NO821220L - Nitrosourinstoff-derivater med antitumor-aktivitet - Google Patents

Description

Tittel

Nitrosourinstoff-derivater med antitumor-aktivitet.

Beslektede ansøkninger

Denne ansøkning er en "continuation-in-part" av

US-ansøkning 117,940 innlevert 14. august 1980.

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår nye nitrosourinstoff-derivater og farmasøytisk godtagbare salter derav som er nyttige på grunn av sin antitumor-aktivitet og antikoagulerende aktivitet. Oppfinnelsen omfatter også farmasøytiske preparater som inneholder disse forbindelser og fremgangsmåter for anvendelse av dem.

Teknikkens stand

I det siste decennium har nitrosourinstoffer blitt godtatt som aktive antitumor-midler (T. P. Johnston et al, J. Med. Chem., 14, 600 (1971)). Den aksepterte virkningsmåte synes å omfatte frigjøring av isocyanat in vivo. De forbindelser som hyppigst anvendes klinisk er 1-cykloheksy1-3-(2-kloretyl)-3-nitrosourinstoff (CCNU), 1,3-bis-(2-kloretyl)-3-nitrosourinstoff

(BCNU) og MeCCNU '(1- (4-trans-metylcykloheksyl)-3- (2-kloretyl) - 3-nitrosourinstoff som frigjør in vivo et isocyanat avledet fra den unitroserte side av molekylet, og et alkyleringsmiddel fra den annen side derav. MeCCNU er funnet å ha den høyeste aktivitetsgrad mot de fleste tumor-systemer, særlig faste tumor-systemer.

Tallrike undersøkelser er rettet mot stoffskifteproduktene som dannes in vivo og in vitro i vandige medier, hovedsakelig bestående av 2-kloretanol, vinylklorid, acetaldehyd og dikloretan fra den nitroserte side av molekylet. (R.P. Johnston et al,

J. Med. Chem., 18, 634 (1975)). Det er også kjent at N-nitroso-N-alkyl-ureido-delen av molekylet alkylerer DNA(deoksyribo-nukleinsyre). in vivo og in vitro (Frei et al, Biochem. J., 17 4: 1031 (1978)). Det er faktisk vist at den carcinogene effektivi-tet av slike midler som N-metyl-N-nitrosourinstoff, faller sammen med graden av alkylering av guanin-delen i DNA i mål-vevet ved oksygen-6-atomet.

Alkylering av DNA finner sted i løpet av 1 time efter administrering av nitrosourinstoffet, og halveringstiden for de alkylerte produkter er ca. 24 til 48 timer (D. J. Reed et al, Cancer Res., 35^ : 568 (1975)). Undersøkelsen viste at lave doser av nitrosourinstoffer bare representerer en liten trusel som mutagener og er derfor ikke vesentlig carcinogene.

Det er nylig vist at en rekke isocyanater er aktive inhibitorer for transglutaminase .(Gross et al, J. Biol. Chem., 250: 7693 (1975)), et kalsium-avhengig enzym som kan katalysere lysin-glutamin-tverrbinding i visse proteiner som er til stede på neoplastiske celle-overflater. Dette enzym (Yancey et al, Ann. N.Y. Acad. Sei., 202: 344 (1972)), og andre lignende enzymer så som gamma-glutamyl-transpeptidase (Novogrodsky et al, Proe. Nati, Acad. Sei. USA, 73: 2414 (1976); Fiala et' al,

J. Nati. Cancer Inst., 57: 591 (1976); Cameron et al, Cancer Res., .38: 823 (1978)), har vært innblandet i den uregulerte vekst av cancer-celler og fibrin-tverrbinding. Det er generelt anerkjent at disse tverrbundne proteiner danner et ekstra-cellulært belegg som gjør at cellen ikke kjennes igjen av det cellulære immunsystem, hvorved den normale ødeleggelse av det fremmede neoplastiske vev hindres. Disse enzymer er temmelig spesifikke overfor glutamin- og glutaminsyre-rester som substrater, og isocyanater som ligner på disse rester, er funnet å være de mest effektive inhibitorer (Gross et al, J. Biol. Chem., 250: 7693 (1975)). Andre enzymer med lignende funksjoner og egenskaper kan også være innblandet, så som andre glutamyl-cyklus-enzymer. På dette grunnlag kan man postulere at jo mer isocyanatet som dannes ved nedbrytning av nitrosourinstoffet, viser spesifisitet overfor slike enzymer, desto lavere er den nødvendige dose, hvilket resulterer i en redusert risiko for carcinogenese på grunn av antitumor-midlet.

