NO800743L - Nye peptider og fremgangsmaate til deres fremstilling - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører nye peptider av somatostatin-typen og deres fremstillingsfremgangsmåter, samt iSarmasøytiske preparater inneholdende disse forbindelser og anvendelsen av disse forbindelser resp. preparater til terapeutiske formål. Oppfinnelsen ved-rører spesielt peptider som sammenlignet med somatostatin har en med de første 2-N-terminale aminosyrer kortere og ved noen erstatningsledd modifisert aminosyresekvens.

De somatostatin-analoge peptider ifølge

— 1 2 — oppfinnelsen omfatter modifiserte des-/ala- gly /desamino-cys 3-somatostatiner med den generelle formel

hvori Bmp betyr desaminocystéinresten (dvs. g-merkapto-propionyl-resten), X betyr Asn eller His, trp betyr D-Trp, som i benzenringen kan være substituert med et halogenatom og Y betyr resten av en sekundær aa-amino-

syre med maksimalt 8 karbonatomer og de tilsvarende peptidamider, samt syreaddisjonssalter og komplekser av alle disse forbindelser.

Det i benzenringen av D-tryptofan g-resten eventuelt tilstedeværende halogenatom er spesielt et klor- eller fluoratom, som fortrinnsvis Befinner seg i 5-stilling; spesielt å nevne er 5-fluor-D-tryptofyl g-resten.

Den som Y betegnede sekundære a-aminosyre

er en a-laverealkylaminolaverealkylkarboksylsyre,

hvori de to laverealkylrester kan være forbundet sammen ved hjelp av en C-C-binding, et oksygenatom, et svovel(II)-atom eller et eventuelt laverealkylert nitrogenatom,

idet hver enkelt av laverealkylrestene maksimalt inneholder 6 karbonatomer og alle tilsammen maksimalt 7 karbonatomer. Laverealkylresten, som ligger til grunn for karboksylsyrens karbonstruktur har fortrinnsvis mer

enn et C-atom og er spesielt en slik, av de i naturen forekommende naturlige aminosyrer som butyl, isobutyl, pentyl og spesielt etyl og isopentyl. Laverealkyl, som forekommer som substituent av aminogruppen eller nitro-genbroen er fortrinnsvis metyl. C-C-bindingen som eventuelt forbinder de to laverealkylrester er fortrinnsvis en enkeltbinding. a-aminogruppen befinner seg fortrinnsvis i en slik sterisk konfigurasjon som til-svarer de naturlige aminosyrer, dvs. L-aminosyrene.

I betydningen av Y er spesielt restene av slike sekundære a-aminosyrer foretrukket som er kjent som i naturen forekommende aminosyrer, som fremforalt L-prolin med formel

hvori Z er metylengruppen, eller er umuddelbart struktu-relt analoge til disse, som på den ene side 4-oksa- og spesielt 4-tiaprolin av ovennevnte formel, hvori Z betyr oksygen eller svovel, og på den annen side en N-laverealkylert, spesielt N-metylert, alifatisk aminosyre, fremforalt N-metyl-L-leucin.

De foretrukne somatostatin-analoge ifølge oppfinnelsen er slike forbindelser med formel I, hvori X betyr Asn, trp betyr D-Trp eller 5-fluor-D-Trp og Y betyr Pro, Tpo (dvs. resten av den ovenfor karakteriserte 4-tiaprolin) eller MeLeu (dvs. N-metyl-Leu). Fremforalt

3 8 13

skal det nevnes: Desamino-Cys -D-Trp -Pro -somatostatin (3-14) /"Formel I; X = Asn, trp = D-Trp og Y = Pro/;

3 8 13

desaminoCys -(5-F-D-Trp) -Pro -somatostatin(3-14) /"Formel I; X = Asn, trp = 5-fluor-D-Trp, Y = Pro/; Desamino-Cys -D-Trp -Tpo -somatostatin(3-14) / Formel li

_ 3

X = Asn, trp = D-Trp, Y = 4-tia-Pro/ og desamino-Cys - D-Trp<i->MeLeu<13->somatostatin(3-14) /Formel I, X = Asn, trp = D-Trp, Y = N-metyl-Leu/. Alle disse foretrukkede somatostatin-analoge kan også foreligge i form av syreaddisjonssalter eller komplekser.

