CH652932A5

CH652932A5 - Procede pour la preparation d'un concentrat purifie de facteur antihemophile.

Info

Publication number: CH652932A5
Application number: CH3134/82A
Authority: CH
Inventors: Patrea L Pabst; David H Bing
Original assignee: Ionics
Priority date: 1981-05-22
Filing date: 1982-05-19
Publication date: 1985-12-13
Also published as: US4435318A

Description

L'invention se rapporte à la séparation, à l'isolation et à la concentration de facteurs antihémophiles à partir de dérivés de plasma sanguin et au nouveau produit obtenu par ledit procédé.

Le facteur VIII et le facteur de von Willebrand sont des protéines du plasma associées qui, prises conjointement, constituent le facteur antihémophile (AHF: Antihaemophilic Factor). Elles jouent toutes deux un rôle important dans le mécanisme de coagulation du 5 sang. Le facteur VIII agit en tant que cofacteur avec le calcium et le phospholipide sur le facteur IXa pour lui permettre d'activer le facteur X par scission du profacteur correspondant, le tout faisant partie du système complexe de la coagulation en cascade. Le facteur de von Willebrand (vWF: von Willebrand Factor) agit apparemment io au niveau de l'agrégation des plaquettes qui libèrent le phospholipide nécessaire. L'absence de l'un de ces deux facteurs peut provoquer un saignement prolongé. Le facteur V joue aussi un rôle important dans le système de la coagulation en assistant le facteur X activé lors de la scission de prothrombine en thrombine («The Plasma Pro-15 teins», vol. III, 2e éd., «Structure, Function, Genetic Control» (1977) (Academic Press, Inc., N. Y.), pp. 422-544).

Plusieurs méthodes pour la préparation de concentrais de AHF sont en usage. Celles-ci vont de la congélation/décongélation du plasma (cryoprécipitation) qui donne un mélange insoluble plus con-20 centré de facteur VIII, de fibrinogène et de globuline insoluble à froid, à des procédés plus élaborés. Ces concentrats peuvent être purifiés à un plus haut degré par des traitements subséquents faisant appel à des techniques telles que l'absorption sur l'hydroxyde d'aluminium, l'extraction à la glycine, la concentration dans le polyéthy-25 lèneglycol, etc. Les désavantages inhérents à de tels concentrats purifiés se retrouvent dans la perte du facteur de coagulation VIII et/ou l'augmentation du pourcentage d'allo-agglutinines non désirées (I.M. Nilsson; L. Holmberg; P. Seenberg; P. Menrichson, «Scand. J. Hac.ïiatology», 24: 340-349 (1980), Allain, J.P.; F. Vervoust; J.P. 30 Soulier, «Vox Sanj.» 38: 68-80 (1980).

La présente invention se rapporte au procédé défini dans la revendication 1 et s'applique en particulier à la préparation d'un nouveau concentrât de produits antihémophiles à partir de plasma ci-traté frais ou de plasma citraté congelé/décongelé (dont le pH est 35 normalement compris entre 6,0 et 8,5), pratiquement exempt des produits contaminants trouvés dans les concentrats antihémophiles présentement à disposition. Le citrate de sodium est l'anticoagulant préféré pour le plasma, car il a été trouvé qu'il permettait l'obtention d'un produit contenant les plus faibles quantités d'agents contami-40 nants.

L'invention constitue une amélioration du procédé objet de la demande US N° 256264 déposée le 21 avril 1981 au nom du titulaire. Cette demande se rapporte à un procédé de dessalement d'une solution de protéine du plasma par dialyse dont le but est la séparation 45 et l'isolation du facteur antihémophile AHF. Dans la présente invention cependant, le pH du plasma et le degré de dessalement sont soigneusement contrôlés de façon à donner un produit ou concentrât antihémophile contenant les divers constituants protéiques dans la concentration et/ou dans les proportions les plus proches de celles 50 souhaitées, et qui présente un plus haut degré de pureté.

On décrit ci-après diverses protéines spécifiques du plasma autres que le facteur AHF qui se trouve dans les précipités résultant du dessalement du plasma selon le procédé de la présente invention.

