NO830404L - Paavisning av maligne tumor-celler. - Google Patents

Paavisning av maligne tumor-celler.

Info

Publication number
NO830404L
NO830404L NO830404A NO830404A NO830404L NO 830404 L NO830404 L NO 830404L NO 830404 A NO830404 A NO 830404A NO 830404 A NO830404 A NO 830404A NO 830404 L NO830404 L NO 830404L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cancer
malignin
cells
antibody
product
Prior art date
Application number
NO830404A
Other languages
English (en)
Inventor
Samuel Bogoch
Original Assignee
Samuel Bogoch
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Samuel Bogoch filed Critical Samuel Bogoch
Publication of NO830404L publication Critical patent/NO830404L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4731—Recognins, e.g. malignin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/473—Recognins, e.g. malignin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Denne oppfinnelse angår (1) fremstilling ay to produkter som er distinkte typer antimalignin-antistoff, og (2) fremstilling av tre kunstig fremstilte cellearter som alle har den atskillende karakteregenskap at de. produserer enten én'
eller begge typer anti-malignin-antistoff; hvorved
de ovennevnte produkter, både antistoffene selv og'cellene som produserer dem, er nyttige for diagnostiske, metabolske
og terapeutiske formål.
Metoden til fus jon.av cellehybrider er nå en rutine-messig anvendt og akseptert fremgangsmåte innenfor denne vitenskap (Monoclonal Antibodies, Cesar Milstein, .'Scientific American, mai 19.80, sider 6 6 — 7 4). Fremstilling av antistoffer ved injeksjon av tumorceller på dyr har også vært en vanlig métode innenfor denne vitenskap i mange år. Et US-patent
(nr. 4 172 124, Hillary Koprowski og Carlo M. Croce) angår en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer mot hele tumorceller, og det kritiske første trinn ved denne fremgangsmåten er injeksjonen i ét dyr av hele- celler fra forskjellige tumores, og denne avviker derfor fra den foreliggende oppfinnelse som ikke anvender injeksjon av hele cel-
ler men heller fordrer anvendelse av et spesifikt polypet-tid-preparat, Malignin, gjenstanden for US-patenter nr.
4 195 017 og 4 196 186, for fremstilling av spesifikke:
arter av et spesifikt antistoff, antimalignin-antistoff.. ' Malignin ble tidligere anvendt for fremstilling av . antimalignin-antistoff, også en gjenstand for de ovennevnte tidligere patenter. Men mens disse patenter beskriver fremstilling av polyklonalt anti-malignin-antistof f i pattedyr,
er antimalignin-antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse monoklonale og er produkter av en kunstig fremstilt enkeltcelle.. I tillegg til en annerledes fremstillingsmåte, som vil bii beskrevet i det foreliggende, har de foreliggende monoklonale antistoffer unike egenskaper -dg bør derfor hen-vises' til'unikt for å skille, dem fra det anti-malignin-antistoff som, er polyklonalt, fremstilles i pattedyr og har andre egenskaper.'
Selve de kunstig fremstilte cellelinjer som er produsert, ifølge den foreliggende oppfinnelse og har evnen til
å produsere Monoklonale Anti-Malignin-Antistoffer, har
Viktig informasjon
Av arkivmessige grunner har Patentstyret for denne allment tilgjengelige patentsøknad kun tilgjengelig dokumenter som inneholder håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, eller som kan være stemplet "Utgår" eller lignende. Vi har derfor måtte benytte disse dokumentene til skanning for å lage en elektronisk utgave.
Håndskrevne anmerkninger eller kommentarer har vært en del av saksbehandlingen, og skal ikke benyttes til å tolke innholdet i dokumentet.
Overstrykninger og stemplinger med "Utgår" e.l. indikerer at det under saksbehandlingen er kommet inn nyere dokumenter til erstatning for det tidligere dokumentet. Slik overstrykning eller stempling må ikke forstås slik at den aktuelle delen av dokumentet ikke gjelder.
Vennligst se bort fra håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, samt eventuelle stemplinger med "Utgår" e.l. som har samme betydning.
det karakteristiske nye trekk at en enkelt(monoklonal)— linje eller -celletype er blitt fremstilt kunstig med det
.patenterte produkt Malignin og er blitt sikret varighet
in vi tro med evnen til å produsere Monoklonal't .Anti-Malignin-Antis toff.. Videre kan denne nye cellelinje produsere Monoklohalt Anti-Malignin-Antis tof f med uavbrutt varighet og i hvilke som helst ønskede mengder. Disse nye kunstige celler' beteges derfor.herved Monoklonale Anti-Malignin-Antistoff-Pro.duserende Celler. De nye. celler har umiddelbare anvendelser som er relatert til anvendelsene av deres produkt-antistoff, d.v.s. både diagnostiske og terapeutiske anven- . deiser. De tidligere patenter referert til ovenfor klargjør således både i sine beskrivelser og eksempler anvendelsen av antistoffet diagnostisk for identifikasjon av tilstedeværelse av enten antigenet Malignin eller hvilke som helst celler som inneholder Malignin, eller for terapeutisk behandling (d.v.s. ødeleggelse) av slike celler, d.v.s. maligne eller kreft-celler, ved den^ spesifikke reaksjon mellom anti-malignin-antistof f og dets spesifikke antigen malignin, enten det er i oppløsning.eller fastbundet i celler (se Eksempler 11, 11A og 12 for anvendelse av antistoffet'for spesifikk farging av kreftceller ved'immunfluorescens, og se Eksempel 13 for anvendelse av antistoffet for identifikasjon eller spesifikk festing til kreftceller, hvor antistoffet enten' bærer en-signal-emitter for identifikasjon og lokalisasjon av kreftcellene i kroppen eller de bærer' et antikreft-medikament eller -kjemikalie for konsentrering i kreftcellen'for dennes' ødeleggelse, såvel som Eksempler 16 og- 17, hvor antistoffet alene anvendes for behandling (ødeleggelse) av kreftceller).
Fra oppfinnerens tidligste fremstilling av anti-malignin-antistof f. (publiserte US-patenter nr. 4 195 017. og 4 196 186) ble to typer bestanddeler gjenkjent: (1) Hurtig-må.ltilhef-tende glubolin (Fast Target-attaching-globulin) (F-TAG), .som
■in- vi tro hurtig, innen ti minutter, forbandt seg med sitt spesifikke ubevegeliggjorte antigen malignin, og (2) Sakte-måltilheftende globulin (Slow Target-attaching-globulin) (S-.TAG) , som in vitro sakte, innen to. timer, forbandt seg med sitt spesifikke ubevegeliggjorte antigen malignin (se Eksempler 10, '10 A") . Både S-TAG og F-TAG ble fremstilt fra blodserum,
og bestemmelsen av deres konsentrasjon i serum hos mennes-
ker ble basis for den kreftdiagnose-test som er gjenstanden for publisert patent nr. 4 196 186. Metoden for fremstilling av hver .av artene ga imidlertid aldri én av
dem fullstendig fri for den andre. • Den foreliggende oppfin-neise er en betydélig forbedring siden den beskriver fremstilling av en unik ny .cellelinje som produserer bare S-TAG-typen, én cellelinje som produserer bare F-TAG-typen og én cellelinje som produserer begge.typer. ■Som oppsummert ovenfor, ble evnen hos det tidligere polyklonale anti-malignin-antistoff, som inneholdt begge arter,,, til å ødelegge kreftceller spesifikt (cytotoksisitet) beskrevet i US-pat.ent nr. 4 195.017. Jeg har nå funnet at
■enkelt-arten av monoklonalt antistoffprodukt fremstilt
her for første gang for S-TAG, Monoklonalt Anti-Malignin-Antistoff Sakte (MAMA-S), fortrinnsvis tilheftes kreft-celler, ..men ødelegger dem. ikke. Enkeltarten av monoklonalt antistoffprodukt fremstilt her for første gang for F-TAG, Monoklonalt Anti-Malignin-Antistoff - Hurtig (MAMA-F) heftes også'fortrinnsvis•til kreftceller, men ødelegger dem ikke.
.Typen kombinert antistoff fremstilt'her for første gang ved monoklonale produksjonsceller., betegnet MAMA-FS, såvel
som en kunstig blanding av de' to antistoffer MAMA-S og
MAMA-F'heftes fortrinnsvis til kreftceller og ødelegger dem.
. Atskillelsen, av tilheftningen fra ødeleggelses-funksjonene hos.anti-malignin-antistoff-typené beskrevet i denne oppfinnelse har viktige anvendelser ved de atskilte anvendelser av antistoffet' som nå er mulige for diagnose på den ene side og for behandling (ødeleggelse.av kreftceller) på. den annen side. De respektive, nye produksjons-celler betegnes .MAMA-S- ,
Danner og MAMA-FS-Danner, idet hvert av dem er uniktkarakterisert, ved sitt spesifikke antistoffprodukt.
Det omhyggelige studium gjennom dé siste syv år angående mulig relasjon mellom konsentrasjonen av anti-malignin-antistoff
i serum hos; dé , enkelte pasienter, som har kref t, har tilveie-.brakt utvetydige data som er presentert i denne søknad;
(Eksempel ,10A) om at pasienter som overlever lenger, 13-46 måneder, har høyere nivåer av antistoff enn dem som døde innen ett år..Av alle pasienter med lave antistoffnivåer, var. 3 3,3%
døde innen ett år (middel 4,4 - 3,5 mhdr.). Denne klaré sammenheng mellom.overlevelse og' økende mengder anti-malignin-antistof f gir ny <betydningsf ullhet for - den ■terapeutiske
'-'.'nytte av dette antistoff. Mens den terapeutiske nytte av
anti-malignin-antistoff klart var vist i de■tidligere■pa-tenter i denne' serie (cytotoksisitet overfor kreftceller), var det ikke kjent hvor.stor forskjell,tilgjengeligheten av ekstra antistoff ville bety for balansen mellom kreft-og normale celler, d.v.s. hvor viktig denne terapi kan være for kreftpasientens overlevelse. Det foreliggende kliniske studium gjør det klart at nivået-av anti-malignin-antistoff tilgjengelig viser seg klart å være forbundet med overlevelse.
Produktene beskrevet i denne' søknad hvorved det patenterte produkt malignin er blitt anvendt for fremstilling av. nye celler som selv med uavbrutt varighet og i praktisk talt. ubegrensede, mengder produserer spesifikke kreftcelle-^
ødeleggende anti-malignin-antistoffer som fortrinnsvis angri-per kreftceller, får derfor forøket betydning, som nye tera-. peutiske anti-kreft-produkter.
Disse nye celler, som .er blitt fremstilt kunstig bare ved kontakt med. det patenterte produkt malignin, bærer de permanente instruksjoner i sitt genetiske apparat for pro-..duks jon av det spesielle antis tof fprodukt i det uendelige. De bærer også instruksjonen om å fortsette å deles i det uendelige. Begge disse instruksjoner kan^ ses utført i Eksemplene i det foreliggende. For dem som er kjent innen denne vitenskap, følger det herav at de spesielle celle-bestanddeler som bærer 'denne genetiske informasjon., nå kan isoleres og foranlediges til å utføre sine spesielle funksjoner ved antistoff-produksjonen in vitro dersom dette skulle være spesielt nyttig. For eksempel, hvis det skulle være noen effektivitets-, omkostnings- eller annen fordel ved å gjøre dette, kan nukleinsyren hos produksjonscellen som bærer, den spesifikke informasjon .for produksjon av
det spesielle monoklonale, anti-malignin-antistoff produsert av. denne spesielle . celle,: fjernes og isoleres . f ra' de-andre ' celle-bestanddeler og innsettes i en annen celletype, for
eksempel en bakterie,>som for eksempel kan dele seg hur-tigere, bli mindre ømfintlig overfor forurensning under masseproduksjon eller bli mindre kostbar å opprettholde kontinuerlig i'laboratoriet. Dette: er bare ett eksempel på anvendelse.av en hvilken som helst metode som praktise-res innenfor vitenskapen som bare kan anvendes når først den spesifikke celle, MAMA-S , MAMA-F eller MAMA-FS:, produsert ved. det spesifikke produkt: malignin,.ér blitt produsert og har vist seg å være selv-fornyende med uavbrutt varighet, .som beskrevet nedenfor.
Anti-malignin-antistoff reagerer spesifikt immunologisk ikke bare med- antigenet malignin, men også med strukturelt nært beslektede produkter såsom Astrocytin, Recognin L og Recognin M. ' Den foreliggende oppfinnelse, er derfor
i fortsettelsen rettet mot den nye gruppe forbindelser,
■ i det foreliggende betegnet Rekogniner. Rekogniner fremstilles, ved behandling a<y>tumorceller eller, kunstige kreft-celler; og de ønskede produkter separat Rekogninene kan anvendes for fremstilling av deres Kjemoresiprokaler, d.v.s. ved at'Rekogninene eller Rekogninene på én bærer, bringes i.kontakt med kroppsvæsker. Disse Kjemiresiproka-ler er. egnede for' diagnostiske og terapeutiske formål,
. d.v.s.. for diagnostisering og behandling av krefttyper.-Ett av Rekogninene ifølge: den foreliggende oppfin nelse er Astrocytin. Astrocytin er blitt- fremstilt av hj er.netumorvev,,. fortrinnsvis h jerne-gliomtumorvev. Protein- ■ fraksjoner inneholdende Astrocytin-forløperen ekstraheres først fra vevet. En foretrukket, fremgangsmåte for utfø-relse av'ekstråksjonen er å behandle vevet-med en nøytral buffer, under homogeniserings^betingelser eller ved andre teknikker for.å splitte cellene og vevene for å bringe proteinf raks joner som inneholder As trocytin-f orløperén', i oppløsning. -Ved dette punkt er Astrocytin-forløperén ennå, bundet til mange substanser med stor molekylvekt, innbefattende f .eks. proteiner, glykoproteiner, lipoproteiner, nukleinsyrer og nukleoproteiner. De oppløste proteiner separeres så fra det re.sulterende vevsekstrakt. Eks trakt-oppløsningen fra vevet, klares for fjerning av uløselige partikler. Forurens- .nings-substanser med- lav molekylvekt fjernes fra den resulterende oppløsning- ved en avdampnings-konsentrasjons-teknikk. Oppløsningen som fås, behandles.så for å spalte As.trocytin-forløper fra andre forurensninger for å oppnå den proteinfråksjon som har et.pK-område.mellom l . og.4 . Oppløs-ningen -anbringes således f.eks. i en kromatografi-kolonne og eluere.s med løsningsmidler med økende surhetsgrad. ' Alle fraksjonene som elueres i det nøytrale eller sure område ned-til pK 4, vrakes, og de fraksjoner- som har et pK-område på 1-4, oppsamles. Eluatet. behandles for oppnåelse_ av et produkt med en molekylvekt pa 8.000. Dette gjennomføres for eksempel ved at materialet førs.t filtreres for fjerning av substanser med lav molekylvekt, d.v.s.. de • som har molekylvekt under 1.000 , bg filtrering på nytt for fjerning av de substanser som har molekylvekt over 25 .000 . Fraksjonen med molekylvekt mellom 1.000 og 25.000 behandles, . så ytterligere, d.v.s.. ved tynnsjikt-gelkromatografi (TLG), for frembringelse av Astrocytin.
Astrocytin kan således fremstilles ved at hjerne-gliomtumorvev ekstraheres med én nøytral buffer, ved.gjentatt homogenisering og ved sentrifugering med høy hastighet, separasjon av.fraksjonen med pK-område fra 1 til 4 .fra det '.. resulterende ekstrakt, , separasjon, av substanser med høy molekylvekt, d.v.s; opp til .230.000,fra nevnte fraksjon, og isolasjon av produktet Astrocytin med en molekylvekt på 8 .000/ fra- dette..
Produktet Astrocytin fremstilt i henhold til denne fremgangsmåte erkarakterisert vedat det danner et. enkeltlinje-presipitat med sitt spesifikke antistoff i kvantitative presipitasjonstester og Ouchterlony gel-diffusjonstester,
idet-det er løselig i vann og vandige oppløsninger .med surt eller nøytralt pH og uløselig ved alkalisk pH og har en spektrofotometrisk absorpsjonstopp-bølgelengde på 280yum
•og en.molekylvekt på 8.000.
Astrocytin er ogsåkarakterisert vedat det inneholder en meget, stor prosentandel av glutaminsyre- og asparagin-syreresteo: og et meget høyt. forhold mellom disse syrer og histidin. En .'ytterligere, analyse av Astrocytin ér gitt nedenfor.
På en måte som er lik den ovenfor beskrevne er et.
annet Rekognin, kalt Malignin, blitt fremstilt av kunstige kreftceller, d.v.s. kreftceller dyrket in vitro. Malignin har en molekylvekt på 10.000 og en aminosyrerest-sammensetning som er lik-, men. atskilt fra, As trocy tins , ■ d . v.s . store mengder glutaminsyre og asparaginsyre og- høye.forhold mel-
lom disse syrer og histldin. En ytterligere analyse av Malignin er gitt nedenfor..
Malignin kan således fremstilles ved ekstraksjon av kunstige kreftceller dyrket i kultur med'en nøytral buffer ved gjentatt homogenisering og sentrifugering ved-høy has-,
r tighet, separering av fraksjonen med pK-område.1-4 fra det resulterende/ekstrakt, separering av substanser med.høy .molekylvekt, d.v.s. opp til 230.00.0, fra nevnte : f raks jon og' isolasjon av produktet med molekylvekt 10.000 fra denne.
Malignin 'fremstilt i henhold til■denne prosess er
.karakterisert vedat det danner et enkeltlinje-presipitat med sitt 'spesifikke antistoff.i kvantitative presipitin-
tester og Ouchterlony. geldif f us jons-tester, idet det er løselig i vann og vandige løsninger méd- surt eller nøytralt pH og uløselig ved- alkalisk pH, med en spektrofotometrisk absorpsjonstopp-bølgelengde på 280yum og molekylvekt 10.000....
Rekogniner er viderekarakterisert vedat de kan danne kompleks med bromacetylcellulose under dannelse av brom-acetyl-cellulose-Rekogni.n og ved at det danner spesifikke Anti-Rekognin-antistof f er ved ' in j-eks jon i dyr", idet Anti-.Rekogninene er toksiske overfor hjernetumorceller in vitro og g.ir; fluorescens av gliomceller når de kobles med fluorescein, som beskrevet i ytterligere detalj nedenfor..
Rekogniner, såsom Astrocytin, Malignin og lignende substanser, er egnede, som preparater som kan innføres i et biologisk system for reduksjon av fremmede■ reaksjoner, .såsom
.ved at et stoff påføres Rekognin. Et ytterligere eksempel kan være å innføre Rekognin for, produksjon.av Kjemoresipro-. kalene i det biologiske system. De kan.også anvendes ernæ-ringsmessig for befordring av veksten av et spesielt biolo-
gisk system som de er en del av. En ytterligere anvendelse av Rekogninene er fremstilling av 'mål-reagenser -som omfatter.
kompleksene av Rekogninene med bærere,, for lettelse av deres anvendbarhet i biologiske systemer. Komplekset trans-porterer således for eksempel de fysisk-kjemiske karakteristika hos selve Rékogninet. Bæreren bør utvelges fra dem som danner kompleks med.Rékogninet og som er hovedsakelig biologisk inerte...
En hver- substans kjent innenfor vitenskapen som vil danne et stabilt kompleks med polypeptider eller proteiner, kan være egnede for kompleksdannel.se med Rekogniner.. Et eksempel er et. cellulosébasert materiale såsom bromaeetyl- . cellulose. I tillegg.til at den må være inert overfor det biologiske system, bør bæreren ikke forandre de spesifikke fysisk-kjemiske egenskaper hos Rékogninet som er nyttige for de, formål som er beskrevet i det- foreliggende. Komplekset av Rékogninet og dets bærer er. egnet for •'■' produksjon, separasjon og identifikasjon av sitt kjemoresiprokal ■ -i et hvert biologisk system det bringes i kontakt ' med.- Rekognin-bærer-komplekset er. også . egnet f or. stimule-ring av produksjonen.av sin kjemoresiprokal-forløper i et hvilket som helst biologisk system det innføres i.