Som syreaddisjonssalter kommer det spesielt

i betraktning fysiologisk tålbare salter med vanlige terapeutisk anvendbare syrer;av uorganiske syrer er det å nevne halogenhydrogensyrene, som klorhydrogensyre, men også svovelsyre og fosfor- resp. pyrofosforsyre, av de organiske syrer er det i første rekke sulfonsyrer,

som benzen- eller p-toluensulfonsyre, eller laverealkan-sulfonsyrer, som metansulfonsyre, videre også karboksyl-syrer, som eddiksyre, melkesyre, palmitin- og stearin-syre, eplesyre, vinsyre, ascorbinsyre og citronsyre.

Med komplekser er det å forstå de i deres struktur ennu ikke helt avklarte forbindelser som opp-

står ved tilsetning av visse uorganiske eller organiske stoffer til peptider og gi disse en forlenget virkning. Slike stoffer er eksempelvis omtalt for ACTH og andre adrenokortikotrop virksomme peptider. Det kan nevnes f.eks. uorganiske forbindelser, som avleder seg fra metaller som kalsium, magnesium, aluminium, kobolt og spesielt sink, fremforalt alle tungtoppløselige salter,

som fosfater, pyrofosfater og polyfosfater, samt hydrok-syder av disse metaller, videre alkalimetallpolyfosfater, f.eks. "Calgon N", "Calgon 322", eller "Calgon 188". Organiske stoffer som frembringer en forlengelse av virkningen er eksempelvis ikke antigene gelatin-typer f.eks. polyoksygelatiner, polyvinylpyrrolidon og karboksymetylcellulose, videre sulfonsyre- eller fosforsyreestere av alginsyre, dekstan, polyfenoler og polyalkoholer, fremforalt polyfloretinfosfat og fytinsyre, samt polymerisater og kopolymerisater av basiske eller fremforalt sure aminosyrer, f.eks. protamin eller polyglutaminsyre.

Når intet annet er angitt refererer for-kortelsene av aminosyrerestene til rester av a-aminosyre av L-rekken, som forekommer i naturen.

Når intet annet angis, betegner uttrykket "lavere" hvor det alltid forekommer i sammenheng med en organisk rest eller forbindelse,en slik rest eller forbindelse med maksimalt 7, fortrinnsvis imidlertid maksimalt 4 karbonatomer.

De nye peptider ifølge oppfinnelsen har

en fysiologisk virkning som i grunnkarakter er lik virkningen av somatostatin. De kan derfor med fordel anvendes i tilsvarende terapeutisk indikasjoner som ette, f.eks. spesielt til behandling av funksjonsforstyrrelser hvori sekresjonen av veksthormonet eller glukagon er overnormal, som ved acromegali eller diabetes. Ide€

de dessuten også hemmer blodtap i fordøyelseskanalen kan de også anvendes i dette indikasjonsområde med følgende resultat:

Somatostatin, et cyklisk tetradekapeptid

med formel

/Science 179, 77 (1973_)/ hemmer som kjent hypofysestyrt sekresjon av veksthormon (Somatotropin). Dessuten hemmer det den sekretoriske aktivitet av det endokrine pankreas, som sekresjon av insulin og glukagon. Disse verdifulle egenskaper kan ved selve somatostatin ikke komme til full praktisk anvendelse, da ofte den hemmende virkning er ønsket på bare en av de to kjertler, hvorimot en annen hvis mulig skal undertrykkes. I de fleste tilfelle er hemningen av den hypofysære sekresjon (dvs. av veksthormon-utrustning) heller funnet som ulempe ved de hyppig-ste terapeutiske indikasjoner. Av disse grunner ble det søkt etter analoge strukturer, hvor man ved egnet modi-fisering av grunnsekvensen, spesielt ved utelatelse av enkelte opprinnelige aminosyrer og/eller eller deres utveksling mot andre, ofte også "unaturlig" aminosyrer kan oppnå en dissosiasjon av hemmevirkningene.