Le facteur V est une glycoprotéine à très haut poids moléculaire. 55 II agit, tout comme le facteur VIII, en tant que cofacteur du facteur Xa avec le calcium et le phospholipide, dans l'activation de prothrombine en thrombine. Les déficiences en facteur V sont rares, mais elles existent. Le traitement s'effectue à l'aide de plasma frais, car le facteur V perd son activité lors de la congélation. Ledit facteur est 60 extrêmement instable et sa nature moléculaire est source de controverses.

Le facteur IX est une protéine dite vitamine K dépendante qui joue un rôle important dans la coagulation. Sous sa forme activée, il intervient dans le processus d'activation du facteur X en facteur Xa, 65 avec l'aide du facteur VIII, de calcium et de phospholipide. Il peut agir en l'absence du facteur VIII pour initier la coagulation, mais ce mode d'action n'est pas très bien compris. Une déficience en facteur IX conduit à une maladie appelée hémophilie B (Christmas disease).

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Ledit facteur se trouve fréquemment associé aux concentrats de facteur VIII dont il peut être éliminé sélectivement par adsorption sur du citrate de baryum.

Le facteur X est une autre protéine, dite vitamine K dépendante, synthétisée par le foie. Il joue un rôle déterminant dans la coagulation du sang en reliant les mécanismes de coagulation intrinsèque (coagulation initiée par le facteur VII) et extrinsèque (facteur VII et facteur de tissu). Il circule sous une forme zymogène qui est activée par la thrombine, le facteur IXa ou le facteur VII (voie extrinsèque). Les protéines, dites vitamines dépendantes, peuvent être éliminées sélectivement par adsorption sur du citrate de baryum.

La plasmine est une enzyme protéolytique générée à partir de plasminogène au moyen d'activateurs spécifiques, en particulier par l'urokinase trouvée dans le plasma. La plasmine est inhibée par l'an-tithrombine III, l'a-2-macroglobuline, l'a-l-antitrypsine, l'inhibiteur de plasmine a-2 et l'inactivateur d'ions chlorure. Puisque la plasmine peut agir comme activateur du facteur XII (facteur de Ha-geman) qui est l'initiateur de tout le système de coagulation, il est impératif qu'elle ne contamine pas les concentrats antihémophiles. La plasmine s'utilise également comme agent physiologique pour la dissolution des caillots de fibrine issus du processus normal de coagulation. L'élimination du plasminogène peut être effectuée par l'emploi d'une colonne de lysine-sépharose.

Le fibrinogène est une grosse molécule du genre globuline (poids moléculaire 340 000) que l'on trouve dans le plasma humain normal à raison de 2 à 4 mg/ml. C'est la protéine la moins soluble après congélation, après extraction à l'éthanol ou après adsorption sur l'hy-droxyde d'aluminium. Les précipités de facteur VIII usuels sont normalement contaminés par du fibrinogène associé au plasminogène et par le facteur XIII (facteur de stabilisation de la fibrine). Les précipités de fibrinogène formés lors de la congélation sont hautement insolubles; leur dissolution requiert l'emploi de solutions salines fortement concentrées (notamment NaCl 3M). La méthode d'isolation du fibrinogène insoluble la plus courante est la filtration.

Les préparations de facteur VIII commerciales contiennent des anticorps spécifiques des antigènes A et B des globules rouges. Ces anticorps (allo-agglutinines) ont été impliqués dans des cas d'hémolyse constatés chez des patients ayant reçu ces préparations de facteur VIII. Ces anticorps spécifiques provoquent l'agrégation desdits globules qui devienennt alors sujets à lyse lorsque des immuno-globulines se fixent à la surface des globules. Ces anticorps sont de la classe des immunoglobulines G et M bien qu'il n'y ait pas de relation directe entre la concentration en immunoglobuline et celle en allo-agglutinine.

Le procédé de l'invention comprend de préférence l'emploi d'un système à flux continu dans lequel la concentration saline de la solution de protéine de plasma est abaissée par élimination des sels (ions) au travers de systèmes à membranes semi-perméables, telles l'électrodialyse, la dialyse et/ou l'ultrafiltration. Les méthodes et équipements d'électrodialyse sont décrits de façon plus complète dans les brevets US Nos 2848403, 2863813, 3003940, 3341441, 4115225 et autres.

