oppdannes ved innkapsling^av suspensjonen i enten et hermetisk lukket mykt/'■ skal^- i jett s".■tykke eller et todelt hårdt cfelatinkapselskall som Éépre.senterer en enhetsdose, fortrinnsvis i en egnét me.ri.gde|;på 0;, 25 - 200 mg matremblad med eller uten andre farmasøytisk aktive substanser.

Alternativt k-an:/itørk;jét og; pulverisert matrem tillates a sta i det ikke--pola're oppløsningsmiddél i et tids-yr.,fi-:-i

rom tilstrekkelig til å tM-late ekstraksjon, f.eks. 14 dager,

'■<li*>

og deretter omdannes til e.t måoerat eller filtreres for å oppnå en ekstraheringsmiddeloppløsning.

Suspensjonen, måeeratet éi ler ekstraktoppløsning-en kan blandes med overflateaktive -midler eller blandinger derav slik som polyetoksy-.fettsyre-^sorbitanestere, mono- og diglyserider, acetylerte giyserider, for derved å oppnå et selvemulgerende system. ■"<' .i;

'■'^ ■,-?)•■ .; .,■

Et preparat iføl'ge oppfinnelsen kan inngis som det er, dvs. i form av en planteekstrakt eller et organisk syn-tetisert seskviterpenlaktoir alene,/.-'.men blandes vanligvis med et farmasøytisk akseptabel^ strekkmiddel. Preparatet kan omfatte én eller fl ere. tekstrakte r og/eller syntetiserte seskviterpenlaktoner. ^'

For behandling a.y migrene,' kan preparatene inngis oralt eller parenteralt og:1:hensiktsmessig i form av en tablett eller en flytende suspensijon. De kan i tillegg til seskviterpenlaktoene inneholde andre kjente anti-migrene-preparater, analgetika og antiemetika slik som propano.loihydroklorid,

ergotamintartrat,

metysergidmaleat,

dihydroergotaminmesulat,

Klon idinhydroklorid,

isomethep tenmucat,

buclizindihydroft&orid,

pizotif enhydrøgerimaMt,

til

aspirin og andré^ikkésteroide anti-inflammator-

■ rf:< .-v

iske midler, f

paracetamol dg attdrép.mindre analgetika, pentazocinhydroklorid, V

proklorperazin, is

: 'tf "'v

kaffein,

meprobamat, sø

& V::

etoheptazins it r år£, ;v

zomepirac og ,y

meptazinolhydroki-orid.

il<&>l! -v

Doseringen av ak.tiv -bestanddel kan være fra 0,25 - 200 mg pr. dag. Generelt-jer -f'«ra 0/25 - 20 mg pr. dag til —

lv ■ ''*•'

strekkelig, men ved behandiingu,av akutte angrep av migrene eller lignende mangler vilvrden;'^optimale dose være høyere og ca. 2 - 200 mg pr. dag. >f

. ir ' yl

Den gis best i oral Æorm'-.bestående av en tablett eller en kapsel eller som en flytende suspensjon på daglig basis eller på regulær basis som foreskrevet av en lege. En dose bør være effektiv,' mén kaln gjentas etter nødvendighet. Imidlertid kan det oppstå -omstendigheter der medikamentet

■!,'■ 'V'

best inngis som et suppositorium, ved inhalering eller injek-

For oral inngivel.se 'kan preparatet blandes med et

'•V. ■■.J»i it

hvilket som helst tablett-^elier kapsel-bæremiddel eller som en suspensjon i en hvilken>|som>?;hel<;>s-t oralt akseptabel ikke-toksisk flytende bæreir. Hvis /ønskelig, kan medikamentet tilveiebringes i innkapslet form -for forsinket frigjøring i løpet av et visst tidsrom. For parenteral inngivelse kan medikamentet tilveiebringes som en suspensjon i et hvilket som helst egnet sterilt injeksjonsmedium, f.eks. steril vandig saltoppløsning. Gitt de ønskede doseringsmengder som er antydet ovenfor, vil den egnede metode for formulering av medikamentet i en form egnet for oral eller parenteral inngivelse være åpenbar for fagmannen. Det samme gjelder rek-tal inngivelse som også er tenkelig.

Utmerket effektivitet for et preparat ifølge opp-• >.' .7

finnelsen antas sannsynlig'£<!>ved« (a)<..>'behandling av klassisk

og vanlig migrene; (b) vé'd behandling av migrenøs neuralgi (cluster-hodepine) ; og <(c)>!;«fV.e&.behandling av premenstruell og menstruell migrene og awdrev,;hodepiner.

Preparatene er birjukriare ved forhindring av den ovenfor angitte type hodepine ,j;er effektive med henblikk på

å redusere frekvensen, al vor 1 iigheten og varigheten av angrepene. De skulle også være éjf f elctive: med henblikk på kvalme og brekninger i forbindelse mecl slike angrep eller kvalme og brekninger som isolerte symptomer. -.-'"De kan sannsynligvis også benyttes for å behandle akutte angrep av de ovenfor angitte typer hodepine og å redusere deres varighet, alvor-lighet og forbundne symptomer.^j.

Den nøyaktige grunn :for effektiviteten til disse preparater ved behandling av migrene er ikke kjent, men det antas at det ved migrenemarigleri og'>:dermed forbundne til-

ø"'-'V

stander er en forandret reaktivitet for cerebral-blodkarene

. ;:■ 'V, ,u

til biogene aminer og prostaglandiner som er frigitt lokalt eller til den systemiske sirkui<f>asjon. Basert på denne hypotese antas det at virkningene -f.'or preparatet ifølge oppfinn-eisen ved behandling av migrene. kari;/være resultatet av en stabilisering av membranene i blodkarene i glatte muskel-celler, noe som fører til ,.eh direkte inhibering eller reduksjon av responsiviteten til; biogene-/aminer og prostaglandiner eller til en indirekte virkning ved inhibering av

-fM«fr

virkningene av disse stoffer pa'.; nervene i de interkraniale blodkar. X'

Søkeren finner at preparater ifølge oppfinnelsen blokkerer virkningene av neurohumorale transmittorer og auta-coider slik som acetylcholin, noradrenalin, 5-hydroksytryptamin , histamin, bradykinin og prostaglandin E2på den glatte muskel. Videre forårsaker kronisk inngivelse av ekstraktene til.marsvin en progressiv reduksjon i reaktiviteten i den glatte muskel mot 5-hydroksytryptamin og histamin. Således finner søkeren at slike prøver kan gjennomføres på et spesielt preparat for å bestemme dets sannsynlige effektivitet ved 'vif..' ,'<;

behandling av migrene.

For behandling av" a ri?f r i tiske tilstander kan preparater ifølge oppf innql se^'. iir-ng i s.-bra 11, rektalt, parenteralt eller ved inhaler ing-p.g hensiktsmessig ha form av tab-letter, kapsler, suppositoi;ier||e 1 ler flytende suspensjoner.

Doseringen av atøfilv «Bestanddel kan være fra 0,25 - 200 mg pr. dag. Generelt'xer fira 0^ 25 - 20 mg pr. dag tilstrekkelig, men ved behandlinga av et akutt angrep av revma-

; r,i:

toid artritt el-ler en bcslejkte^fc mangel, vil den optimale

dose være høyere og ca. 2 f 20-0 mg "pr. dag.

Den gis best i dral ;form'- i form av en tablett eller som en flytende suspensjon)>;pa ;daglig basis eller regulær basis som foreskrevet av én lege..En dose bør være effektiv, men kan gjentas hvis nødvendig'!;; Imidlertid kan det oppstå

b f.

tilstander der medikamentet best inngis ved hjelp av supposi-torier, inhalering eller injeksjoner.

'■'»'■!

Et preparat ifølge oppfinnelsen kan i tillegg inneholde andre antiartrittmidiier inkludert ikke-steroide anti-inf lammatoriske medikamen.ter ,,;.analgetika , skjelett-muskelrelaksanter, steroider, gull og penicillamin.

Eksempler på slike midlet er:

Aspirin, indometacini:;. pirioxicam, benorylat, ibu-profen, paracetamol, salicylamln, diflunisal, etoheptazin, fenoprofen (ka 1 siur.fenoprofat )•" j flufenaminsyre, mef enaminsyre , naproksennatr ium, ketoprof én, fenyibutazon , sulindac, penicillamin, salsalat, f enclo.f enac , f lurbiprof en , fenbufen, f eprazon , natr iumaurotiomålat ,!v napr.dk sen , benoksaprof en ,

'■'V,.7,! \':.

aloksiprin , hydroksyklorkin sulf-at, 'azapropazon , ok sy f enbuta-zon, tolmetin, cholinmagnésiumtrisålicylat, diclofenac og adrenalsteroider slik som prednison eller prednisolon.

Når det gjelder oral inngivelse av preparatene for artrittbehandling, henvises det til det som er sagt ovenfor.