Strukturen av det aktive sted i transglutaminase er funnet å inneholde pentapeptid-sekvensen —Tyr-Gly-Gln-Cys-Trp— og har form av en lomme som er 5 x 5 Ångstrom i diameter (Folk et al, J. Biol. Chem., 241: 3238 (1966)). Gamma-glutamyl-transpeptidase kan ventes å ha en noe lignende struktur for det aktive sted.

Toksiske bivirkninger så som myelo-undertrykkelse, er

av vesentlig betydning ved kjemoterapi når nitrosourinstoffer

anvendes. Øyensynlig er denne virkning ikke direkte knyttet til alkyleringsmidlet som frigjøres in vivo fra den nitroserte side av nitrosourinstoffmolekylet. Dette understøttes av det forhold at store doser av nitrosourinstoffene Streptozotocin og Chlorozotocin i forhold til andre nitrosourinstoffer frem-bringer et forholdsvis lavt nivå av myeloundertrykkelse (Schein et al, Cancer, 34: 933 (1974)). Forbindelser så som CCNU og BCNU oppviser myeloundertrykkelse som sine mest giftige bivirkninger. Alle fire midler frigjør lignende alkylerings-midler in vivo. Det er videre påvist at Streptozotocin og Chlorozotocin frigjør det samme isocyanat som derefter gjennom-går en intramolekylær karbamoylering for å danne et cyklisk karbamat (Montgomery et al, Cancer Treat. Rep., 60: 651 (1976)). Denne intramolekylære reaksjon kan derfor elimineres ved direkte anvendelse av et cyklisk karbamat eller et annet karbamat..

Beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til den hypotese som oppfinnelsen er basert på,

vil en overlegen inhibitor for transglutaminase og beslektede enzymer ha, på bakgrunn av den ovenfor angitte form og størrelse, hydrofobe deler som er rettet vekk fra, men i nærheten av,

lommen ved det aktive sted. Substratet kan ha grupper som fremmer hydrogen-binding til tyrosin-hydroksylgruppen ved det aktive sted. Andre forbindelser som foreliggende oppfinner tidligere er kommet frem til (US-patentansøkning 68,470) ved å behandle problemet på denne måte, har vist seg å være vel-lykkede antitumor-midler og antikoagulasjons-midler.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er noen 1-cykloalkyl-mety1-3-(2-kloretyl)-3-nitrosourinstoffer som bærer hydroksyl, halogen eller andre hydrogen-binding-grupper i den tertiære stilling i cykloalkylringen, fremstilt for å bli undersøkt som antitumor-midler og antikoagulasjonsmidler. Hypotesen ifølge oppfinnelsen understøttes av det forhold at hydrofobe grupper som er bundet til beta- eller gamma-karbonatomet i glutamin, representerer utmerkede substrater for transglutaminase (Gross et al, J. Biol. Chem., 248: 130 (1973)) og lignende enzymer,

og nitrosourinstoffer som frigjør isocyanater analogt med disse substrater, er aktive antitumor-midler (US-patentansøkning 68,470). Hydroksylgruppen bundet til tyrosin ved det aktive sted repre-

senterer et område hvor hydrogenbinding kan forekomme, og de hydroksylerte og halogenerte isocyanater som frigjøres fra nitrosourinstoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, skulle derfor ha en mye høyere affinitet for det aktive sted i transglutaminase og muligens andre lignende enzymer enn alkyl-isocyanatér som' ikke er substituert. Dette kan forklare effektiviteten av slike forbindelser som BCNU og CCNU, eftersom BCNU inneholder en klorgruppe som kan danne hydrogenbinding til tyrosin-hydroksylgruppen ved det aktive sted, og CCNU og MeCCNU er kjent for å bli hydroksylert i leveren til derivater som kan bidra til dens binding til det aktive sted på lignende måte. Denne hydroksylering senker imidlertid lipid-oppløseligheten og hindrer krysning av blod-hjerne-barrieren.

