NO803951L - Fremgangsmaate for fraksjonering av protein - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for styrt proteinfraksjonering,. ved hvilken en kald proteinholdig oppløsning sirkuleres i kontakt med den ene side av en membran, og temperaturen styres ved sirkulasjon av en proteinfellingsmiddel-oppløsning i kontakt med den motsatte side av membranen. Strømningshastigheten økes, og mottrykk utøves på fell-ingsmiddeloppløsningen for å bringe den til å gjennomtrenge membranen, blande seg med proteinopplsningen og utfelle protein i fine partikler langs en innvendig mem-branvegg. Det utfelte protein kan konsentreres og fraskilles ved sentrifugering eller diafiltrering. Membranen foreligger fortrinnsvis i form av mange hule fibre. Styring av prosessvariable øker utbytte og renhet, mins-ker prosesstiden og nedsetter graden av denaturering.Fremgangsmåten er særlig anvendelig for utførelse av Cohn's kald-alkohol-fraksjoneringsprosess.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt en protein-frak-sjoneringsfremgangsmåte. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen hittil ukjente kombinasjoner av teknologi, som tillater samtidig tilsetning av potensielt skadelige denaturerings-løs-ningsmidler til proteinoppløsninger ved styrte hastigheter, samtidig effektiv utveksling av varme som utvikles ved tilsetning av disse løsningsmidler til væske, styring av konsentrasjon av protein, løsningsmiddel, pH og ionestyrke i komplekse blandinger av proteiner, som f.eks. blodplasma. Denne meto-dikk kan også anvendes for å fjerne organiske løsningsmidler fra proteinløsninger under unngåelse av den kraftig denaturerende virkning av løsningsmiddel som fjernes ved frysetørring, lynfordamping eller lyofilisering og under eliminering av behovet for sentrifugering i visse faser av Cohn's kaldetanolmetode, spesielt Cohn-metodene 6 og 9. Fremgangsmåten kan ide-elt tilpasses en kontinuerlig kaldetanolmetode for protein-eller plasma-fraksjonering. Endelig gjør tilsetning av det organiske løsningsmiddel på den ifølge oppfinnelsen beskrevne måte det mulig å oppnå den mest effektive dannelse av små partikler under utfelling. Temperaturstyringen, pH-styringen, styringen av ionestyrke, dannelsen av små partikler under utfelling og agglomereringsvirkningen av anvendelsen av hule fibre er synergistiske i sin virkning når det gjelder å redusere den totale prosesstid ved fremstilling av Cohn-fraksjon V (albumin) fra 5-7. dager til mindre enn 3 dager under oppnåelse av høyt utbytte, stor renhet og minimal denaturering.

Fraksjonering av blodproteiner foregår i alminnelighet

ved hjelp av metoden med alkoholfellingsmiddel som er inn-

ført av E.J.Cohn (US-patenter 2 390 074 og 2 770 616). Selv om fraksjonering av proteiner ved denne fremgangsmåte har vært en suksess, er det samlet et omfattende bevismateriale som viser at proteiner, som er isolert hovedsakelig ved anvendelse av alkohol og andre proteinfellingsmidler, ikke er naturlige produkter. Både human-albumin og særlig immun-gammaglobulin inneholder alltid aggregater, når de er isolert med etanol. Disse aggregater er til stede i mengder som viser at det er skjedd en denaturering. Mange kommersielt tilgjengelige produkter, som er fremstilt ved etanolfraksjonering og anvendelse av andre proteinfellingsmidler, inneholder opp til

25 % aggregater (se US-patent 4 136 094).

Den av Cohn foreslåtte fremgangsmåte avhenger av en av-balansering av den utfellende virkning av det organiske løs-ningsmiddel og løsningsmiddelvirkningene av de tilstedeværen-de elektrolytter. Ved en slik fremgangsmåte har fem uavhengi-ge variable bare vært styrt i varierende grad: elektrolytt-konsentrasjon, alkoholkonsentrasjon, hydrogenionkonsentrasjon, temperatur og proteinkonsentrasjon. Av den grad disse variable styres avhenger renheten, utbyttene og denatureringsgraden for hvert av de isolerte plasmaproteinene.

Cohn-prosessen praktiseres i alminnelighet som en prosjons-vis gjennomført fremgangsmåte. Avkjølt plasma behandles med reagenser i meget store beholdere. Etter pH-innstilling av plasmaet eller en underfraksjon derav avkjøles protein-opp-løsningen til en spesifikk temperatur ved eller under 0°C for å minske løsningsmiddeldenaturering av proteinet og oppnå betingelser for korrekt utfelling. Utfelling oppnås ved å tilsette fellingsmidlet (vanligvis etanol) under omrøring, idet mengden på forhånd er fastlagt med henblikk på å oppnå en endelig konsentrasjon som er hensiktsmessig for fraskillelse av den ønskede proteinfraksjon. Den hittil benyttede praksis kan hverken styre lokale temperaturvariasjoner, lokale variasjoner i proteinkonsentrasjon eller lokale variasjoner i alkoholkonsentrasjon. Det er ikke uvanlig å se lokale temperaturvariasjoner på så meget som - 15°C. Omrøring av blandingen kan ikke gjennomføres effektivt uten overdreven skumming, hvilket er uønsket. Fremgangsmåten er i det vesentlige langsom, med det resultat at konsentrasjonen av fellingsmidlet svinger kontinuerlig, helt til alt fellingsmiddel er tilsatt. Felling av fraksjoner finner derfor sted progressivt, og det kreves en lang aldringsperiode for å nå endelig likevekt. Det er i praksis meget sjeldent å nå den krevede likevektstilstand, og sluttproduktet er nesten alltid forurenset og denaturert.

Slike systemer med store masser har også den ulempe, at store volumer av plasma til stadighet er under risiko som følge av anleggsfeil og menneskelige feil. Innblanding under hensiktsmessige betingelser med henblikk på å oppnå en fullstendig fraksjoneringscyklus med Cohn-metoden krever 160 timer eller ca. 7 dager.

I US-patent 2 469 193 har Cohn forklart at når et protein som lett denatureres, f.eks. gamma-globulin, skal utfelles, må det utvises betydelig forsiktighet ved tilsetningen av fellingsmidlet til plasmaet eller en underfraksjon derav. Det anbefales således at fellingsmidlet etter en passen-de pH- og temperatur-innstilling av plasmaet, eller en underfraksjon derav, tilsettes ved hjelp av en semipermeabel membran for å unngå denaturering. Dette har ikke vært mulig i systemer av stor målestokk. Tilsetning av alkohol ved diffusjon gjennom semipermeable membraner styrer imidlertid ikke vide svingninger i proteinkonsentrasjon eller alkoholkonsentrasjon eller temperatursvingninger.

Det er naturlig å vente at fremgangsmåten i det vesentlige er langsom, og at konsentrasjonen av fellingsmidlet varie-rer kontinuerlig helt til alt fellingsmiddel er tilsatt. Lan-ge aldringsperioder kreves for å nærme seg endelig likevekt.