Overraskende ble det nu fastslått, at man i et forkortet molekyl av somatostatin kan erstatte visse av disse opprinnelige aminosyrer med andre, sogar "unatur-lige" aminosyrer, som enkeltvis ikke har nevneverdig innvirkning således at derved en del av den fysiologiske aktivitet ikke bare bibeholdes, men sogar økes. Således har forbindelsen ifølge oppfinnelsen en i forhold til somatostatin øket hemming av isulin- og glukagon-sekresjonen ved en liktblivende eller sogar senket hemmende virkning på den hypofysære sekresjon av veksthormonene.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan frem-, stilles etter i og for seg kjente metoder. Spesielt fåes de idet man i en forbindelse med den generelle formel

hvori X, trp og Y har ovennevnte betydning og A og A<1>uavhengig av hverandre hver betyr en e-amino-beskyttelsesgruppe eller hydrogen, B og B<1>betyr uavhengig av hverandre hver en hydroksyl-beskyttelsesgruppe eller hydrogen, C og C betyr uavhengig av hverandre hver en merkapto-beskyttelsesgruppe eller hydrogen og D betyr en karboksyl-beskyttelsesgruppe, aminogruppen Nr^ eller hydroksyl, i ønskelig rekkefølge a) avspalter tilstedeværende beskyttelsesgrupper og b) mellom merkaptogruppene av begge endeplaserte syrer eventuelt under samtidig avspaltning av tilstedeværende merkapto-beskyttelsesgrupper danner disulfid-broen og, hvis ønsket, omdanner et som syreaddisjonssalt fremkommende sluttstoff i den tilsvarende frie base eller et som base resulterende sluttstoff i et syreaddisjonssalt herav og/eller hvis ønsket, isolerer et sluttstoff i form av et kompleks.

En variant av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består f.eks. i at man i utgangsstoffet med ovennevnte formel II avspalter alle tilstedeværende beskyttelsesgrupper unntatt C eller C, hvilket kan ut- føres ved egnet valg av beskyttelsesgrupper med foirdel i en eneste operasjon, og deretter holde den som mellomprodukt foreliggende forbindelse med formel II, hvori hver av A, A', B og B<1>betyr hydrogen, D betyr hydroksyl eller aminogruppen NH_, et av symbolene C og C hydro-

gen og det andre en n-alkyltiogruppe eller rest H-Cys-OH, på i og for seg kjent måte, f.eks. ifølge U.S. patent 3.929.758 resp. BOS 26.47843, i en i det vesentlige oksy-genfri oppløsning vied pH 5-10 til cyklisering. Som beskyttelsesgrupper A, A", B og B<1>er det i dette tilfelle spesielt egnet acidolytisk avspaltbare grupper, f.eks. de nedenfor angitte, som en av merkaptobeskyttel-sesgruppen C og C er det likeledes foretrukket en acidolyttisk avspaltbar gruppe, f.eks. en benzylgruppe eller t-butyltiogruppe, fivorimot den andre fortrinnsvis er en n-laverealkyltiogruppe, som metyltio-, etyltio-, propyltio- eller butyltiogruppen.

En foretrukket variant av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består i at man i utgangsstoffet med formel II avspalter alle tilstedeværende beskyttelsesgrupper, hvilket kan utføres ved egnet valg av beskyttelsesgrupper med fordel i en eneste operasjon og deretter behandler den som mellomprodukt foreligende forbindelse med formel II, hvori hver av A, A", B,B', C

og C betyr hydrogen og D betyr hydroksyl eller aminogruppen / på i og for seg kjent måte med et oksyda-sjonsmiddel, som spesielt elementært jod eller oksygen.

En spesielt foretrukket variant av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består i at et utgangsstoff med formel II, hvori X, trp, Y, A, A<1>, B, B', C, C og D har ovennevnte betydninger, idet minst et av symbolene A, A', B, B' og D betyr en beskyttelsesgruppe, eventuelt under samtidig avspaltning av merkaptobeskyttelsesgrupper oksyderes til et cyklisk disulfidisk mellomprodukt med formel hvori X, trp, Y, samt A, A', B, B' og D har ovennevnte betydning, idet minst et av symbolene A, A', B, B' og D betyr en beskyttelsesgruppe, og i disse avspalter den eller de tilstedeværende beskyttelsesgrupper.