Effektiviteten for et preparat ifølge oppfinnelsen indikeres (a) ved behandling av revmatoid artritt; (b) ved behandling av osteoartritt; og (c) ved behandling av artritt forbundet med Felty's syndrom, Still's sykdom, systemisk lupus erytematose, polyarteritis nodosa, scleroderma, gikt, kardian achalasi, Crohn' s;'feykdpm, kronisk brucellose, anky-loserende spondylitt, sarojpidqse, psoriasis og gonore.

Preparatene er sannsynligvis brukbare ved forhindring av de ovenfor ang|ftte]artritider og er effektive med henblikk på å reduseré.'!f rlkverisen, alvorligheten og varigheten av angrepene, forbindelsene kan også benyttes

'■$0. '■&(>i'-":

for å behandle akuttangrep&av jijdedyenfor angitte artritider og redi!serer disses var ighét, h$alvor! ighet og ledsagende symptomer.

•/•i V|y

Den nøyaktige gr^uhn v;*f or denne sannsynlige effektivitet for disse stoffer ved'-behandl ing av artritt er ikke kjent, men det antas åt vé.d réymatbld artritt og ledsagende tilstander blir prostaglandiner og-:andre stoffer slik som

"tf." ■ "ty

histamin, 5-hydroksytryptamin -og bradykinin frigitt i og

■ tS ' ■■■it-

rundt ledd. Prostaglandiner pøtensierer de smerteinduserende egenskaper for de andre stoffer. Basert på denne hypotese antas det at de sannsynlige virkninger av et preparat ifølge i<:>'

oppfinnelsen ved behandlinjg avf.Jart-rltiske tilstander kan være resultatet av deres antipirotaglandin-, antihistamin-, anti-5-hydroksy tryptamin- dg åritibradykinin-virkning.

Søkeren finner a<t preparatene ifølge oppfinnelsen har markert spasmolytisk virkning mot et vidt spektrum glattmuskelspasmogener. Således blokkerer de virkningen av histamin, 5-hydroksytryptamin, brodykinin og prostaglandin Ep. Således går de imot de farmakologiske virkninger av de hyppigst implisertevmediatorer ved kronisk inflamma-

■ ■ .■-'M'' ';'^'< i-'1'''

sjon. Søkeren finner at sliké^prøver kan gjennomføres på

et spesielt preparat for å''bestemme<1>.' dets sannsynlige virkning ved behandling av revmatpld artritt og ledsagende tilstander .

For behandling av astma, kan preparater ifølge oppfinnelsen inngis oralt, rektalt, parenteralt eller ved inhalering.

Doseringen av aktiv bestanddel kan være fra 0,25 - 200 mg pr. dag. Generelt er fra o,25 - 20 mg pr. dag tilstrekkelig, men ved behandling av akutte angrep av astma eller tilsvarende mangler vil den optimale dose være høyere

og ca. 2 - 200 mg pr. dag

>.Vfi.

Medikamentet gi sii-be st i oral form som tablett

.-•a:,d, ;\-

eller kapsel eller som en flytende^suspensjon pa daglig eller regulær basis som f cfjre sklir evet; av en lege. En dose kan være effektiv, men kan gjentas hvis nødvendig. Imidlertid kan det oppstå omstendigheter :,der medikamentet best inngis

'Vi ib

i form av suppositoriér, ved inhalering eller injeksjon.

-P■

I tillegg til se^skvijterpenlakton kan preparatet også inneholde andre be ståriddei-er slik som bronkodilatorer, antihistamin- og anti-inf ektiy,e midler og eksempler på slike

$Xi-

er: - P

isoprenalinsulf at'., dr.c iprenal in , adrenalin, terbuta-linsulfat, teofyllin, choiinte.ofy 1-i.inat, aminofyllin, efedrin-hydroklorid, papaverinhydr;pklor id , rlprotropiumbromid, atro-pinmetonitrat, beclométasondipropi<q>nat, fenoterolhydro-bromid, betametason, isoetårinmesy.lat eller -hydroklorid, fenylefrinhydroklorid eller -bitar.trat, tenyldiaminhydro-klorid , reproterolhydroklqr.id Æ depbropincitrat, butetamat-citrat, acepifyllin, difenylpyralinhydroklorid, natrium-kromoglykat, etamifyllinkamsy■ l-iå-i't, teofyllinmonoetanolamin,

t-' '''■v

etafedrinhydroklorid, buf y 11 irt.,' guaifenesin, difenydramin-hydroklorid og annet histamin ,:. H^-reseptorantagonister, di-profyllin, me tok sy f enaminhydrpklorjLd, r imiterolhydrobromid, hyoscinhydrobromid, salbuta/mols.ul f at, ketot if enhydrogen-f umarat, p se udo-ef edr inhydrbkl:prid>,;'. bromheks inhydroklor id og antifungale, antibakter iel.le dg antivirale midler.

Når det gjelder .drai^vinn^ivel se ved behandling av astma skal det henvises tir bemerkningene ovenfor.

r* &7.

Effektiviteten f dr e;t preparat ifølge oppfinnelsen er antydet (a) ved behandling av bronkialastma; (b) ved behandling av bronkokonstriksjon i forbindelse med kronisk bronkitt; (c) ved behandling av symptomer i forbindelse med histaminfrigivelse i allergiske hypersensitivitetsfenomener slik som høyfeber og anafylakse.

Preparatene kan også medinngis med andre bronkodilatorer, antihistamin- og anti-infektive midler som angitt ovenfor.

Den nøyaktige gi^iinn |for den foreslåtte effektivitet for disse stoffer ved behandl |ng ay astma og andre allergiske reaksjoner ligger i deres Jevne!*' til>Tå forhindre eller inhibere

...' .Vjføillr.

glattmuskelspasmer forårsaket ^ved et antall endogene stoffer

• . ,p

slik som acetylcholin , :hié'.tamin, 5-,hydroksy tryptamin, bradykinin og prostaglandiner ijstand til- frigivelse lokalt eller til den systemiske sirkulasjon''! Således kan de utmerkede virknirger av et preparat '^fø]&je oppfinnelsen ved behandling av bronkokonstriksjon væréSi-res^ultatet av en stabilisering

■',.■■'-■•.

av glattmuskelcellemembrahene .vsom f-ører til en direkte inhi-'v':. !>■«■/ y

bering eller en reduksj:on/å-v respohsiviteten mot biogene aminer, prostaglandiner ogipoLypeptidcr, og til en indirekte

..:(•'.•V.f-

virkning ved inhibering avf;virkningene av disse stoffer pa nervene til bronkialmuskuTåturén og/el ler mucus-sekreter-ende celler.

Søkeren finner at preparater ifølge oppfinnelsen blokkerer spasmer (kontraksjoner) ijden glatte muskel f or-

■ ty ■■ <;.:'-":'

årsaket av acetylcholin, 5f%hydroksytryptamin, histamin, prostaglandin E-, og bradykinih;; Således finner søkeren at slike spasmolytiske aktivitetsprØver.';kan :,gjennomføres på et spe-

ili■'

sielt preparat for å bestemme 'den sannsynlige virksomhet ved behandling av bronkial.plageV ....

Ekstraheringen av preparatene ifølge oppfinnelsen fra matrem og effektiviteten for sljike preparater skal vises

..<.>'.i'<->åi<->"<->

i større detalj under '.hen visn ing til den ledsagende tegning

'••*v' ■'■'■;.

og de følgende eksempler..w':..

' U.-- iX- fe

Den ledsagende tegning viser ekstraherings- og isoleringsprosedyren fra en; lejtt pe£roleumsekstrakt av matrem.

I tegningen betyi "P^fLC" preparativ tynnsjikts-kromatografi ("Preparative Thin Layer Chromatography"), og tallene representerer kombinerte fraksjoner, f.eks. 1 - 8, og nye forbindelser eller blandinger er antydet ved de følgende koder:

DJ 156a - partholide med formel (3)' ovenfor,

DJ 177b - chrysanthemolide med formel (4) ovenfor, DJ 140a - chrysanthemonin med formel (5) ovenfor, DJ 140a M2 - en forbindelse med formel (6) ovenfor,

DJ 61a en langkj éd.et f ett syreester,

DJ 192a - eri blå'ndihg av parthenolide og et ikke-identifisert terpen,

'■?*>;■■ ■

DJ 124a - eri blandin-g av .f ettsyreestere,

DJ 179al - muligens $en blanding av reynosin,

chrysantemin A e.g et nytt seskviterpenlak-toridihydrorteynosln ,

DJ 179c - ét komplektet seskviterpenlakton inneholdende e/H a^metyien-Y-lakton.