En klasse Kjemoresiprokaler er anti-Rekogninene, f.eks. anti-Astrocytin og anti-Malignin..Disse kan fremstilles ved at.Rekognin injiseres i et biologisk system. En immo-nulogisk effektiv dose av Rekognin bringes i. kontakt med
. kroppsvev eller -væsker på en måte som fremkaller antistoff-respons i henhold til teknikker kjent innenfor vitenskapen
om produksjon av antistoffer. Anti-Rekogninene kan anvendes for overføring av materialer såsom diagnostiske, nærings-
og terapeutiske midler til spesifikke celler eller steder i et biologisk system,- hvilket omfatter innføring av nevnte middel
i kompleksbundet form med anti-Rekogninet i det biologiske system. Anti-Rekogninene er også egnede for diagnostisering,
av tilstedeværelsen av tumorceller i et histologisk preparat ved påføring av anti-Rekogninet konjugert med en merkings-'substans.såsom en.fargesubstans eller en radioaktiv substans på nevnte . preparat , hvorved farghing eller radioaktiv merkning skjér bare for tumorceller. " Enda en annen anvendelse av anti-Rekogniner er for økning av utbyttet av andre nyttige Kjemoresiprokale produkter (såsom TAG, beskrevet nedenfor')
fra et pattedyr, hvilket omfatter injeksjon-av en immunologisk effektiv dose av Rékogninet i pattedyret eller annet
■biologisk system.
En annen klasse Kjemoresiprokaler er Mål-reagenser
.i kompleks, med sine kjemoresiprokaler.. For 'eksempel bringes - 'Mål-produktet Astrocytin kompleksbundet med. en bærer såsom bromacetylcellulose, i kontakt med anti-Astrocytin. Denne type forbindelse kan kompleksbindes med, og anvendes for, overføring av diagnostiske, nærings- og terapeutiske, midler til spesifikke"celler eller steder i. et biologisk system. Disse- forbindelser, kan også anvendes for rensnings-prosedy-r-er.. For eksempel kan anti-Astrocytin. fremstilles ved at kompleks av Brpmacetylcellulose-Astrocy.tin-Anti-Astrocy tin oppløses ved hydrolytisk behandling meden syre eller' et proteinase-enzym. Mål-reagenser er. også nyttige for økning av mengden av TAG-produkter (beskrevet nedenfor) i ét biologisk: ■ system, såsom ved at en immunologisk effektiv dose av Mål-reagens bringes i kontakt med kreppsvev eller -væsker ^
Ytterligere Kjemoresiprokaler er TAG-reagenser (f.eks..
M.ål-Tilhe'ftende Globuliner). TAG-prod.uktene dannes ved at■Mål-reagenser bringes i kontakt med kroppsvæsker i varierende, tidsrom., under, dannelse av et kompleks , og spalt-'
nihg av TAG fra dette. To egnede utformninger er -S-TAG og
F-TAG.
En fremgangsmåte for fremstilling av S-TAG (Sakte-Mål-Til-. heftende Globulin) omfatter at blodserum eller annen kroppsvæske får reagere med-et Mål-produkt (f.eks.' Bromacetylcellulose-Malignin) i ca. to timer eller mer ved lav temperatur, f..eks. 4°C, og spaltning av S-TAG. fra det resulterende ' materiale, f.eks.med en fortynnet syre, i ca. to, timer ved en temperatur på 37°C. Produktet S-TAG fremstilt i henhold til dertne fremgangsmåte erkarakterisert vedat det er løse-lig i vandige bufferløsninger, danner et enkeltlinje-presipitat med sitt tilsvarende Rekognin- i Ouchterlony geldiffusjonstester, er ikke.-dialyserb.art i cellofanmembraner., holdes tilbake av Millipore-filtre'som holder tilbake■molekyler med . molekylvekt over 10. 000, har molekylvekt ved forskjellige aggregattilstander, bestemt ved tynnsjikts-gelkromatografi,
på ca. 50..000 og mangedobles herfra opp i.makroglobulin-
området og har en spektrofotometri.sk absorps jonstopp-bølge-léngde på 280yUm.
En.fremgangsmåte for fremstilling av et F-TAG-produkt (Hurtig-Mal-Tilhenftende Globulin) omfatter at blodserum eller annen kroppsvæske får reagere" med et Mål-reagé.ns (f .eks . Bromacetylcellulose-Malignin) i ca. 10 minutter ved lav temperatur, f.eks. 4°C, og spaltning av F-TAG fra den resulterende. subs'tans, f.eks. med en fortynnet syre, i ca. to timer ved en temperatur på 3 7°C.. Produktet F-TAG frem-
stilt i henhold til denne fremgangsmåte erkarakterisertved. at det.er løselig i vandige bufferløsninger, danner
et enkeltlinje-presipitat med sitt,tilsvarende Rekognin i. Ouchterlony geldif f us jons-tester , er ikke-dialyserbart-i cellofan-membraner, holdes tilbake av Millipore-filtre
som holder tilbake molekyler med molekylvekt over 25.000, har molekylvekter i.forskjellige åggregattilstander, bestemt ved tynnsjikts-gelkromatografi, på ca. 50.000 og mangedobles herfra opp i makroglobulin-området og har en spektrofotometrisk absorpsjonstopp-bølgelengde på 280^,um.
TAG-pfodukter er egnede til påvisning av kreft-tumores i levende pattedyr ved bestemmelse av konsentrasjonene av-S-TAG- og F-TAG dannet av'et kjent volum .av pattedyrets blods-erum eller annen kroppsvæske og bringe denne konsentrasjon i
. overensstemmelse med mengder som er bestemt å.være et tegn på -kreft. TAG-produkter er også egnede ved diagnostisering, av tilstedeværelsen, av tumorceller i et'histologisk prepa rat, hvilket omfatter påføring av TAG konjugert med en merknings-substans såsom en fargesubstans eller en radioaktiv substans på.nevnte preparat, hvorved fargning eller radioaktiv merkning skjer bare for tumorceller. TAG-produkter -er i tillegg' blitt funnet å være- cytotoksiske - overfor tumorceller. TAG-produkter er også egnede til å styre overførin-gen av diagnostiskenærings- og terapeutiske midler til spesifikke-celler-eller steder" ved at nevnte midler innføres i kompleksbundet form;med TAG-p rod uk te t. Normal celledeling i planter eller dyr begrenses eller -hemmes når cellene kommer til å oppta fullstendig et spesielt hulrom. Mekanismen , (a)- ved hvilken normale celler "gjen-kjenner" at de' har fylt det..hulrom -som er tilg jengelig'for
dem, og (b) ved hvilken innvirkningen av.denne gjenkjennel-sesmekanisme. i' sin tur hemmer celledéling,. har begge vært •ukjente.. Jeg har tidligere fremstilt en gruppe forbindel-' ser'hvis forløpere, øker i konsentrasjon når normal gjenkjen-ning og innlæring skjer,'o.g som har forbindelse med gjen-kjenning , og innlæring i partikler og céller og med sammen-binding celler imellom. Disse forbindelser ble. betegnet Rekogniner. Ved forsøk på å fremstille d-isse forbindelser av normale, kreftceller har oppfinneren -oppdaget åt ' de ikke er tilstede som sådanne, og at forandringer i deres mole-kylære struktur har.oppstått på samme tid som kreftcellene . har mistet sin evne (a.) til å gjenkjenne at de har. fylt sitt .■normale volum og/eller (b) å stoppe deling når de har fylt sitt normale volum.
Rekogniner er forbindelser med fysisk-kjemiske karakteristika som har likhet med de konfigurasjoner som .er -karakteristiske for kreftceller uttrykt vedderes svikt ved gjen-kjenning'og stansing av celledeling. Anvendelsen av Rekogniner- går ut over forståelsen av kref-tmekanismen,- idet umiddelbare produkter og metoder tilveiebringes derved" som er nyttige ved diagnose og behandling av kreft og for dens
. forebyghing..
Jeg har oppdaget metoder ved hvilke kunstig dyrkede celler kan anvendes for dannelse av Rekogniner, spesielt Malighiner. En fordel med. de metoder som er beskrevet i det foreliggende er .at Rekogniner og de produkter som fås fra dette kan fremstilles effektivt i praktisk talt ubegrensede mengder.
Denne .oppdagelse går ut over området for kreftforskning'. og er umiddelbart anvendelig ved et hvilket som helst og allé. biologiske systemer i hvilke det erønskelig å påvirke
■vekst og stoffskifte. Ved fremstilling av den spesielle forbindelse-eller forbindelser for passénde celletype i kunstig kultur og den videre fremstilling .av produkter fra disse substanser kan en spesifikk virkning bringes.til å gjelde for et hvert vev, celle, celle-organelle, sub-orga-néllemolékyl eller molekyl-aggregat i et hvert levende system. Spesielle ernærings-i.nnvirkninger ved kritiske tidspunkt i utviklingen, spesielle diagnostiske, forhindrende
og behandlende metoder og konstruksjonen av kunstige bio-elektriske systemer (som i vevs- eller organ-transplanta-ter) kan således alle'påvirkes. Disse kunstige..bioelektriske systemer, kan lages for. å bære egenskapene' hos det spesifikke Rekognin;eller Rekognin-kjemoresiprokal hos det normale vev eller den normale komponent som. de vil grense opp , til og således forhindre at disse blir "gjenkjent" som "fremmede" og således forhindre de vanlige reaksjoner mot fremmede substanser, innbefattende' forkastelse: Et .annet aspekt ved denne oppfinnelse er fremstilling av et verdifult spesifikt antistoff-lignende produkt (Anti-Astrocytin) mot et spesifikt hjerneprodukt (Astrocytin), idet dette antistoff-lignende'produkt spesifikt får danne kompleks, med, og opptre' som- et spesifikt transporthjelpe- ' middel overfor,'spesif ikke punkter i nervesystemet hos forskjellige arter.
Mål-Tilheftnings^Globulinene (The Target-Attaching-Globulins - TAG). kalles så' fordi de dannes ved to reaksjoner; i den første får biologiske væsker reagere med et syntetisk kompleks, inneholdende- fysisk-kjemiske .konfigurasjoner som har likhet med Malignins og kalles Mål (Target), ved den annen spaltes det spesifikke TAG fra komplekset,, og ved måling av det således"dannede TAG fås en kvantitativ indikasjon, fra de biologiske væsker i levende organismer, om hvorvidt det er tilstede en tumor i denne organisme; og derved en diagnostisk test for tumores. Fordi -TAG-produkter og anti-Malignin er fysisk-kjemisk, komplementære overfor Maligninér, betegnes dé Kjemoresiprokaler.
' Jeg har videre., tidligere oppdaget at to. kvantitativt og kvalitativt forskjellige TAG-produkter kan fremstilles, avhengig av den tid serumet får. reagere med det spesifikke :Mål-reagens som anvendes, og. avhengig av den tid i hvilken
■det produkt som.har vært kompleksbundet, får spaltes.
Etter undersøkelse av mengdene for disse produkter•som kan fremstilles frå mange forskjellige individer .méd hjerne-" tumores og forskjellige.andre medisinske forstyrrelser såvel som hos dem som ikke har noen tilsynelatende sykdoms-prosess/ ble det klart at mengdene av 'disse to nye produkter som kunne dannes i et gitt individ, var, én indikasjon på hvorvidt dette individ hadde', en malign tumor, og tilyeie-brakte- derved et diagnostisk serumtest for maligne tumores. Anvendelsene avdisse produkter samt. deres anvendelse ved diagnostisering ut fra serum og andre biologiske væsker av tilstedeværelsen., av hjerne- og andre tumores, er illustrert ved den påvisning at TAG og anti-Rekognin-forbindelser heftes fortrinnsvis til glia-tumorceller i hlstologiske preparater av hjernetumor og omgivende vev som er fjernet ved operasjon av h jernetumoren.. Denne ' pref eraiise-merkning
ved TAG og anti-Rekognine.r av tumorceller påvises ved standard-immunfluorescensteknikker. En metode er 'således også tilgjengelig for bestemmelse, "ved histologisk undersøkelse med-'en'ny. grad av sikkerhet om hvorvidt, tumorceller er tilstede i det.fjernede vev: og hvorvidt disse tumorceller har trengt igjennom tll^de ytterste kanter av dét fjernede vev, hvilket .'angir sannsynligheten av at tumoren fremdeles finnes 1 hjernen eller, annet organ, eller om tumorceller ikke er tilstede- i periferien; av det fjernede vev, hvilket angir muligheten for at hele tumoren er blitt fjernet fra hjernen eller annet organ. I tillegg er TAG og anti-Rekogninene fremstilt som beskrevet blitt funnet å være cytotoksiske overfor hjerne-gliomtumorceller dyrket i vevskultur in vitro. Denne høye. •' affinitet for tumorceller i et annet medium, her dyrket i vevskultur, er'et ytterligere bevis på dét spesifikke kop-lingspotensial hos det nye produkt TAG, og forklarer benyttelsen av navnet Mål-Tilheftnings-Globuliner (Target-Attaching-Globulins (TAG) ), slik som TAG's egenskaper i forbindelse med det syntetiske produkt Target og tumorceller i histologisk'?
preparater. Videre tilveiebringer TAG<1>s og anti-Rekogninérs cytotoksisitet overfor tumorceller en ny diagnostisk tilleggs-test. for serumet' hos pasienter som-man antar kan ha en
■tumor. Serum eller annen kroppsvæske fra disse pasienter får således for eksempel reagere med et Mål-reageris under dannelse av TAG, og produktet TAG utprøves i vevskulturer,
av tumorceller med hensyn til cytotoksisitet.. Bade konsentrasjonen av TAG og graden av cytotoksisitet tilkj.ennegitt ved det TAG som kan dannes' fra et gitt individs serum., kan være ikke bare av diagnostisk verdi, men også av verdi ved .opp-sporing . av sykdomsforløpet preoperativt . dg pos toperativt- hos
en gitt pasient. Koplingen av radioaktive indikatorer og
farge-indikatorer til TAG. tilveiebringer nye TAG-produkter som er nyttige iri vivo ved diagnostisering av tumores og ved deres nøyaktige lokalisasjon. Injeksjon av passende.. merkede. TAG enten'.intraarterielt eller Intravenøst, i cere-brospinalvæsken eller direkte I hjernevev eller dets hul- ••
rom, gjør således at tilstedeværelsen av en hjernetumor kan påvises ved. radioaktive hjelpemidler eller ved visua-lisering av den koplede farge, fordi det er bare til tumor-cellene at TAG heftes spesifikt. Videre kan lokalisasjonen
av hjernetumoren nøyaktig ..visualiseres ved denne metode.
Dette kan ses å være en forbedring av diagnostise.rings-metoden in vivo hvor det anvendes anti-Astrocytin'dannet i
kariinblod for merkriing av hjernetumoren, fordi anvendelsen •av TAG-reagenser fremstilt av humant serum hindrer muligheten -for reaksjoner med fremmede proteiner.. Siden . TAG-reagensene og anti-Rekogninene har den kjemiske spesifisitet, som gir mulighet for pref eranse-tilhef tn.ing til As trocytin-f orløper-inneholdende tumorceller både in vitro og in vivo, kan disse
.produkter også anvendes terapeutisk såvel som diagnostisk
når de f.eks., koples med radioaktive " stoff er,. protonoppf ang-ningsmidler eller andre toksiske fysiske eller kjemiske midler, slik at disse toksiske substanser kan lokaliseres fortrinnsvis ved disse forbindelsers tilheftnings-spesifi.si-tet " i tumorcellene sammenlig.net med deres, omkringliggende normale celler. Denne selektivitet er universalt anerkjent
som den avgjørende, eller i hvert fall' som én avgjørende', '• faktor for oppnåelse av effektiv kjemisk eller fysisk terapi av tumores, og en faktor som hittil ikke er oppnådd. TAG~produktet • har,således påvist effektivitet ved preferanse-til-.'hef.tning til tumo.rcellene og har følgelig et terapeutisk middels egenskaper.
I serum hos pasienter med maligne tumores kan, som det vil., ses i Eksemplene nedenfor, én type TAG, Sakte-TAG . (Slov/. Tag (S-TAG)). som er forskjellig fra en annen type, Hurtig-TAG (Fast-TAG (F-TAG)), dannes i forholdsvis større mengder av et gitt serumvolum-enn i pasienter uten. slike tumores;
. Dette tyder.på at en av de. naturlig forekommende.forløpere
(Precursor-Tag (P-TAG)) for TAG finnes i forøket konsentrasjon eller at andré faktorer finnes' som begunstiger den relative in vitro-dannelse. av S-TAG i forhold til F-TAG.
Den mulige "forbindelse mellom funksjonen av dé aktuelle .. syntetiske produkter Mål samt TAG, og deres, forløpere, og i sin. tur. deres forhold til postulerte men ikke påviste celle-"ahti<g>ener".og sirkulerende "antistoffer" mot dem som kan finnes', in vivo, mangler ennå en forklaring.'. Således danner for.eksempel F-TAG og S-TAG på en antistoff-lignende måte atskilte enkelt-reaksjonslinjer. med Astrocytin i Ouchterlony-geldiffus jon, og injeksjonen av Mål i kaniner bévirker en økning I utbyttet av TAG-produkter fra kaninserum etter reaksjon med .-. Mål. Det funn at'det kan finnes" et normalt nivå av én forløper som ligner sirkulerende .antistoff mot et celleantigen som er skjult i den ikke-delende celle,, reiser, spørsmål angående .parets mulige funksjon. Det er .'her foreslått-at. TAG-forløper (P-TAG) og-: Mål-lignende -'substanser finnes, in vivo, som fungerer ved regulering av celleproliferasjon og celledød. Blottlegging.av en celle-bestahddel•som normalt Ikke er direkte utsatt for serum-prbteiner kan således- for eksémpel skje under celledeling. Blottlegging av denne cellebestanddel kan. resultere i at . denne bestanddel blir omdannet til. en Mål-lignende. substans til hvilken det-så kan skje tilheftning av et P-TAG-lignende molekyl fra serum, hvilket kan stimulere celledeling eller alternativt hemme- den. Alternativt kan på den annen side. en ikke-delende, celle som er skadet .eller'som ; fungerer feil, blottlegge en Mål-lignende substans på hvilken tilheftningen -av P-TAG-1'ignende molekyler kan virke gjenopprettende. Under visse cellebetingelser kan imidlertid tilheftningen av P-TAG-lignende' molekyler,bevirke ødeleggelse av cellen (f.eks."er Anti-Gliom-TAG fremstilt syntetisk s.om beskrevet- i det foreliggende, tydelig, cytotoksisk overfor gliom-tumorceller som vokser i- vevskultur). Dette kan'således representere en avspeiling av en normal.meka-nisme for regulering av celledeling og for enten reparasjon eller fjernelse av individuelle celler i kroppen gjennom orga-nismens levetid. Hvis blottleggingen av cellenestanddeler økes unormalt slik at .unormalt store mengder celle-Mål-
lignende substanser dannes, hvilket kan skje i hurtig-delende, kreftceller såsom i hjernegliomer, kan det bevir-. kes en.økning i konsentrasjonen av én type.serum-P-TAG i. forhold til en annen.
Hva enn- forløpernes virkelige funksjon er, er' øknin-. gen i den relative mengde, av hovedsakelig én type TAG, Sakte-TAG (S-TAG) som kan dannes in vitro;ved de metoder som er beskrevet i det. foreliggende fra serum- hos pasien-. ter med maligne tumores, basis for den diagnostiske serum-,
test beskrevet i de. følgende eksempler.
Muligheten ifølge den foreliggende oppfinnelse til å, danne spesifikke monoklonale arter for S-TAG.og F-TAG ved hjelp av nye kunstig fremstilte celler som beskrevet i. det .foreliggende, har' muliggjort, separasjonen av visse funksjoner
hos disse TAG-molekyler, som tidligere' ikke kunne separeres
■på grunn av at de var blandet i sin polyklonale produksjons-form.. Mens de tidligere TAG-produkter således både haddevpreferensial-tilheftnings-egenskaper overfor.maligne celler og den cytotoksiske egenskap hvorved den maligne celle ødelegges, viser de'nå beskrevne monoklonale former .av■ TAG: MAMA-A.og MAMA-B, begge pref erensial-til.héf tning^ og således spesifikk fluorescens med maligne, celler, men er ikke cytotoksiske;.i motsetning til dette produserer en
blanding av ,MAMA-A og.MAMA-B"både fluorescens og- cytotoksisitet., Separasjonen av diagnostiske og terapeutiske anvendelser er således mulig for første gang.