De uforholdsmessige tidskrav er dokumentert i US-patent

3 826 740 vedrørende en fremgangsmåte og et apparat for behand-ling av multifase-systemer, og i US-patent 3 769 009 vedrøren-de et forbedret system for blodplasma-fraksjonering.

Anvendelse av Cohn-metoden har hittil krevet et stort an-legg, utbyttene av visse fraksjoner er lave, og metoden krever at proteinene langvarig utsettes for høyt alkoholinnhold, hvilket har denaturerende virkning på noen av disse proteiner. Hittil er styring av de fem variable bare oppnådd delvis og alltid under mindre enn optimale betingelser. Det faktum at det ifølge Cohn kaldetanolpfraksjonerte gamma-globulin inneholder molekylære aggregater, gjør det uegnet til intravenøs anvendelse. Dette faktum er dokumentert og omtalt i US-patent 3 763 135 og US-patent 3 869 436. Selv når den anbefalte Cohn-metode følges nøye, har det vist seg at proteiner som er isolert med alkohol som fellingsmiddel, fører til albumin-

og immunserumglobulin-aggregater.

Watt (US-patent 3 764 009) har forsøkt å styre temperatur og alkoholtilsetning ved å innføre en fremgangsmåte for fraksjonering av proteinoppløsninger, særlig plasma, ved hvilken i rommet projiserte, konvergerende stråler samles med protein-fellingsmidlet til dannelse av en blanding hvori plasmaprotei-net øyeblikelig utfelles, og hvorfra proteinet deretter skilles. Ifølge Watt er i praksis de i rommet projiserte stråler tilstrekkelig fine til at blandingen etter samling med plasmaet er i det vesentlige øyeblikkelig. Den eksoterme reaksjon ved tilsetning av alkoholen til plasma og spredningen av den utviklede varme oppnås ifølge 'Watt, hvis strålene forenes glatt under dannelse av en sammensatt strøm som deretter ram-mer en kald overflate, således at unødig temperaturstigning, som er tilbøyelig til å bevirke proteindenaturering, unngås. Turbulens, som er et annet problem ved tilsetning av alkoholen, begrenses til et minimum eller reduseres til et ubetyde-lig nivå.

Den grad hvori de fem variable styres, bestemmer utbyttet, renheten og denatureringsgraden av de resulterende proteinfraksjoner. Denaturering av protein kan fremkalles av en kombina-sjon av hvilke som helst av eller alle følgende - turbulens og skumvirkning, høye alkoholkonsentrasjoner, varme som utvikles ved alkoholtilsetningen eller manglende evne til å holde temperaturen i oppløsningen konstant eller fjerning av alkohol fra proteinet i det siste trinn. Med unntagelse av protein-konsentras jonen , som bare styres innledningsvis ved fremgangs-måtens start, er alle disse variable i det vesentlige ikke-styrte inntil de endelige etapper av hvert trinn. Under de kritiske faser som oppstår og hvor det forekommer lokale for-skjeller i alkoholkonsentrasjon, er det kraftig varme, høy alkoholkonsentrasjon og lav proteinkonsentrasjon. Disse store svingninger, som skyldes manglende evne til å styre kritiske faktorer, resulterer i denaturering av proteinet, lav renhet og lave utbytter. For å begrense to kritiske variable, nemlig alkoholkonsentrasjonen og temperaturen, til et minimum, tilsettes alkoholen meget langsomt til proteinoppløsningen og med et minimum av omrøring for å unngå skumdenaturering. Dette gjør det nødvendig med ca. 7 dager for å fullføre den totale cyklus. Foruten de omfattende tidskrav har proteinkonsentrasjonen aldri vært tilfredsstillende styrt. Endelig skal etanol på grunn av den omfattende denatureringsvirkning og eksoterme frigjøring av varme ved dens tilsetning til vandige opp-løsninger i høye konsentrasjoner, tilsettes langsomt og i temmelig lave konsentrasjoner (55 %), hvilket stiller krav om et samlet volum på fire ganger volumet av utgangsvæsken eller

-plasmaet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en rekke prinsipper

for nøye styring av de seks vesentligste variable ved ethvert

tidspunkt i Cohn-metoden, omfattende 1) proteinkonsentrasjon, 2) tilsetningshastighet for alkohol, 3) temperaturstyring ved hjelp av et spesielt varmeutvekslingssystem, 4) styring av pH, 5) styring av ledningsvne og 6) styrt agglomerering av det protein som skal utfelles. Dette gir for første gang styring av de vesentligste variable ved Cohn-metoden. Den tid som kreves for å fullføre den totale fraksjoneringssyklus reduseres fra 7 til 3 dager, utbytter og renhet økes og denatureringsgraden reduseres betydelig.

Grovt forklart består oppfinnelsen i en styrt, hurtig proteinfraksjoneringsmetode som omfatter følgende trinn: En kald, proteinholdig oppløsning, f.eks. plasma, sirkuleres gjennom et begrenset rom, som er avgrenset av den ene side av en porøs membran, som f.eks. en hul fiber. Temperaturen i pro-teinoppløsningen styres ved å sirkulere en flytende protein-fellingsmiddeloppløsning i kontakt med den motsatte side av membranen. Ved å øke strømningshastigheten og innstille mottrykket bringes fellingsmiddeloppløsningen til å gjennomtrenge membranen og bevirke utfelling av fine partikler av plas-maprotein langs membranens første side. De utfelte proteinpartikler fraskilles deretter. Systemet kan returskylles med puffere for å innstille pH-nivå, Na<+->konsentrasjon og ionestyrke.

Oppfinnelsen er illustrert på de medfølgende tegninger, hvor tilsvarende deler er identifisert med samme henvisnings-tall, og hvori: Fig. 1 skjematisk viser én systemform som omfatter foreliggende oppfinnelse; Fig. 2a og 2b skjematisk viser én form for fraksjone-ringscelle, idet én operasjonsform er vist i fig. 2a og én annen operasjonsform er vist i fig. 2b; Fig. 3 grafisk viser hastighet og konsentrasjon av alkohol i plasma, temperaturen i inngående og utgående plasma og temperaturen i inn- og utgående alkohol, målt ved den i eksempel 1 omtalte praksis;

Fig. 4 grafisk viser hastigheten for alkoholtilsetning

og konsentrasjon i plasma, temperatur i inngående og utgående plasma før og etter alkoholtilsetning og temperatur i inn-

og utgående varmeutvekslende alkohol målt ved hjelp av den i eksempel 2 omtalte praksis; og

Fig. 5 grafisk viser betingelsene målt ved hjelp av

den i eksempel 3 omtalte praksis.