Hemningsmekanismen for isocyanatet er via alkyl-tiokarbamat-ester-dannelsen ved den enkle sulfhydrylgruppe ved det aktive sted i enzymet (Gross et al, J. Biol. Chem., 250: 7693 (1975)):

hvor R betyr en alkylgruppe.

I henhold til foreliggende oppfinnelse frigjør nitroso-urinstof f derivater de følgende cykloalkyl-isocyanater:

hvor R er en gruppe som kan danne hydrogenbinding med tyrosylgruppen ved det aktive sted i enzymet, fortrinnsvis en halogen-, karboksy- eller hydroksylgruppe, eller et derivat derav, og særlig foretrukket en klor- eller hydroksylgruppe. Cykloalkylringen kan videre være substituert med 1 eller mer foretrukket 1 eller 2 alkylgrupper, fortrinnsvis metylgrupper, eller 1 eller mer foretrukket 1 eller 2 hydroksylgrupper.

Senere undersøkelser har vist at aktiviteten av nitrosourinstoffer økes markert ved hjelp av 2-kloretyl- eller 2-fluor-ety1-gruppene som er til stede på den nitroserte side av for bindelsen (Montgomery, Cancer Treat, Rep., 60: 651 (1976); Johnston et al, J. Med. Chem., 9: 892 (1966); Farmer et al,

J. Med. Chem., 21: 514 (1978)). Eftersom 2-kloretyl- og 2-fluoretyl-gruppene ogsåøker oppløseligheten, er de de foretrukne grupper ifølge oppfinnelsen.

I henhold til oppfinnelsen har de nye forbindelser som

er i besittelse av de strukturelle kriterier som er nødvendige for selektivt å hemme transglutaminase og lignende glutamyl-cyklus enzymer, og som derfor har potensiell betydning som antitumor-midler og som antikoagulasjonsmidler, den følgende formel:

hvor n er 4 til 7, hal er klor eller fluor, og R er en gruppe som er i stand til å danne hydrogenbinding med tyrosylgruppen på det aktive sted i enzymet, fortrinnsvis en halogen-, ;: karboksyl- eller hydroksyl-gruppe, eller et derivat derav,

og mér foretrukket en klor- eller hydroksyl-gruppe. Den resulterende 5- til 8-karbon-ring kan være substituert med én eller flere, fortrinnsvis 1 eller 2 lavere alkylgrupper, fortrinnsvis metylgrupper, for å øke selektiviteten, eller visse hydrofile grupper, så som hydroksylgrupper, for å øke oppløseligheten, eller andre grupper som er beskrevet i stor utstrekning i litteraturen.

Selv om det bare er ett karbonatom mellom ringen og NH-gruppen, skal tilføyelse av et ekstra karbonatom ikke ansees å falle utenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, eftersom isocyanater som frigjøres fra disse forbindelser, også ville være i overensstemmelse med de enzym-hemmende kriterier, eftersom "forgrening" i virkeligheten vil finne sted ved gamma-karbonatomet som er bundet til isocyanat-gruppen.

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye forbindelser som har antitumor-aktivitet i mennesker og andre pattedyr.

Det er et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe nye forbindelser som hemmer aktiviteten av transglutaminase og enzymer med lignende funksjoner som har tilsvarende spesifikasjoner.

Et ytterligere formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe nye forbindelser som er effektive antitumor-midler ved lave doser, dvs. at de har en lavere toksisitet enn MeCCNU, for å minimalisere skadelige mutagene og/eller carcinogene virkninger, og for å tilveiebringe forbindelser med minimale eller ikke-eksisterende myeloundertrykkende virkninger.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe preparater, som inneholder de nye forbindelser og fremgangsmåter for anvendelse av dem.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe nye nitrosourinstoff-derivater som har antikoagulerende virkning.