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
EKSEMPEL 1
Fremstilling av ubearbeidet Astrocytin-forløper-inneholdende fraksjon.
Humant hjernegliom-tumorvev fjernet ved operasjon dis.se-keres for at det skal bli så fritt så mulig for overflate-blodkar og normalt hjernevev. For, en typisk mengde dissekert tumorvev'på 11 gram utveies vevet i seks deler a 1,5 g og to. deler å 1,0 g. Hver del behandles deretter som følger..
Hver-del homogeniseres i en nøytral bufferløsning ved sonikering eller ire.d annet mekanisk hjelpemiddel. For eksem-, pel homogeniseres hver del i 100 ml 0,005 M fosfatbuffer-.
løsning, med pH 7 pr. gram vev, i en Waring-blander. Homoge-'.
.nise.ring børUtføres i kulde for .forhindring av denaturering av de tilstedeværende proteiner. For eksempel bør blanderen for-kjøles i kjølerom ved 0-5°C og betjenes . i bare tre minutter. Homogenate.t sentrifugeres, deretter foråt det .skal bli klart, for, eksempel ved 80.000 ganger tyngdeakselerasjdnen i.30 minutter i en avkjølt ultrasentrifuge. , Den løselige :supernatant dekanteres og holdes kaldt. 'Det uløselige resi-duum rehomogeniseres med. ytterligere 100 ml nøytral buffer, pg sentrifugeres som før, og .det annet løselige ekstrakt blande.s med det første.. De beste utbytter oppnås ' når denne .fremgangsmåte for homogenisering og sentrifugering gjentas ■ inntil mindre enn 50^ug protein pr. ml oppløsning oppnås i . .. supernatanten. For. de fleste vevstyper er dette fullført etter den femte ekstraksjon.
De således oppnådde.oppløsninger blandes sammen og konsentreres ved avdampning med etterfølgende dialyse,
■f.eks. ved dialyse mot 0,005 M f osf atbuf f er, i kulde for oppnåelse av et volum på 15 ml. Volumet av denne oppløsning noteres ned, en del uttas for totalprotein-analyse, og resten fraksjoneres for oppnåelse 'av den proteinfraksjon som har pK-område mellom 1 og 4. Den foretrukne fraksjonerings-metode er kromatografi, som følger.
Oppløsningen fraksjoneres i kjølerom (4°C) på en DEAE-cellulose .(Cellex-D)-kolonne 2,5 x 11,0 cm, som er ekvilibrert med 0,005 M natriumfosfatbuffer. Trinnvise eluerings-løshingsmiddel-overga.nger lages med de følgende løsnings-midler .(.oppløsninger) : Oppløsning (.1): 4,04 g Nal^PO^og 6,50 g Na2HP04løses i 15 liter destillert H20 (0,005 molar, pH 7) ; Oppløsning (2) : 8,57 g Na.H2PO^løses i 248.0 ml destillert H20; Oppløsning. (3): 17,1 g' NaH2P04 løses i -2480 ml destillert R*20 (0,05 molar., pH 4,7);, Oppløsning (4) : 59 , 65 g NaH2P04løses i. 2470 ml destillert H20 (0,175 molar); Opp-løsning (5):.101,6 g NaH2P04 løses i 2455 ml destillert H20
(0,3 molar, pli 4,3); Oppløsning (6): 340,2 g Kall2PO4løses i 2465. ml- destillert" H20 (1,0 molar, pH 4,1); Oppløsning (7):'
283,64 g 80% fosforsyre (H3P04) blandes med 2460 ml destil- - lert H20 "(1,0 molar, pH 1,0) .
Tilsett nervevevs-ekstrakt,. 6 til 10 ral ..volum. La det passere inn i ..kolonnen..Legg.så Oppløsning (1) over og tilkoble et reservoar på 300.ml Oppløsning (1) som får. dryppe ved hjelp, av-, tyngdekraften ned i kolonnen. Porsjoner på 3 ml eluat oppsamles ved hjelp av en automatisk
f r.aks jonssamler . De påfølgende eluerings-oppløsninger ut-byttes trinnvis etter de følgende 'eluat-rørnumre. Oppløs-ning (2) : . ved rør 88,' bring oppløsningen på kolonnen til toppen av harpiksen,, .legg så overbg tilkoble reservoar med50 ml Oppløsning (2); Oppløsning (3): ved rør 98, bring oppløsningen .på kolonnen til toppen av harpiksen, legg så over og tilkoble reservoar, med- 75 ml med Oppløsning. (3) ; .'. Oppløsning (4) :. ved rør 114, bring oppløsningen på kolonnen,
til toppen av harpiksen,' legg så over og tilkoble reservoar, med 150 ml Oppløsning (4); Oppløsning (5) : ved rør 155,'.
■ bring oppløsningen på.kolonnen til toppen av harpiksen, legg så. over og tilkoble reservoaret med 125 ml Oppløsning (5);
Oppløsning (6): ved rør 18 7, bring oppløsningen på kolonnen til,toppen av harpiksen, legg så over og tilkoble reservoar
■med 175 ml av Oppløsning- (7); fortsett elueringen inntil elueringen er■fullstendig, ved rør 260. Anvend nylig tillaget harpiks for hvert nytt volum vevsekstrakt,. ' Hvert eluatrør analyseres kvantitativt med hensyn til protein.. Eluatene
, i rør nummer 212 til 230-, blandes sammen, og inneholder
de ubearbeidede produkter fra hvilke Astrocytin skal fremstilles .
Mens-data er .publisert for dette råmateriale, tidli— gere kalt fraksjon.10B (Protein.Metabolism of the Nervous
System, sider 555-569 (Plenum Press, 1970); Journal of Neurosurgery, . Vol33,.. sider 281-286 (september 1970) , kan avspaltningsproduktét fra fraksjon 10B fremstilles som et produkt i mengder mellom 0,1 og 10 mg pr. g opprinnelig
■friskt nervesystem-vev fra hvilket det ble utvunnet. I tillegg til en Astrocytin-forløper, inneholder det varierende mengder kovalent bundne karbohydrat-residuer Inklusive et
antall.heksoser, nemlig glukose, galaktose, mannose; heksose-aminer, inklusive glukosamin, -galaktosamin og. mannosamin;
■ og leilighetsvis- andre sukkerarter, såsom fukose, ribo.se og
.kanskje rhamnose. Det inneholder også -proteinprod.ukter
méd høy molekylvekt og flere lipider og nukleinsyrer.
EKSEMPEL 2
Fremstilling.av renset Astrocytin .fra■ubearbeidet Astro-cy tin-f orløp.er-inneholdende fraksjon.
Den Astrocytin-fo.rløper-inneholdende fraksjon utskil-les ytterligere ■ fra forurensninger. Ved en foretrukket utførelsesform kromatograferes materialet fra Eksempel'1
på Sephadex-gel G-50 i en kolonne som typisk er 40 cm. lang-, 2,5 cm i diameter, og 196-ml i volum.. Det anvendte trykk
er. 40 mm Hg; strømningshastigheten er 35 ml pr... time, og bufferen er 0,-05 molar fosf atbuf f erløsning-, pH 7 , 2 . Den første (gjennom-strømnings-)topp inneholder Astrocytin-forløper sammen med forurensninger, mens etterfølgende top-per bare inneholder forurensninger. Ved den foretrukne utførelsesform- konsentreres produk-■ tene' ■ i.' ovennevnte, første gjennomstrømningstopp på Sephadex G-15-, og overføres så til en kolonne med Céllex-D med
de samme oppløsninger, (1) ■ til (7), som i .Eksempel '1,
ogde samme elueringstrinn som de. som er utført i Eksempel 1. Produktet Astrocytin er tilstede som en skarp , topp i. de
samme rør' (nummer 212-230) som før, idet dets opptreden ved Cellex-D-kromatografering bibeholdes, uten tilstedeværelsen av et stort antall forurensninger.
Forurensninger med lav molekylvekt kan så fjernes ved teknikker kjent innenfor-, vitenskapen, såsom Millipdre . skive-.filtrering. Ved den foretrukne fremgangsmåte befris produktet Astrocytin fra salt og andre forurensninger med lav molekylvekt ved filtrering gjennom Millipore Pellicon Dise nr.. 10 00, 13 mm, som holder'tilbake substanser med mplekylyekt større enn. 10.00 og - tillater passas je. av substanser, med mole kylvekt under 1000. Produktet Astrocytin forblir, på Pelli-conskivenog gjenvinnes fra denne ved vasking med Oppløsning (1) fra Eksempel 1. Astrocytin fås så ved at forbindelsen med molekylvekt. 8000 isoleres fra ovennevnte oppløsning. En foretrukken frem-: gangsmåte anvendertynnsjikts-gelkromatografi (TLG) som føl-, ger: ■Det anvendte apparat er det kommersielt tilgjengelige som er
utformet av Boehringer Mannheim GmbH; Pharmacia.Fine Che-. mi.cals og CAMAG (Sveits). Gelen (2,'5 g Sephadex G-20.0 super-fint) tilberedes, i 85 ml 6/5 M. NaCl i 0,02 M Na^HPO^/ KH^PO^-.. f osf atbuf f er, pH 6,8 (6,6-7,0) . La den svelle i to- eller tre
.dager ved romtemperatur med leilighetsvis forsiktig blanding' (magnetiske og andre rørere bør ikke anvendes)." Den svellede gel stabiliseres i tre uker ved k jøleskapstempe.ra-tur; bakterie-, og soppvekst kan imidlertid interferere- med den' svellede gel. - Hvis gelen,skal oppbevares i lengre
■tid bør en liten mengde bakteriostatisk middel, tilsettes (natriumazid 0,02%). 2,5 g tørr gel anvendes for å lage to plater på glass, 20 x 20 cm, 0,5 mm'tykke. Platene får
.tørke ved romtemperatur- i 10 minutter og overføres til
et f uktekammer. hvor de k.an oppbevares i toukér, eller de anvendes umiddelbart etter passende for-ekvilibrering
(vanligvis.1 løpet av natten i minimum 12 timer). Ekvili-breringehs hovedfunksjon er å normalisere forholdet mellom de stasjonære og mobile fasevolumer. Med de. for-ekvillbrerte plater i horisontal stilling, påsettes substanser som skal bestemmes, med mikropipetter som flekker eller som en .stripe ved startlinjen. 10 til 20 ml 0,2-2% proteinoppløsning anbringes på kanten av et mikroskoperings-dekkglass (18 x
18 mm) og holdes mot gél-ovérflaten. På noen få sekunder vil oppløsningen trenge inn 1 gelen. Alle, prøvene tilberedes først på dekkglassene og påsettes dexetter hurtig.. Hvis det ikke påsettes nok materiale, ér det vanskelig å lokalisere individuelle flekker etter separasjonen. Hvis det påsettes for mye materiale, blir det ikke.avgrenset separasjon. Prøvene fortynnes■med.buffer for å lette behandlingen, og separasjonen av prøvene utføres ved en nedadgående teknikk med platen-
ved en- vinkel på 22°. Strømningshastigh.et på 1-2 Cm pr. time . er mest passende. Markørsubstanser' .(såsom Cytokrom. C, hemoglobin,. myoglobin eller bromfenolblått-merket albumin) påsettes i forskjellige po sis joner tvers over platen for at man;
skal få. en kontroll på mulige variasjoner i strømning over platen, og de tjener også som referanseproteiner for bereg-ningen av den forholdsvise avstand (mobilitet) for ukjente substanser. Etter påsetti-ng av prøvene anbringes platene
i apparatet Igjen og papirvekén skyves litt .nedover for å
Resultatet uttrykkes ved R -verdien definert som forholdet.
■ m ■ ". ■ mellom vandringsstrekningen.for det utprøvede protein (d^)
og<y>andringsstrekningen for cytokrom' ; C eller myoglobin (d )• som anvendes som ref eranseprote.ini Ved sammenligning av vandringsstrekninger- for utprøvede substanser og standarden'
dD ' , anvendes, formelen (-Rm = -rM . En. rett kalibreringslinje am oppnås, ved'at logaritmen til molekylvekten for standardene som anvendes, inntegnes, mot Rm~verdiene.. Fra. denne linje kan det ukjente proteins molekylvekt fås.- For å få de .mest
. nøyaktige resultater, bland seks like deler av protelnprøve-" oppløsningen med standard, i dette tilfelle Cytokrom C, før det påsettes platen. Ved den ovennevnte TLG-metode observeres . stoff et Astrocytin som en atskilt flekk ved en avstand.-på ca.. 0 ,83 - 0 , 02 med referanse til' standarden, Cytokrom C, hvilket gir en omtrentlig molekylvekt på 8000 for Astrocytin. Flere atskilte stoffer separeres ved denne metode fra Astrocytin på basis av små forskjeller i kjemisk
struktur .og store forskjeller i molekylvekt. .Tre stoffer
som er medført som forurensninger til dette punkt med molekylvekter på henholdsvis 64 . 000, ,148.000 og 230.000 , er således blitt oppdaget og fjernet'ved TLG-metodene beskrevet ovenfor. Stoffet Astrocytin bortsuges med gelen i hvilken det finnes, i tørr form, oppløses i Oppløsning' (1) og befris,
fra gel ved sentrifugéring eller ved andre lignendé hjelpemidler.
.Stoffet Astrocytin som er blitt fremstilt ved dette trinn ér løselig i destillert vann, løselig ved nøytralt og surt pH og uløselig ved,alkalisk pH og har en spektro-: .f otdmetrisk absorps jons topp-bølg.elengde på 280^um. Det er
et polypeptid med molekylvekt, som angitt ovenfor, på ca-. 8000. Dets kovalent bundne aminosyrer-viser seg ved hydrolyse, 'med 6N' HCl . og deretter kvantitativ- automatisk bestemmelse, å ha følgende gjennomsnittlige sammensetning av.aminosyrer :
Cysteinsyre, hydroksyprolin, norleucin, ammoniakk, isodesmosin, desmosin,■hydroksylysin, lysin-norleucin og gamma-aminosmør-''syre er alle fraværende i påvisbare.mengder, mén et spor av gluko.samin kan . være tilstede.
Av 11 gram av■utgangs-hjernetumorvevet i Eksempel 1 fremstilles 3 mg renset Astrocytin' ved de ovennevnte metoder..
EKSEMPEL . 3
Fremstilling av Malignin-forløper i kunstig kreftcellekultur.
Vanligvis gjennomføres en steril-teknikk samvittighets-', fullt.
Alle oppløsninger (f.eks. Hank's Balanced Salt (BSS), F-10 Nutriént medium, føtalt kalveserum, trypsinoppløsning)
inkuberes ved 35°C i<y>annbad I ca-. 20 minutter eller mer før bruk ..'■■'■
Celler fjernes'fra tumoryev og dyrkes in vitro gjennom mange generasjoner, under anvendelse av et egriet medium, slik som det som er beskrevet nedenfor. For-skyll begerglass som skal anvendes, med en steriliserende' oppløsning,, for eksempel 12-propanol pluss Amphyl- eller kreolin-oppløsning..
Ved den foretrukne utførelsesform dyrkes de kunstige kreftceller (d.v.s. celler.dyrket in vitro i mange generasjoner) i 250 ml kolber. Væs.kemediet i hvilket cellene .'vokser, helles i de for-skyllede begerglass• Cellene vas-, kes deretter forsiktig med 5-10 ml Hank's BSS eller annen lignendé oppløsning i 30 sekunder. Unngå agitering. Alle vegger og overflater vaskes. Oppløsningen gjøres fri for celler ved' séntrif ugering. i. kulde. f ra 10 minutter ved 3000. rpm (omdreininger pr. minutter). Mediet helles i et begerglass som ovenfor. Tilsett en liten mengde bufret proteinase-enzymoppløsning og skyll hurtig for forhindring av oppløsning av dellene. Ved den foretrukne fremgangsmåte tilsettes 1-2 ml trypsinoppløsning (EDTA) og skylles i bare , 10 sekunder. Hell. av trypsinoppløsningen....
Tilsett et lignende volum ny trypsinoppløsning og inku-ber inntil cellene kan ses å atskilles fra veggene I kammeret ved observering i" mikroskop.- Dette krever vanligvis 5-10 minutter. Tilsett et passende vekstmedium, såsom 50 ml av en oppløsning av 7-10% løsning av føtaIt kalveserum i 100 ml F-10 Nærj.ngs-medium.
Femogtyve ml av..det .nye medium med celler overføres
til et . nytt veks tk.ammer f or formering og de gjenværende 25 ml beholdes I det første kammer for formering. Begge kamre .anbringes.i en. inkubator ved 35°C i ca. syv dager. Ved frem-, gangsmåten ifølge dette Eksempel til détte punkt, deles- en kunstig kreftcellekultur i tor nye. kulturer omtrent hver syvende dag. Hele denne fremgangsmåte kan gjentas så. ofte som ønskelig,, med omtrent syv dagers mellomrom, for hvert vekstkammer. Antallet av., celler som . vokser in vitro kan således omtrent dobles hver syvende dag.
Cellene kan ekstraheres for fremstilling.av Malignin etter ca. syv dagers vekst. For eksempel kan celler som vokser i hvert 250 ml vekstkammer som beskrevet ovenfor, gjenvinnes ' som følger: Mediet overføres til et sentrifugerør 'og sentrifugeres.ved 3.000 rpm i kulde i 10 minutter. Mediet helles av. Cellene som er tilbake I vekstkammeret, skrapes av fra kammerveggene og vaskes ned i sentrifugerørehe med nøytral bufferløsnlng. ■Cellene vaskes to ganger med nøytral bufferløsning og sentrifugeres igjen ved 3.000 rpm . i. kulde, og mediet helles åv. De vaskede celler suspenderes i 10 ml. nøytral fosfatbuffer inntil de er klare for ekstraksjon av. den ubearbeidede ' Malignin-forløper-l.nneholdende f raks jon. •
EKSEMPEL 4
Fremstilling av ubearbeidet Malignin-fprløper-inneholdende fraksjon.
Vaskede celler suspendert i nøytral buffer fra. Eksempel
3 splittes mekanisk under .betingelser som forhindrer denatu-rerihg av, de fleste proteiner. Ved den foretrukne ,fremgangsmåte.behandles de vaskede celler i kulde med et sonikerings- apparat i 20 sekunder. Etter son.ikering sentrifugeres cellerestene. ved. 30.000 rpm i 3 0 minutter og supernatanteh- dekånteres' av. Ti milliliters porsjoner av bufferl.øsning anvendes for vasking, av gjenvæ rende celler ut av kammeret og disse tilsettes til de gjenværende cellerester. Soni-fiker og., sentrifuger, som ovenfor og bland supernatantene sammen. Gjenta prosessen enda en gang. Den sammenblandede supernatant fordampes for reduk-. s'jon av .det omtrentlige volum på. 30 ml til 6-7 ml. En por-sjon tas.ut for totalprotein-analyse og resten fraksjoneres • i henho.ld . til. metodene ifølge Eksempel 1 for Astrocytin-. forløper .
EKSEMPEL 5
Fremstilling av renset Mal.ignin-produkt .fra ubearbeidet Malignin-inneholdende fraksjon.
Produktet Malignin isoleres videre fra forurensninger
ved fremgangsmåtene ifølge Eksempel- for Astrocytin.'
I TEG-trinnet i den. foretrukne utførelsesform observeres produktet Malignin ved en. atskilt flekk ved en...avstand på ca. 0,91 - 0,02 med referanse til standard-cytokrom C, hvilket gir en omtrentlig molekylvekt på.10.000 for Malignin..,
Produktet Malignin som er blitt fremstilt ved dette
trinn er løselig idestillert vann, løselig ved nøy tralt; eller
. 'surt' pH og uløselig i alkalisk pl-l og har e'n -spektrofotometrisk
topp på 280^,um. Det er et polypeptid med en molekylvekt på ca. 10.000. Dets kovale.nt. bundne aminosyrer viser seg ved ■
■hydrolyse med 6N HC1 og deretter, kvantitativ bestemmelse
å ha. den følgende gjennomsnittlige sammensetning av aminosyrer:
.idet aminosyrene cysteinsyre, hydfoksyprolin, norleucin, ammoniakk, is.odesmosin, desmoslh, hydroksylysin, lysin-norleucin og gamma-amlnosmørsyre ikke er tilstede i påvisbare mengder.