Idet det henvises til tegningene, og spesielt til fig. 1, er det vist et eksempel på et system til utførelse av fraksjo-neringsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse. Systemet omfatter en isolert plasmabeholder 10, en isolert alkoholbehol-der 11 og en pufferbeholder 12, hver utstyrt med en rører 13, varmeutvekslingsorganer 14 og temperaturangivénde organer 15. Videre er tanken 12 utstyrt med en ledningsevnetøler 16 og en pH-føler 17. Et par alkohol- og plasma-blande- og varmeut-vekslings-fraksjoneringsbeholdere 18 foreligger anbragt parallelt.

Som det best sees skjematisk i fig. 2 omfatter hver beholder eller celle 18 flere porøse membran-fibre 19, som alle ved den ene ende kommuniserer med et innløpskammer 20 og ved den annen ende med et utløpskammer 21. Hver beholder er utstyrt med en innløpsåpning 22 og en utløpsåpning 23, som hver er utstyrt med en temperaturføler 15. Alle fibre 19 strekker seg gjennom og er omgitt av et sentralt kammer 24 med en inn-løpsåpning 25 og en utløpsåpning 26, som hver også har en temperaturføler 15. Fig. 2a viser cellen ved én operasjonsform med etanol (angitt ved skravering) som passerer gjennom fibre 19 og plasma som passerer gjennom det rom som omgir fibrene. Fig. 2b viser den motsatte operasjonsform 2, hvor plasmaet passerer gjennom fibrene, og alkoholen, igjen angitt ved skravering, passerer gjennom det omgivende rom.

Plasmabeholderen 10 er forbundet med.blandecellene 18

ved hjelp av en rør- eller kanal-dannende ledning 27, som strekker seg fra beholderen 10 til innløpsåpningen 22 for blandecellene. Ledningen 27 omfatter en styrt doseringspum-pe 28 for sirkulering av plasma. Videre finnes en tempera-turf øler 15, en pH-føler 17, en alkoholkonsentrasjonsføler 29, en proteinføler 30, en strømningsmåler 31, et trykkontroll-organ 33 og en trykkmåler 34, alle med det formål å bestemme og styre betingelsene for væskestrømning gjennom ledningen. Treveisventiler 32 i ledningen gjør det mulig å dirigere strømningen etter ønske. Utløpsåpningene 22 for blandecellene 18 er forbundet tilbake til plasmabeholderen 10 gjennom en rør- eller kanaldannende ledning 35, hvilke ledninger har temperaturfølere 15, pH-følere 17, alkoholfølere 29, strøm-

ningsmålere 31, trykkventiler 36 og trykkmålere 34 med henblikk på å kunne bestemme og styre strømningsbetingelsene. Alkoholbeholderen 11 er gjennom ledning 37 og pumpe 28 forbundet med innløpsåpningen 25 for blandecellen 18 oa aiennom . ledning 38 med utløpsåpningen26for sairrn^ celle. Ledningen 37 omfatter strømningsmåler 31, trykkventil 36 og trykkontroll-organ 33. Pufferbeholderen 12 er på tilsvarende måte forbundet med den andre av blandecellene gjennom ledninger 39 og 40.

Fremgangsmåten innebærer fortrinnsvis anvendelse av

hule fibre av enten Teflon-, divinylakrylonitril-, polysulfon-eller celluloseacetat-konstitusjon. Alternative systemer kan omfatte anvendelse av spiralsnodde, rørformede membraner, plate- og rammesystemer som gjør bruk av membraner av tilsvarende sammensetning og porestørrelse.

De foretrukne, hule fibermembraner er fremstilt som en-kelte, sammenhengende strukturer, som kan tåle trykk på hver side av den aktive membranoverflate, uten at det skjer brudd på eller beskadigelse av den aktive membranoverflate. Hule fibre fremstilles ved "spinning" av en polymeroppløsning, som ved stivning eller størkning danner den anisotrope membran i en rørformet konfigurasjon. Disse hule fibre består av en meget tynn, glatt membranoverflate på innersiden av fiberhul-rommet med styrt poretetthet og molekylavvisningskoeffisient, og en grov, svampaktig membranstruktur på yttersiden av fiberen med en løsere og mer åpen porekonfigurasjon.

Denne membranstruktur er egnet til å utsette både innersiden og yttersiden av den hule fiber for trykk. Anvendelse av den hule fibermodul på samme måte som ved ultrafiltrering foregår ved å sette trykk på innersiden av den hule fiber. Anvendelse av den hule fibermodul på samme måte som ved "returskylling" foregår ved å sette trykk på yttersiden eller skallsiden av den hule fiber. Muligheten til å returskyl-le hule fibre er viktig for anvendelsen av hule fibre ved tilsetningen av kald etanol ved Cohn-prosessen.

Selv om etanol er et foretrukket proteinutfellingsmid-del kan det anvendes en rekke alternative løsningsmidler og oppløsninger. Disse omfatter metanol, butanol, aceton, for-bindelser fra glykolrekken, polyetylenglykol, dioksan osv., nøytrale salter som f.eks. fosfater, sulfater osv. eller en blanding av reaktanter, som f.eks. alkohol og salter, og endelig blokk-kopolymerer av etylenoksyd og polyisopropylen. Oppfinnelsen er, selv om den er beskrevet i forbindelse med fraksjonering av blodplasma, anvendbar til fraksjonering av proteinoppløsninger fra en hvilken som helst kilde, det være seg dyr (mennesker, kveg, griser osv.), bakterier eller planter.

Plasma med en temperatur mellom 4°C og -7°C pumpes gjennom hulrommet i de hule fibre. Denne temperatur kan styres følsomt og nøyaktig ved å pumpe 50-80%ig etanol ved en temperatur mellom -20 og -10°C på yttersiden av de hule fibre. Den kalde etanol tilsettes til det resirkulerende plasma inne i fibrene ved simpelthen å øke strømningshastigheten og innstille mottrykket på yttersiden av de hule fibre tilstrekkelig til å bringe alkoholen til å gjennomtrenge porene i den hule fiber. Ved å bringe den kalde etanol i kontakt med plasmaet på denne måte er lokal varmeoppbygning minimal som følge av hastigheten (61-305 cm/sek) av plasmaet gjennom den hule fiber og det tynne (monomolekylære) lag av alkohol, som kontinuerlig kommer i kontakt med plasmaet ved membranoverflaten. Denne kontakt over et stort overflateareal skapt av de hule fibermembraner bringer meget små partikler til å falle ut, hvilket fremmer skarpe fraksjoner, høut utbytte og minimal kontakttid for fullstendig utfelling.

Denne kritiske temperaturstyring av plasma ved grensefla-ten mellom alkohol og plasma oppnås ved å innstille følgende lettstyrte faktorer. Temperaturen og strømningshastigheten til alkoholen virker sammen for oppnåelse av effektiv og øyeblikkelig varmeutveksling og virker synergistisk med strøm-ningshastigheten og temperaturen til plasmaet. Varme spres derfor effektivt, lokale konsentrasjoner av alkohol begrenses til et minimum, og plasma-proteinkonsentrasjonen holdes ved konsentrasjoner som begunstiger optimal dannelse av optimalt dimensjonerte proteinfellinger.