Un bloc d'électrodialyse comprend normalement une ou plusieurs paires de chambres de dilution ou de concentration salines, séparées par des membranes alternativement sélectives d'anions et de cations. Une ou plusieurs desdites membranes sélectives peuvent être parfois remplacées par une membrane neutre ou non sélective. Les chambres sont placées entre une anode et une cathode. Une solution d'électrolyte passe de préférence au travers des chambres de l'anode et de la cathode de façon à permettre le passage du courant au travers des chambres de concentration et de dilution. Habituellement, la chambre de concentration est disposée de façon à isoler les solutions des électrodes du produit ou de la chambre de dilution. Les membranes sélectives d'ions sont choisies en fonction de la solution à traiter et du flux de liquide transitant par l'appareil. Le courant appliqué est réglé avec précaution pour obtenir les résultats souhaités. Le plasma passe au travers des chambres de dilution et, par application d'un courant aux électrodes, le contenu salin ou ionique du plasma est réduit par le passage des sels dans les chambres de concentration, au travers des membranes. Les chambres de concentration peuvent être amorcées par addition d'une petite quantité de NaCl. Le plasma dessalé résultant est recueilli dans les chambres de dilution et traité de façon à obtenir une ou plusieurs des protéines désirées.

La dialyse est un autre mode de séparation à membrane utilisable dans le contexte de la présente invention, dans lequel l'élément moteur est un gradient de potentiel chimique, par exemple de concentration ou d'activité des solutés de part et d'autre de la membrane séparant les deux solutions. La membrane utilisée est perméable à l'eau et aux solutés de faible poids moléculaire. Le soluté diffuse au travers de la membrane jusqu'à ce que le gradient de concentrations, de part et d'autre de la membrane, devienne négligeable. La dialyse est particulièrement efficace lorsque de forts gradients de concentration sont mis enjeu. La principale application de la dialyse concerne le domaine de la dialyse du rein: c'est un processus au cours duquel des solutés à faible poids moléculaire, tels que l'urée et quelques sels, sont éliminés du sang. De tels systèmes de dialyse sont notamment décrits dans les brevets US N°s 4192748, 4191646, 4213859, 3960730 et autres. Ces brevets, cependant, ne concernent que la réduction de la teneur en sels et en protéines à bas poids moléculaire, tels qu'urée, créatinine, vitamine B12 par exemple, plutôt que l'application de la dialyse à un processus complexe de fractionnement de protéines du plasma en vue de l'isolation d'un composant spécifique du plasma tel que le facteur antihémophile AHF.

Il a été constaté que le précipité de facteur AHF se forme après élimination d'au moins 45% environ de la teneur en sel du plasma (mesuré de préférence par conductivité). On obtient une activité spécifique optimale (rapport de l'activité du facteur de coagulation VIII au contenu protéique total), une pureté et un rendement accrus lors de l'élimination d'environ 70% de la teneur en sel du plasma. Lorsqu'on procède à l'élimination de plus de 80% environ de ladite teneur en sel, on décèle une quantité notable de produits contaminants dans le concentrât obtenu. Il est de la plus haute importance que le pH du plasma soit maintenu pratiquement à son niveau originel, de préférence à ± 0,2 unité de pH près, durant les phases de séparation et d'isolation du facteur AHF. Ce contrôle du pH est déterminant et l'électrodialyse peut être, par exemple, effectuée en employant une solution de citrate de sodium comme flux d'électrode. La température doit rester supérieure à 0°C, pour prévenir une cryoprécipita-tion, et en dessous de 40° C pour éviter une dégradation du facteur AHF. Dans les cas où le facteur VIII n'est pas séparé au fur et à mesure, on opère, de préférence, à une température inférieure à 25° C, car il a été démontré que celui-ci possède une plus courte durée de demi-vie à des températures plus élevées.

Comme indiqué précédemment, l'élimination à un pH pratiquement constant d'au moins 45% environ de la teneur en sel initiale du plasma conduit à la précipitation du facteur AHF. Une fois éliminé, ledit précipité est remis en suspension dans un volume d'eau déionisée qui correspond, de préférence, à environ 10% du volume initial de solution de protéine de plasma dont ledit précipité est issu. Le précipité ainsi lavé est ensuite dissous dans un certain volume de solution 0,15M de NaCl (de préférence un volume représentant environ 1% du volume de plasma initial) en vue de son stockage à 4°C pour de courtes périodes ou à — 70° C pour de longues périodes, ou sous forme de produit lyophilisé.