Et typisk utbytte av ■: rent Malignin fra tolv 250 ml reaksjonskamre- ifølge Eksempel .3, sammenlagt ér ca. 1 mg .
Malignin.
EKSEMPEL 6
Hydrolytisk spaltning av .Rekogniner.
En oppløsning av Rekognin, i dette tilfelle enten Astrocytin. eller Malignin ved pH mellom l-2;.får stå i kulde. Etter
7 til 14 dager viser TLG-kromatografi at stoffet er blitt, redusert i molekylvekt med ca. 200. Når.oppløsningen får stå lenger., fraspaltes ytterligere enheter med molekylvekt
ca. 200 .hver 7. til 10. dag. For Astrocytin reduseres 'således molekylvekten fra 8.000 og for Malignin reduseres molekylvekten. fra 10.000, i. hvert tilfelle sekvensielt med enheter på ca.' 200.
Astrocytlns fysisk-kjemiske spesif isiteter' beholdes .av.hvert-produkt ned til molekylvekt ca. 4.000. Malignins fysisk-kjemiske spesif isiteter' beholdes av hv.ert produkt ned til en molekylvekt på ca. 5.000:..Dette vises.ved' Ouchterlony gel-diffusjonstester'mot henholdsvis'anti-Astro-.cytin og anti-Malignin.
Denne, spaltning kan også utføres enzymatisk, f.eks. med trypsin og andre proteinaser, med lignende resultater. Molekylvektene for disse forbindelser fremstilt ved hydrolytisk .spaltning av'Rekogniner kan.defineres omtrentlig ved de følgende formler: For produkter med Astrocytins fysisk-kjemiske spesifisitet er : 4000 + 200x.'? Y. For produkter med Malignins, fysisk-kjemiske spesifisi-..teter: 5000 + 200x=Y, hvor Y er molekylvekten for pro-.duktet og X er 0 eller et. helt tall fra 1 til 19...
EKSEMPEL 7
Fremstilling av kunstig.vev eller organ med Rekogniner...
Et stivvegget .'rør av plast, metall eller annet egnet stivt materiale dyppes i eller impregneres med.en sterkt konsentrert (d-.v.s... 10 mg/ml)' viskøs oppløsning av Rekognin, ^1. dette- tilfelle enten Astrocytin eller Malignin., inntil alle overflater er -fullstendig belagt med Rékogninet.- Rekog-. . nln-oppløsning føres vekselvis gjennom og rundt røret under trykk -inntil alle overflater er fullstendig belagt.. Røret, tørkes så i, luft eller i vakuum, eller det fryse tørres.
Belegningsprosessen gjentas flere ganger for oppbygging av et flerdobbelt molekyllag med Rekognin-belegg.
Røret er nå klart til å anbringes i et hulrom eller i et vev som. inneholder Astrocytin- eller Malignin-lignende forløpere i det tilstøtende- vev eller væske i et levende pattedyr.■ Dette kunstige vev eller organ kan anvendes for reduksjon eller utelukkelse av reaksjoner som fremmede substanser uten Rekognin-belegningen ville sette i gang...
Kunstige vev eller organer med annen geometri kan. fremstilles på samme måte.....
EKSEMPEL 8
Fremstilling, av Target-reagenser (også kalt'Mål-reagenser) av Rekogniner Astrocytin, fremstilt som i Eksempel. 2 ovenfor, eller.
Malignin., fremstilt som i Eksempel 5 ovenfor,'danner kompleks med en bærer under dannelse av et Target-reagehs.
Ved den foretrukne ut.f ørelsesf orm løses. Astrocytin eller Malignin i 0,15 M' NaH2P04~citratbu'ffer, pH 4,0. En brom-
acetyl-harpiks , 'for ' eksempel bromacetylcellulose (BAC)' med
.1,0 til. 1,5 milllekvivalenter. Br pr. gram cellulose, lagret i kulde, tilberedes i' 0,15 M NaH2P04-buffer, pH 7,2. Omgjør pH' i bufferen til 4 ved å helle av bufferoppløsningén med
pH 7,2 og tilsette 0,15 M NaH-yPO^-citratbuf f er med pH 4 ,0 ..,
Astrocytin- eller Maligni-noppløsn.ingen og BAC-oppløsningen-
røres sammen (forhold 10:1 mellom BAC og Rekognin) i 30
•-.timer ved romtemperatur, og sentrifugeres deretter.
Det foretrekkes at.alle steder på BAC som er tilgjen-gellgefor å bindes til Rekognin, bindes. Dette kan utføres
som følger. Supernatanten' fra det umiddelbart foregående trinn fryse tørres og prdtein-innholdet bestemmes for a få
en angivelse av mengden Astrocytin eller Malignin som ennå Ikke er kompleksbundet med BAC. ■ Det kompleksbundne BAC-Astrocytin (eller BAC-Maligni.n) resuspenderes i 0,1 M bikarbonatbuf f er pH ..8 , 9 og omrøres 1 24 timer, ved 4°C for
at dannelse av kjemiske bindinger mellom BAC og Astrocytin
•eller- Malignin skal .kunne skje. Etter,de 24 . timer, sentrifugeres suspensjonen o.g supernatanten analyseres med hensyn ti.l protein. Det kompleksbundne BAC-Astrocytin eller. BAC-Malignin
resuspenderes nå'i 0,05 M åminoetanol - 0,1 M bikarbonat - buffer med pH 8,9 for å blokkere et hvert ureagert brom.
Suspensjonen sentrifugeres og supernatanten beholdes> men analyseres ikke, på grunn av.nærvær av åminoetanol. Fjerning av alt.ubundet Astrocytin eller Malignin utføres, så ved sent-rifugéri-ng og resuspensjon ved tre vaskinger i 0,15.M NaCl inntil det ikke kan måles noen absorbans. på spektrpfoto-meteret ved 26éyum. BAC-Åstrocytin- eller BAC-Malignin-komplekset omrøres nå. i 8 M urea i'2 timer ved:38°C, s e-n tr i'-
fugeres og vaskes så (tre ganger er-vanligvis nok) med 8 M urea inntil det ikke vises noen- absorbans i vaskeløsnin-. gene ved 266yum. Komplekset vaskes- to ganger med 0,15 M.
NaCl f or å' gjøre, det fritt for urea,. Komplekset omrøres
så ved 37°C i 0,25 M eddiksyre i 2 timer for påvisning .av dets stabilitet.. Sentrifuger og avles supernatanten ved : 266^um; ingen absorbans bør finnes Dette kjemisk kompleks-- bundne BAC-Astrocytin eller BAC-Malignin er derfor stabiltbg kan. nå anvendes som reagens, ved de metoder som er beskrevet nedenfor; i denne stabil-reagens-form refereres det
til som TARGET (Topografisk-Aritigen-Lignende-Reagens-Templat)
(Topografic-Antigen-Llke-Réagent-Template) fordi det er et syntetisk fremstilt kompleks hvis fysiske og kjemiske egenskaper har likhet med de stabile cellebundne- forløpere for Astrocytin eller Malignin når det er i en.potensiell reaktiv tilstand overf or, serumkomponentér.. For lagring sentrifugeres TARGET-reagenset og .vaskes inntil det e.r nøytrali--sert med 0,15. M NaH2P04_-buf f er med pE 7,2.
Target-reagenser kan fremstilles av bromacetyl-ligand-bundne bærere: som ikke er cellulose,, såsom bromacetylerte harpikser eller til og -med filtrerpapir.
EKSEMPEL 9'
Fremstilling av' antisera mot Astrocytin, Malignin og•TARGET.
Antisera mot Astrocytin-, Malignin- eller TARGET-reagenser 'kan fremstilles ved at det bevirkes en antistoff-respons
■mot doni i et pattedyr: . Den.følgende fremgangsmåte er funnet å være- tilfredsstillende.
Ett milligram Rekognin (Astrocytin eller Malignin) injiseres i tåputene på hvite han-kaniner med standardFreund's adjuvans, og deretter gjøres den samm.e injeksjon intraperitonealt én uke. senere, igjen intraperitonealt etter ti dager og hvis nødvendig, tre uker senere. Spesifikke antistoffer kan påvises i. blodserum hos disse kaniner så tidlig som en uke til ti' dager etter den første injeksjon. Den samme fremgangsmåte- følges for TARGET-antigen ved injeksjon av den mengde
■TARGET som inneholder 1 mg Astrocytin eller Malignin ved bestemmelse med Folin-Lowry - proteinbestemmelse .
Det spesifikke antistoff mot Astrocytin kalles anti--Astrocytin. Det spesifikke antistoff mot Malignin kalles anti-Malignln'.. _ På samme måte kalles det spesifikke antistoff, mot TARGET-reagens anti-Target: Disse antistoffer, påvises klart på standard-0'ucht'er-lony-geldiffusjons-tester for antigen-antistoff-reaksjoner •
■ med spesifikke skarpe enkelt-reaksjonslinjer-dannet med deres spesifikke antigen.
Nærvær av spesifikke antistoffer i serum 'kan - også testes ved standard-kvanti t.atlv-presipitlntés ten for aritigen-antistoff-reaksjoner. Gode kvantitative presipitin-kurver oppnås og mikrogrammene for spesifikt antistoff
kan beregnes fra disse.
Ytterligere bevis for tilstedeværelse av spesifikke, antistoffer i. serum kan fås.ved absorpsjon av det spesifikke antistoff anti-Astrocytin på bromacetyl-cellulpse-Astrocytin (BAC-Astrocytin) fremstilt som beskrevet ovenfor. Det antiserum-inneholdende spesifikke anti-Astrocytin kan-omsettes med■BAC-Astrocytin. Når serumet båre føres over BAC-Astrocytin, bindes de" spesifikke antistoffer mot.Astrocytin til deres spesifikke antigen Astrocytin. Siden Astrocytin- bindes koyalent til bromacetylcellulose, bindes det spesifikke antistoff, anti-Astrocytin, nå til BAC-Astrocytin under dannelse av BAG-Astrocytin-Anti-Astrocytin (BACA-Anti-Astro.cytin)'. Dette bevises ved testing av resten av serumet som er vasket fritt for BAC-Astrocytin. Ved standard-Ouchterlony-diffusjon er det nå ingen antistdffer tilbake i serumet som vil reagere med Astrocytin. Det kon-kluderes derfor med at: alle.spesifikke- antistoffer (Anti-Astrocytin) som tidligere er påvist å være tilstede i. serumet, er blitt absorbert til BAC-Astrocytin. Dessuten, når anti-, Astrocytin løses fra sin binding til BAC-Astrocytin,'isoleres det derved fritt for alle forurensende antistoffer. Denne fraspaltnfng av anti-Astrocytin kan utføres ved at BAC-:'ahti-Ast.rocyti,n-komplekset vaskes med 0,25 M eddiksyre (4°C,,. 2 timer) som..ovenfor er' vist ikke å. bryte BAC-Astrocytln-bindingen....
Enda et bevis for tilstedeværelsen .av spesifikke anti-.stoffer i serum'kan fås ved adsorpsjon av det. spesifikke antistoff anti-Malignin på bromacetylcellulose-Malignin (BAC-Malignin.)- fremstilt som ovenfor. Det antiserum-l.nnehol-dendé spesifikke anti-Malignin kan få reagere med BAC-Malignin.
Når serumet føres over BAC-Malignin, bindes, bare de .spesifikke antistoffer mot Malignin til. sitt spesifikke antigen Malignin.. Siden Malignin bindes kovalent til bromacetylcellulose, bindes det spesifikke antistoff, anti-Malignin, nå. til BAC-Malignin under dannelse av ,BAC-Malignln-ant.i-Malignin (BACM-Anti-Malignin).. Dette påvises "ved .testing
av resten av serumet som er vasket fritt for BAC-Malignin. Ved st.andard-Ouchterlony-dif f us jon er .det nå ingen antistoffer, tilbake i .serum som vil reagere med Malignin. Det '. trekkes derfor den konklusjon at alle spesifikke, antistoffer (anti-Malignin) som tidligere er påvist å være tilstede i
serumet, er blitt absorbert til BAC-Malignin. Dessuten,
når anti-Malignin løses fra sin binding til BAC-Malignin, isoleres det" derved fritt for alle forurensende antistoffer.
Denne frigjøring av anti-Malignin kan' utføres ved at BACM-Anti-' Malignin-komplekset,vaskes med 0,25.M eddiksyre (4°C, 2 timer), Som er vist ovenfor'ikke'å bryte BAC-Malignin-bindingen.
Antistoffene mot TARGET påvises ■ klart på standard-Ou.chter- ■ lony-geldiffusjonstester for antigen-antistoff-reaksjoner
med spesifikke enkelt-reaksjonslinjer. dannet med TARGET som viser en linje i likhet med reaksjonslinjen med anti-Astro-cytih eller anti-Malignin-antisera . (d.v.s. det som dannes ved injeksjon av selve stoffene Astrocytin eller Malignin). Det er observert at en del -kaniner har nivåer av anti-TARGET
■i blodet.før. de injiseres med TARGET. Disse anti-TARGET- . substanser gir, når de får reagere spesifikt med TARGET-reagens som beskrevet under ved .tester av humane sera, dannelse av omtrent ekvivalente mengder av de to ■ typer TAG, S-TAG
og F-TAG (se senere Eksempler-) .
'. EKSEMPEL 10 Påvisning av maligne tumores ved kvantitativ dannelse' iri vitro- av TARGET-Tilhef tende ■ Globuliner (TARGET-Attaphing-Globulins (TAG)) fra biologiske væsker.
' TARGET-reagens fremstilt i henhold til Eksempel 8 vas-
kes for -fjerning av et hvert ubundet Rekognin som kan være: ■ ' tilstede-på grunn av forringelse. Den følgende fremgangsmåte- er tilfredsstillende.- TARGET-reagens ' omrøres med- eddiksyre i to timer ved 37°C, sentrifugeres, supernatanten. dekanteres og supernatantens optiske- densitet avleses ved 26 6yUin. Hvis det er noen . absorbans,. gjentas denne vasking inntil intet ytterligere materiale, oppløses . TARGET resuspenderes -..
■deretter i. fosfatbufret saltvann med pil 7,2. (Standard S-TAG og F-TAG renset ved tidligere reaksjoner i humant serum ved fremgangsmåten beskrévet.nedenfor kan anvendes,: hvis de er tilgjengelige, som refer.anSe-standarder for testing av
TARGET-reagenset, og dette gjelder-også kanin-full-serum som er bestemt å inneholde S-TAG og F-TAG ved.andre TARGET-f rems ti11inger) . Sakte-bindings(S-TAG)-bestemmelsen utføres som følger: .. Frosset serum lagret i mer■enn ét par dager bør ikke anvendes.'
. Serum fremstilles omsorgsfullt av nytt fullblod eller annen kroppsvæske ved de standard-fremgangsmåter som brukes innenfor denne vitenskap. Den følgende- fremgangsmåte ér funnet å være tilfredsstillende. Blod får koagulere -ved henstand 12 timer ved romtemperatur i 'et gl.ass-testrør.. Klumpene atskilles fra veggene med. en glass-rørestav,. og blodet får stå ved 4°C i minimum 2.-timer (eller over natten) . Klumpene atskilles fra serumet ved sentrifugering ved 20.000 rpm ved 4°C i 45 minutter. Serumet dekanteres over i et.sentrifugerør og sentri--fugéres'. igjen ved 200 0. rpm ved 4°C i 45 minutter . Serumet dekanteres, og e.n 1'%'oppløsning av. Methiolat (1 g i 95 ml, vann. og ,5- ml 0, 2 M bikarbonatbuf f er pH 10) tilsettes i en mengde på 1% av serumets volum. Serumprøver fremstilt ved den ovennevnte eller .en annen fremgangsmåte, 0,2 ml for hver, tilsettes til hver av .0,20 ml .porsjoner .av TARGÉT-reagenssuspensjon inneholdende 100-200yUg' Rekognin pr. 0,2 0 ml. TARGET-reagens, f or ■ dobbeltprøver.
Suspensjonen blandes- ved 4°C-på en slik måte at pellet-dan-neise hindres. Et liten ' gummideksel-hur.tigris ter kan
■for eksempel anvendes- i 1-2 sekunder, og deretter kan d.e ristes i en Thomas-rister i 2 timer eller mer med røret litt. på skrå. -TARGET-reagenset og proteinet som er bundet til det,
atskilles fra -serumet. En av fremgangsmåtene som er funnet .
-å være tilfredsstillende er den følgende.- -Rørene sentrifugeres ved -2000 rpm i 20 minutter ved 4°C,. supernatanten dekanteres., pelleten som er dannet ved sentrifugering,. vaskes 3. ganger ved blanding om igjen og risting ved romtemperatur .med 0,2-0,3ml 0,15.M saltvann og sentrifugeres, og super-'natantene kastes.
Proteinet som forblir.tilheftet til TARGET, spaltes
fra dette og bestemmes kvantitativt. For .eksempel tilsettes 0,2 ml 0,25 M eddiksyre, suspensjonen ristes i 1-2 sekunder med en gummi.deksel-rister og deretter i en Thomas-rister
■i 2 timer i én 37°C inkubator. Rørene.sentrifugeres ved 2000 rpm ved '4°C i 30 minutter. Supernatanten dekanteres
forsiktig for forhindring av overføring, av partikler, og supernatantens optiske densitet avleses ved 280yum. Verdien av den optiske densitet deles med en faktor på 1,46 for å få resultatene i mikrogram serumprotein (S-TAG) pr. ml. - To parallelle bestemmelser bør ikke variere med mer enn- 5%.
- En.hvilken som helst- annen fremgangsmåte som er-effektiv
for bestemmelse åy proteininnhold kan anvendes,.såsom Folin-, Lowry-bestemmelse, men standarder må fastsettes for bestemmelse" av området for kontroll- og tumbrverdier for S-TAG~og F-TAG-konsentras jon.
■Hurtig-bindings (F-TÅG)-bestemmelsen'utføres som følger:' Frosset serum lagret i mer enn et par dager bør ikke anvendes.
Serum fremstilles med forsiktighet -av ferskt fullblod eller annen kroppsvæske ved standard-freargangsmåter innenfor denne vitenskap.'Fremgangsmåten beskrevet ovenfor i dette Eksempel for serum-fremstilling er tilfredsstillende.
Serumprøver fremstilt ved den ovennevnte eller annen fremgangsmåte får'stå ved 4°C i .10 minutter mindre enn den totale tid i hvilken S-TAG-serumpr'øvene fikk være i kontakt med ovennevnte TARGET-reagens (for eksempel i 1 time'og 5 0 .minutter'hvis en "to-timers" S-TAG-bestemmelse ble -utført. Denne fremgangsmåte tilsvarer temperatur-forløpene ved S-TAG- og F-TAG-bestemmelser.
Tilsett 0,2 ml: prøver av det temperatu.r-ekvilibrerte serum til hver. av 0,20 ml porsjoner av TARGET-reagens-suspen sjon inneholdende 100-200^'jg Rekognin pr.. 0,20 ml TARGET-reagens., for dobbeltprøver. Suspensjonen blandes så ved •4°C i ca. 10 minutter på en slik måte at pellet-dannelse hindres. For . eksempel kan det anvendes en liten gummi- . deksel-hurtigrister i 1-2 sekunder, og deretter, kan de, med rørene litt på skrå, ristes i en Thomas-rister i. ca. •10 minutter. TARGET-reagénset og proteinet som eir. bundet til det, atskilles.fra serumet. En av fremgangsmåtene som er funnet å være tilfredsstillende, er den følgende: Rørene, sentrifugeres ved .2000 rpm- 1 20 minutter, ved. 4°C, supernatanten dekanteres, pelleteri som er dannet ved sentrifugering, vaskes 3 ganger ved blanding bm igjen og risting ved. romtemperatur med 0,2. - 0,3 ml 0,15 M saltvann og sentri---fugering, og supernatantene kastes.
Det protein som forblir tilheftet til TARGET, spaltes fra dette og bestemmes kvantitativt. Fremgangsmåten beskrevet ovenfor i dette Eksempel for bestemmelse av S-TAG-konsentrasjon, er tilfredsstillende. En hvilken som helst annen, fremgangsmåte som er effektiv ved bestemmelse av protein- . innhold, kan anvendes, såsom Folin-Lowry-béstemmelse, men. standarder må fastsettes, for bestemmelse, av. området for kontroll- og tumor-verdiér for S-TAG- minus F-TAG-konsehtra-s jon.