Tilsetningen av puffere kan foregå på tilsvarende "retur-skyllings"-målte, noe som tillater hurtig og glatt ekvilibre-ring til forskjellige pH-nivåer, Na<+->konsentrasjoner og ione-styrker.

Tilsetningen av kald etanol og pufferoppløsninger kan styrkes nøyaktig ved trykkforskjellen mellom innersiden (hulrom) av de hule fibre og yttersiden (skall) av de hule fibre. Den høye hastighet av plasmaet som strømmer gjennom hulrommet av fibrene, fremmer den mest effektive kontakt mellom alkohol og plasma og virker som en agglomerator for å ska-pe fine partikler av plasma som faller ut, samtidig med at en-hver reaksjonsvarme som stammer fra sammenblandingen av plasma og kald etanol begrenses til et minimum.

Dannelsen av optimal partikkelstørrelse under utfelling, temperaturstyring, pH-styring og agglomererende effekt av de hule fibre virker synergistisk når det gjelder å redusere den totale fremgangsmåtetid ved fremstilling av Cohn-fraksjon V (human-albumin) fra 5-7 dager til mindre enn 3 dager.

En annen fordel ved den foreslåtte anvendelse av hule fibre ved tilsetning av proteinfellingsmidler, f.eks. kald etanol, til plasma er elimineringen av behovet for åpne por-sjonstanker, hvorved risikoen for pyrogene tap av plasmaproteiner reduseres. Dén foreliggende fremgangsmåte kan gjennom-føres i lukkede tanker, da pH, temperatur og alkoholtilsetning styres i det indre av den hule fibermodul. Spesielle blande-organer og alkoholtilsetningsorganer i tankene er også eliminert, da blanding og alkoholtilsetning'foregår i den hule fiber. Da temperatur, partikkelstørrelse og pH kan styres nøye ved anvendelse av hule fibre, er behovet for meget kostbare lavforskyvningspumper eliminert, og det kan anvendes modifiser-te lavforskyvnings-sentrifugalpumper til mer moderat pris.

Noen eksperter har fremsatt den antagelse at forskyv-

ning tilveiebragt ved pumping og strømning gjennom snevre ka-nalrør (hule fibre) medfører betydelig denaturering. (Charm, S.E.: Shear Inactivation in Processing Biologic Material, DHEW Publication nr. NIH 78-1422, side 27). Hule "Romicon"-fibre

er imidlertid anvendt for opparbeidelse av enzymer i kommersi-ell målestokk med minimalt tap av enzymaktivitet. Disse kommer-sielle systemer gjør også bruk av pumper av sentrifugaltypen.

Andre eksperter (Dunhill, P.: The Action of Shear on Enzymic Proteins, DHEW Publication nr. NIH 781422, side 40)

har foreslått at forskyvning i seg selv ikke er skadelig (ikke bevirker denaturering) for enzymer og labile proteiner, men at utsettelse for oksygen (atmosfærisk luft) og/eller forhøyede temperaturer er de denaturerende betingelser som bevirker tap av enzymaktivitet og protein-integritet.

Denne hypotese synes å bli understøttet av det arbeid som er utført med hule "Romicon"-fibre ved opparbeidelse av både enzymer og plasmaproteiner. Det er mulig at det som er blitt oppfattet som forskyvningsdenaturering av enzymer og proteiner,

i virkeligheten har vært denaturering bevirket av forhøyede temperaturer og utsettelse for atmosfærisk luft, særlig skumning.

Nevnte evne til temperaturstyring med den kalde etanol på enten yttersidene eller innersidene av de hule fibre svarende til en rørformet varmeveksler over et areal på 1,4 m 2 eller 2,5 m pr. modul eliminerer så å si lokal oppvarmning, mens elimineringen av åpne tanker og blandere i porsjonstankene hindrer skumning og overdreven utsettelse for atmosfærisk luft. Dette gjør det mulig å anvende sentrifugalpumper i forbindel-

se med hule fibre til plasmapumping, samtidig med at tilsetningen av kald etanol styres ved anvendelse av en trykkjøletank eller en kjøletank méd sentrifugalpumpe. Denaturering av pfo-teinaggregasjon vil bli begrenset til et minimum under disse betingelser, likesom risikoen for pyrogen forurensning begrenses til et minimum.

Alternativt kan alkoholen tilsettes til plasmaet ved om-bytting av avdelingene, dvs. alkoholstrømning gjennom innersiden av den hule fiber og plasma sirkulerende på yttersiden.

Se fig. 2, Ved utførelsesform 1, fig. 2a, sirkuleres alkoholen inne i den hule fiber. Ved utførelsesform 2, fig. 2b, sirkuleres alkoholen utenfor den hule fiber.

Endelig medfører evnen til å styre proteinkonsentrasjon eliminering av behovet for store lagerbeholdere, som ved praksis til nå er anvendt for å passe til en opptil 4 gangers volumøkning etter alkoholtilsetning.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av følgen-

de eksempler.

Eksempel 1

Prosessdata Cohn<1>s metode nr. 12 - Utførelsesform 1,

Fig. 2a - Kryo-utfelt plasma.

Fraskilling av fraksjon I

Det forsøksanlegg som anvendes i disse eksempler, er

vist i fig. 1. Alkohol- og plasma-avdelingene i celler 18 er vist i fig. 2a og 2b. Sammenblandingen av alkohol og plasma og varmevekslingen foregår også i denne mellomflate. Kryo-utfelt

utgangsplasma (1,6 liter, 12,2 mS ved 24°C, inneholdende 93 g totalt protein: 54,4 g albumin og 13,5 g IgG) avkjøles til +1°C uten at is får lov å dannes. 3 ml natriumacetatpuffer (4,Om HAc + 0,2m natriumacetat, pH 4,0) tilsettes for å innstille pH i plasmaet fra 7,86 til 7,1 - 0,1 (alle pH-bestemmel-ser er 1:5 fortynninger av prøve med 0,9%ig saltoppløsning). Alkohol (80%ig) til tilsetning omrøres i en lukket tank ved en temperatur på -11°C. Plasmaet omrøres i en lukket tank, og temperaturen innstilles for å svare til de ønskede betingelser. Proteinet resirkuleres på yttersiden av den hule fiber ved en hastighet på 2500 ml/min. På samme tid resirkuleres den kalde etanol på innersiden av fibrene med en hastighet på 300 ml/min. For å oppnå en endelig etanolkonsentrasjon i plasmaet på 8 % ble 178 ml 80%ig etanol satt til plasmaet ved å øke hastigheten av etanol-strømningen, inntil det ble observert et mottrykk på 1,4 kg/cm 2. Under disse betingelser var tilsetningen av alkohol fullendt på 7 0 minutter. I løpet av dette tidsrom gikk plasma-etanolkonsentrasjonen fra 0 % til 8 %, plasmatemperaturen falt fra 0°C til -2,5°C, og etanoltemperaturen steg fra -11 til -8,5°C. Hastigheten og konsentrasjonen av alkohol i plasma, temperaturen av inngående plasma (før blanding med.alkohol) , temperaturen i utgående plasma (etter alkoholtilsetning) og temperaturen i inngående og utgående alkohol er vist i fig. 3.