Som e-amino-beskyttelsesgrupper kan det anvendes alle i peptid-kjemien vanlige amino-beskyttelsesgrupper slik de omtales i de tilsvarende oppslags-verker, f.eks. i Houben-Weyl: Methoden der organischen Shemie; 4. opplag, bind 15/1, E. Wiinsch (Utgiver): Synthese von Peptiden. (Georg Thieme Verlag, Stuttgart; 1974) .

Således kan man f.eks. anvende reduktivt

eller basisk avspaltbare aminobeskyttelsesgrupper, f.eks. spesielt Benzyloksykarbonyl-gruppen og benzyloksykarbonyl-gruppene, som i den aromatiske del er substituert med halogenatomer, nitrogrupper, laverealkoksygrupper og/eller laverealkylrester, som p-klor- og p-brombenzyloksykarbonyl-, p-nitrobenzyloksykarbonyl-, p-metoksybenzyloksykarbonyl-, p-tolyloksykarbonyl-gruppen, eller også isonikotinyloksykarbonylgruppen, videre også acylgrupper, som pptoluen-sulfonyl, benzensulfenyl , o-nitrobenzensulfenyl, resp. også formyl, trifluoracetyl eller ftaloyl.

En foretrukket e-amino-beskyttelsesgruppe

er en etoksykarbonylgruppe, som i g-stilling er en med tre hydrokarbonrester substituert silylgruppe, som trifenylsilyl-, dimetyl-butyl-silyl- eller fremforalt trimetylsilylgruppen. En slik 3-(trihydro-karbylsilyl)-etoksykarbonylgruppe, som en 6-(trilaverealkylsilyl)-etoksykarbonyl-, f.eks. spesielt 3-(trimetylsilyl)-etoksykarbonylgruppe, danner med e-aminogruppen som skal beskyttes en tilsvarende 3-trihydrokarbylsilyl-etoksykarbonylaminogruppe (f.eks. 3-trimetylsilyletoksy-karbonylaminogruppen), som er bestandig under betingelsene

for sur hydrolyse og hydrogenolyse, men under helt spesifikke, meget milde betingelser lar seg avspalte ved innvirkning av fluoridioner. I denne henseende forholder den seg analogt som den nedenfor som karboksyl-beskyttelse sesgruppe omtalte 6-silyletylestergruppe. (Denne lik-

het må spesielt tas hensyn til ved syntesen: untatt enkelttilfelle utelukker anvendelsen av en av disse beskyttelsesgrupper den samtidige anvendelse av den andre beskyttelsesgruppe.) Videre detaljer er angitt neden-

for ved beskyttelse av karboksylgruppen ved 6-silyl-etylester.

Helt spesielt foretrukket er acidolytisk avspaltbare grupper, som i første rekke tert-butoksykarbonyl-gruppen og analoge grupper, f.eks. tert-amyloksykarbonyl-, isopropyloksykarbonyl-, di-isopropyl-metoksykarbonyl-, allyloksykarbonyl-, cyklopentyloksy-karbonyl-, cykloheksyloksykarbonyl-, d-isobornyloksy-karbonyl- og adamantyloksykarbonylgruppen, samt også grupper av aralkyl-typen, som benzhydryl og trifenylmetyl (trityl), eller bestemte aralkoksykarbonyl-

grupper av 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykarbonyl-typen,

som omtalt i sveitsisk patent 509.266.

Som hydroksyl-beskyttelsesgrupper kan det anvendes alle for dette formål i peptid-kjemien vanlige grupper, sammenlign ovennevnte verk (Houben-Weyl). Foretrukket er acidolytisk avspaltbare grupper, som 2-tetrahydropyranyl og helt spesielt tert-butyl. Videre kan man imidlertid også anvende reduktivt eller basisk avspaltbare hydroksyl-beskyttelsesgrupper, f.eks. benzyl-grupper, som i den aromatiske del kan være substituert med halogen, nitro og/eller laverealkoksy, resp. lavere-alkanoylrester, som acetyl, eller aroylrester, som benzoyl. Det er også mulig, under overholdelse av visse begrensende forholdsregler å gå frem uten beskyttelse av hydroksylgruppene.