De endelige resultater angis som mikrogram- TAG pr. ml serum, og er-lik S-TAG minus F-TAG. ■TAG-verdier hos ikk'e-h jernetumor-pasienter og andre kontroller er stadig f ra null (eller et negativt tall)- til 140 mikrogram,pr. ml serum.. TAG-verdier hos de første pasienter som er undersøkt, hjernetumor-pasienter, vår fra'141 til 500yug pr. ml .serum. Ved den første,"blinde" undersøkelse av 50 blodprøver som ble utført i henhold, til fremgangsmåtene ifølge dette. Eksempel, under anvendelse av TARGET-reagens fremstilt.av Astrocytin og brdmacetylcellulose, ble 11 av 11 hjernetumor-tilfeller og 28 av 32 normale riktig identifisert. En av de 4 antatte
normåle (d.v.s. kontroller uten hjernetumor) viste seg å ha kreft i skjoldbruskkjertelen som tydeligvis var blitt behandlet med hell noen'år tidligere. De tre siste normal-tllfeller var individer i alderen 60-70 år som hadde dårlig helse, idet de muligens.hadde kreft som ikke var diagnostisert. Av de
gjenværende 7. prøver ble tre- av tre. tilfeller av Hodgkins sykdom riktig identifisert;, én prøve i tumorområdet (141-500yug TAG/ml) svarte til pasienter med henholdsvis en intrakranial-masse-diagnose som var usikker, men som var.
en ikke-tumor-diagnose, og osteosarkom (ikke-hjernetuirior) og et.melanom-sarkom (ikke-hjernetumor).
■Påfølgende blinde undersøkelser utført i henhold til fremgangsmåtene ifølge dette Eksempel under anvendelse.av. TARGET-reagens fremstilt avMalignin og bromacetylcellulose, identifiserte korrekt tre av tre maligne hjernetumor.es og alle normale, når de ble fortsatt som detaljert béskrevet i Eksempel 10A som følger.
EKSEMPEL 10A
Bestemmelse av. anti-Malignin-ahtis tof f hos 1.0.26 kreftpasienter og kontroller: En syyårs blind undersøkelse ved ni sykehus.
Antistoffet mot malignin, et kreftcelle-polypeptid på .10.000 Dalton av kjent sammensetning, ble kvantitativt bestemt blindt, ved spesifikk immunadsorpsjon i 1.094. serum-prøveeksemplarer.fra 1.026 kreftpasienter og kontroller.. Konsentrasjonen av anti-malignin-antistoff, kjent, for å'
være cytotoksisk overfor kreftceller in vitro, var forhøyet i. 9 2,7% av sera fra pasienter med klinisk og patologisk aktiv kreft (middel 273,7 - 156,S^ug/ml) sammenlignet med'. friske normale individer (middel ■ 59,1 i 2 7,O^ug/ml) -i et bredt område av malignitetstyper, til støtte for den hypo-tese at malignin er et generelt transf ormas jon.s-antigen. .Antistoffet var i normalområdet (0-134^ug/ml) i 100% av seraene hos friske normale individer (første.kontrollgruppe), i 94,6% av. seraene fra utenfor-sykehus-ikkekreftpasient- . kontroller (middel 64,3 46', 3^ug/ml) . (annen kontrollgruppe) og'91,2% av seraene fra innenfor-sykehus-ikkekreft-pasienter med medisinsk/kirurgisk sykdom (middel 81, 2. ± .6 7 , 3^ug/ml)
(tredje kontrollgruppe). At bare én aktiv krefttilstand viser seg- å. ha ■ forbindelse med forhøyede antistoff nivåer, underbygges av det funn åt antistoffet var i det normale område i 9 4,2% av sera'fra kreftpasienter som hadde vært behandlet med hell<p>g som klinisk-patologisk "ikke viste noe tegn
til sykdom" ved tiden for bestemmelsen (fjerde kontrollgruppe) (middel 70,1 t 36., 7yug/ml) . Ingen av de fire kon-' trollgrupper var statistisk signifikant forskjellig fra noen- annen, men hver kontrollgruppe var forskjellig fra gruppen med aktiv kreft ved ' et. nivå. på P< 0,000001. Av de • 109 kreftpasienter som hadde antistoffnivåer under 135yug/ml„ .-.var 90 (83, 3%.) døde innen ett år (middel 4,4 3,5 måneder) . •Av.de' 76 pasienter med aktiv kreft som kunne følges og som ennå levde ut over ett år. og opp til- 46 måneder (middel, 22,0 - "8 måneder) etter antistoff-béstemmelsen, hadde 68
(89,5%) hatt antistof f nivåer over 135yUg/ml. Forbindelsen mellom konsentrasjonen av anti-malignin-antistoff og overlevelse antydet ved disse data såvel som.en del diagnostiske og - terapeutiske implikasjoner, er observert.
Et generelt trahsformasjons-antigen er ett som er
felles ved prosessen for malign transformasjon, heller enn for den spesielle celletype som•er innblandet. Det generelle antigen'er derfor forskjellig fra cellespesifikke tumor-markører som er beslektet med produktene i den spesielle celletype som transformeres, som i tilfellet med
insulin- eller, tyroid-hormonoverskudd dannet av henholds-
vis bukspyttkjertel- -eller s-kjoldbruskkjertel-neoplåsmer (7) ... Malignin, et . polypeptid på 10.000 Dal ton fra maligne glia-celler, med et høyt innhold glutaminsyre og asparagi.nsyre og et høyt forhold av disse to aminosyrer i forhold til histidin,.publisert i, 1975 (1-3) og dets nært strukturelt beslektede stoffer astrocytin, rekognin 1/ (lymfom) og rekognin M (bryst-karsinom) ..(2,4) er medlemmer av det som
viser seg å.være den første kjemisk og immunologisk defi-nerte familie av generelle transformasjons—antigener.
Disse antigener, eller anti-malignin-antistoffer. som reagerer med hverandre, er blitt bestemt i cellene: og seraene fra pasienter med forskjellige neoplasmer, i påførte maligne transformasjoner hos dyr og i cellene og supernatantene .fra maligne celler dyrket i vevskultur (5-7,12). Andre transformasjons-antigener, ikke fullt ' så.generelle, men med bred representasjon, identifiseres nå i andre laboratorier ved. eksperimentelle celletransformasjoner bevirket av kjemikalie- og virusmidler (8,9) .
I løpet av de siste , syv'år har vi undersøkt mulig-, forbindelse'mellom malignin samt anti-malignin-antistoff, og humane.krefttilstander. Tidligere tumor-forbundne antigener
undersøkt hos. mennesker, såsom de karsino-embryonale antigener (10) har. vist forskjellig påvisbarhet i forskjellige'
krefttyper o.g liten overensstemmelse-med kliniske diagnoser. Kanskje på grunn av det faktum at ingen har hatt et konstant kjemisk definert preparat eller fremstillingsmåte, har .
de i .skiftende grad. frigitte antigenblandinger, snarere enn et-potensielt mer konstant nivå av spesifikt antistoff,
måttet måles i serum... Malignin dannes i bestandig vevskul--tur av maligne celler, er av kjent og reproduserbar sammensetning, og dets antistoff har vist. seg å være tilstede i, og.
er isolert'fra, serumet- hos pasienter med kreft' (6,7). Antistoff- og antigen-undersøkelsene som beskrives i det., foreliggende,'underbygger den tilsynelatende allesteds nærværende distribusjon av det maligne antigen eller dets
-strukturelt meget nært beslektede stoffer ved aktiv kreft
i alle typer som er undersøkt.
METODER.
Pasienter og kontroller
a) Serum- anti- malignin- antistoff- undersøkelser
Kref tpasienter ble utvalgt av de- kliniske undersøkere
ved hvert av de ni sykehus fra forskjellige krefttyper
ved den omtrentlige hyppighet av deres forekomst i befolkningen - eller på grunnlag av undersøkerens spesielle inte-resse (se Tabell'1). Ubehandlede såvel som behandlede tilfeller ble mottatt. Av de resulterende 50.0 kreftsera som ble undersøkt, var 24 7 (49,4%) fra pasienter som hadde klinisk. og patologisk definert kreft'som var behandlet med hell opp til 15 år tidligere og -som ikke hadde noe klinisk -eller patologisk tegn på sykdom ved den,tid antistoffet ble bestemt
(fjerde kontrollgruppe nedenfor). Av gruppen med.aktiv kreft kunne 76 -pasienter, som fortsatt levde ut over ett år. og opp til 46 måneder, . følges .' Fire kontrollgrupper ble undersøkt :
(1) 59 friske normale (60 sera); , (2') '56 utenfor-sykéhus-pasienter med noen symptomer men uten bestemt klinisk diagnose (56 sera);. (3) 258 innenf or.-sykehus-paslenter med bestemte medisinske-kirurgiske diagnoser ..(261 sera); og (4) de 86 kreftpasienter referert til ovenfor som. ikke hadde noe tegn til '. sykdom ved tiden for bestemmelsen.. De medisinske-kirurgiske diagnoser i den . tredje kontrollgruppe innbefattet bakterie- infeksjoner (26 sera), virusinfeksjoner (28. sera), skader. (8 sera), kardiovaskulære sykdommer (30 sera), gastrointesti-'naie, og hematopoietiske sykdommer (39 sera), thorakalé sykdommer (6 sera), obstétriske og.. gynekologiske sykdommer (7 sera) , sykdommer i genitalia (11 sera) , endokrine, meta-. bblske og artrittiske sykdommer (22 sera), neurologiske sykdommer- (62 sera), psykiatriske sykdommer" (6 sera) og hud-sykdommer (1.6 sera) . I tillegg til de ovennevnte til-feldig samlede' sera er selektive blinde undersøkelser ..på-begynt, men ikke fullført, for flere spesifikke grupper: • ,45 pasienter med multippel sklerose (49 sera) og 57 med beni<g>ne tumores (7.4 sera) såvel som for 31 prøver av blod fra slektninger av kreftpasienter ("beslektede") (31 sera), for mennesker som er.i kontakt med kreftpasienter, d:v.s. 54 ikke-blod-beslektede og s.ykehus-ansatte ("kon-, takter") (63 sera). 84% av seraene kom fra Medical College of- Ohio ved Toledo.. b) Immunkjemiske metoder
Anti-malignin-se.rumantis tof f ble kvantitativt bestemt
■ved en immunabsorpsjons-metode tidligere beskrevet ved hvilken ..serumantistdf f et adsorberes spesifikt på ubevegelig-gjort malignin ("Target"-reagens) ved en 2-timers (sakte)
og en 10-minutters- (hurtig) reaksjon, deretter frigjort
. til. løselig form og avlest for optisk densitet ved 280^urn
som^,ug antistof f-pro.tein (11). ' Verdiene . f of anti-malignin-antistof f angis som netto-Target-tilheftende globuliner.
("Nettp-TAG") beregnet: 2-timers immonadsorps jon. Sakte (S) -TAG minus. 10-minutts immunads.orps jon Hurtig (Fast (F)-TAG) .
Alle verdier gitt representerer Netto-TAG dersom, ikke annet er angitt. Netto-TAG gjenspeiler ikke hensiktsmessig antistoff-forhøyelsen når'F-TAG' er tydelig forhøyet til
mellom 270 . og. 1100 '^ug/ml. I disse tilfeller,, som sjeldent 'ble sett hos de fire kontrollgrupper (2 av 464 sera, 0,4%),
men. i 58 åv 247 sera fra pasienter med aktiv kref t (-23 , 5%) ,
er S-TAG-vérdiene også forhøyet til over 400 og så mye som . 12,00yug/ml.. På de .medfølgende figurer er bare S-TAG angitt som . åpne•sirkler, for å skille disse tilfeller med ekstra-ordinær økning av begge former for antistoff, heller enn -å legge.sammen verdiene for de to former. Disse tilfeller er-blitt undersøkt statistisk på to måter, separat, og. som. en del av den klinisk bestemte gruppe med aktiv kreft..Antistoff-bestemmelsene. ble utført blindt på kodéde prøveeksemp-larer ■ av sera av laboratoriépersonale■som var ved et annet senter enn- der hvor prøveeksemplarene ble samlet..
c) Sammenheng mellom kliniske og laboratorie- data Sammenligninger ble'gjort for hver pasient etter full-føring og■notering av både kliniske og laboratorie-data separat.. Feilen ved disse.sammenligninger i .terminal-tilf el-lene.er rimeligvis meget liten siden de innbefatter patologisk bekreftet kreft og to pålitelige datoer:, dato for 'antistoff-bestemmelse og dødsdatoen. For hver av 206 av de
. 247 tilfeller med aktiv kreft var det, i tillegg til at navnene ikke var anført., i registeret f or - tumor-dødsf all, mulig.å' få bekreftet, ved å kontakte hver pasient eller'deres lege, at. pasienten fremdeles levde etter ett år. Ved 41 av disse tilfeller vår det enten ikke mulig å få bekreftelse ved kontakt eller det var bare mulig til den tiende måned. Si.dehdé fleste av disse 41 tilfeller var. fra de første to
år av undersøkelsen, da klinisk-termina.l-pasienter
aktivt var utelukket frå undersøkelsen, er det ikke sanh-synlig at dette representerer noén betydelig feil.- Antallet i gruppen med aktiv kreft ville I.høyden reduseres og antallet i terminal-gruppen økes, hver med 41, men ingen av disse ville i. noen betydelig, grad påvirke de konklusjoner man kom til, bortsett fra middelverdien for antistoffet i.
., . terminalgruppen. som ville være øket. Ved den. statistiske sammenligning, av gruppene ble verdier på P <0,01 ansett- for å være'statistisk signifikante. Den eneste sammenligning av
■ dem. som ble funnet- å være ikke-signifikante under disse kri-terier, som nærmet seg men ikke" fullstendig rakk opp. til 0,05-nivået, var mellom de første to kontrollgrupper. (Figur 1).
RESULTATER
'Fig. 1 på de medfølgende tegninger viser konsentra-'sjonen av .anti-malignin-antistoff i ^ug/nal serum i individuelle sera,, i de fire kontrollgrupper og gruppen for aktiv... kreft; det. vil si: (1) friske normale, (2) kreftpasienter som ikke hadde noe tegn på sykdom etter vellykket behandling, (.3) utenfor-sykehus-pasienter (ikke-kreft) med medisinske-kirurgiske symptomer men uten bestemte sykdommer, (4)' innenfor-sykehus-pasienter . (ikke-kreft) med, bestemte
medisinske-kirurgiske sykdommer, og (5) pasienter med aktiv kreft som levde ett. år eller lenger.. Mens de fire kontrollgrupper . ikke var forskjellige fra hverandre ved et statis-.tisk signifikant nivå, var hver av dem.forskjellige fra gruppen" med aktiv kreft ved det signifikante nivå på
P < 0,000001.
Fig. 2A på tegningene viser konsentrasjonen av anti-malignin-antistoff i individuelle sera fra pasienter med tefminal-kreft, det vil si de som' døde innen ett-år, (mid-, del 4,4 ± 3 , 5 " måneder) . Konsentrasjonen . av antistof f. i.-denne gruppen . er- statistisk forsk jellig fra gruppen med aktiv .. kreft ved et nivå på P < 0,000001. Sammen med dataene vist på Fig. 1 vil det ses at 90-av 108 kreftpasienter . (83,3%) som hadde antistoffnivåer under 135/ug/ml døde innen ett år.. I motsetning hadde 68 (89,5%) av de. 76 pasienter med aktiv kreft som., overlevde i lengre tid og som kunne - følges ' 13 til-. 46 måneder (middel 22,3 - 8) etter antistoff-bestemmelsen, hatt forhøyede antistoffnivåer.'.'Fig. 2B
av tegningene viser syv eksempler på reduksjonen før død som ble observert i anti-malignin-serumantistoffnivå hos indi-■ viduelle pasienter når'de ble bestemt, i serier...
Tabell 1 viser de kreftpasienttyper som er undersøkt,,
og- fordelingen av prøver mellom aktiv "sykdom, terminal-
sykdom bg intet tegn til .sykdom:for hver krefttype. Fordelingen av krefttypen er meget typisk med unntak av et over-skytende antall av.hjernekréft-tilfeller som var det begynnende, intéressefokus for undersøkelsen.
I den begynnende blind-undersøkelse av hver av de ikke-tilfeldige for-utvalgté'grupper var antistoffnivået forhøyet i seraene hos 2.0,4% av pasienter med multippel sklerose, 31,1% av .pasienter med benigne tumores, 30,2% "kontakter"-, for pasienter med aktiv kreft'og 38,7% av blod-beslektede til pasienter, med aktiv kreft.
EKSEMPEL 10 A;
Tekst til Fig:. 1: Konsentrasjon av anti-mali<g>nin-antistof f EKSEMPEL 10A i fire kontrollgrupper og i.pasienter med
aktiv kreft..
Massive sirkler, Netto-TAG; åpne sirkler, S-TAG (F-TAG-overskudd). Se Metoder
for. detaljer.
■ Tekst til Fig. ■, 2: Forhold mellom anti-malignin-antisto.f f-nivå
.. EKSEMPEL i OA ' og terminal-klinisk tilstand.'
Massive sirkler, Netto-TAG; åpne sirkler,
S-TAG (F-TAG-cverskudd) . Se Metoder for detal jer.
A. Enkelt-blind-bestemmelse for individuelle pasienter..
B.,- Langsgående blind-bestemmelse for syv individuelle kre.ftpasienter (1 til 7) hvis død (D) inntraff 1 til 4.måneder fra datoen da den sis te prøve ble bestemt.
DRØFTING
Dataene'oppnådd ved denne blind -undersøkelse er i overensstemmelse. med■det tidligere bevismateriale for at malignin er et generelt transfprmasjonsantigen. Anti-malignin-antistoff var således signifikant forhøyet over normale nivåer, heller, enn å være begrenset. til spesielle- celletyper, , og- malignin ble anskueliggjort i celler hos.pasienter med mange forskjellige "former; for aktiv kreft (Tabell 1 og Metoder b>. At antistoffet var i det normale område for 94,2% av pasienter.som hadde, vært vellykket behandlet og,ikke viste noe tegn til sykdom ved. tidspunktet for antistoff-bestemmelsen, angir at en tilstand med aktiv kreft trenges for opprettholdelse
av forhøyede antistoff-nivåer. Ved atskillelse av friske normale, tilfeller' fra pasienter med aktiv kreft ved bestemmelse .av anti-malignin-antistoff hadde alle friske normale verdier under .135 (middel 59,1 ± -27) mikrogram pr. ml og
■det var ingen "falske positive", mens 92,7% i gruppen med aktiv kreft. viste forhøyede verdier av antistoff, (middel 2 73, 7 - 156'., 5^ug/ml) . Den friske normale gruppePg.gruppen. med aktiv kreft avvek ved et nivå på P < 0,000001. for hele gruppen med aktiv kreft, såvel som for hver av de to under-grupper vist på'Fig. 1.