Le facteur IX, une protéine dite vitamine K dépendante qui contamine normalement le concentrât AHF, peut en être éliminé et purifié par adsorption sur citrate ou sulfate de baryum et élution au moyen de citrate de sodium. On obtient ainsi un facteur IX sous une forme convenant au traitement de l'hémophilie B.

Les exemples suivants illustreront la présente invention sans pour autant la limiter.

Exemple 1:

Un plasma frais, citrate, dextrosé, acide a été dessalé au moyen d'un appareil à électrodialyse de façon à provoquer un abaissement

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de 70% de son contenu salin initial, lorsque mesuré par conducti-vité. Le pH originel du plasma (6,95) n'a pas été altéré par le processus et est demeuré pratiquement constant durant toute l'opération.

L'appareil à électrodialyse utilisé a été fabriqué par Ionics Incor-porated, Watertown, Massachusetts (USA). Il consiste en un empilement alterné de 22,5 x 25 cm de membranes sélectives d'anions et de cations, séparées par des espaces réservés à l'écoulement de liquide, le tout placé entre une anode et une cathode. Un générateur de courant continu de 5 A a été utilisé, conjointement à des appareils de mesure de pH, de conductivité et de température. Des pompes ont été utilisées pour faire circuler la solution d'électrode (initialement une solution de citrate de sodium à 2,5% ayant un pH de 8 à 8,05), le flux de concentration saline (initialement une solution de NaCl à 0,15%) et le flux de dilution ou le flux de plasma à dessaler. La solution d'électrode a circulé à raison d'environ 180 ml/min et les flux de concentration et de dilution à raison de 90 ml/min par paire de cellules. Pour procéder au dessalement de 500 ml de plasma (exempt de tous composants cellulaires), on a utilisé deux paires de cellules logées entre les deux électrodes, chacune desdites paires comportant un espace cellulaire réservé aux flux de concentration et de dilution, séparés tous deux par une membrane cationique ou anionique. Le contenant de chacune desdites cellules était de 22,5 ml environ.

Après avoir fait circuler les solutions jusqu'à obtention d'un équilibre, on a appliqué un courant continu que l'on a maintenu constamment à 5 A. La mesure de conductivité du plasma a été conduite jusqu'à abaissement de celle-ci à environ 30"' de sa valeur initiale. La température, comprise entre environ 16 et 20° C, n'a que peu varié au cours de l'opération. Une fois l'opération terminée, le plasma subsistant dans le corps de l'appareil et les pompes a été récupéré et stocké à 4°C.

Après 12 h de stockage, le plasma a été centrifugé à 5000 g environ durant 15 min. La solution surnageante a été décantée (pour être soit réutilisée pour d'autres préparations, soit au titre de plasma, après compensation de la perte en teneur en sel) et le précipité récupéré a été lavé par mise en suspension dans 50 ml d'eau déionisée. Le précipité ainsi lavé a été à nouveau récupéré par centri-fugation et ensuite aisément dissous dans un volume correspondant au maximum à environ 1 % du volume originel du plasma, c'est-à-dire dans 5 ml d'une solution 0,15M de NaCl. Le liquide résultant contenait 40% du contenu originel du plasma en facteur VIII et en facteur de von Willebrand. De petites quantités de facteur IX, Cl, et de fibrinectine ont également été trouvées dans le précipité. Au cas où le plasma originel aurait également contenu du facteur V intact, ce dernier se retrouverait dans les mêmes proportions (40%) dans 5 ledit précipité.

La capacité du produit contenant le facteur antihémophile AHF à corriger le temps de coagulation d'un plasma congénitalement déficient en facteur VIII et en facteur de von Willebrand a été testée. L'antigène du facteur de von Willebrand a été détecté par la techni-i° que de l'essai immunologique de Laurell. La présence d'autres protéines a été déterminée par des essais d'immunodiffusion radiale, im-muno-électrophorèse et des essais de coagulation sur du plasma congénitalement déficient. Il a été déterminé que l'activité fonctionnelle du facteur VIII, mise en relation avec celle du facteur de von Wille-15 brand, était pratiquement dans le rapport de 1:1. L'activité spécifique du produit était de l'ordre de 0,6 environ en facteur VIII par milligramme de protéine isolée et le produit contenait moins de 1 % en poids de fibrinogène. Il a été trouvé que ledit produit restait stable durant plusieurs jours à 4°C.