Bunnfall I ble fjernet ved sentrifugering i 15 minutter, 27000 x G. Bunnfall I ble resuspendert med is til 420 ml. Dette bunnfall er hovedsakelig fibrinogen. Det inneholder

1,9 g totalt protein (0,6 g albumin og 0,4 g IgG). Overstående materiale I inneholder 87 g totalt protein (51 g albumin, 12,1 g IgG) i et volum på 1550 ml. Ledningsevnen til overstående materiale I er 8,7 mS ved 24°C. Proteinkjøletanken og yttersiden av den hule fiberen renses med destillert vann og skylles med 20%ig etanol.

Fraskilling av fraksjon II + III

Overstående materiale I anbringes.i plasmakjøletanken og holdes ved fra -2,5 til -3°C. pH-verdien innstilles på 6,8 0,05 ved tilsetning av 3,1 ml natriumacetatpuffer. Det overstående materiale bringes fra 8 % etanol til 20 % etanol ved tilsetning av 310 ml 80%ig etanol under anvendelse av de samme strømningshas-tighets- og trykk-betingelser som beskrevet under "Fraskilling av fraksjon I". Fig. 3 viser at under denne 30 minutters tilsetning senkes temperaturen i overstående materiale I til -6°C, mens etanoltemperaturen stiger fra -13 til -6°C.

Bunnfall II + III fjernes ved sentrifugering i 15 minutter, -6°C, 27000 x G. Bunnfall II + III gjensuspenderes med is til et volum på 1,16 liter. Det inneholder 19,7 g totalt protein (1,9 g albumin og 10,5 g IgG). Overstående materiale II + III inneholder 60,5 g totalt protein (43,7 g albumin og. 1,4 g IgG) i et volum på 1,7 liter. Dets ledningsevne er 4,8 mS ved 24°C. Proteinkjøletanken og yttersiden av den hule fiber skylles med destillert vann og 40%ig etanol.' Den 80%ige etanol får lov å falle til -15°C ved forberedelsene til fra-skillingen av fraksjon IV^.

Fraskilling av fraksjon IV^

Overstående materiale II + III føres tilbake til plasma-kjøletanken og holdes ved -6°C. pH-verdien innstilles på

5,4 - 0,1 ved tilsetning av 13 ml natriumacetatpuffer. Det overstående materiale fortynnes til 18 % etanol ved tilsetning av 190 g destillert, knust is, som får lov å blandes inntil isen er oppløst. Dette trinn tar 25 minutter.

Bunnfall IV^fjernes ved sentrifugering i 15 minutter, -6°C, 27000 x G. Det resuspenderes med. is til et endelig volum på 830 ml. Bunnfall IV^ inneholder 6,6 g totalt protein (1,6 g albumin og 0,9 g IgG). Overstående materiale IV^inneholder 50,4 g totalt protein (39,4 g albumin og 0,2 g IgG) i et volum på 1,8 liter. Dets ledningsevne er 5,3 mS ved 24°C.

Proteinkjøletanken renses med destillert vann. Den 40%ige etanol evakueres fra den utvendige side av den hule fiber.

Fraskilling av fraksjon IV^

Overstående materiale IV^anbringes i kjøletanken og holdes ved -6°C. pH-verdien innstilles på 5,8-^0,05 ved tilsetning av 20 ml av 1,Om NaHCO^• Det overstående materiale bringes fra 18 % etanol til 40 % etanol ved tilsetning av 998 ml 80%-ig etanol. Det anvendes de samme innledningsvise strømningshastigheter som ved fraskilling av fraksjon I, men under tilsetningen økes etanolstrømningen inntil det obser-veres et mottrykk på 1,8 kg/cm . Fig. 3 viser at i løpet av denne 80 minutters tilsetning holdes plasmatemperaturen mellom -6 og -9°C, mens etanoltemperaturen holdes under -7°C. Bunnfall IV4fjernes ved sentrifugering i 15 minutter, -6°C, 27000 x G, og resuspenderes i is til oppnåelse av et endelig volum på 730 ml. Det inneholder 6,6 g totalt protein (1,6 g albumin og 0,9 g IgG). Overstående materiale IV^inneholder 40,2 g totalt protein (35,8 g albumin og 0,0 g IgG) i et volum på 2,68 liter. Dets ledningsevne ved 24°C er 2,5 mS.

Proteinkjøletanken renses med destillert vann og skilles fra den hule fiber. Den hule fiber og etanol,kjøletanken renses på dette tidspunkt.

Fraskilling av fraksjon V

Overstående materiale IV^anbringes i kjøletanken og holdes mellom -7 og -11°C. pH-verdien innstilles på 4,8 - 0,05 ved tilsetning av 38 ml natriumacetatpuffer. Plasmaet blir melkehvitt. Dette trinn tar 60-70 minutter, og plasmatemperaturen er hele tiden under -7°C.

Bunnfall V fjernes ved sentrifugering i 15 minutter, -6°C, 27000 x G, og resuspenderes til et volum på 3,0 liter med is. Dette bunnfall er hovedsakelig albumin. Det inneholder 37,5 g totalt protein ved Biuret-bestemmelse (37,7 g albumin ved immunokjemisk prøve og 0,0 g IgG). Overstående materiale V inneholder 2,6 g totalt protein (0,1 g albumin og 0,0 glgG)

i et volum på 2,18 liter. Dets ledningsevne er 3,0 mS ved 24°C..

De vesentlige trekk, som f.eks. totale proteinutbytter av IgG og albumin, er samlet i.tabell I.

Eksempel 2

Prosessdata - Cohn's metode nr. 14 - Utførelses-form 1 og utførelsesform 2 - Stabilisert human- plasma Stabilisert human-plasma ble fremstilt ved den metode som er beskrevet i US-patenter 3 998 946 og 4 136 094. Stabilise-ring av plasma resulterer i fjerning av fibrinogen, størknings-faktorene, komplementsystemet, kininogenene, lipoproteinene og det proteolyttiske enzym plasmin-plasminogen. Da det er fritt for fibrinogen, kreves ikke fraskilling av fraksjon I. For det gitte eksempel gjensirkuleres proteinet på den utvendige side av den hule fiber og er omtalt som utførelsesform nr. 1 (fig. 2a). Når tilsetningen av alkohol foretas med proteinet på innersiden av den hule fiber, omtales det som utførelses-form nr. 2 (fig. 2b). Tilsetningshastigheter for alkohol og konsentrasjon i plasma, temperatur av inngående og utgående plasma før og etter alkoholtilsetning og temperaturen i den varmevekslende alkohol (inn- og utgående) er vist grafisk i fig. 4.