Når medisinsk syke individer tas med i sammenligningen (Fig.' 1), '.ses. middel.nivåene av antistof f-konsentras jon å forandres litt., men ikke signifikant, oppover. Av utenfor-sykehus-ikke-kreft gruppen var 9 4,6% fortsatt i det normale område, og 5,4% var i det forhøyede område. For innenfor-sykehus-pasient-gruppen, med mer tydelig .syke pasienter med positiv medisink-kirurgisk diagnose, (men. tydelig-
vis ikke kreft) var 9.1,2% . fremdeles i det normale område, og: 8,8% var i det forhøyede område. Disse to kontrollgruppér var ikke'statistisk signifikant forskjellige fra de friske normale kontrollgrupper, men avvek hver fra gruppen med aktiv kreft ved et nivå på P < 0,000001.. Det kunne ventes.,-. sammenlignet med .friske normaler, at forekomsten av kreft ville være større'hos medisinsk syke pasienter og åt noen
formasjon-, et .genetisk bestemt høyt nivå av. antistoffproduk-' s jon for. immunoverlevelse, eller det samme fenomen .'som det som. er observert for "kontakt"-gruppen, ér ukjent. Siden "beslektede" ér statistisk-forskjellige fra.deri "friske normale" kontrollgruppe ved et nivå på P < 0 , 000001,'må noen .forklaringer søkes, og det er helt opplagt at meget større grupper må undersøkes. '• Benyttelsen av malignin-antigenet og antistoffet for generell screening, av befolkningen, med hensyn til kreft ån-tydes ved de låve "falske positive" antall vist på Fig. 1 i kontrollgruppene med friske normale og utenforsykehus-•pasienter.. Resultatene av de foreliggende undersøkelser angir også, innenfor avgrensningene for alle.laboratorie-. fremgangsmåter,.at både bestemmelsen av malignin i celler og av dets antistoff i serum kan være nyttig som hjelpemiddel for.oppdagelsen av 'tilstedeværelsen av maligne til stander i individer hvor man har mistanke om kreft. Dessuten . har den kliniske oppfølgning av individuelle pasienter over måneder og.år muliggjort sammenligningen mellom klinisk utfall og antistoffnivåer som ble bestemt på blindkodedé-serumprøver. De observerte sammenheng angir at nivået av anti-maligniir-antistoff kan ha sammenheng med overlevelse på- den måten at forhøyede verdier under aktiv sykdom var forbundet med lengre overlevelse, og lave nivåer under aktiv, sykdom med tidlig død. Etter :vellykket behandling kan imidlertid tilstedeværelsen av normale (lave) antistoff-nivåer være et. hjelpemiddel for bestemmelse av hvorvidt en tilstand med aktiv kreft er blitt erstattet av en tilstand i hvilken det "ikke er noe tegn på sykdom". Enda en gang kan laboratorieverdien bare ha aktualitet i sammenheng med den kliniske status, og det bør Vanligvis- ikke være vanskelig å: atskiile.de klinisk friske fra dem som -er klinisk-terminal-pasienter, idet begge disse har lave antistoff-nlvåer, men av forskjellige grunner. Signifikansen ved sammenhengen mellom.lavere nivåer av .anti-malignin-antistoff med terminal-sykdom vist på Fig."2A og 2B'er ikke kjent. Siden, som det vil ses av -Fig. 2B, antistoff-fallet kan oppstå plutselig, innen så.
kort som en måned før død, ,e,r det ikke kjent hvor mange av de forhøyede verdier, vist -på Fig.. 2A som.ble fulgt av et
lignende fall før død.. Fallet kan derfor være enda mer
■vanlig enn det som er observert i de enkelte bestemmelser. Fenomenet er i samsvar med tidligere påvisninger av andre
av den generelle reduksjon i immunkompetanse.som er observert å gi signaler om at døden nærmer seg i tilfellene av-kreft både hos mennesker og dyr (15), og kan ganske enkelt representere en sekundær konsekvens av terminal-tilstanden. Siden anti-malignin-antistoff imidlertid er spesifikt; for et kreftcélleantigen, er lokalisert fortrinnsvis i maligne
celler in vitro og in vivo og har vist seg å være cytotok-,sisk overfor maligne celler in vitro (7), kan fallet i. antistoff være mer sentralt i kreftprosessen og være til skade for pasienten. I tillegg viste tidligere data (6).
at antimalignin-antistof f i humane' kreftsera var "uskade-' liggjort", med dets Fc-del avspaltet fra' Fab-fragmentene, hvilket ville resultere i tap av cytotoksisitet. Denne prosess kan reflektere én form for kreftcellens forsvar mo.t antistoffet. De lave antistoffnivåer observert her før død. kan være tegn på en andre form av kreftcellens forsvar, resultatet av en økende blokkering av antistoff-dannelse eller frigjøring på grunn av antigenoverskudd etter hvert som tumoren.formerer seg.
At malignin ikke er. et "onko-føtalt" antigen under-støttes ved at malignin ikke er tilstede i fostervev.
'Malignin viser- seg å være meget eldre fylogenetisk enn
de tilstander som vanligvis anses for å' rekapituleres under fosterets utvikling; dets eneste strukturelt beslektede stoffer er, ifølge computer-undersøkelse (16) ferredoksi-néne fra planter, Lucaena glauca og alfalfa, acylbærer-proteinet i E. coli og cytokrom b5. Disse fire deler den egenskap at de er anaerobe enzymer,' idet ferredoksinene er de mest elektro-negative oksydasjons-reduksjons-e.nzymer i'naturen. Warburg obsefverte.de anaerobe fordeler ved maligne celler, men var ikke 1 stand til å gjøre rede for. denne egenskap ved aktiviteten av de.da kjente anaerobe enzymer.
(17).. Muligheten for at malignin' et et fraspaltet derivat fra'et slikt anaerobt enzymsystem, at dette system er
-. felles .for alle maligniteter. uansett celletype og at dette system gir kreftcellene en unik' anaerob fordel, ville være - i. overensstemmelse med den påviste økning i utbytte av malignin méd økende malignitet i cellevekst (1,2) , den allesteds nærværende, fordeling av antigenet, antistoffets cytotoksisitet .og antistoffsvikten i terminål-tilstanden.
Nå når renset humant antimalignin-antistoff er tilgjengelig (6,7) og monoklonale anti-malignin-antistoffer er tilgjengelige, kan de terapeutiske anvendelser ay antistoffet,, idet det fungerer alene eller som bærer- for antikreft-medikamente.r, ytterligere undersøkes systematisk.
Referanser for Eksempel lOA'
1.'-. Bogoch, S. Brain glycoproteins•and recognition function:• Recognins and cancer. Sider 555-556. I. Vol-k, B.W. og Schneck, L. (red'.)',. Cufrent Trends ln ' Sphingolipidoses and Allied Disorders Plenum Press, New York, 19 76..
: 2. Bogoch, S. Astrocytin and malignin; Two po ly pep tide
fragments (recognins) relatedto brain tumor.
Nat. Cancer Inst. Mon.'46: 133-137, 1977.
3. Bogoch, S. The detection of malignant gliomas in
.' brain by the guantitative production in vitro pf
TAG (target-attaching globulins), from human serum.
Sider 358-361. I. Bogoch, S..(red.) Biological Diagnosis of Brain. Disorders"... Spectrum-Wiléy Press.,
New York, 19 74.
4. ' Bogoch, S . og Bo<g>ochE ..S . Production of. tv/o récognins
related to malignin:'Recognin M from mammary MCF-7 carcinoma cells and recognin L from P^J lumphoma cells.
.. Neurochemical Res. 4: 465-472, 1979.
5. Bogoch, ^S. , Bogoch, E.S., Fager, C, Goldensohn, E.,
Harris, J.H.., Hickok, D. F .' Lov/den , J . Å . Lux, .VJ.E., Ransohoff, J. og Walker, M.D. Elevated anti-malignin antibody in the serum', of cancer patients; A mult!--hospital blind' study. Ne.urology . 29: 584 ,' 19.79 .
6.. Bogoch, S., og, Bogoch, E. S. Disarmed antimalignin antibody in human cancer. Lancet,- 1> 987 , 1979. 7.. • Bogoch, S.. og Bogoch, E.S. Tumor markers: Malignin : and related recognins associated with malignancy rather than with cell type. I Battistin, L., Hashim, "G., and Lajtha, A-., (red.) Neurochemistry and Clinical ■ Neurology, sider 407-424. Alan R..Liss, Inc., New York, 1980. 8. Rigby,. P. The .transforming genes of SV40 and po.ly oma viruses . Nature. 2 82 : 78.1-784 f 1979. 9. Langan, T. Malignant transformation .and protein, .phosphorylation. Nature '286: 329-330, 1980 . 10. Krupey,.- ,J. , Gold, P. og Freedman, S.O. Physico- . chemical studies of the.carcinoembryonic antigens 'of the human digestive system. 'J. Exptl-. Med.. 128: '387-398, 1968'. .11.. Bogoch, S. og Bogoch,"E.S... Quantitative determi-nation of anti-malignin antibody. I Rosenberg, ■ S.A. (red.) Serclogic Analysis of. Human Cancer Antigens,' sider 693-696. • Academic Press, Inc.,.
■ New York 19 80.
12. Harris, J. H. , Gbhara-, A., Redmond, F., Bogoch, S. og Bogach, E.S. Tmmunofluorescent and serologic studies with anti-malignin antibody. I Rosenberg,' S.A. (red.) Serologic Analysis.of Human Cancer Antigens, sider 571-582. Academic Press, Inc., Nev; York, 1980.
"13'. ■ Meek, R. A., Ingram,. M., Meek ,: J .J . , McCullough ,. J . L . ,
Wu, M-C, and.Yunis, A.A. Establishment and Cell Cycle Kinetics of 'a Human Squamous Cell Carcinom.a in Nude
.Mige arid in Vitro. Cancer Res..4: 10<7>6-1085 , 1981.
14. Lederartikkel, The Cancer Connection. Lancet 1: 635-636, 1977.
15. Hersh, E.,M., Gutterman, J.U.., Mavligit, ' G.M. ,
Mountain, C.W.,. McBride, C.M. Burgess, M.A., Lurie, P.M.-, Zelé-n,. M. , Takita, H. og Vincent, R.G'. Immuno-competehce,,Immunodeficiency and Prognosis in Cancer,.
Ann. New York Acad. Sei.-276: 386-406 , 1976. 16. Dayhoff, M.O. (red.) Atlas of Protein Sequence and Structuré.' National Biomedical Research Foundation, Silver Springs, Md., 19 72. 17. Warburg, 0., Gaweh, K., Geissler, A.W.', Schroder, W., Gewitz, H..S.. og Volker, W. Arch. Biochem. Biophys ..
78:. 573, 1958.,
EKSEMPEL li-
Diagnose av tumorceller ved immunfluoréscens>
Forbindelsene Anti-Astrocytin, Anti-Malignin og S-TAG har. vist seg .å heftes fortrinnsvis til tumorceller.. Denne spesifisitet tillater anvendelse av disse forbindelser for
diagnostisering av tumorceller i histologiske preparater ved korijugering av fargestoffer eller radioaktive substanser med Anti-Astrocytin/Anti-Malignin eller S-TAG.. Standard-merkriingsteknikker kan så anvendes. En fremgangsmåte for anvendelse av S-TAG er som følger. .■En fremgangsmåte som er funnet å være. tilfredsstillende, er-en modifisert St.Marie-fremgangsmåte. Humane hjernetumor-prøver, fryses og -5^,um tykke prepara ter utskjæres . ' Disse lagres i en'fuktig beholder ved minus. 70°C i '4-8 uker før fargning. .Konjugatet kan være et ståndard-antiserum,såsom geit-antikanin-konjugat.-. Konjugatet me-rkes ved teknikker kjent innenfor denne vitenskap'med fluoréscein eller annen merknings-substans.. Fluore-scein-merket geit-antikanin-konjugat kommersielt tilgjengelig kan anvendes. Den anvendte fluorescens-.teknikk var en standardteknikk ved.hvilken, en 1:200 - 1:400-' oppløsning av TAG inkuberes i 30 minutter eller mer på tumor-preparatet, 'fulgt, av vaskingen for fjerning av utilheftet TAG.' Tre- vaskninger med f osf atbuf re t saltvann er funnet tilfredsstillende . Konjugat-ihkubering med fluorescein-mer-
ket konjugat fulgt av vaskninger utføres deretter, fulgt av mikroskopisk undersøkelse. Normale celler og deres prosesser
blir ikke farget verken i tumor-preparater eller i kontroll-, preparater av normal ikke-tumor-hjerne. I gliatumorceller og deres prosesser viser det. seg skinnende fluorescens..
EKSEMPEL. 11A Påvisning av ikkefh jerne-., maligne celler med fluorescens-signaler .fra. TAG-,
Anvendelsene av TAG-produkter koplet med en signal-emitter såsom et fargestoff eller ét radioaktivt merkestoff for påvisning av kreftceller er for eksempel beskrevet på sider 12-18. og;i Eksempel 11 i det foreliggende. I dette Eksempel llA er påvisningen av ikke-hjerne-, maligne celler beskrevet. .Som'beskrevet i. Eksempel 10 under anvendelse av humant .serum ved bestemmelse av TAG ble antistoffet, etterat anti-malignin-antistoffet var bundet til det ubevegeliggjorte antigen og ikkebundne serumproteiner var.blitt .vasket bort, spaltet fra bindingein med 0,25 M eddiksyre ved- 37°C :i 2 timer og Targét-reagenset ble fraskilt'ved sentr.ifu-gering. TAG-antistoff-oppløsningen ble bestemt kvantita-' tivt ved hjelp av sin absorpsjon ved 280^um. TAG-oppløs-ningene ble. lagret ved - 20°C, deretter tint og blandet sammen, brakt til pH- 7 ved titrering med 6.N'NaOH, dialysert mot fosfatbufret saltvannsoppløsning med pH 7, filtrert ..og konsentrert på Mil.lipore. Pellicon 1000 '- membraner, sentrifugert for å få det fritt fra uløselig protein og immunglobulin-kompleksene, konsentrert og gjort fritt for immunologisk" ikke-aktive forbindelser ved kromatografering' på Celléx D og Blå Sepharose C16B (Pharmacia).' Dette, humane anti-malignin-antistoff reagerer med antl-humant gammaglobulin i Ouchterlony dobbeltdiffusjonssystem. Når' TAG anvendes med f luorescein konjugert med anti-hurnant gammaglobulin ved'standard-dbbbeltsj iktig■Coons . immunfluorescens, farger det maligne;gliaceller, brystkarsinom-celler,.ovariekarsinom-celler, adenokår.sinom-celler fra tykktarm og andre typer •kreftceller i postoperativ-- og biop.si-vevspreparater såvel som i humant spytt,' bronkial-utvaskninger, pleura-effus jons- " væske, mageaspirat og blæreurin. Konsentrasjonen-av protein i TAG som gir klar fluorescens når kontrollene er negative;
er l-10yug pr. preparat.
Fremstillingen av et "renset" TAG ble utført ved at
sera fra pasienter med mange forskjellige krefttyper fikk reagere med bromacetylcellulose - -Malignin ved metoder
.beskrevet tidligere (Eksempel 8).,Antistoffet som.ble bundet' ved denne reaksjon, ble frasp.altet med 0,25 M eddiksyre, bestemt kvantitivt ved måling ved -O.D.. 280 under anvendelse av en omregningsfaktor, på 1,46 for gammaglobulin frosset og lagret ved -20°C. Dette antistoff ble funnet å inneholde immunglobulin, bestemt ved anti-humant gamma-globulin-antiserum spesifikt'for. gammakjedef (BioRad Laboratories , ..'
Inc . ) og med anti.-Fab og anti-Fc-f ragmenter (Miles- Labora-. tories) .- Det reagerer ..også med kanin-anti-humant albumin'
(BioRad Laboratories).
Det ble funne hat bare l-10yug renset TAG-proteiri trenges for denne spesifikke fargning for alle preparater, méns 10-50^,ug TAG-protein trenges for utførelse- av spesifikk immunfluorescens-fargning av ce,lle'r som Inneholder
Malignin, og for noen få har det.vist seg å være tilstrek-kelig med mindre enn ett mikrogram.
-Det ble funnet at den mest aktive frémstilling av
renset TAG er den -som eluere.s med. - det elueringsmiddel som har høyest ionestyrke, 'd.v.s. fra 0,15iM til 1,5 M.
En hver fremstillingsmetode hvor dette anvendes, er egnet;
tre ' foretrukne' metoder er beskrevet nedenfor.
Metode I - Fraksjonering av TAG ved kromatografering med DEAE-céllulose ..(Cellex. D,. Bio Rad Laboratories) ble først utført ''■■■' under anvendelse a-v trinnvis eluering med økende ionestyrke
og synkende pH, og den samme rekkefølge av elueringsmidler som den som er beskrevet- i Eksempel 1' for fremstilling av . ubearbeidet Astrocytin-ForlØper-Inneholdende Fraksjon. God separasjon ble oppnådd for.hovedmengden av proteinet i. tre fraksjoner, Topp I oppnådd med Oppløsning 1- (se Eksempel 1) og , Topp II oppnådd med Oppløsning 6 ; og . Oppløsning 7.. Ouchterlony dbbbeltdiffusjons-tekhikk viste.at TAG i Topp. I fremdeles inneholdt vesentlige mengder protein med albumins bevegelighet, og mens Topp II Inneholdt størstedelen av albuminet, kunne vesentlige mengder IgG påvises. Re-kromato-
graf i av. Topp I. ga et i stigende grad rent IgG inntil-, etter den syvende kromatografi, praktisk talt intet albumin (mindre enn 3%) kunne påvises ved Ouchterlony geldiffusjon i hvilken 5-10^,ug humant albumin var påvisbart med kanin-anti-human-albumin...Det IgG man fikk på denne måte hadde .'tilbøyelighet til å denatureres og å tape immunologisk reaktivitet etter noen få dagers henstand ved'0-5'°C.
■ Metode . 11 - En andre fraksjonering av TAG ble utført ved kromatografi på Sepharose CL-6B (Pharmacia, Inc.), idet man startet med buf fer. med lav molaritet (0 , 0005 M fosfat)
og . fortsatte i to trinn med henholdsvis 0 ,-15 M<p>g 1,5-'M' for éluering .av resten av proteinet. S'om ved Cellex D
ble. én passasje funnet å være utilstrekkelig for separasjon,, og gjentagelse av prosessen forbedret/produktet langsomt. Igjen var den mest'aktive fraksjon overfor anti-malignin-antistof f, i 1,5 M-f raks jonen .'
Metode III -. Kromatografi med Sepharose ■CL-6B etter den. frittede glasskive og Cellex D som var lagt over Sepharoseri, viste seg å være den mest ■ tilfredsstillende metode.
Den grafiske fremstilling på Fig. 1 viser de fraksjoner' man fikk ved kromatografering'av TAG under anvendelse' av
Metode III.. Etter det'.føste eluat på 200 ml, ble sub-. fraksjoner på 50 ml eller mindre oppsamlet. Proteininnh.ol-det,i hvert eluat ble bestemt ved optisk densitet ved 280^um, og en fast faktor på 1,46 basert på gammaglobulin ble anvendt for omgjørelse til mikrogram for beregning av .utvin-ning. Den absolutte mengde protein fordrer korreksjon for
;de. fraksjoner hvor det er betydelige mengder albumin. De punkter ved hvilke det trinnvise løsningsmiddel ble forand-ret, er angitt ved piler.. Subtraksjonene, er betegnet med romerske tall.fra I' til og med Viti.
,Løsningsmidlene tilsvarende bokstaver A- F ved pilene, var som'■ følger-: A - 0,01 M TRIS (pH 7,2)
B - 0,05 M TRIS med 0,1 M NaCl (pH 7,2)
C - .PBS . (fosfatbufret saltvannsoppløsning) , 0,11 M NaCl
•D -PBS, 0,165 M NaCl (pli 7,2) (pH<7>,<2>) "É. -■ PBS, 0,33-M NaCl (pH 7,2)
F - 0,05 M Tris, 1,5 M NaCl (pH 7,2)
.1 den følgende Tabell er det -vist utvinningsmengden for hver fraksjon, en semi-kvantitativ bestemmelse av hver av gamma-globulinene og albumin for hver, såvel.som aktivi- ■teten av.hver fraksjon ved immunfluorescens-fargingen av . kreftceller (plusstegnet angir reaksjon., .0 ingen reaksjon og pluss/minus reaksjon i noen tilfeller).
Fotografier ble laget som viste reaksjonslinjen mellom anti-humant gammaglobulin .spesifikt - for"gammakjéder bg' hver av Fraksjonene I og VIII av de ovenstående.
Fotografier ble:tatt som viste anvendelse av TAG (Fraksjon VIII av de ovenstående) ..for' farging av ikke-hjerne-, maligne, celler, d.v.s. én fårgning av bronkogéne kårsinom-
celler i bronkialutvaskningene fra en pasient og en farg-
ning av lymfomceller i pleuravæsken fra en pasient. Ikke-kreft-celler fluorescerer.ikke. TAG (1-lO^ug i 0,1 ml fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS)) påføres overflaten av pakkede celler på et objektglass, inkuberes i 30 minut-
ter, vaskes tre ganger med PBS og påføres så 'et lag
■, fluorescein-konjugert anti-humant IgG .fortynnet .inntil ikke-malignt kontfollvev gir praktisk talt ingen, fluorescens. Cellene anskueliggjøres méd et fluorescens-mikroskop av typen Zeiss under_anvendelse av en wolframlampe og filtere BG 23 , BG. 12 og 500.