1 Nærmere beskrivelse v

A K romatograf i '••>•• jv<<>

(a) Ad so rbs jon smid ler ..-.v

Silikagel vår adsorbssjonsmidlet som ble benyttet for all kromatograf i.. Den'/silikagel som ble benyttet for kolonnekroma tograf i var " K-ie se>ige 1 .^60 " og for tynnsjikts-kromatograf i , TLC, "Kieselgel •/£'' og,- "Kieselgel GF254 "' alle kommersielt tila j engelige f rå .-firma, Merck . TLC-platene for rutinearbeid, både analytisk6$ préparativt, ble preparert ved å blande 15 g "Kieselgel Gli og ,15 g "Kieselgel GF254" med 60 ml destillert vann.;-;' Oplpslemmingen ble spredd i et tynt 0,25 mm tykt sjikt på/i-glaissplater med dimensjoner 20 cm x 20 cm. Platene ble .tørket i-^åpen. luf t og deretter aktivert ved 105 C i 1 time. Sølvnitratimpregnerte plater ble preparert ved å blande 30 g'"Kieselgel G'_" med 60 ml av en 10% vekt/volum-oppløsning ,av sølvnitrat;; i destillert vann. Opp-slemmingen ble spredd, i et';;:s j i^t som før.

(b) Oppløsn ing smidde 1 sy s temer .

Oppløsningsmidlepe som bie benyttet for eluering •■v; ■ •

av kolonner og fremkallingyav .TLC-platene er detaljert i de tilsvarende avsnitt.

(c) Detektering av komponenter på TLC- plater

Kortbølget ultrafiolett lys (254 nm) og sprøyting med 20% volum/volum svovelsyre i destillert vann, fulgt av oppvarming til 105°C i 10 minutter ble brukt for påvisning av komponentene.

B I nfrarøde spektra

Oppnådd i faste filmer, Nujol, kloroformoppløsning- er eller KBr-skiver ved br^uk åy et."Unicam SP 200" spektrometer. £J

C Ultrafiolette spektra v$ . 'f

Opptatt i spéktroskopisk^etanol med en veilengde

på 1 cm ved bruk av et Perøiri^Élmer "Lambda 3" UV/VIS-spektro-■■,»<.-• :ri ■>.■>

fotometer.. .'v-..

D Smeltepunkt 0

*«> ..<V>"

Tatt med en "Elé'ctro;£hermal" smel tepunktapparatur

.A*. ;-',fV ■'■>"

og er ukorrigert. a\ :p'

E Hydrogen - 1 k j ernemagne fe- jLj sk éure sona ns spek tra

Tatt opp ved 400£MHz%ved'Pbruk av et "Bruker WH 4 00" •*> P-! . >

spektrometer eller ved 200^MHz:*på et "Nicolet NT 200" spektrometer i deuterok loirof orm v' : ed ' bruk - å ' 'v . tetrametylsilan, TMS, som indre standard.

F Karbon- 13 NMR Pt ^

Opptatt ved 100,'.<S MHz- ved;, bruk av et "Bruker WH 4 00" spektrometer i deuteroklorpform ved'i: bruk at tetrametylsilan som indre standard. ■

Både H- og C-resonansene er gitt i 6 (TMS 6 0,0) og de følgende forkortelser ertbenyttet: s = singlett; d = dublett; t = triplett; q = .kvartett; m = multiplett og J = koplingskonstant.

G Massespektra p

Opptatt på et- "ÅET MS' 902" høyoppløsnings-masse-spektrometer eller et ."VG Micromass-16S" spektrometer ved 18 eller 70 eV med dir-ektePirin:£øps'temperaturer vå mellom

18 0 og 2 4 0°C. PP 'p

■ r-<:>A -v.

2 Ekstrahering av Tariacetum parthenium med lett petroleum ( kokeområde 40 - 6 0- °C) P'

5,8 kg blader av Tariacetum parthenium ble samlet i januar 1980 fra Chelsea Physic Garden, Royal Hospital Road, London SW3, og frysetørket ved bruk av en "Chemical Laboratory Instruments SB4" frysetørker. En prøve av de tørkede luft-deler av planten ble anbragt i museet i Chelsea College. De frysetørkede blader mistet 82,8 vekt-% ved tørking og ga en sluttvekt på 1 kg. Materialet ble deretter pulverisert og ekstrahert grundig i en Soxhlet-appara tur med lett petroleum

med et kokeområde pa 40 - tøO Gli 7 dager. Ekstrakten ble for--;lc-M:■■■■

dampet til tørr tilstand ygd pruk av en rotasjonsfordamper under et redusert trykk, <M.. m% ri oppnådde en gul oljeaktig

rest i en mengde av 44 g. >-■•■■ i-

,j..i»r ■ «j; f

■ ;0 $;'

3 Spasmolytisk virkning a& le;- ttpetroleumekstrakten

50 mg av pétr'Gl<e>'4mek.:|,tra-<k>.ten ble prøvet med hen-

o 'Qi■'.l<-:

blikk pa spasmolytisk åktiyitét ved bruk av acetylcholin (Ach) , 5-hydrokytryptamin '-i('5-H<:>T') ogt histamin som agonister som beskrevet nedenfor...;;*•' *■ £

Marsvin med en vekt v'på 200 - 300 g ble drept ved slag på hodet. Proximal iÆeum^rjle^.skåret ut og 2 - 3 cm lengder ble renset og .-suspendert i.;Krebs-oppløsning (NaCl 118,4, KC1 4,7, CaCl., 2,5,&MgS&. 1,2, KH„PO. 1,2, NaHCO, 25 og glukose 11,5 mmol/liter )'i vé' <h 37 C hvorigjennom det konstant ble boblet en blanding .-ay 9 5'.%V 02 og 5% CC^. Lengdene av ileum ble tatt opp for å" nojtere "longitudinelle kontraksjoner isometrisk. Kurvene for, log' (dose) mot responsen ble

■v,, ■ ;;1f:

satt opp for acetylchol in ,-<'5-h,yj;drok sy tryptamin og histamin og ut hvilke ED^^-dosene bie tatt og gitt gjentatte ganger inntil konstant response bie oppnådd. Antagonisten, dvs. petroleumekstrakten, ble deretter oppløst i en minimal meng- i '■■' -4

de dimetylsulfoksyd og bragt til e% konsentrasjon på 10 g/ml med Krebs-oppløsnlng. Denne ble tilsatt til badet inneholdende ileum og latt der'.;.-'i 3-0' minutter. Etter grundig vasking med Krebs-oppløsnirig for åCfjerne restantagonist ble responsene for vevet mot a<*>gonistene målt og prosentual forandring beregnet. ■;/;

Et kontrollforsøJc ble gjennomført på nøyaktig samme måte, bortsett fra at antagonisten 'ble utelatt. (Dette var vesentlig fordi å la ikke-dosert vev i 30 minutter ofte øker sensitiviteten overfor eksogene agonister). Petroleumekstrakten viste 100% inhibering overfor de tre agonister.

4 Råseparering av lettpetroleumekstrakten

1,25 g av petroleumekstrakten ble benyttet og kromatografert på en silikagelkolonne på 50 g for å under-søke de tilstedeværende komponenter og separeringsgraden med

.1 •*■'« ^1

henblikk på storskalaunder\søké[! se . Dette pilotstudium

i ■ ■ <

viste seg a være tilfredss.ti leende og således ble 40 g petroleumekstrakt anbfagt».på -^n kolonne inneholdende 1,2 kg silikagel blandet til . en o^psl''<g>mmih<g>med lettpetroleum med kokeområde 40 - 6 0°C.. Det#/blé;.samlet 200 ml fraksjoner. Fraksjonene ble under søkt _yed ^,TLC olg kombinert ettersom det var hensiktsmessig (se^teghingen).

Oppløsningsmiddéleluéring av kolonnen og vekten av de kombinerte fraksjoner fremgår fra tabellene 1 og 2.

5 Spamolytisk aktivitet for de kombinerte fraksjoner fra l ettpetroleumekstrakten

De kombinerte fraksjoner fra petroleumekstrakten ble prøvet på spasmolytisk aktivitet som beskrevet i del 3 ovenfor. Resultatene er vist i tabell 3.

6 E kstrahering av Tanacetum parthenium med kloroform

Plantematerialet; 9 5.0 g, tidligere ekstrahert med lett petroleum med kokeområde '40 - :60 C, ble utstrakt ekstrahert med kloroform i en-TSoxhlet-apparatur i 9 dager. Ekstrakten ble fordampet d!i"l £ørr tilstand under redusert trykk ved bruk av en rotas.jonsftordamper under redusert trykk for å oppnå en grønn<*o 1 j;e 1 ignende rest som veiet 46 g. .•>;. ••;

7 S<p>asmolytisk aktivitet- f or , ;kloro. f ormekstrak ten

50 mg av kloroformert r akten ble prøvet på spasmolytisk aktivitet som ovenf1 \oi r, i ,■ s■e del 3. 100% inhibering av de tre agonister ble oppnådd.