Fraskilling av fraksjon II + III

Stabilisert utgangsplasma (1,8 liter, 11,4 mS ved 24°C,

inneholdende 120,1 g totalt protein: 98,1 g albumin og 11,4 g IgG) ble avkjølt til +1°C, uten at is fikk lov å dannes. 4 ml natriumacetatpuffer (4,Om HAc + 0,2m natriumacetat, pH 4,0) ble tilsatt for å innstille pH fra 7,53 til 7,1 0,1 (alle pH-bestemmelser er 1:5 fortynninger av prøve med 0,9%ig saltopp-løsning). Alkohol (80%ig) for tilsetning omrøres i en lukket tank ved en temperatur på -11,5°C. Plasmaet omrøres i en lukket tank, og temperaturen innstilles etter ønskede betingelser. Proteinet gjensirkuleres på yttersiden av den hule fiber (utførelsesform nr. 1) ved en hastighet på 2500 ml/min. Samtidig resirkuleres den kalde etanol på innersiden av fibrene, med en hastighet på 300 ml/min.

For oppnåelse av en endelig etanolkonsentrasjon i plasmaet på 8 % ble 178 ml 80%ig etanol tilsatt til plasmaet ved å øke hastigheten på etanolstrømningen, inntil det ble observert et mottrykk på 1,8 kg/cm 2. Under disse betingelser var tilsetningen av alkohol fullført i løpet av 25 minutter. I dette tidsrom steg plasmaetanolkonsentrasjonen fra 0 til 20 %, plasmatemperaturen falt fra 0 til -5°C, og etanoltemperaturen steg fra -11,5 til -5,5°C (se fig. 4 - II+III).

Når utførelsesform nr. 2 anvendes, resirkuleres proteinet på innersiden av den hule fiber ved en hastighet på 400 ml/ min. Da etanolen resirkuleres på yttersiden av den hule fiberen, er mottrykket, som bare skyldes plasmaet, 0,84 kg/cm .

En skrueklemme anvendes på etanol-utgangsledningen, inntil det totale mottrykk når 1,4 kg/cm 2. Denne tilsetning tar 70 minutter. Etanoltemperaturen holdes under -5°C, og proteintemperaturen holdes under -3°C under hele tilsetningen.

Bunnfall II + III ble fjernet ved sentrifugering i 15 mi-. nutter, -5°C, 27000 x G. Bunnfall II + III ble resuspendert med is til 1270 ml. Dette bunnfall er hovedsakelig IgC. Det. inneholder 132 g totalt protein (3,4 g albumin og 8,4 g IgG). Overstående materiale II + III inneholder 89,1 g totalt protein (75,9 g albumin, 2,5 g IgG) i et volum på 2160 ml. Ledningsevnen for overstående materiale II + III er 5,0 mS ved 24°C. Protein-kjøletanken og den utvendige side av den hule fiber renses med destillert vann og skylles med 40% ig etanol.

Fraskilling av fraksjon IV^

Overstående materiale II + III føres tilbake til kjøle-tanken og holdes ved -3,5°C. pH-verdien innstilles på 5,4-0,1 ved tilsetning av 12 ml natriumacetatpuffer. Det overstående materiale fortynnes til 18 % etanol ved tilsetning av 240 g destillert, knust is, som får lov å blandes inntil isen er oppløst. Dette trinn tar 25 minutter. Tilsetningen av is bringer plasmatemperaturen til å falle til -8°C (se fig. 4 - ivx).

Bunnfall IV-^ fjernes ved sentrif ugering i 15 minutter,

-6°C, 27000 x G. Det resuspenderes med is til et endelig volum på 960 ml. Bunnfall IV^inneholder 5,1 g totalt protein (2,0 g albumin og 1,4 g IgG). Overstående materiale IV^inneholder 86,3 g totalt protein (77,1 g albumin og 1,0 g IgG)

i et volum på 2,34 liter. Dets ledningsevne er 5,4 mS ved 24°C.

Protein-kjøletanken renses med destillert vann. Den 40%ige etanol evakueres fra den utvendige side av den hule fiber.

Fraskilling av fraksjon IV^

Overstående materiale IV^anbringes i kjøletanken og holdes ved -6°C. pH-verdien innstilles på 5,8 - 0,05 ved tilsetning av 17 ml l,0m NaHCO^. Det overstående materiale bringes fra 18 % etanol til 40 % etanol ved tilsetning av 1294 ml 80%ig etanol. Samme strømningshastigheter og mottrykk anvendes som ved fraskilling av fraksjon II + III. Under denne 55 minutters tilsetning holdes plasmatemperaturen mellom -6 og -8,5°C, da etanoltemperaturen holdes under -9°C (se fig. 4 - . IV4> • Når utførelsesform nr. 2 anvendes, er betingelsene de samme som i fraksjon II + III, utførelsesform nr. 1, unntatt at mottrykket fåo r nå 1,8 kg/cm 2. Etanoltemperaturen holdes under -8°C, og proteintemperaturen holdes under -5°C under hele tilsetningen. Tilsetningen ble innstilt til fullføring i løpet av 250 minutter.

Bunnfall IV^ fjernes ved sentrifugering i 15 minutter,

-6°C, 27000 x G, og-resuspenderes i is for oppnåelse av et endelig volum på 1100 ml. Det inneholder 19,9 g totalt protein (13,0 g albumin og 0,9 g IgG). Overstående materiale IV^inneholder 64,6 g totalt protein (56,4 g albumin og 0,0 g IgG)

i et volum på 3,4 liter. Dets ledningsevne er 2,4 mS ved 24°C.

Proteinkjøletanken renses med destillert vann og adskilles fra den hule fiber. Den hule fiber og etanol-kjøletanken kan renses på dette tidspunkt.

Fraskilling av fraksjon V

Overstående materiale IV^anbringes i kjøletanken og holdes mellom -6,5 og -7,5°C. pH-verdien innstilles på

4,8 - 0,105 ved tilsetning av 33 ml natriumacetatpuffer. Plasmaet blir melkehvitt. Dette trinn tar 55 minutter, og plasmatemperaturen er hele tiden under -6°C (se fig. 4 - V).

Bunnfall V fjernes ved sentrifugering i 15 minutter, -6°C, 27000 x G, og resuspenderes til et volum på 2,8 liter med is. Dette bunnfall er hovedsakelig albumin. Det inneholder 57,4 g totalt protein ifølge Biuret-metoden (58,7 g albumin ved immunokjemisk prøve og 0,0 IgG).

Overstående materiale V inneholder 3,8 g. totalt protein (0,8 g albumin og 0,0 g IgG) i et volum på 2,56 liter. Dets ledningsevne er 2,9 mS ved 24°C.

De vesentligste trekk vedrørende IgG- og albumin-utbytte for dette forsøk er vist i tabell II.

Tabell III sammenfatter IgG- og albumin-utbyttene for

fem forsøk med kryo-fattig plasma og fire forsøk med stabilisert human-plasma. Albumin-utbyttene var i gjennomsnitt 69,5 3,1 % for forsøkene med stabilisert human-plasma og 69,8 - 1,8 % for forsøkene med kryo-utfelt human-plasma. Albumin isolert under disse forsøk inneholdt mindre enn 2 % forurensninger med andre plasmaproteiner.