Som karboksyl-beskyttelsesgrupper kan det anvendes de vanlige for dette formål vanlige grupper, sammenlign ovennevnte verk av Houben-Weyl). Således beskyttes karboksylgrupper eksempelvis ved hydrazid-dannelse eller ved forestring. Til forestring egner det set f.eks. lavere, eventuelt substituert alkanoler som metanol, etanol, cyanmetylalkohol, 2,2,2-trikloretanol, benzoylmetylalkohol eller spesielt tert-butylalkohol,

men også en eventuelt substituert benzylalkohol. En spesielt fordelaktig kategori av de substituerte alkanoler er etylalkoholer, som i 3-stilling har en trisubsti-tuert silylgruppe, som trifenylsilyl-, dimetyl-butyl-silyl-eller fremfor alt trimetylsilylgruppen. Slik det f.eks.

er omtalt i belgisk patent nr. 851.576 egner disse alkoholer seg til beskyttelse av karboksylgruppen derfor spesielt godt, fordi de tilsvarende 8-silyletylestere, f.eks. 6-(trimetylsilyl)-etylester, riktignok har stabi-litetén av vanlige alkylestere, imidlertid lar seg avspalte selektivt under milde betingelser ved innvirkning av fluoridioner under bibehold av alle andre beskyttelsesgrupper .

Som merkapto-beskyttelsesgrupper kan man anvende alle for dette formål i peptid-kjemien vanlige grupper, idet merkaptogruppene spesielt beskyttes ved egnet acylering eller alkylering. Til acylering egner det seg f.eks. acetyl- eller benzoylresten, en laverealkyl-, f.eks. etyl, -karbamoyl, eller en eventuelt som angitt ovenfor substituert benzyloksykarbonyl-gruppe (karbobenzoksy-gruppe). Egnet til alkylering er f.eks. tert -butyl-, isobutyloksymetyl-, benzyltiometyl- eller tetrahydropyranylresten eller eventuelt med halogen, laverealkoksy eller nitro substituerte arylmetylrester som benzyl, p-metoksybenzyl, difenylmetyl, dimetoksy-benzhydryl eller helt spesielt trityl, samt også fenyl-cykloheksyl (PCH), p-metoksyfenyl-cykloheksyl (MPCH), tienyl(2)-cykloheksyl og lignende, sammenlign Ber. 101, 681, (1968). Meget fordelaktig er også en acylamino-metylrest med den generelle formel R-C0-NH-CH2-, hvori R-CO- betyr resten av en karboksylsyre RCOOH, sammenlign Tetrahedron Letters 1968 (26)_, 3057 og DOS 2.060.969. Acylresten R-CO- kan avlede seg fra en alifatisk, cykloalifatisk, aromatisk, aralifatisk eller hetero-cyklisk karboksylsyre eller fra et karbonsyremonoderivat, som en karbonsyremonoester, eller fra en karbaminsyre.

Ved symbolet R er i første rekke en eventuelt substitu-, ert laverealkylrest representert, f.eks. metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, n-butyl eller tert.-butylresten, som som substituenter f.eks. kan inneholde klor, trifluormetyl eller nitrogruppen. Videre betyr R eksempelvis en eventuelt substituert cykloalkylrest med 3-8, fortrinnsvis 5-6, ringatomer, som cyklopentyl- eller cykloheksylresten eller en eventuelt substituert aromatisk eller aralifatisk, fortrinnsvis monocyklisk rest, fremforalt en eventuelt substituert fenyl- eller benzylrest, f.eks. usubstituert eller i fenylresten med laverealkyl, laverealkoksy, halogen eller nitro substituert fenyl eller benzyl, eller en monocyklisk heterocyklylrest, f.eks. tienyl eller furyl. Spesielt foretrukket blant acylaminometylgruppene er acetylaminometylgruppen (acetamido-metylgruppen). Det er allerede ovenfor henvist til den spesielle anvendelse av alkyltiogrupper til beskyttelse av merkaptogrupper og dannelse av S-Srbroer.

Fortrinnsvis velges beskyttelsesgruppene

A, A', B, B<1>og D således at de er avspaltbare under tilsvarende betingelser; spesielt foretrukket er da de allerede fremhevede acidolytisk avspaltbare grupper. Avspaltningen av alle beskyttelsesgrupper foregår da fortrinnsvis i en eneste operasjon; det kan imidlertid også anvendes grupper av forskjellig type og hver enkelt avspaltes.