EKSEMPEL 12 Blind undersøkelse av TAG-spesifisitet i immunfluorescens
Det ble létt ettér ..tilstedeværelse av malignin i celler
.samlet fra kreftpasienter og kontroller. Prøveeksemplarer
ble samlet ved. punktur av lungesekken, gjennomstikking (pafa-centese)., bronkial- eller luf trørs-utvaskninger, spytt og hjertepose-effusjon, fra pasienter, med lunge-, bryst-," prostata-, tykktarms- og udifferensierte kreftformer såvel som fra.ikke-kreft-kontroller innbefattende pasienter, med
■emfysem, storrøkere og pasienter med epilepsi, og. spytt fra
en tidligere kreftpasient'som ikke hadde hatt noe tegn til sykdom på to år som er følge av vellykket behandling.. Cellene , ble konsentrert ved sentrifugefing.
"Den følgende Tabell viser sammenhengen mellom.tilstedeværelse eller, fravær av malignin i celler, bestemt blindt ved,immunflubrescens-fårgning med anti-malignin-antistoff (TAG)., og. den- klinisk-patologiske diagnose . TAG-fargnings-.resultatet var riktig for 20/22 prøver (91%) . ■ Undersø-kelser ved fargning med Standard Papanicolaou, utført blindt på to paralleller av disse prøveeksemplarer av andre, pato- .. loger, va'r korrekt før 17/22 prøveeksemplarer (77%) ...
I tillegg.til den positive fargnirtg med hensyn til malignin i celler fra bryst-, ovarie- og. bronkogene.karsino-mer og astrocytomer, har celler dyrket i vevskultur fra humane skjellcelle-karsihomer i , ytre-kvinnelige kjønns-organer og fra fem forskjellige typer.humane lymfomer- såvel som leuke.miceller fra blod med både akutt og kronisk leukemi, vist positiv fargning. Malignin ble anskueliggjort og fotografert.i mange forskjellige humane kreftceller ved anti-malignin-antistoff-dobbeltlag-immunfluorescens. Det annet, låg av ,f luoresceinmerket anti-a-nti.s tof f ble fortynnet i kontrollforsøk til så mye som 1:1.600 inntil ikke-spes.if ikk .. fluorescens var fullstendig eliminert i fravær av det første lag av anti-malignin-antistoff. Under disse betingelser var anti-malignin-antistoff aktivt ved ett nanogram antistof f protein pr. kreftcelle.ved produksjon av den spesifikke immunfluorescens som ble sett og fotografert 1: A - bronko-gene kårsinomceller, fra bronkial-utvaskninger; B - lymfo-cyttleukemi-celle, fra blod; C ovarie-karsinomceller, ved operasjon; D - skjellcellekarsindm (2' celler),,'dyrket i vevskultur; E - astrocytom, ånaplastisk,' ved operasjon. EKSEMPEL 13 Påvisning av kreftceller med radioisotopsignal fra TAG .1 dette Eksempel er-vist gjénnomførbarheten. av tilhéf-.' ti-ng a-v en radioaktiv merknings-subs.tans på TAG.'For det annet er injeksjonen i dyr av dette radiomerkede.TAG utført
.og har' vist seg å være sikkert og effektivt. For.det tredje
er det radiomerkede TAG, lokalisert fortrinnsvis i. kreft-vevet i sammenligning med normalt vev, hvilket angir at deh spesifisitet.som. tidligere- er påvist in vitro ved pre-ferering av kreftceller, tilkjennegitt ved anvendelse av spesifikke anti-Malignin-TAG-produkter, bekreftet in vivo.
9o-l
Merking av TAG med 99m Technetium ..( Tc) Fremgangsmåte for merking
1. To.preparater av TAG ble anvendt, her betegnet TAG-1
og TAG-2-. TAG-1' og. TAG-2 (konsentrasjon av hver-:
.0,4 mg/0,5 ml) ble tilsatt til separate sterile, lufttomme flasker. 2. I hver flaske ble det tilsatt 0,1 ml'tinnklorid-' oppløsning (10 mg/SnCl^.-2H;2p i 100 ml 0,01. N HC1) . Flaskene ble blandet i -3-4 minutter. 3..0,1 ml (6m'Ci) Te-pertechnetat (natriumsalt) ble tilsatt og blandet i 2-3. minutter. . Fremgangsmåte til bestemmelse av merknings- efféktlvitet 9 9m 9 9m • Prøver av. Tc-TAG-1.og Tc-TAG-2 ble testet med hensyn til merknlngs-effektivitet ved nedadgående :papifkromatogråfi under anvendelse av Watman-papir. nr. ,1 med -85% metanol som løsningsmiddel. En lignende under- ' - 9 9m • søkelse ble utført' med Nåtrium-Pertechnetat- ■ Tc som utgjorde en kontroll.... Etter .2 ;timer ble papirene tatt ut av kromatografi-.tanke-n og delt. i. to deler: (.1) 1 cm. ved begynnelsespunk- tet;- (2) resten av papiret opptil løsningsmiddel-fronten. Hver . del ble 'så tellet i en brønn-gammascintillas jonsteller og dens innhold av radioaktivitet■bestemt (cpm. = tellinger pr. minutt (courits pr. minute)'. .Ca. 50 lambda ble utplatet på hver papirstrimmel.
Fremgangsmåte for antigen- antistoff- reaks jon .
...En del av den merkede oppløsning ble også utplatet på en Ouchterlony gelplate for bestemmelse av dens evne til reaksjon méd malignin ved antigen-antistoff-reaksjohen. Etter'en 3-timers periode ble de resulterende skarpe reak- . sjonslinjer tatt ut fra gelen og deres, innhold av radioaktivitet ble målt. En like stor del av gelen som ikke var med i.reaksjonen, ble også.uttatt og' dens innhold av radioaktivitet ble også målt som bakgrunnv Resultater
Merknings- éffektivitet
Konklusjoner
De.følgende konklusjoner ble dradd angående, de benyttede k va lite ts-kon troll-tes tei:: 1.., 9 9mTc-pertechneta,t ble redusert ved tinhklorid til en mer reaktiv oksydasjons tilstand ( + 4 + 5) ... 2..Det reduserte, pertechnetat merket både TAG-1- og TAG-2-. preparatene... 9 9m 3.. ■ Tc-TAG-2 • ble testet med hensyn til dets-evne til. bibehol-delsé av sin aktivitet og ble, funnet å bibeholde sin evne .-.til å reagere immunologisk.. Anvendelsen av radio-merket TAG in vivo for påvisning av kreftceller Wistar-rotter ble injisert infracerebralt med C6-gliom-tumorceller. som .tidligere, hadde, vært i rotter og vevskultur. Rottene ble observert med hensyn til de første tegn på voksende, tumor., såsom slapphet, skjelving og ustøhet.. Disse symptomer viser seg første gang fra syv til ti dager fra injek- . sjon og resulterer, med hurtig voksende'tumores, i død innen tre til fire dager for mange dyr,'og én-uke i. alt. Så snart som symptomer viste seg, ble dyrene injisert med merket TAG intravenøst i nålevenen, deretter ble dyrene bedøvet ved forskjellige tidspunkt,, hjernen ble tatt ut,, tumoren ble dissekert fri for normal hjerne og radioaktivitetene i de dissekerte prøver ble sammenlignet med hverandre. ,
.Tumor-'og normal-h jerne-pr.øver ble tellet over natten
i gamma-brønntelleren. Alle prøver og standarder ble korri-gert for nedbrytning for .enkelhets skyld til middeltellin-
gen for den første prøve i rekken.
Konklusjon
Pref erensial-lokal.isas jonen . av .radioaktivitet- i tumor sammenlignet med.,normalt vev ér vist ovenfor.
EKSEMPEL 14 Fremstilling av monoklonale anti-malignin-antis toff er , MAMA-S., MAMA-F og MAMA-FS og deres respektive nye produksjonsceller .En myelom-cellelinje (P3x63-Ag-8) ble dyrket i Dulbecco<1>s Minimum Essential-medium supplert, med 10% føtalt bovint serum (D^q) i en fuktig inkubator ved 37°C og 5%.-CC>2.
Inavlede BALB/cJ hun-mus (-8 uker gamle) ' (Jackson Labora-tory. Bar Harbor, Maine) ble immunisert intraperltonealt 4 ganger med.ukentlige intervaller med 1 mg Malignin emul-gert i komplett Freunds adjuvans (Difcb) . Sera fra de immuniserte mus ble testet med hensyn til tilstedeværelse av åhti-maligniir-antistoff, og mus som var positive med hensyn-til- antistoff; ble ytterligere innsprøytet 4 dager før celle-sammensmeltning ...
Milt-immunceller (10 ) ble sammensmeltet med myelomcellen (.10 ) under, anvendelse av polyetylenglykol (PEG, 1000 , J.T.. ; Backer) som sammensméltnings-bevirkende middel' som beskrevet av Gal f re et al (Nature" 266, 550-552,, 1977).'Den, PEG-behandlede celleblanding ble fordelt i 96 brønner i en raikrotiter-plate (Costar 3596) i D.^^ supplert med hypoksantin, aminoptefin og tymidin (D^q HAT) (Littiefield, J.W., Science.145: 709, 1964)'. Omtrent , en halvdel av D1Q -HAT ble • erstattet to ganger ukentlig- i to-uker. Miltcellene overlevde ikke in, vitro, mens de tilførte myelomcellér ble drept i D^q HAT. Bare hybrid- -. .cellene forble aktivt voksende etter 10 dager under de selek tive betingelser. Etter to uker i D^q HAT ble hybridcellene i enda en uke tilført medium som. var det samme som D'^.q HAT, bortsett fra at aminopterin var utelatt (D-^q HT);så med D-^q-Hver gang brønnene'var dekket ca. 80% av hybridceller, ble supernatantene sugd av for ..anti-malignin-antistof f-analyse'.
Celler fra de'antistoff-produserende brønner ble klonet i bløt .agarose. ved modifikasjon av' metoden som er beskrevet av Cotton et al (Eur. J. Immunol. 3, 135-140, 1973).
Kort beskrevet ble.like. volumer av varm 0,8% agarose (Sea-• plaque, Marine Colloid Inc.) og■dobbeltstyrke-D.^ blandet og utplatet med 2 ml på én 60 mm. plate og avkjølt ved 4°C i 15 .minutter som basis-sjikt.. Ett tusen celler i det .samme medium ble lagt over basis-sjiktet og avkjølt,- og deretter inkubert under de samme betingelser- Som vanlige cellekulturer. De anti-maligni-n-antl.stoff-positive kloner ble ytterligere dyrket som ascitestumores i BALB/cJ-mus.
Ovenstående tabell viser mengdene av monoklonalt anti-malignin-antistof f dannet av hver.antistoffdannende klon i mikrogram protein pr., ml ekstracellulærvæske. Utbyttene av antistoff ses å. være gode i de første fire måneder av .klone-formeringen og å ha øket ved den■femte formerings-måned. Cellene fortsatte- å vokse godt gjennom de åtte måneder og vokste i' sterk grad når de ble dverført intraperitonealt.til •musen, hvor utbytte av antistoff igjen øket.som ventet til . så mye. som ,1 mg MAMA-S pr. ml ascitesvæske. Cellene vokste også .meget godt , på bløt agar og ble frosset og lagret i. 'flytende■nitrogen og dyrket igjen etter tining. Porsjoner
'•av hver klon ble. frosset i flytende nitrogen for permanent lagring og dyrkning om igjen ved senere tidspunkt.
Det monoklonale antistoff ble i hvert tilfelle.bestemt 'kvantitativt som protein ved optisk densitet ved ,28,0yum,
var ikke-dialyserbart og vandret på SDS-polyakrylamidgel-elektroforese hovedsakelig som. gammakjede-immunglobuliner .
Med progressiv :re-kloning ble-hver celle som dannet spesifikke monoklonale antistoff, konsentrert- Re-kloning av .MAMA-B-produksjonsceller ga således fire av seks kolonier som var MAMA-B-dannere, og re-kloning.av MAMA-A-produksjonsceller ga tre av .fire kolonier som var' MAMA-A-dannere.
Hvér av de' tre typer antistoff farget et stort utvalg av maligne celler.ved. immunfluorescens i omtrent det samme 'konsentrasjonsområde som tidligere observert for rensede TAG-produkter.. D'et vil si'at ett'nanogram antistoffprotein-.farget én 'kref tcelle . Fotografier ble tatt 'ay spesifikk immunfluorescens-fargning oppnådd med humant leukemisk blod, både akutt og kronisk, seks kulturiinjer av'leukemiske celler (JY, KARPAS, CEM, RAJI, HL6 0 og K562), og tre humane l.ymfomer. Fargning ble oppnådd med MAMA-F, MAMA-S og MAMA-FS... ■'.''.■■'"■.'.'.
Ånnetlags-merkning med fluorescens-markører, både fluo-rescéln og rhodamin, ved konsentrasjoner så lave som 1:1.600
ble observert og. notert. Disse' meget lave konsentrasjoner,
av det annet' lag muliggjorde fortynning inntil bakgrunns-.ikkes.pes.ifikk merkning var eliminert, og ved annet-lags-.konsentrasjoner (FITC eller rhodamin) ble det oppnådd meget spesifikk .fargning med MAMA-F, MAMA-S og MAMA-FS.
EKSEMPEL 15
Påvisning ved cytofluorografi av en diagnostisk "Maligriin-Fluorescens-Index".med monoklonale anti-målignin-antistoffer F og S
Under anvendelse av de to monoklonale anti-malignin-antistof f er, MAMA-F og. MAMA-S; i flere, forskjellige konsentrasjoner,
ved-flere forskjellige inkubasjonstider, vasking eller ingen vasking, forskjellige konsentrasjoner og tider for inkubering .av fluorescein-isotiobyanat-anti-mus-antistoff (FITC) og andre fremgangsmåter" 'når det gjelder preparering av blod " og/eller- hvite celler, både i normale og kreftsera (leuke-mier, lymfomer), i en undersøkelse av hvordan disse antistoffer best kan anvendes med strømnlngs-cytome tr i-instrumenter, drøf-tes de følgende konklusjoner og foretrukne eksempler. .1. Ved-kvantitativ bestemmelse av'det virkelige antall celler som. - fluorescerer pr..100 celler tellet, og korri-
ger.ing. for■de celler som fluorescerer uten MAMA men med
FITC-antistof f et alene., fås et absolutt antall, hvilket representerer den sanne eller spesifikke fluorescens .på grunn av. RAMA. Malignih-Fluorescens-Indexener så-, ledes lik (antall celler som fluorescerer med MAMA'pluss FITC) minus . (antall celler som fluorescerer med FITC alene).
2 . Malignih-Fluorescens-Indexen er - en hurtig-diagnostisk test for maligne celler i flytende suspensjon, sonv skiller.normale fra maligne celler uansett celletype
(malignin er ét generelt transformasjons-antigen som har forbindelse med prosessen ' for malign transformas jon heller enn celletypen).
3. Eksempler fra de oppnådde data.:
EKSEMPEL 16
Påvisning av. at anti-Astrocytin, Anti-Malignin og S-TAG er cytotoksiske overfor tumorceller som vokser i vevskultur Standardtester for bestemmelse av cytotoksisitet kan anvendes. Vanligvis telles antallet, celler i et fast tellekammer. vanligvis innrettet til å inneholde ca. 100 levende celler. Disse celler behandles så med det stoff'
som testes, og antall celler som fremdeles . er levende, telles .
I en standard-cytotoksisitetstest av S-TAG-oppløsning oppnådd i henhold til fremgangsmåtene.ifølge,Eksempel 9 mot celler i vevskultur f ra en: pasient, med et glioblastom
■ av. Klasse III-IV med tydelige karakteristika for glia-opprinne.lse, frembrakte S-TAG død av alle celler, i télle-kammeret endog'1 høy■fortynning på 1:100 og 1:1000, hvilket representerer så lite som 0,2 og '0,0 2^ug S-TAG pr. ml opp-løsning. Lignende resultater oppnås med høye fortynninger av anti-Astrocytin og anti-Malignin.
Både den; spesifisitet som er vist i Eksempler 11, 11A,. 12, 1.3, 14 og 15 og den cytotoksisitet som er vist i dette Eksempel og Eksempel .17 er høyst aktuell i forbindelse med de terapeutiske muligheter ved anti-Astrocytin, anti-Malignin .og S-TAG overfor maligne tumores i .mennesker. Det praktiske diagnostiske potensiale for begge disse fenomener i forbin-.. deise med tumorvev fjernet ved operasjon, men som ..fordrer histologisk diagnostisering er.allerede vist i det foreliggende. '.
EKSEMPEL 17 Påvisning av cytotoksisitet av en blanding av monoklonale anti- Malignin- antistof f er MAMA- F og MAMA- S
Mens verken MAMA-F eller MAMA-S alene frembringer vesent-lig cytotoksisitet overfor maligne, celler, er blandingen av disse to monoklonale antistoffer aktivt cytotbksisk overfor maligne celler. I tillegg er'produktet MAMA-FS cytotbksisk. Alle de tre preparater er cytotoksiske i omtrent de samme konsentrasjoner som tidligere observert for anti-Astro-'cytin, anti-Malignin og S-TAG-produkter (Eksempel 16). Ca. ett nanogram antistoff pr. celle er cytotoksisk og resulterer i lyse av cellen'. Cytotoksisitet ble også observert og notert både på« ■ Coulter-cytofluorograf og Ortho-cytofluorograf, hvorav begge muliggjør.absolutte tellinger av levedyktige celler over tidsrom. Ødeleggelse av levedyktige maligne celler .(fra
.karsinom'i bukspyttkjertelen, leukemiske og lymfomceller) ble observert over'et tidsrom på 15 til 60 minutter. De ma.ligne. celler som ble identifisert ved . lyssprédning og
spesielt ved fluorescens, ble ødelagt av enten blandingen ' av MAMA-F og MAMA-S eller ved MAMA-FS. Tilintetgjørelsen av kreftceller er pr. definisjon en■terapeutisk .prosess,;
og de stoffer som frembringer denne tilintetgjørelse er.pr. definisjon terapeutiske stoffer.
Som beskrevet ovenfor, var de forskjellige Produksjons-cellers desoksyribonukleinsyre spesielt programmert ved Malignin til å danne anti-Malignin-a.ntistoffet. Disse innbefatter produksjonsceller for monoklonalt Hurtig-anti-Malignin-antistoff og Sakte- og Hurtig-og-Sakte-anti-Ma.lignin-' antistoff. Det vil forstås at denne oppfinnelse dekker både desoksyribonukleinsyrene og, ribonukleinsyrene for alle. slike Produksjonsceller.

Claims (2)

1.. Fremgangsmåte , til fremstilling av monoklonalt anti-kreft-Rekognin, hvorved kreft-Rekogninelt eller en renset fraksjon av dette-som., når det injiseres i en [organisme, har evnen til å bevirke eller forårsake', celler il nevnte, organisme til å danne spesifikt anti-kreft-Rekognin, hvilket danner et enkeltlinje-presipitat med sitt jspesifikke antistoff i kvantitative presipitin-tester og Ouchterlony geldiffusjonstester, er løselig i vann og vandige oppløsninger og har en spektrbfoto-metrisk absorpsjonstopp-bølgelengde på 280yU m og. en molekylvekt på fra 3 .000 til 25.000 og jhar videre en aminosyrerest- • sammensetning med høye andeler ajy- glutami.nsyre og asparagin- \ ' ' .■'-•■■. syre og høye. forhold mellom glutaminsyre. samt asparaginsyre, u og histidin, karakterisert ved at slike antikreft-Rekognin-pfoduserende celler deretter behandles, f for å gjøre dem selvfornyende med uavbrutt,varighet, og at de er identifisert ved sin dannelse av anti-kreft-Rekognin, idet nevnte kreft-Rekognin omfatter et stoff som fås fra kreft-tumorvev eller -celler. i .
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 jj hvor nevnte organisme er en mus -eller annet- pattedyr.. I "■ • . # , s ,
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ,| hvor nevnte induserte •cel' - - li ■ ' ler' er miltceller.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,1 hvor nevnte behandling av de induserte celler er. en hybridiserings-prosess hvorved nevnte induserte celle hybridiseres med. en hvilken som helst celle som selv-fornyes I det uendelige', under dannelse av-en unik hybridisert celle som seljvfornyes i det uendelige. i5n. duseFrretme gcaenlglsemr åitenn-bieføfalgte tekr rhayv br1i,f ; elhi-vseorr ibng ehaav nddleim ng mead v m <d> y <e> elom-celler.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,il hvor nevnte selv-ucndelig-fornyende celler' utvelges ved kloning og testing av hver således dannet klon med hensyn til dens evne til dannelse av det spesifikke monoklonale anti-kreft-Rekognin.