IgG-bunnfallet II + III inneholdt betydelige konsentrasjoner av albumin, mens utbyttene av IgG var 76,6 - 7,5 % for stabilisert human-plasma og 73,9 - 4,3 % for kryo-utfelt human-plasma. Gjenbehandling av bunnfall II + III i dette system etter Cohn-metode 6 ga et i det vesentlige rent IgG med et totalt utbytte, basert på IgG til stede i utgangsplasma på

64,7 %.

Plasmatemperaturstyring under etanoltilsetning

Det er vesentlige ting å legge vekt på vedrørende den nøyaktige karakter av den temperaturstyring som oppnås rutine-messig i dette system, når konsentrert etanol tilsettes til og blandes med plasma. For det første kan alkohol tilsettes gjennom hule fibre ved styrte hastigheter, som kan være meget langsomme eller temmelig hurtige. Fig. 3 og 4 illustrerer at denne tilsetning kan styres slik at etanoltilsetning foregår med konstant, ensartet hastighet. For det annet kan temperaturen i plasmaet under etanoltilsetningen, uansett tilset-ningshastigheten, styres nøye, slik at det i gjennomsnitt er en forskjell på 0,4°C mellom temperaturen i plasma før etanoltilsetning og umiddelbart etter blanding i den hule fiber. Denne fine temperaturstyring oppnås og kontrolleres ved hjelp av: a) alkoholtemperaturen og alkoholstrømningshastigheten gjennom den hule fiber, og b) plasmatemperatur og plasmastrøm-ningshastighet gjennom den hule fiber. Som det klart er vist

i fig. 3 og 4, tjener alkoholen som den vesentlige kilde for varmeveksling, og denne styring fremmes av utformingen og konstruksjonen av hulfibersystemet, når det anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse.

Tid krevet for fraksjonering av plasma ifølge Cohn- metode 9

Et annet betydningsfullt trekk ved fremgangsmåten er reduksjonen av den tid som kreves for å fraksjonere human-plasma fullstendig til albumin. Som det fremgår av fig. 3 er den tid som kreves til hvert trinn kort, med et totalt tidsforbruk på 10 1/2 timer, og albuminutbyttet ligger i gjennomsnitt på 70 % med mindre enn 2 % ikke-albumin-forurensninger.

Når det anvendes stabilisert plasma (eksempel 2 og fig. 4), reduseres den totale tid til 8 timer og resulterer i et i det vesentlige rent albumin med utbytter på 70 %.

Eksempel 3.

Diafiltrering

Diafiltrering kan anvendes for å erstatte sentrifugering og oppløsningsmiddel-fjerning. Det følgende er et eksempel på dens anvendelse for opparbeiding av albumin under eliminering av sentrifugering og løsningsmiddel-fjerning ved hjelp av andre denaturerende metoder. Etter tilsetning av etanol til 40 % kan diafiltrering anvendes for å konsentrere proteinet og fjerne etanolen. Prosessen er identisk med eksempel 1 eller 2 inntil etter tilsetningen av etanol til en plasmakonsentrasjon på 40 %.

De vesentlige trekk i form av plasmatemperatur, plasmavo-lum, proteinkonsentrasjon og plasma-etanolkonsentrasjon er vist i fig. 5. Før sentrifugeringen blir plasmaet som inneholder 40 % etanol konsentrert fra 3,4 5 til 1,88 liter. Denne prosess var innstilt med henblikk på fullføring i løpet av 250 minutter. Proteintemperaturen holdes under -3°C. Proteinkon-sentras jonen i plasmaetøkes fra 26 mg/ml til 48 mg/ml. Plasmaet pumpes på den innvendige siden av den hule fiber med en hastighet på 3000 ml/min., hvilket gir en mottrykksavles-ning på 1,8 kg/cm 2. Filtrat-fjerning foregår ved en gjennom-snittlig hastighet på 390 ml/time ved den beskrevne temperatur.

Det konsentrerte plasma sentrifugeres deretter i 15 minutter, -6°C, 27000 x G. Sammensetningen av bunnfall IV^og overstående materiale IV^er den samme som beskrevet for eksempel 1 og 2. Volumet av overstående materiale IV^er imidlertid redusert til 1,70 liter med en proteinkonsentrasjon på 42,5 mg/ml.

Overstående materiale IV^anbringes i kjøletanken og holdes ved -6°C. Istedenfor å senke pH til 4,8 etterfulgt av sentrifugering bringes plasmaet simpelthen til 0 % etanol ved diafiltrering med is og kaldt vann.

Til å begynne med gjensirkuleres plasmaet på den innvendige side av den hule fiber, inntil det obserberes et mottrykk på 1,8 kg/cm 2. Strømningshastigheten for plasma vil være på 3000 ml/min. Det tilsettes 1200 g destillert is til plasmaet for å redusere etanolkonsentrasjonen fra 40 til 23 %. Denne tilsetning øker plasmavolumet til 2,95 liter. Etterhvert som isen oppløses, fortsettes konsentrering, inntil plasmavolumet er redusert til 1,95 liter. Ytterligere 120 g.destillert is tilsettes til plasmaet for å redusere etanolkonsentrasjonen fra 23 til 10 %. Denne tilsetning øker plasmavolumet til 2,95 liter. Etterhvert som isen oppløses fortsettes konsentrering inntil plasmavolumet er redusert til ca. 2,5 liter. Filtrat-strømningshastigheten er i gjennomsnitt 900 ml/time under istilsetningen, som er fullført i løpet åv 120 minutter.

Da etanolkonsentrasjonen i plasmaet er redusert til 10 %, er det fordelaktig å la plasmatemperaturen stige til over 0°C. Konsentreringshastigheten for plasmaet er sterkt tempe-raturavhengig, og utstrømningshastigheten for filtratet stiger fra 900 ml/time til 5800 ml/time, etterhvert som plasmatemperaturen stiger til 14°C. Reduksjonen av etanolkonsentrasjonen fra 10 til 0 % foregår ved å tilsette 3,5 liter kaldt, destillert vann til plasmaet i løpet av 2 timer. Da konsentreringshastigheten er større enn vanntilsetningshastig-heten, avtar plasmavolumet til et endelig volum på 1,6 liter og en endelig proteinkonsentrasjon på 45,5 mg/ml. Det resulterende albumin er fritt for alkohol og IgG, foreligger i konsentrert tilstand og ble ikke tillatt å falle ut. Selv om det er illustrert fraskilling av albumin ved diafiltrering, kan samme metode anvendes for fjerning og fraskilling av alkohol og andre oppløsningsmidler fra proteinfraksjoner fra et hvilket som helst trinn i det totale system.

Det er klart at mange modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse som ovenfor beskrevet kan foretas, uten at det fravikes fra oppfinnelsens ånd og område. De spesifikke utførelsesformer som er beskrevet er bare gitt som eksempler og oppfinnelsen er bare begrenset av følgende krav.