8 Råseparering av kloroformekstrakten

4,5 g av k lorof orme^strak.ten ble kromatograf ert på en sil ikage lkolonne (120 gj- for å undersøke tilstedeværende komponenter og separer ingsgraden i lyset av en undersøkelse i større skala. 100 ml fraks joner-ble tatt og kombinert

-•• s' :; slik det syntes hensiktsmess igpmed'.ref e ranse til TLC . Opp-løsning smiddele luer ing av kolonnen og vekten av de kombinerte fraksjoner er vist i ta be 1 lene"'4 og. 5. 9 Spasmolytisk aktivitet for ;d'e kombinerte fraksjoner fra klorof ormekstrakten-, . 1 . _ ^ • i j . •

De kombinerte fraksjoner fra kl-<p>roformekstrakten ble

■H■

prøvet på spasmolytisk. aktivitet som beskrevet i del 3 oven-.'• •{<<>'•'

for. Resultatene er vist ;i; tabell ^6. Ingen fraksjon viste 100% antagonisme til alle tre Agonister og ble således ikke undersøkt ytterligere med henblikk på farmakologisk aktivitet. Ekstraktene ble imidlertid fraksjonert for å isolere nye forbindelser i det håp at disse ville være til hjelp ved den strukturelle belysning av de aktive fra lettpetroleumekstrakten.

■ Fraksjorierié'^144■ 176 fra petroleumekstrakten viste 100% inhibering 'åv de tre agonister Ach, 5-HT og

_4;a

histamin ved 10 g/ml. ,a

A Y tterligere separering åv :fjgaks|bnene 144 - 176 ( A)

Disse f rak s jionerbi .e-n- merigde av 1 , 959 g ble kromatografert på en 40 g silik;'ågei;kblorihe. 100 ml fraksjoner ble tatt opp og kombinert slik-pdet "-'passet best med referanse til TLC. Oppløsningsmiddeleluering av kolonnen og vekten av de kombinerte fraksjoner er vist i tabellene 7 og 8 .

'i....'•}■ :. •'■

B Spasmolytisk aktivitet .■& for . ifiraksgonene 144 - 176 ( A)

De fraksjoner som veiet mer enn 50 mg ble prøvet

/;B•-

på spasmolytisk ak tiv i tet /-Joe skrevet' i del 3 ovenfor. Resul-tåtene er vist i tabell 9 ..'V v/i

Fra tabell 9 frerfigårp;.det'at ekstraktene fra matrem som ligger innenfor op.p.firlrvélsens ramme og som oppnås ved ekstrahering med et i &|?e-pilart* oppløsningsmiddél har

'■ ' ' i§V '/fe'' - ' "'"S l

spesielt høy spasmolytisk oaktii^ite%'som, som søkeren antar, kan benyttes ved behandling, av^migrene. Det antas derfor at i det minste de fraksjoner fsom y.iser 100% inhibering av

w: '-Vi/. >if>'

alle de tre agonister Ach ,.^5-H-T. og -"histamin vil være effek->P H-V

tive met migrene. Det antas vÆdereV.. at disse fraksjoner også vil være brukbare. som'iant;i''-iir'flammatoriske midler og ved behandling av artritiske o£ brpnkiale tilstander. Som vist nedenfor inneholder dissé^frak^sjoner alle seskviterpenlaktoner. ;k >

C Videre undersøkelse av de tre fraksjoner som viser 100%

inhibering av de tre agonister i -

(a) Fraksjonene A 59 —- :6 5 i•;

Fordi fraksjonene A.p|;9 -p6 5 veiet mest av de 100% aktive fraksjoner ble denne undersakt først.

Det ble besluttet å Reparere fraksjonene A 59 - 65 ved preparativ TLC. 204 mg bie anbragt på fire 20 cm x 20 cm TLC-plater med tykkelse 0,25 mm og;fremkalt i kloroform: metanol i forholdet 98:2. ' 8 bånd ble lokalisert unc<l>er ultrafiolett lys ved 254 nm. Komponentene :i hvert ';J5ånd,;ble ekstrahert med kloroform på vanlig måte.

K

Hovedkomponenten1,-i fraksjonene A 59 - 65, dvs.

bånd 6, krystalliserte fråf. iklorofotm og metanol som fine nåler i en mengde av 26 mq<> av DJ 14'0a, 8 ' a-[ 4 1 a , 5 1 8-epoksy-1'6-(16 ,10B-epoksy-4a-hyd,roksygermacr-ll (13) -en-12 , 6a-olaktoyl-56-yloksy) -germacra-iø ' (14'' ) , 11 ' (13 1 ) -dien-121 , 6'a-olak toy1]-8"a-(3a-hydroksy-3a, 4a-dimetyl-2a-metylen-pentanoyl)-4"»,5"B-epoksy-1"3,6"a-dihydroksygermacra-J 0"(14") , 11"(13")-dien-12"oat (chrysanthemonin, ), med smeltepunkt 211°C (d)

UV:' ^3°gdog e) 210 (4,01) nm.

IR:<fllm>3470 (hydroksyl, 1760 (^C-0), y-lakton, 1715

CC=0, ester), 1665 t£C = &£, konjugert), 1640 (;:C=C--) ,

//' <■}. ' " W i ■■■

126 5 (-C-0-C-, e pok syd) \ cm~ ..P

1<1>i *. :i-

H NMR: 6 (4 00 MHz , CD'C1,M 1 ,p0'7 (3/H, d, J = 7.0 Hz, H-5as eller 6as) , 1, 21 ' (;3H j^fd fø. = 7p 0 Hz, H-6as eller 5as) , 1,32 (3H, s, H-15s) , -I, 33||(3h;£. s, H-7as) , 1,43 (3H, s, H-15's), 1,44 (3H, s:M^- É>" s)' i 1,59 (3H, s, H-14s), 1,97 (1H, dd, J = 8,0} 2, Q|tHz^H-9.[,) , 2,03 (1H, m, H-9"-, 2,13 (1H, d, J = 10 ,q|Hz^H-5)p 2,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-5"), 2,42 (1H, j|;= l|>5 Hz, H-5'), 2,58 (1H,

m, H-3a), 2,82 (1H, dd, 9 0 , 9,0 Hz, H-7'), 2,89 (1H, dd, J = 9,5, 9,5 Hz, - U- 7'%, 2 ,-9 9 (111, m, H-l"), 3,08 (1H, m, H-7), 3,36 (1H., ||| H-X;) , 3,99 (1H, m, H-l')/4,01 (1H, dd, J ll/|!/ ?|;0 Hz, H-6'), 4,09 (1H, dd, J 9,5, 9,5 Hz, H-6"), 4p 13 <;(:1H, vdd, J = 10,0, 10,0 Hz, H-6), 4,78 (1H, d, J ~ 2,0 #z, ;Mv-14 t) , 4,81 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-14"), 5,0 9 (1H, d, J. =j£, 0 H-z, H-l 4 ' ) , 5,12 (1H, J =

2,0 Hz, H-14"), 5,19;(lH;;|m, H,-8 ' ) , 5,33 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-13a) , 5,36 |lll||m, H-8"), 5,39 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-13"a) , 5,94. (2H^rn, H-8a) , 6,05 (1H, dd, J = 5,5, 1,0 Hz, H-l 3 'a) ,'6 ,0.7. (IR, d, J = 3,5 Hz, H-l 3b) , 6,09 (1H, dd, J = 5,5, 1 ,:0: HzH-l 3 ' b) , 6,13 (1H, d,

J = 3,5 Hz, H-13"b) .

MS: m/z (%, rel. int.), 3&1 (£'., 7) , 367 (2,0), 273 (2 , 1),

261 (1 , 7), 259 (1, 9) ,:.'.24 7/(2 ,4) , 246 (8,1), 245 (4,7), 243 (11,0), 229 (13 ,0),, 228 (3^9,0), 226 (14 , 2), 213 (12, 2), 202 (6 , 3)V 2OM ( 3É, 7) 2-200 (10 , 2), 199 (6 ,0), 198 (5,2), 197 (5., 7) , M 8- 5^,( 7 M , 183 (9,1), 173 (6 , 4), 169 (7,1), 167 (7,9) , ' 157'v,( 8 ,6/) , 156 (8 , 2), 97 (34 ,5), 95 (15,2), 94 (100,0), 83,(33,1), 71 (19,8), 43 (11,3).

(i) Hydrolyse av DJ140a

52 mg DJ140a, kombinert med moderlut, ble oppløst i-5 ml dioksan og en støkiometrisk mengde K^ CO^ (dvs. 245

<y>l av en oppløsning inneholdende 500 mg i 5 ml) ble tilsatt. Reaksjonen ble overvåket ved TLC. Etter 7 dager med en grad-vis økning av temperaturen og tilsetning av mere bare kunne kun utgangsmaterialet påvises.