7. Fremgangsmåte, ifølge krav, 1, hvor nevnte anti-Rekognin-antistof f er . et antirMalignin-antistpf f, hvorved det inj.i- serte Rekognin er Malignin eller én renset fraksjon av dette eller et stoff som er strukturelt beslektet med Malignin og som danner eller reagerer spesifikt med anti-Malignin-antistoff, hvorved nevnte produkt eller en renset fraksjon derav fortrinnsvis, heftes til kreftceller og derved kan påvises ved tilheftede synlige, eller signal-emittjerende midler, idet nevnte Malignin omfatter et stoff, utvunnet av hjernetumorceller, som danner-et enkeltlinje-presipitat med sitt spesifikke antistoff i .kvantitative presipitintester. og Ouchterlony gel-dif fus jonstester, ér. løselig i j/ann og vandig oppløsning med surt eller nøytralt pH og uløselig véd alkalisk.pH, og har en spektrofotometrisk absorip.sjonstopp-bølgelengde på 280^ um, en molekylvekt på 10.000 og en aminosyre-sammensetning' omtrent som følger:
idet aminosyrene cystein, hydroksyprolin, norleucin, ammoni akk, isodesmosin, lysin-norleucin og gamma-aminosmørsyre/ ikke er tilstede i påvisbarejmengder.. i
8. Fremgangsmåte til påvisning av tilstedeværelsen av kreft- eller maligne tumorceJler i en celleansamling, karakterisert v |e d at•man påfører nevnte celleansamling et spesifikt monoklonalt antikref t-Rekogni.n, hvilket heftes fortrinnsvis tfil kreftceller og derved kan-påvises ved tilheftedé synlige eller signål-emitterende mxdler, idet nevnte kreft-Rekjipgnin omfatter et.stoff, utvunnet fra kreft-tumorvev el.l!er--celler, som danner et. enkeltlin_e-presipitat med sijtt spesifikke antistoff i kvan titative <p> re sipitintester og Ouchterlony geldiffusjonstester, er løselig i vann og vandige oppløsninger med surt eller nøytralt pH og" uløselig ved. alkalisk pH, har en spektrof o.to-metrisk absorpsjonstopp-bølgel.engde på ;280^un og en molekylvekt på.fra 3.000 til 25.000, <p> g har en aminosyrerest-sammensetning karakterisert ved høye;andeler av glutaminsyre og asparaginsyre og høye forhold mellom glutaminsyre samt asparaginsyre, pg histidin. S'!
9.. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor nevnte celleansamling er, in vivo . '•
10. Fremgangsmåte Ifølge krav 8, hvor nevnte celleansamling . er in vitro.
11. Fremgangsmåte, ifølge krav 8, hvor kreft-Rekogninet er Malignin .. <■ ■ : ■ ' ■ ■ :| . ''
12. Produkt- omfattende monoklpnalt Hurtig-anti-Malignin-. antistoff.eller en renset fraksjon av dette, hvorved nevnte produkt eller--en renset fraksjon derav fortrinnsvis heftes til kreftceller og derved kan påvises ved- tilheftet synlig eller signal-emitterende middel, idet nevnte Malignin omfatter et stoff, utvunnet av hjernetumorcellér, som danner et' enkeltlinje-presipitat. med sitt spesifikke antistoff i kvantitative presipitintester og Ouchterlony gel-diffus.jons-tester, er løselig i vann og vandige oppløsninger med. surt eller nøytralt pH og uoppløselig ved alkalisk pH, og har-en spektrofotometrisk absorps jo|stopp-bøl.gelengde på 280yum, ■en molekylvekt på 10..000' og en aminosyre-sammensetnlng omtrent som følger: ;j
idet aminosyrene cystein, hydroks'yprolin, n6rleucin, ammo.ni- • akk, isodesmosin, lysin-nprléucin og gamma-aminosmørsyre ikke er tilstede i påvisbare1 mengder.
13. 'Produkt omfattende monoklonalt Sakte-anti-Malignin- ■ .... I •: ■ antistoff eller en renset fraksjon av dette, hvorved nevnte produkt, eller en. renset fraksjon, derav heftes fortrinnsvis til kreftceller og-derved kan påvises ved tilhef tede. synlig.e eller signal-em.itterende midler, idet nevnte Malignin omfat-.ter et s tof f,. utvunnet fra hjernetumor-celler, som danner et enkeltlin je-presipitat med' si tt . spesif ikke antistoff i kvantitative presipitintester og Ouchterlony geldiffusjons-testef, er løselig i vann og vandig opplø sning med surt el l-er ' il / nøytralt pH og uløselig ved alkalisk pH, og har en spektro fotometrisk.absorpsjonstopp-bølgelengde. på 280^ um, en molekylvekt på 10.000b g en aminosyresammensetning omtrent som følger:
idet aminosyrene cystein, hydroksyprolin, norleucin,■ ammoniakk, Isodesmosin, lysin-norleucinb g gamma-aminosmø rsyre , ikke- er tilstede i påvisbare mengder.
14.. Produkt, omfatténde monoklonalt Hurtig-og-Sakte-anti-Malig-nin-antistoff eller en renset .fraksjon av dette, hvorved nevnte produkt er cytotoksisk overfor, og dreper, kreftceller, hvorved nevnte produkt eller en renset fraksjon derav heftes fortrinnsvis"til kreftceller og derved kan påvises ved tilhef tet synlig eller signal-emitterende middel, idet nevnte Malignin omfatter et produkt utvunnet fra hjernetumorceller,, som danner et enkeltlinje-presipitaé' med sitt spesifikke antistoff i kvantitative presipitintester .og Ouchterlony. gel- ..... / dif fus jonstester, er'løselig i jiann og-vandig opplø sning., med surt eller nøytralt pH og uløselig' ved alkalisk pH, og har en spektrofotometrisk absorpsjonstopp-bølgelengde på 28d^ um, en molékylvekt på lO.oéo.og. en aminosyre-sammens.ét-ning omtrent som. følger:
idet aminosyrene cystein, hydroksyprolin, . norleucin, ammoni-V akk, isodesmosin , ,lysin-norleucin;)Og gamma-aminosmørsyre ikke er tilstede i påvisbare mengder. ' <<> i
15 . Produkt ifølge- krav. 12, hvori nevnte monoklonale Hurtig-anti-Malignin-antistoff eller e-n -renset fraksjon derav er blandet med produktet i.henhold til krav 13, monoklonalt Sakte- . anti-Malignin-antis tof f eller en renset ..fraksjon derav, hvorved■nevnte blanding er cytbtoksisk overfor, og dreper, kreftceller..
16. Produkt-'ifølge krav 12, hvor 'nevnte monoklonale Hurtig- anti-Malignin-antlstoff er /kompleksbundet med eri hvilken som helst'substans som det/er ønskelig å få preferensial-heftet til kreftceller.. '■
17. Produkt ifølge krav 13, hvori nevnte monoklonale Sakte-anti-Malignin-antistoff er kompleksbundet med en hvilken som ;heIst substans som det ert ønskelig å få. preferensial-heftet til. kreftceller.
18. Produkt ifølge krav 14, hvori nevnte monoklonale Ilurtig- .Sakte-anti-Mallgnin-antlSjtoff er kompleksbundet med en hvilken som helst substans soi m d" et er ønskelig ■ å få preferensial-hef tet til kreftceller.
19.. Produkt omfattende, monoklonalt anti-kref t-Rekognin-, hvorved nevnte. anti-kref t-Rekognin. er fremstilt ved -injek sjon- i en organisme av et kreft-Rekognin, idet nevnte kreft-" Rekognin har' evne. til å indusere eller forårsake at celler . i nevnte organisme danner spesifikt anti-kreft-Rekognin, hvorved slike anti-kreft-Rekognin-dannende celler deretter behandles slik at de blir selv-fornyende..med uavbrutt varighet og identifiseres.ved sin dannelse av monoklonalt anti-kreft-Rekognin, idet nevnte kreft-Rekognin omfatter et-stoff, utvunnet fra kreft-tumorvev eller -celler, k a r a k - t e r 1 s e r t ved at det danner et enkeltlinje-presip.i-tat' med- sitt spesifikke antistoff i kvantitative presipitin-tester og Ouchterlony geldiffusjonstester, er løselig i vann og ■ vandige oppløsninger, med surt eller nøytralt p.H' og uløselig ved alkalisk pH, har en spekt.rofotometrisk absorp-sjonstopp-bølg.elengdé på 280y.um og en molekylvekt på fra 3.00.0. til 25.000 ,og Videre en aminosyrerest-sammensetning- karakterisert ved høye andeler av glutaminsyre og asparaginsyre og høye forhold mellom,glutaminsyre■samt asparaginsyre, og histidin.
20. Produkt ifølge krav.19, hvori nevnte monoklonale anti-kref t-Rekognin eller en renset fraksjon derav fortrinnsvis heftes til kreftceller og derved kan påvises ved tilheftede synlige eller signal-emitterende midler.
21. Produkt ifølge krav 19, hvori nevnte monoklonale an ti-' kreft-Rekognin eller, en renset fraksjon derav er cytotok-si.sk overfor, og dreper, . kjref teol ler. s f" ' 2-2.: Produkt ifølge krav ^.9, hvori nevnte monoklonale anti- kref t-Rekognin eller en renset fraksjon derav er'kompleks--' bundet med en hvilken, som jhelst substans som det er ønskelig å få preferensial-tilheftet til' kreftceiler. ' ..
23. Produkt omfattende .produksjonscelle for monoklonalt - Hurtig-anti-Malignin-åntlstoff, hvilken celle er k a r a k - t e, r. i s e r t Ve d evnen „ til å fornye seg selv med. uavbrutt varighet og å danne.monoklonalt Hurtig-anti-Malignin-ant.istoff, hvorved nevnte Produks jonscelle. • har. fått' sin desoksyribonukleinsyre spesif ikt programmert ved Malignin.' <:> til, å danne anti-Malignih-antistoffet, idet. nevnte Malignin omfatter-et produkt, utvunnet fra, hjernetumorceller, som danner et enkeltlinjepresipi-tat med sitt spesifikke antistoff i kvantitative presipitintester og Ouchterlony gel-dif f us jonstester, er løselig1'1 i vann og vandige oppløsninger med surt eller nøytralt pH og uløselig.ved alkalisk pH, og har .én spektrofotometrisk absorpsjonstopp-bølgélengde på 280^ um, en molekylvekt på 10.000 og en aminosyre-sammensetning omtrent som følger:.
idet aminosyrene cystein, hydfoksyprolin, norleucin,' ammoniakk, isodesmosin, lysin-norleucin og gamma-aminosmørsyre. ikke er tilstede.i påvisbare mengder.
24. Produkt omfattende Produksjonscelle for'monoklonalt Sakte-•'...'■• 'i ariti-Malicmin-antistoff, hvilken celle . er karakterisert ved evnen til å'fornye seg selv med.uavbrutt 'varighet og å danne monoklonalt Sak-te-anti-Malignin-antistof f , hvorved nevnte Produksjonscelle har fått sin desoksyribonukleinsyre spesifikt programmert ved Malignin til å danne anti-Malignin-anti.stoffet, idet nevnte Malignin omfatter et produkt, - utvunnet fra hjernetumorceller, som danner et, enkeltlinje-presipitat. med sitt spesifikke, antistoff i kvantitive. presipitintester og Ouchterlony geldiffusjonstester, er løse-, lig ■ i vann og vandige oppløsninger med surt eller nøytralt.. pH - og-uløselig véd alkalisk '• pH,', og. har en spektrofotpmetrisk absorpsjon.stopp-bølg.elengde på 2,80yum, en molekylvekt på 10.000 og én aminosyre-såmmensetning omtrent som følger:
1 idet aminosyrene cystein,'<hy>d rok s <y> pr ol in, norleuciri, ammoni- i, akk, isodesmosin, lysin-norleucin og gamma-arninosmørsyre ikke er tilstede i påvisbare mengder,. .25.' Produkt omfattende Produksjonscelle for monoklonalt Hurtig-og-Sakte-anti-Malignin-antistoff, hvilke celler er karakterisert ved evnen til å fornye seg selv med uavbrutt varighet og. å danne monoklonalt Hurtig-og- .Sakte-anti-Malignin-antistof f,. hvorved nevnte Produksjons- celle har fått sin desoksyribonukleinsyre spesifikt programmert ved Malignin til dannelse av anti-Malignin-antistoffet, .idet nevnté Mali <g> nin omfatter et produkt-, utvunnet fra •hjernetuméreeller, som danner-ét enkeltlinje-presipitat med sitt spesifikke antistoff i kvantitative presipitintester og. Ouchterlony gel-dif f us jonstester., er løselig i vann og vandige op <p> løsninger med surt eller nøytralt pH <p> g uløselig ved alkalisk pH, og har en spektrofotometrisk absOrp.sjons- topp-bølgelengde på 280^,um, molekylvekt på .1.0.000 og en.aminosyresammensetning omtrent som følger:.
Idet aminosyrene cystein, hydroksyprolin,norleucin,'ammoni-■ akk, isodesmosin, lysin-norleucin og gamma-aminosmørsyre Ikke er tilstede i påvisbare méngdér.
26. Produkt omfattende desoksyribonukleinsyren ifølge krav 23 .
27. Produkt omfattende desoksyribonukleinsyren ifølge krav •24.
28. ' Produkt omfattende desoksyribonukleinsyren ifølge krav -25.
29. Produkt omfattende ribonukleinsyren ifølge hvilket som helst av kravene 2 3-25.
NO830404A 1981-06-08 1983-02-08 Paavisning av maligne tumor-celler. NO830404L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/271,645 US4486538A (en) 1978-07-07 1981-06-08 Detection of malignant tumor cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO830404L true NO830404L (no) 1983-02-08

Family

ID=23036465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO830404A NO830404L (no) 1981-06-08 1983-02-08 Paavisning av maligne tumor-celler.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4486538A (no)
EP (2) EP0080474A1 (no)
JP (2) JPS58500837A (no)
CA (1) CA1215919A (no)
DK (1) DK51983D0 (no)
NO (1) NO830404L (no)
WO (1) WO1982004262A1 (no)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4624932A (en) * 1978-09-13 1986-11-25 Samuel Bogoch Recognins and their chemoreciprocals
SE8401945L (sv) * 1983-04-08 1984-11-13 Kureha Chemical Ind Co Ltd Antikropp mot cancer i urinblasan hos menniska
GB2139645A (en) * 1983-04-08 1984-11-14 Kureha Chemical Ind Co Ltd Antibody to human prostrate cancer
US4529693A (en) * 1983-12-09 1985-07-16 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Detecting neoplastic mammary epithelial cells by detecting thioesterase II marker
US4783330A (en) * 1984-11-15 1988-11-08 New England Medical Center Hospitals, Inc. Monoclonal antibodies to activated platelets
EP0221748A3 (en) * 1985-11-01 1988-10-12 Samuel Dr. Bogoch A process for the production of human antibodies
WO1987004164A1 (en) * 1986-01-06 1987-07-16 The University Of Melbourne Technetium-antibody conjugate
IL84285A (en) * 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5013645A (en) * 1987-04-14 1991-05-07 Abbott Laboratories Immunological methods and materials for detection of tumor associated antigens
US5028594A (en) * 1988-12-27 1991-07-02 Naxcor Use of photodynamic compositions for cytotoxic effects
US4983527A (en) * 1989-05-26 1991-01-08 Arizona Board Of Regents Oocyte test for detection of tumor promoting compounds
AU6409894A (en) * 1993-03-16 1994-10-11 Samuel Bogoch Recognin vaccines
US6242578B1 (en) * 1994-02-17 2001-06-05 Samuel Bogoch Aglyco products and methods of use
US7420028B2 (en) * 2001-03-27 2008-09-02 Samuel Bogoch Replikins and methods of identifying replikin-containing sequences
US7306919B1 (en) 2001-10-31 2007-12-11 Thornthwaite Jerry T Antigen-antibody cancer recognition system
WO2013013075A2 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Samuel Bogoch Peptides shared among lethal cancers and therapeutic compositions comprising said peptides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196186A (en) * 1975-10-09 1980-04-01 Samuel Bogoch Method for diagnosing malignant gliol brain tumors
US4298590A (en) * 1975-02-25 1981-11-03 Samuel Bogoch Detection of malignant tumor cells
US4195017A (en) * 1975-02-25 1980-03-25 Samuel Bogoch Malignin, derived from brain tumor cells, complexes and polypeptides thereof
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4172124A (en) * 1978-04-28 1979-10-23 The Wistar Institute Method of producing tumor antibodies
EP0007214B1 (en) * 1978-07-07 1985-10-23 Samuel Dr. Bogoch Product for detecting the presence of cancerous or malignant tumor cells
ATE8897T1 (de) * 1979-03-09 1984-08-15 Samuel Dr. Bogoch Recognine, ihre chemoreziprokale, am target haftende globuline und verfahren zur herstellung dieser produkte; verfahren zum bestimmen von krebstumoren.
US4349528A (en) * 1979-11-21 1982-09-14 The Wistar Institute Monocolonal hybridoma antibody specific for high molecular weight carcinoembryonic antigen

Also Published As

Publication number Publication date
JPS58500837A (ja) 1983-05-26
EP0080474A1 (en) 1983-06-08
EP0067642A1 (en) 1982-12-22
JPH0372894A (ja) 1991-03-28
CA1215919A (en) 1986-12-30
WO1982004262A1 (en) 1982-12-09
DK51983A (da) 1983-02-08
US4486538A (en) 1984-12-04
DK51983D0 (da) 1983-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO830404L (no) Paavisning av maligne tumor-celler.
US5866690A (en) Detection of malignant tumor cells
US4298590A (en) Detection of malignant tumor cells
Gold et al. Demonstration of tumor-specific antigens in human colonic carcinomata by immunological tolerance and absorption techniques
Lemieux et al. Artificial antigens. Antibody preparations for the localization of Lewis determinants in tissues
JPS62190074A (ja) ヒトの癌に付随したジフコガングリオシドを規定するハイブリド−マ抗体
Goldenberg et al. Antigens associated with normal and malignant gastrointestinal tissues
Wilde et al. A radioimmunoassay for human chorionic gonadotrophin
US4196186A (en) Method for diagnosing malignant gliol brain tumors
US5654408A (en) Melanoma-associated antigens identified by monoclonal antibodies
EP0173663B1 (en) The use of a specific tumor associated antigen, sialosyllactotetraose, in diagnostic or therapeutic procedures related to cancer deseases
US4195017A (en) Malignin, derived from brain tumor cells, complexes and polypeptides thereof
KR950006170B1 (ko) 사람과 동물에 있는 고리 모양의 입자 및 암의 존재를 진단하기 위한 시험관 내의 방법 및 프로브(probe)
KR850001770B1 (ko) 인체 암 항원에 대한 특이항체의 제조방법
US4624932A (en) Recognins and their chemoreciprocals
EP0007214A1 (en) Product for detecting the presence of cancerous or malignant tumor cells
US4840915A (en) Method for diagnosing malignant tumors
EP0162825B1 (en) The use of a specific carcinom associated antigen (hapten), fucosylsialosylgangliotetraose (fuc-gm1) in diagnostic or therapeutic procedures related to human lung cancer (small cell carcinomas)
EP0015755B1 (en) Recognins, their chemoreciprocals, target attaching globulins and processes for producing these products; methods of detecting cancer tumors
US4976957A (en) Process for the production of recognins and their chemoreciprocals
US5087573A (en) Monoclonal antibody against bone alkaline phosphatase
JP2006317220A (ja) 成人ｔ細胞白血病の診断器具
JPS62500304A (ja) 膵臓がんに伴う胞状奇胎分化蛋白質、これらの蛋白質に対する抗血清およびモノクロ−ナル抗体、製造方法
Jacob et al. The participation of complement in the parietal cell antigen–antibody reaction in pernicious anaemia and atrophic gastritis
Gold Tumor-specific antigen in GI cancer