Claims (26)

1. Fremgangsmåte for styrt, hurtig proteinfraksjonering, karakterisert ved at den omfatter A) sirkulasjon av en kald proteinoppløsning gjennom et begrenset rom som er avgrenset av den ene side av en porøs membran, B) temperaturstyring ved sirkulasjon av en flytende proteinfellingsmiddeloppløsning i kontakt med den motsatte side av nevnte membran, C) økning av strømningshastigheten og trykket for fell-ingsmiddeloppløsningen på den motsatte side av nevnte membran for å bringe proteinfellingsmiddelopplø sningen til å trenge gjennom membranen og blande seg med proteinet fra oppløsnin-gen langs den første side av membranveggen, og D) fraskilling av de utfelte proteinpartikler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at temperaturen i proteinoppløsningen styres ved sirkulasjon av en kald proteinfellingsmiddeloppløsning.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at A) det resulterende overstående materiale igjen avkjøles, B) pH, Na <+-> konsentrasjon og ionestyrke i det overstående materiale innstilles, og det overstående materiale resirkuleres gjennom et begrenset rom som avgrenses av den ene side av en porøs membran, C) temperaturen styres ved å pumpe en kald, flytende proteinfellingsmiddeloppløsning i kontakt med den motsatte si-de av nevnte membran, D) strømningshastigheten og trykket i fellingsmiddel-oppløsningen på den motsatte side av membranen økes for å bringe proteinfellingsmiddeloppløsningen til å gjennomtrenge membranen, blande seg med det overstående materiale og utfelle ytterligere fine partikler av protein langs den første side av membranveggen, og D) de ytterligere utfelte proteinpartikler fraskilles.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakteri sert ved at A) pH, Na <+-> konsentrasjon og ionestyrke av sukessive overstående materialer innstilles ytterligere, og det overstående materiale.sirkuleres i kontakt med den ene side av membranen, B) ytterligere kald proteinfellingsmiddeloppløsning sirkuleres i kontakt med den motsatte side av membranen for å styre temperaturen i det overstående materiale, C) strømningshastigheten og trykket i fellingsmiddelopp-lø sningen økes for å bringe denne oppløsning til å gjennomtrenge membranveggen og utfelle ytterligere fine proteinpartikler langs den første side av membranveggen, og. D) de utfelte proteinpartikler fraskilles suksessivt, inntil alleø nskede fraksjoner er utvunnet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den proteinholdige oppløsning surgjøres ved: A) sirkulasjon av en sur puffer i kontakt med den motsatte side av membranen, og B) økning av strømningshastigheten og trykket i pufferen for å bringe pufferen til å gjennomtrenge membranen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at A) membranen foreligger i form av mange hule fibre med liten diameter, B ) en av de nevnte oppløsninger sirkuleres gjennom fibrene, og C) den annen av de nevnte oppløsninger sirkuleres om-kring yttersiden av fibrene.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de utfelte proteinpartikler fraskilles ved sentrifugering.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de utfelte proteinpartikler konsentreres, og oppløsningsmiddel fjernes ved diafiltrering.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, k.arakteri-sertvedat A) en oppløsning inneholdende utfelte proteinpartikler sirkuleres gjennom et begrenset rom som er avgrenset av den ene side av en porøs membran, B) en annen væske sirkuleres på den motsatte side av membranveggen, og C) strømningshastigheten og trykket økes i nevnte oppløs-ning for å bringe oppløsningsmidlet deri til å gjennomtrenge membranveggen og konsentrere proteinpartiklene.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteri-sertvedat A) nevnte proteinoppløsning er blodplasma med en innledende temperatur mellom ca. 4 og -7°C, og B) nevnte proteinfellingsmiddel er etanol i en innledende konsentrasjon mellom ca. 50 og 80 % ved en innledende temperatur mellom ca. -20 og -10°C.

11. Fremgangsmåte for konsentrering av protein, ved fjerning av organiske oppløsningsmidler fra proteinoppløsninger, karakterisert ved at den omfatter: A) tilsetning,under opprettholdelse av et mottrykk, av is til en kald proteinoppløsning, hvorved oppløsningens volum økes, og konsentrasjon av protein og organisk oppløs-ningsmiddel minskes, hvilken is fungerer som varmeo.pptager, B) sirkulasjon av den kalde proteinoppløsning inklusive organisk oppløsningsmiddel ved en temperatur ved eller nær frysepunktet for opplø sningen, gjennom et begrenset rom som avgrenses av den ene side av en porøs membran, C) opprettholdelse av strømningshastigheten av protein-oppløsningen for å frembringe mottrykket på membranen for å minske oppløsningens volum for å øke konsentrasjonen av protein ved å tvinge dialyserbare materialer gjennom membranen, D) gradvis økning av temperaturen i proteinoppløsningen for å fjerne væske inkludert det organiske løsningsmiddel gjen- . nom membranen for å redusere konsentrasjonen av organisk opp-løsningsmiddel i oppløsningen, hvorved passasjen av organisk løsningsmiddel gjennom membranen økes med stigende temperatur, og E) fortsettelse inntil det organiske oppløsningsmiddel er fjernet. e

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at en vandig væske sirkuleres i kontakt med den motsatte side av membranen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at proteinet er en blodproteinfraksjon, og oppløsningsmidlet er alkohol.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at proteinet er en pasta.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at proteinet er et pulver.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at proteinet er en suspensjon.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at proteinet er albumin.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at alkoholen er etanol.

19. Fremgangsmåte for konsentrering av protein ved fjerning av saltoppløsning fra proteinoppløsninger, karakterisert ved at den omfatter: A) sirkulasjon av en kald proteinoppløsning inkludert en oppløsning av et uorganisk, nøytralt salt gjennom et begrenset rom som er avgrenset av den ene side av en porøs membran, B) opprettholdelse av strømningshastigheten til protein-oppløsningen for å frembringe et mottrykk på membranen for å minske oppløsningens volumjfor å øke konsentrasjonen av protein ved å tvinge dialyserbare materialer gjennom membranen, C) tilsetning,under vedlikehold av mottrykket, av vann til proteinoppløsningen under økning av proteinoppløsnin-gens volum og reduksjon av konsentrasjonen av protein og salt, D) gradvis økning av temperaturen i proteinopplø snin-gen for å fjerne væske inneholdende saltet gjennom membranen for å redusere konsentrasjonen av salt i oppløsningen, hvorved passasjen av salt gjennom membranen økes etterhvert som temperaturen stiger, og E) fortsettelse inntil saltet er fjernet eller sva-rer til osmolariteten i blod.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at vann sirkuleres i kontakt med den motsatte side av membranen.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at proteinet er et blodfraksjonsprotein.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at proteinet er en pasta.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at proteinet er et pulver.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at proteinet er en suspensjon.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at proteinet er albumin.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at saltet er valgt fra gruppen bestående av fosfater og sulfater.