2 ml av en 2;%.-ig|bpp^øsni?ng av KOH i H20 ble deretter tilsatt og oppløsningen kokt /under tilbakeløp i 30 minutter. Etter vanlig opparbeiding av blandingen ble denne separert ved preparativ TLjS;vé.d1;. briik av CHCl^: MeOH

i forholdet 49:2 som f remk'||i<l><i>n<g>smipdel. Mer enn 20 bånd

ble lokalisert ved ultraflø/lett. lys ved 254 nm og sprøyting av kanten av platen méd 20,| volum/vid lum svovelsyre og oppvarming. Hovedkomponenten ,;;-' lokalisert i bånd 2, ble ekstrahert med CHCl^. DJ140a (dvjjs. iSrtganjgsmaterialet) ble lokalisert i bånd 3 og dette ble ekstrahert og hydrolysert igjen ved bruk av 2% vékt/y/olu-m1 KOH<jf>oppløsning og opparbeidet som før. Den organiske opplø:shingsmiddel-oppløselige delen av denne og ekstrakten f ra :;bån'd'' 2 fra den opprinnelige hydrolyse var identiske ved TLCpV De-, ble| kombinert og renset ved TLC ved bruk av CHC1-, : MeOH isforholdet 98:2 som frem-kallingsmiddel. Platen blé fremkalit tre ganger. Hovedkom-ponentene ble lokalisert i' /-bånd. 2 ved spraying.av kanten av platen med svovelsyre som ovenfor og oppvarming.

Denne komponent ble y-t teri igere renset ved TLC

ved bruk av CHCl^: MeOH i;:? f or holdett 98:2 som f remkal 1 ings-middel. Etter ekstraher ing til CHC.l-j krystalliserte materialet fra CHCl^og heksan som fargeløse plater i en mengde av 5 mg av DJ 140aH2, ,4 ' a , S.' S-époksy-8 'a-hydroksy-1 ' 6-(IB , 10g-epoksy-4a-hydroksygermacr-3;l (1.3) -en;-12 ,6a-olaktoy 1-56-yloksy) - germacra-10 ' (14 ' ) , 11 ' (13 'l'-dien-i2--' ,6 'a-olakton ), smel-

O '• '. P

tepunkt 159 C (d) . ,y- ..u>

■ ' "--i

UV: (log f.) , 209. (3,9>j9) imi.

IR: \>J„![Jg fllmf 3500 (Oll) , 17&0 (;C = 0, y-lakton), 1665 (;C-cC,

konjugert), 1640 (iC=CC), 1260 (-C-0-C-, epoksyd) cm"<1>.

XH NMR: 6 (400 MHz, CDCl^), 1,32 (3H, s, H-15s), 1,40 (3H, s,

H-15's), 1,48 (1H, m, H-8), 1,55 (3H, s, H-14s), 1,77 (1H, m, H-9'), 2,06 (1H, m, H-9'), 2,23 (1H, m, H-8), 2,30 (1H, d, J = 14,5 Hz), 2,44 (1H, m, H-7'), 2,46 (III, d, J = 11,5 Hz, H-5'), 2,59 (1H, dd, J = 14,5, 5,0 Hz), 2,6 8 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-5), 3,01 (lii, m, H-8'), 3,2 0 (III, m, H-7), 3,35 (1H, s, H-l), 3,92 (1H, dd, J = 11,5,

8,0 Hz, H-6'), 4,0 3 (,£>H, rn-, H-l'), 4,13 (1H, dd, J = 9,5, 9,5 Hz, H-6), 4,91 (1H, d,l J =11, 5 Hz, H-14'), 5,15 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-14 ' ) 5,35 (1/H, d, J 3,5 Hz, H-13a), 5,89 (1H, dd, J 5, 5% 0,:7-.Mz,^ H-13'a) , 6,07 (1H, dd,

•■'•i'* r

J = 5,5, 0,7 Hz, H.-13'Vb) ,^6 ,0 9;:.. (1H, d, J = 3,5 Hz, H-13b). , l

<13>C NMP: 6 (100,6 MHz, CDC 2^ ) ,fø 5, lp , 18,69 ig 29,10 (C-14, C-15 og C-15') , 23,40,, 33 /35, <34 , 64, 38,09, 38,77, 6 5,04 og 66 ,08 (C-2, C-2', C- 3, *' £-3'.', C-8, C-9 og C-9'), 43,24 og 4 4,31 (C-7 og C-7')';•, 50,, 7 2 ; (C-8 ' ) , 55,30 , 61 , 39 og 73, 27 (C-4, C-10 og C-4 ' )■£< 50;:86, 6 2, 90 , 6 5, 66 og 68,88 (C-l, C-l', C-5 og C-5') ,*.75,3,5 og 79 ,95 (C-6 og C-6 ' ) , 118,00 og 118,64 (C-13 og4C-13.'.' ) , 135,69 (C-14'), 137,92 C-10'), 140,98 (C-ll) 1 7,0> 60 og 178,64 (C-1 2 og C-1 2 ' ) .

C-ll ' ikke sett. - i.\

*'.<->> i-

MS: m/z (%, rel. int.), 4 30 (1 , 1) ,' 3 56 (1,3), 342 (1,3),

281 (2 ,7), 281 (1,0) ,<:->280\;(4 ,3') , 279 (12 , 9), 266 (1,4), 265 (7 ,1), 261 (1 , 3) , '''24 7 ( 2 , 7) , 228 (5,0), 207 (8,9), 16 7 (15,4), 150 (10,5), 149 (ioO), 113 (5,3), 99 (6,1), ■r- . v 98 (5,4), 97 (6,4), 94 (9,7), 8 7 (5,5), 85,1 (11,1),

85,0 (30,6), 83,1 ( 7 ,8), 8J , 0 .'•( 4 6 , 0 ) , 71 (18,4), 70 (10,5), 69 (15 , 2), 60 (5 ,6) , 57 (50,7), 56 (16,9), 55 (22,9). '''r

v

Nøyaktige massemål inger :

Funnet: 265,1449 ;C]5^21^4k^ver 265,14 40;

funnet: 279,124 1; c15H1g'05krever 279 , 1232 .

(b) Fraksjoner A 53 - 58- og^. A 6 6' - 6 7

Disse to sett av.fraks joner ble kombinert, det ga en mengde av 0,236 g, og deretter krornatogra f ert på en 10 g si 1ikagelkolonne. 100 ml fraksjoner ble tatt og kombinert på egnet måte under henvisning til TLC. Oppløsn ing smidde 1-eluering av kolonnen og vekten av de kombinerte fraksjoner er vist i tabellene 10 og 11.

•''IM

Fraksjonene"Aa 5'Q - .63 i'Ven mengde av 0 ,039 g ble videre separert ved preparåtiypTLCsved bruk av kloroform:

'•- ■ ^ii' #

metanol i forholdet 98 :2 s;©m frremkallingsmiddel. Det ble lokalisert tre band utider;-ultråfio>l,ett lys ved 254 nm og

y5;f \'y

disses bestanddeler ekstråker tyJmed^k lorof orm. Hovedkompo-

■.fW ''ti

nentene av fraksjonene. Aa^O -^'::63,;|dvs. i bånd 2, veiet 18 mg og krystalliserte f ra :. kloéjff orrfr. og'|heksan som fargeløse nåler i en mengde av 8 mg DJ177E<*>;,. 9 ,-fro-ép"oksy-3 , 5-dihydroksyguia-4(15), 11 (13)-dien-12 ;;6a-p'iakt<:>on (.ehrysanthemolide, ), smeltepunkt 116 - 117°C (df. ';\ '■'

UV: Xj^g (log e) , 215 (4 ^'1:0) _.nm.

"i' "f' ■■'

IR: v<fa>,<fc><fl>lm,3540 (OH) ;ål 16- 0 O C=0, Y-lakton), 166 5 (*C=CC,

maKs X- V konjugert), 1640 ■ (^C='|C)'/:pl250 (-C-0-C-, epoksyd) cm . 1H NMR: 6 (400 MHz, CD'Cl3)'jf 1,^57 (3H, s, H-14s), 1,73 (2H,

m, H-9s) , 1,98 (2H, m<?>*H-#s) , 12 ,18 (2H, m, H-2s) , 2,31 (1H, dd, J = 13,5, ll;,0 Hz, H-7) , 2,81 og 3,97 (1H hver, br ss, C-3 og C-5 OHs|, 4',.'41 (1H, m, H-3), 4,88 (1H, s, H-15a) , 5,21 (1H, s, H-15:£), 5,23 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-6),5,45 (III, dr. J 3,5;'Hz, H-13a) , 6,18 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-l 3b) . i'

MS: m/z (% rel. int.), 280 (2 /0), ;279 (2 ,6), 278 (0,2), 267

(3,4 ), 266 ( 5, 5), 26 5^: (16^8 ) , p26 4 (40,8), 263 (17 ,9), 262 (6,2), 258 ( 4 , 9 ) , p26 0(8 , 0!) , 258 (4 ,9), 230 (22, 0), 226 (10,5), 2 23 (7,2)y 2 22 (18,2) , 220 (10,7), 180 (18 ,6), 179 (11,9), 169 (10 , 9,)';, lj&6 (#,2), 165 (18,0), 164 (14,7), 163 (14,6), 1^1 (10 ,4 )C, 1 57 (20 ,4 ), 155 (14 , 1), 153 (10 , 7), 152 (.19 , 2)', l'5;l (2-1,9), 150 (24 , 7), 143 (24 ,0), 137 (32 , 9;), 13:5 (21 , 1 ) , 129 (20 , 1), 125 (25,8), 124 (30,1), 123 (37,4), 111 (43,4), 110 (45,4), 109 (46,6), 101 (54,0), 97 (68,1), 95 (74,3), 85 (58,9), 84 (65,7), 83 (100,0), 81 (64,0), 69 (68,7).