Beste utførelsesform for oppfinnelsen

Smeltepunkter ble bestemt ved anvendelse av et Thomas-Hoover kapillar-smeltepunktapparat og er ukorrigerte. Infrarøde (IR) spektra ble oppnådd under anvendelse av et P.erkin Eimer 397 spektrofotometer, og NMR-spektra ble tatt på et Nicolet 200 MHz instrument under anvendelse av CDCl^ som oppløsningsmiddel og TMS som en indre standard.

Eksempel 1

Neostatin

1- tert- hydroksycykloheksyImety1- 3-( 2- kloretyl)- 3- nitrosourinstoff

1-aminometyl-l-cykloheksanol-hydroklorid (16,6 g, 0,1 mol) ble omrørt med 13,9 ml (0,1 mol) trietylamin i 75 ml vannfri dietyleter og avkjølt til under 5°. 2-kloretyl-isocyanat (10,5 g, 0,1 mol) ble oppløst i 25 ml eter og tilsatt i små porsjoner med omrøring mens temperaturen ble holdt på under 5°. Efter 2 timers ytterligere omrøring ble reaksjonsblandingen filtrert, og residuet ble vasket med to 20 ml porsjoner eter og

suspendert i 20 ml vann, filtrert, suspendert påny i 20 ml vann, filtrert påny og tørret i vakuum over CaC^/KOH. Utbyttet av urinstoffet var 19,5 g (83%) som et hvitt pulver, sm.p. 109-110°.

En 11,7 g (0,05 mol) mengde av den ovenstående forbindelse ble oppløst i 50 ml 98% maursyre og avkjølt til 0°. Natrium-nitritt (6,9 g, 0,1 mol) ble tilsatt porsjonsvis under kraftig omrøring mens temperaturen ble holdt under 5°. Efter omrøring i ytterligere en time ble 100 ml vann tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med 30 ml eter, kan vaskes med 5% NaHCO^, og ble inndampet til tørrhet i vakuum for å gi 13,2 g (82%) av nitrosourinstoffet som et oljeaktig, fåst stoff. IR-analyse viste bånd ved 1710 cm"<1>(C=0) og 1530 cm<-1>(C-N-H). NMR viste en triplett ved 4,2 ppm (2H,J=6,5Hz), en triplett ved 3,5 ppm (2H, J=6,5 Hz), og en multiplett ved 1,6 ppm (12H). 1-nitroso-isomeren var også til stede i en utstrekning av ca. 30%.

Eksempel 2

( 1- klor- l- cykloheksyl) metyl- 3-( 2- kloretyl)- 3- nitrosourinstoff

Den ovenstående forbindelse ble fremstilt under anvendelse av fremgangsmåten ifølge eksempel 1, idet hyd.roksy-utgangs-materialet ble erstattet med den tilsvarende klor-forbindelse. Utbyttene var tilsvarende med ca. 33% isomer til stede.

Andre forbindelser i henhold til oppfinnelsen, så som metyl- eller hydroksyl-substituerte cykloalkyl-derivater kan syntetiseres ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av et passende substituert 1-aminometyl-l-cyklo-alkanol-hydroklorid som kan syntetiseres ved kjente metoder.

Antitumor- utprøvning

Antitumor-utprøvningsdata ble oppnådd gjennom

National Cancer Institute, Drug Evaluation Branch, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Utprøvningsdata for

MeCCNU ble oppnådd samtidig for sammenligningsformål.

L-1210 lymfoide leukemi-tumorer (10^ celler) ble implantert i CDF^mus i henhold til NIH Protocols. Resultatene angitt i tabell I er enkeltdose-reaksjoner hvor overlevelse er bestemt 5 dager efter i.p. injeksjon av Neostatin (seks dager efter implantering). Forbindelsen ble injisert som en suspensjon i 10% EtOH, 10% emulphor og 80% saltvann. Log avlivelse data viser antall tumor celler som ble avlivet, og overlevende efter 30 dager er betegnet som "helbredet". Graden av antitumor-aktivitet er uttrykt som et forhold mellom behandlede dyr over kontrolldyr (T/C) under anvendelse av NCI testvurderingsverdier, som spesifisert i individuelle protokoller. Tabell II inneholder sammenligningsdata for MeCCNU, det mest aktive middel mot dette tumor-system i bruk på det nuværende tidspunkt.