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Exemple 2:

Dans cet exemple, un plasma citraté fraîchement congelé, rapidement décongelé, a été utilisé comme source de facteur antihémo-2S phile. Le plasma a été décongelé à 37° C sur une courte période, puis centrifugé à 5000 g durant 15 min. La solution surnageante a ensuite été dessalée, comme indiqué à l'exemple 1, de façon à provoquer à nouveau un abaissement de 70% de la teneur en sel initiale lorsqu'elle est mesurée par conductivité. Le précipité ainsi formé consis-30 tait en un produit possédant pratiquement les mêmes caractéristiques que celui résultant de l'opération précédente.

Exemple 3:

Cet exemple concerne la précipitation de facteur AHF à partir 35 d'une solution de plasma, suivie de l'isolation immédiate dudit précipité. Le rendement en facteur antihémophile représentait environ le tiers de celui obtenu à l'exemple 1 où la solution a été équilibrée durant 12 h à 4° C après le dessalement. Le concentrât obtenu présentait cependant pratiquement la même composition que celle du pro-40 duit décrit à l'exemple 1.

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Claims

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REVENDICATIONS

1. Procédé pour la séparation et l'isolation du facteur VIII, du facteur de von Willebrand et du facteur V à partir d'un courant de plasma sanguin ou de dérivés de plasma ayant un pH normalement compris entre 6 et 8,5, caractérisé en ce qu'on élimine du courant sanguin pratiquement toute la turbidité initiale lorsqu'elle est présente, on fait ensuite passer le plasma sanguin au travers d'un appareil contenant une ou plusieurs membranes semi-perméables qui séparent le courant de plasma d'un courant récepteur de sel, provoquant ainsi une diminution de la teneur en sel dudit courant de plasma de 45 à 80% qui entraîne la formation d'une tubidité protéi-que enrichie en facteur VIII, facteur de von Willebrand et facteur V, on élimine ensuite pratiquement toute ladite turbidité et on maintient la température du courant de plasma à une valeur comprise entre 4 et 40'C durant les phases de séparation et d'isolation et son pH pratiquement à son niveau initial.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le courant de plasma contient du citrate de sodium à titre d'anticoagulant.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le courant de plasma est constitué de plasma citrate fraîchement congelé/ décongelé.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase de diminution de la teneur en sel à l'aide de membrane semi-perméable comporte une électrodialyse.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase de diminution de la teneur en sel à l'aide de membrane semi-perméable comporte une dialyse.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase de diminution de la teneur en sel à l'aide de membrane semi-perméable comporte une ultrafiltration.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH initial du plasma est maintenu pratiquement constant à ± 0,2 unité de pH.
8. Produit protéique obtenu selon le procédé de la revendication 1.
9. Produit selon la revendication 8, contenant de 0,5 à 2 unités de facteur de coagulation VIII par milligramme de protéine totale, ce qui correspond à 30 à 50 unités par millilitre de protéine, le facteur d'activité antigénique de von Willebrand étant présent dans une proportion pratiquement de 1 à 1 par rapport audit facteur VIII, et jusqu'à 2 unités de facteur de coagulation V par milligramme de protéine totale.
10. Produit protéique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il contient moins de 1 % en poids de fibrinogène par rapport au poids total de protéine.
11. Produit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient également une protéine dite vitamine K dépendante.
12. Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce que la protéine dite vitamine K dépendante est le facteur IX.
13. Produit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient moins de 1 % en poids de plasminogène par rapport au poids total de protéine.
14. Produit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient moins de 1 % du facteur de coagulation X.
15. Utilisation du produit selon la revendication 11 pour l'isolement de la protéine dite vitamine K dépendante, par adsorption sur un sel constitué de citrate ou de sulfate de baryum ou d'un mélange des deux.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la protéine dite vitamine K dépendante est le facteur IX.
17. Facteur d'activité IX obtenu conformément à l'utilisation selon la revendication 16.