Nøyaktig massemåling:

Funnet: 278,1150;<c>15<H>i8°5krever 278.1154.

(i) Acetylering av DJl77b

4 mg DJl77b ble acetylert på vanlig måte ved bruk

ty

av pyridin og eddiksyféanfiydrEtter den vanlige opparbeiding var punkter bade for 5i£gang,smat!eriale dg et mindre polart produkt tilstede ved TLC-urideceføkeOise. Det var for lite

k. ■';>$! ■: .v i

materiale til helt å kunner r eirs es , imen H NMR-spekteret for råproduktet viste følgehde^ytt^rligere signaler som kan tilskrives ace tatprodukte t'| 6 |§CDQ|fø: 2,16 (3H, s, CH^CO-)

og 4,60 (1H, m, H-3) . % t:' f:-

4-' ■ ji f

(c) Fraksjonene A 47 ■'- -52

Fraksjonene 4 7 -J52-^eri<f>mengde av 0,123 g ble kromatograf ert på en 10 g ^ilafkage-i-kolonne. 100 ml fraksjoner ble tatt og kombiné'rt p:å egriet måte under referanse

■%M<

til TLC. Oppløsningsmidde^eluering av kolonnen og vekten av de kombinerte fraksjoner ér ' visst i-tabellene 12 og 13.

'■£

Fraksjonene- Ab 3% -^5,6 ble ytterligere separert

ved preparativ TLCved bruS av'vklor6form:metanol i et for-

hold av 98:2 som f r emk" a 11 ing smidde 4 bånd ble lokalisert under ultrafiolett lys ved; 2 54'finm og komponentene ble ekstrahert med kloroform. Hovedkomponenten, inneholdt i bånd 3,

veiet 20 mg og krystalliserte ;fra kloroform og n-pentan og man oppnådde DJl79c. Dette materialet var en blanding av seskviterpenlaktoner som motstod ..ål le',for søk på rensing. Under-søkelsen ble derfor ikke fortsatt ytterligere.

Komponentene i hånd :.'|v i en mengde av 11 mg ble renset ytterligere ved preparativpTLG.. Platen ble kjørt 7 ganger med klorof ormrmetanbl i ,et forhold av 98:2 som fremkal1ings-middel. 4 bånd ble lokalisertpundér ultrafiolett lys ved 254 nm og komponentene ekstrahert ..med 'fel o ro f orm-. Komponentene inneholdt i bånd 1 i den sistnevnte plate veiet 6 mg og krystalliserte fra kloroform og n^pen^an hvorved man oppnådde DJ179al. Dette var muligeri's også en blanding av seskviterpenlaktoner til tross for at.:;det :kun var én flekk ved TLC-undersøkelse. Signaler bie sett i H NMR-spekteret som kunne tilskrives reyno'sin, pchry^sarfcémin B og muligens et di-hydroderivat av reynosin. ';VMang|elen: på materiale umulig-gjorde et ytterligere studium på dette trinn, men den videre mulighet at dette materiale er en trimerforbindelse heller lik DJl40a kan ikke utelukkes.

16 Studier på fraksjonene 124 - 143 (B) fra lettpetroleumekstrakten

Fraksjonene 124 - 143 fra petroleumekstrakten viste 100% inhibering av de to agonister 5-HT og histamin og 91% inhibering av Ach.

A Ytterligere separering1;^ v fraksjonene 124 - 14 3 ( B)

Disse fraksgoner«;i e,n; mengde pa 7. 525 g ble kroma-'ifav,

tografert pa en 150 g^silikage^kolonne. 100 ml fraksjoner ble tatt ut og kombinert l||h epip" 1 dV--1 i 1 TLC. Oppløsnings-middeleluering av kolonneh^ogåtøéktten av de kombinerte fraksjoner er vist i tabellené|*14 å|g 1^'.

B Spasmolytisk aktivitet ■' åv fir åk sif onene 12'. 4 - 143 ( B)

De fraksjoner som veiiet mer enn 50 mg ble prøvet på spasmolytisk aktivitet isom/.pe skrie vet i punkt 3 ovenfor. Resultatene er vist i-.tabell 16..

C Ytterligere undersøkelse aøjfrak'sjonene som viser 100%

i nhibering av de tfee agcpnigter ' y. :

Fraksjonene ~B 1 -y^til viste 100% inhibering av

'■'V

alle tre agonister. Fraksjonene i -en mengde av 2,4 34 g ble kromatograf ert på en 1-20 g . silikagélkolonne . 100 ml fraksjoner ble tatt opp og. slått sammen under henvisning til TLC. Oppløsningsmiddeleluering av kjolonnen og vekten av de kombinerte fraksjoner er gitt i ,v tabuel lene 17 og 18.

Overkomponenten i" fraksjonene B 10 7 - 111, dvs. inneholdt i underfraksjonerie Ba 34 i<->55, krystallisert fra kloroform og heksan og ga parthenoiide i en mengde av 4 78 mg som fargeløse plater -og méd et smeltepunkt på 113 - 114°C.

UV: (log c) 213 / (4 ,20) rim.

IR: vJJiaJg 1V60 COO, y-låkton) , 1660 CC=C, konjugert),

1640 (;c=C:), 1250 (-G-O-G-) dm"<1.>

XH NMR: 5 (400 MHz, CDCl,).?l.v.;32 (3 H, s, H-15s), 1,73 (3H,

s, H-14s), 2,81 (III, d, J§ = 8,5 Hz, H-5), 2,81 (1H, m, H-7), 3,87 (1H, dd, j'"= 8-'\ 5, 8,5 Hz, H-6), 5,23 (1H, dd, J = 12,5, 3,0 Hz, H-l), 5,64 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-13a), 6,35 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-13b).

<13>C NMR: 6 (100,6 MHz, CDCl-j), 16 , 97, 17 , 24 (C-14 og C-15),

24,11, 30,64 (C-8 og C-3), 36,35, 41,19 (C-2 og C-9), 47,65 ( C- l), 61,45 (C-5), 66,36 (C-4), 82,38 (C-6), 121,08 (C-l), 125,24 (C-13), 134,51 (C-10), 139,21 (C-ll), C-12 ikke detektert.

VA

MS: m/z (%, rel. int.), 2$'8 #,5),' 233 (1,1), 230 (8,1), 190

(9,3), 107 (8,4) v 105|(l2£2) ,^-9 5 .,(8,9)/, 91 (13,6), 81 (12,4), 79 (11,7)., 1% £'( 9%) , fj (9 ,6), 58 (24 ,8), 55 12,0) , 53 (17 , 3) , 43',(,0:.000) . -v

Dette materiale ftaridentisk i alle henseende med en autentisk prøve oppnåddtøf rå^F. Sorm. 17 Studier på fraksjonene - 7-. p\ - j'80 (G) fra le ttpetroleumekstrakten .'■ >> ;

Fraksjonene ,75 £^80 - tye) fira petroleumekstrakten viste 100% inhibering av de topagonister 5-HT og histamin og 91% inhibering av Ach.'

)■ >' " r:

A Ytterligere separer ing ,* av fraksjonene 75 - 80 ( C)

0,6 5 g ble kromatografert på en 60 g silikagel-

.,,';<•: -V-kolonne, 100 ml f raksjonefpble^samiet og kombinert på best mulig måte under henvisning tiyl TLC. Vektene av de kombinerte fraksjoner og oppløsnlngsmiddelélueringen av kolonnen er gitt i tabellene 19- og 20.

'*'•'' •■:«,

Ingen av disse umlerfraksfjoner hadde spasmolytisk aktivitet ved konsentr.asjoner -|1a 10, g/ml og ble ikke ytterligere undersøkt. £g 18 Studier på fraksjonene 1'7 7 ^ 200; (D) f ra • petroleumekstrakten ;,

■— —: " . I.J, '." "—T7~

Fraksjonene .'-i77 2 0Q f ra. petroleumekstrakten viste 100% inhibering av de ,/:to aaonister'5-HT og histamin og 81%

..''■'; •'

inhibering av Ach. ,

<£->■ : v

A Ytterligere separering ay f, r, åk s- jonéne 177 - 200 ( D)

0 , 729 g av '• d! i s se?|f r åi|s j one r ble. kromatograf ert på en 30 g silikagelkolonne. pplOO^ml fraksjoner ble tatt opp og kombinert som best under' henvisning til TLC. Oppløsnings-middeleluering av kolonnen 'og vekten av de kombinerte fraksjoner er vist i tabellene 21 og 22.