Neostatin ble funnet å ha en aktivitet som var like

god som MeCCNU i L-1210 systemet med lavere giftighet ved høyere doser som målt uttrykt ved vekttap. Eftersom L-1210 leukemi reagerer godt overfor en rekke nitrosourinstoffer, ble det ytterligere, mindre reaktive tumor-system (P-1534) anvendt for ytterligere undersøkelse. Under anvendelse av dette system vil det sees at Neostatin er langt bedre enn MeCCNU ved tilsvarende dosemengder.

Tilsvarende kliniske resultater kan oppnås ved anvendelse av de andre forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Nitrosourinstoffene ifølge oppfinnelsen kan tilberedes til en form som er egnet for administrering ved metoder som er velkjente innen teknikken. F.eks. kan de blandes med farma-søytisk godtagbare bæremidler eller fortynningsmidler så som etanol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, tragakantgummi, gelatin og natriumkarboksymetylcellulose, og den resulterende blanding eller oppløsning kan tilberedes ved vanlige metoder til farmasøytiske enhetsdoseformer så som kapsler, tabletter, pulvere, piller, ampuller, stikkpiller og lignende.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, så som Neostatin, kan administreres oralt eller parenteralt. F.eks. kan midlet gis intravenøst ved først å oppløse forbindelsen som skal administreres, i 0,5-10 ml etanol og å tilsettes 50-90% vann til dette. Videre fortynning kan foretas med fysiologisk saltoppløsning eller 5% dekstrose (USP), hvilket resulterer i en oppløsning med svakt sur pH. Intravenøs administrering kan fortsettes i en periode på opptil 2 timer. Nitrosourinstoffene kan administreres parenteralt eller oralt i doser på ca. 0,5-3 mg/kg.

Andre parenterale administreringsveier kan benyttes under anvendelse av en hvilken som helst preparatform som er kjent i teknikken for å tillate emulgering, oppløsning og suspensjon av forholdsvis vannuoppløselige midler eller andre forbindelser før parenteral administrering.

Når de gis oralt i enhetsdoseform, er slike forbindelser som Neostatin aktive når de tilberedes i en gelatinkapsel eller tablett i kombinasjon med farmasøytisk godtagbare binde-midler, fyllstoffer eller andre tilsetningsstoffer som er kjent i teknikken.

Efter at oppfinnelsen således er beskrevet, vil det være åpenbart at den kan varieres på mange måter. Slike variasjoner ansees ikke å gå utover rammen for oppfinnelsen, og alle slike modifikasjoner ansees å falle inn under rammen av de følgende krav.

Claims (8)

1. Forbindelser med formelen:

og farmasøytisk godtagbare salter derav, hvor hal er klor eller fluor; R er en hydroksy-, halogen-, karboksylsyregruppe eller derivater derav, og n er 4 til 7, hvor cykloalkylgruppen eventuelt kan være substituert med én eller flere metylgrupper eller hydroksylgrupper.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvor n er 4 eller 5.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvor R er klor eller en hydroksylgruppe.

4. Forbindelse ifølge krav 3 hvor hal er Cl.

5. Forbindelse ifølge krav 1 hvor n er 5.

6. Forbindelse ifølge krav 3 hvor n er 5.

7. Forbindelse ifølge krav 1 med formelen:

8. Fremgangsmåte for behandling av pattedyr- og menneske-tumorer, som omfatter administrering av en effektiv tumor-hemmende mengde av en blanding av minst én av forbindelsene ifølge et av de foregående krav, og et farmasøytisk godtagbart bæremiddel eller fortynningsmiddel, til et pattedyr eller menneske.