B Spasmolytisk aktivitet av fraksjonene 177 - 200 ( D)

De fraksjoner som veiet mer enn 50 mg ble prøvet på spasmolytisk aktivitet som beskrevet i del 3 ovenfor. Resul-

■1-.[lp. - ■:■ tåtene er som vist i tabelÆ 23a' ,. y

I i.,.

C Ytterligere undersøkelse av..'f rak sjonene som viser 100%

inhibering av agonistehe '-' V.- >■

(a) Fraksjonene D- 16 -'20'/,

0,175 g av fraksjonene D 16 - 20-ble separert videre ved preparativ TLC vett br u^ aV;;k lorof orm: metanol i et forhold på 95:5 som fremkal1ingsmidde^ Platene ble kjørt tre ganger. Tre bånd ble loka 1 i ser t .Under u 1 tr a £ iol ett lys ved 254 nm og komponentene ekstrariert^med;^ 1oroform. Hovedkomponenten, dvs. i bånd 1, vejiet-'!? mgj og :.;kry sta 1 li se rte fra kloroform og metanol som 2-6 m^ar."^løse plater, av DJ 154a med smeltepunkt 248 C: r,", 7-'

UV: -\ EtpH (log c ) 208 ( 3 ,98) hm.

i maks

IR- ;KBr 34 20 (Oll), 1760 ()C=0, ,-lakton), .1675 CC=cC,

maks i _i konjugert), 1260 (-C-0-C-, epoksyd) cm .

*H NMR: 6 (400 MHz, CDCl-j), 1,15 (311, s, H-15s), 1,58 (311, s, H-14s), 2,87 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-5), 3,30 (1H, m, H-7), 3,32 (lii, d, J = 1,3 Hz, H-3), 3,57 (1H, d, J

1,3 Hz, H-2), 4,09 (1H, dd, J = 11,0, 10,0 Hz, H-6), 5,54 (III, d, J = 3,5 Hz, H-13a), 6,19 (III, d, J~- 3,5 Hz,

H-l 3b)

MS: m/z (%, rel. intp'2y?g, (^'7) ; '^2 78 (■ 2 4 ) , 26 3 (2,3),

262 ( 4 , 7) , 260 (:3:,l')|Ji 2/Jik, ( 3*^ 1 ).;, 231 '(<6>,3) , 217 (8,6), 203 (9, 4) , 189 •"(•if-2 5 j|j i (1$, 6,4', tl-6 ^(26,6), 151 (4 0 , 6), 149 (2 3 , 4), Ml ■■••(•|r8,9'):i, 12 3' (26,6), 121 (33,6), 112 (88, 3), 109 ('42,,2^, 9||" ( 3 5, 9) , '9 5 : •( 9 3 , 8) , 91 (41,4), 85 (47 , 7), 83 ( 4 4:, 5 ) t:$<81 5$36 , 7)- , ■ 79. ( 38 , 3), 77 (35, 9),

ly (78 , 1), 69 (52, 3)^6 7^49, .2) , 57 (9.3,8), 55 (71,1),

,.,A,v;' c

53 (75 , 8) , 43 (10'0,0f--. T -.'

;;; *• •

Litteraturen angir smeltepunkt; 25,0 C.

Dette materiale Wvar';-;,'i alle henseender identisk

r .. - r . '}/■■

med 1 itteraturdata for- chr.y(Sar,temin'A.

(b) Fraksjoner D 21 -. -2j6 ;V

■"•yv

0,110 g av fraks-gonene D 21 - 26 ble separert ytterligere ved p repa ra t iv-'TLC-. ,ved bruk av k lorof orm : me tanol i forholdet 95:5 som fremkållihgsmiddel. Platene ble kjørt tre ganger. Tre bånd ble lokalisert under ultrafiolett lys ved 254 nm og ved sprøyting ay/j.kanten av platen med I^SO^

og oppvarming. Komponentene b.i'e ekstrahert med kloroform.

Hovedkomponenteri-i f,r;aksj.onene D 21 - 26, nemlig

i bånd 2, krystalliserte fra kloroform og hek san og ga 16 mg fargeløse nåler DJl56a, 4 «\';1 0 R-. d ihydrok sy-1 G , 5a-gu i-11 (1 3) - en-12 , 6a-olakton (parthol ide, ) , ;'med smeltepunkt 154 C.

UV; ;EtOH (, j 208 ' ( 3 ,'9,5;) nm'.

maks J ^ 't^ >, -...

IR: vFa.St fllm, 3 4 90 • (:OH) ;;"|.17 5''6.: ( ;G-0, -,-lakton), 1660OC=CC, maks .>■;«, .v-,

konjugert), 164o';(- C=eC)

<1>H NMR: 6 (400 MHz, CDC-j ),'•!, 25 (3H, s, H-14s), 1,35 (3H, s,

H-15s), 1,47 (1H, m, H-8), 1,62 (2H, m, H-2s), 1,67 - 2,04 (6H, br m, H-3s. I!-9s, 2 x Olis), 2,16 (1H, M- H-8), 2,39 (1H, dd, J = 12,3, 12,3 Hz, H-5), 2,63 (IM, m, H-l), 2,70 (III, m, H-7), 4,24 (1H, dd, J = 12,3, 9,5 Hz, H-6), 5,54 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-13a), 6,25 (1H, d, J = 3,5

Hz, H-13b).

<13>C NMR: 6 (100,6 MHz, CDCl-j), 23,51 , 24,25 (C-14 og C-15),

25,01 , 25,33 (C-2 og^-839:;,;34 ,; 43 , 77 (C-3 og C-9), 47 , 22 (C-7), 49 , 78 (GrU) É*55 ^3% --(C-5) 7- 74 , 72 (C-4),

79,88 (C-10), 8 2 /7 4 6 12,0', 3 7 (C-13), 1 38 , 45 (C-ll), 169,37 (C-12) . A v • W

MS: m/z (% rel. int.), 26& (Qv4) , 26 5 (0, 9.), 264 (1,8), 263

1 ,8, 26 2 (3,6), 261 7.0,, 260-i (4,5) , 'T'24 9 (3,0), 248

(6 ,0), 247 (7 , 2-) 2 4'^|"(ié|:0) ,'.24 5 (6 , 31, 244 ( 1 3 , 5), 232 (.i,5), 231 (15,3)', 23| (J^Oj;,, 229 (9,0), 228 (19 ,8), 215 (12,6), 213 (-18,9%, 20,3 (-22,5), 191 (22,5), 190 (27 ,0), 188 (24 , 3), 175 (24 , Vl' 2 (-22,5), 1 59 (24 , 3), 105 (4 5 ,0), 9 5 (44 , 6 ), 9 3 ( 4 4 , 1 ) ?J\ 9 1\;%9 ,'-5.) , '8 3 (85,6, 81 (51,4), 79

(49 , 5), 71 (42,3)',, ( 4 7^ 7 )<,>:,<;>5 7 ( 59 , 5) , 55 (91 , 9), 43 (100,0).

Nøyaktige massemål inger : V"f<;,1>v'

• . •;•>

Funnet: 264,1364 ;' Cv-H-^G. krever 264,1362.

"■r- .-i

19 Studier av fraksjonene 119 •-' i23• (.E) fra lettpetroleumekstrakten .'■„' ;,' -'-^' : Fraksjonene .119^- 123 fra petroleumekstrakten viste 9 7% inhibering av 5-HT. og ■histamin' og 84% inhibering av Ach.

A Ytterligere separering^ av fraksjonene 119 - 123 ( E)

1 , 583 g av disse :;:f råks joner ble krona tograf er t på en 30 g sil ikage lkolonne . "''^ 10'0'.Vm 1 fraksjoner ble tatt opp og slått sammen under rett ledrilingsav TLC-resu 1 ta tene . Oppløs-ning smidde le 1 uer ing av kolonnen og::'vekten av de sammenslåtte fraksjoner er vist i ta be lie nev 2 4 -og 25.

B Spasmolytisk aktivitetfclav ' fpaksjbriéhe 119 - 123 ( E)

De fraksjoner som ve]i'et merrenn 50 mg ble prøvet pa spasmolytisk aktivitteti^sbm:foéskrévet i del 3 ovenfor. Resultatene er vist i ta be 1.1 2 6'-.

v<-5>s<.v.y>

C Ytterligere undersøkelser av; fraksjonene som viste 100%

inhibering av agonistene v\ 1

j> .,f i ; ■

Fraksjonene ;E 15''- 28.'• ble kombinert og renset ved i' Vi',

TLC ved bruk av k lorof orm.:'heksan i<s>forholdet 75:25 som frem-■■■ .•>,* ■

kal 1 ingsmidde 1. Flovedkomppneniiténe^ble ekstrahert og identi-fisert som parthenolide ved'kromatografisk sammenligning med en autentisk prøve og ved' hjelp' av;'spek troskopi .

Slik det f rérngår..av.Cået .ovenfor anførte kan ekstrahering av matrem med ét ik;Jt*e-polart, oppløsningsmiddél til-veiebringe fraksjoner med.høyvspasmolytisk aktivitet hvorfra

■'■)-'. v: V

fraksjoner av rene seskviterpene låktoner kan oppnås.

Forbindelsene l'4';0a, ri56a;Og 177b som antas tidligere ikke å ha vært beskrevet r';'.'i itteraturen har de følgende

'\ .v. rv

mobiliteter i tynnsjiktskrpmatpgrafi:

*v

.'•'.yi :''<->■<!>

Fremstilling av kapsler

Eksempel 1

Pulveriserte matremblader og soyabønneolje blandes i følgende andeler: Blandingen-'-settes hé<r>t i -L4 '.dager ;under omrøring for ekstrahering av de; a'k,feVe'wÉe's£'ånddeler ibg stabiliseres deretter ved hjelD av':'' '$<*>' V&V- -/k

"■'v ;•>:■ .-«i ..

Blandingen innkapsles i eri' myk kao.sel eller en hard

>"&•' i:.-;-■ kapsel og oppviser do.ser på 25'^mg -.tørket blad. Dette fylles

•''. •;r;*''- u<r>'''

i en 7,5 oval mykskallkapsel é>Llerken- nr,. 2- hårdska 1 lkapse 1 med en tilsiktet f y 11 ingsye^kt ?pa 3 8|0,5 mg.

I en al terna.tiv' metode blir" blandingen behandlet

og det resulterende måcerakt inpkapsle.s som oljeaktig ekstrakt,

stabiliseres med én eller flere', av^de'- ovenfor beskrevne us-

I :< >■>'■1/

pensjonsmidler i myk ska 11-V.,el, l^r tp-dels hårde gelatinkap-

, '• %p '.'•'

sier. v =

Eksempel 2 ' ^

Pulveriserte matremblader og torskelevertran blandes i følgende andeler:'.'.;

ifu:■■*(>

Blandingen settes hen; i 1.4 dager for ekstrahering av de aktive bestanddeler . :/

Den resul té;rendev:blanding f-iltreres og filtratet innkapsles til en fy 1 l:vekt^på ';2-50 mg pr. doseringsenhet og gir ca. 25 mg tørket blad. i en-'mykskal lkapsel eller en to-dels hårdska11kapse1.

I en alternativ metode blir suspensjonen eller maceratet blandet med over f la teaktive midler eller blandinger av slike slik som polyetyoksy fe11syresorbi tanestere, mono-

og diglycerider, acetylerte glycerider, for å oppnå et selvemulgerende system.

Den resulterende formulering innkapsles i et mykt skall eller i en to-dels hårdkapsel.

Det antas at bl*&ri'diriger ,.og -doseringer vil øke absorbsjonen av den oljeak^ig^bes't.anddel via det lymfatiske system- tif .'li:' 5" ■■<::>

Eksempel3<*>■

Disse blander og/Vinnkapsles ved en doserings-

'■■-V. ■■?>>

fylling på 415 mg i m^kkap;sierA\e 1 ler to-del.s hårde kapsler og gir ca. 2 5 mg tørket må-trémbiad-i ''

Mykskallet elle£Yder^to-de1te hårde gelatinkap-sel kan benyttes oralt<:>eller rektalt.

De kan behandles7'forV.a forsinke disintegrering eller absorbsjon ved hjelpiav-.-gastroresistehte belegg slik som hydroksymety]propyIcel^uld^e eller innholdet kan blandes med polymermatriksmaterialer sbm velkjent i den farmasøy-tiske industri for å fri g.i r.-de nfia k t i ve • h ove dbe standdel på kontrollert måte.'i;

Claims (15)

1. Fremgangsmåte f.pj; f <ij> j <e> mstil 1-ing ay en seskviterpen-lak ton-holdig ekstrak"t for?:f å <r> rnasøy^ i'sk 'briiik, karakterisert ved a <-> te? dén <K> omfra.tter ,behandl ing av planten Tanacetum parthenium med .. <.> ^'f t'. ikxe-pqlart organisk oppløsnings-middél hvori minst ett av| |e •riijeynt. é seskviterpenlaktoner er ' .■•'-'')•.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge^"krav 1; karakterisert ved at ekstrakten-«.'inneholder et antall seskviter- ■;. ■ 'V- penlaktoner. , . " y
3. 3. Fremgangsmåte i følge/k råv 1 eller 2, karakterisert ved at ildet^ikke-polare oppløsningsmiddél er lettpetroleum, heksån //"kloroform eller en olje.
4. 4. Fremgangsmåte if-ølge>rkravéne 1, 2 eller 3, karakterisert ved -v at'--'de t/e 1 ler de nevnte seskvi-terpenlak toner har en Vu -m.é'-£ y 1 élosub.s.ti tuen t på lak tonr ingen .
5. 5. Fremgangsmåte if. ølgéV.et hvilket som helst av de foregående krav, k a r' <;> a 'k-.-.t e^ r i sert ved at nevnte seskviterpenlakton er let ..germakranol id eller et guaianolid. ,'.'*■ '-'r- ■• > ■ i-
6. 6. Fremgangsmåte ifølge'-.krav 5" , k a r a k t e r i- i ,i -* ■.'. sert ved at nevnte seskviterpenlakton er et germakranolid som er par tenol id • medv^f brmeleri

   eller er et cruaianol id sotriAer -.vphrv-sar.temin .'A med formelen - i 'i J • • •■ i - «t "V
7. 7. Fremgangsmåte i f ølgé-.krav 5, karakterisert ved at nevn te.seskviterpenlakton omfatter (a) et germakranolid som inneholder minst to germakrankjerner i molekylet, eller (b-)-' et guaianolid som har en oksygenfunksjonalitet i 10-st illihg i-guaiankjernen.
8. 8. Fremgangsmåte i følgeVfkray T, karakterisert ved at nevnte'.'seskviterpenlakton er et germakranolid som har formeden"--'
9. 9. Fremgangsmåte lf-dlgé$-krav-\ 8>/«-k arakteri- , t ■ M ' - A - i sert ved at deri om^fiatt^; de*; -yjtterl igere trinn for separering av forbindel sé$$ me& Wfo£mét: (5) fra nevnte seskvi-terpend-holdige ekstiåkt og ezøptxøl€;:'4pmd-aiiih ing av dette til et farmasøytisk aksep.t:erb'a%t ;d§rivai.t derav.
10. 10. Fremgangsmåte i$'ølgé^kra,v 9-, k; a r a k t e r i- v;- .;■ sert ved at de.fr omfatt'^de.t.' ytterligere trinn av hydrolysering av nevnl.e fd^bih-Selsé. ifølge formel (5) for å oppnå en forbindelse rned^fo^peleh

    og eventuelt omdanning aVrÆorb^ndéisen med ..formel (6) til et farmasøytisk aksepterbårt derivat derav.
11. 11. Fremgangsmåte if ølge krav 7, karakte r'i-sert ved at nevnte seskviterpenlakton er et guaianolid som har formelen
12. 12. Fremgangsmåte ifølgé/<y> krav 11, k a r a k t e r1 -sert ved at deri' omfattqr det ytterligere trinn av separering av forbinde 1 sen: med,'formel (3)' eller (4) fra nevnte seskviterpen lakton-holdige ekstrakt og eventuelt omdanning av denne til et farmasøytisk akseptabelt derivat derav.
13. 13. Fremgangsmåte i følge/.et hvilket som helst av de foregående krav, kara k- t e£r i's ert ved at den omfatter suspendering av parti-kiler- 'av den tørkede nevnte plante Tanacetum parthenium idet ikke-polare oppløsningsmid-dél og å tillate nevnte oppløsningsmiddél å ekstrahere seskviterpenlaktonet fra den tø rkede plante.
14. 14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav-ene 1 - 12, karakterisert ved at den omfatter det ytterligere trinn av fordamping av oppløsningsmidlet og underkasting av den resulterende rå ekstrakt kromatografi ved bruk av ikke-polart oppløsningsmiddél som i det minste første eluat.
15. 15. Fremgangsmåte i'£#igé&et hvilket som helst av de -.. <;> 'i <U> V-'..,: foregående krav, kara K&t e^r i;,-;'s ert ved at v V- '•(?."'■ seskviterpenlaktonet i<an brukés ve.| behandling av (a) migrene-tilstander eller (b) astmå'(cf'iskiå'. eller bronkiale tilstander, eller (c) artritiske til s.tahdéjr;