Fortrinnsvis beskytter man tilstedeværende karboksylgrupper som tert-butylester, e-aminogrupper med tert-butyloksykarbonylgruppen, hydroksylgruppen og treoninresten, hvis den overhodet beskyttes, som tert-butyleter, og merkaptogruppene med trityl-, acetamidometyl-, p-metoksybenzyl- eller tetrahydropyranylgrupper (Thp). Foruten acetamidometyl kan alle disse funksjonelle grupper avspaltes i ett trinn ved innvirkning av syrer (acidolyse) .. Merkapto-beskyttelsesgrupper av typen trityl, acetamidometyl og tetrahydropyranyl kan også, hvis ønsket, avspaltes selektivt under bibehold av beskyttelsesgruppen av tert-butyl-typen med tungmetallsalter, f.eks. merkuri-acetat, og svovelhydrogen. Man får således det beskyttede peptid med fri merkaptogruppe. Dette kan oksyderes til beskyttet disulfid av ovennevnte karakteristiske formel IIA, på i og for seg kjent måte, f.eks. med jod, med dijodetan i organiske oppløsningsmidler eller med oksygen, spesielt luftoksygen, som med luftoksygen i flytende ammoniakk.. Spesielt fordelaktig er det å beskytte merkaptogruppene med trityl-, tetrahydropyranyl- eller acylaminometylgruppene og å fjerne disse fra det beskyttede peptid under samtidig dannelse av disulfidbroer med jod, f.eks. i metanol eller eddiksyre.

Avspaltningen av beskyttelsesgruppene foregår på i og for seg kjent måte; den sure hydrolyse (acidolyse) gjennomføres f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre, saltsyre eller fluorhydrogen, ved syrefølsomme beskyttelsesgrupper også ved hjelp av en laverealifatisk karboksylsyre, som maursyre og/eller eddiksyre i nærvær av vann og eventuelt av et polyhalogenért laverealkanol, eller laverealkanon, som 1,1,1,3,3,3-heksafluorpropan-2-ol eller heksafluoraceton. De reduktivt avspaltbare grupper, spesielt slike, som inneholder benzylrester, fjernes fortrinnsvis hydrogenolyttisk, f.eks. ved hydrogenering under palladium-katalyse. Isonikotinyloksykarbonylgruppen avspaltes fortrinnsvis ved hjelp av sinkreduksjon.

Sluttstoffene ifølge oppfinnelsen fåes alt etter isoleringstypen, som base eller som syreaddisjonssalter; de kan selvsagt på i og for seg kjent måte omdannes i hverandre.

Også dannelsen av ovennevnte komplekse foregår etter kjente metoder: Komplekser med tungt oppløse-lig metall-, f.eks. aluminium- eller sinkforbindelser fremstilles fortrinnsvis på analog måte som kjent for ACTH, f.eks. med omsetning med et oppløselig salt av det angjeldende metall, f.eks. sinkklorid eller sinksulfat og utfelling med et alkalimeefallfosfat og/eller -hydroksyd. Komplekser med organiske forbindelser som polyoksygelatiner, karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, polyfloretin-f osf at, polyglutaminsyre etc. f ås;-ved blanding av disse stoffer med peptid i vandig oppløsning. På denne måte kan det også fremstilles uoppløselige forbindelser med alkalimetallpolyfosfater.

Utgangsstoffene med ovennevnte formel II og IIS; og, når intet annet er angitt, dgså de til deres syntese tjenende mellomprodukter er riye og delvis også anvendbare til fremstilling av andre somatostatin-analoge, f.eks. slike med analoge aminosyre-delsekvenser. Disse såvel som også deres fremstillingsfremgangsmåter, omfattes av foreliggende oppfinnelse. De fåes etter i og for seg kjente metoder, idet man kondenserer de til deres opp-bygning nødvendige aminosyrer, resp. mindre peptidenheter under dannelse av CO-NH-bindinger i ønskelige tidsmessige rekkefølger med hverandre, idet ikke i reaksjonen deltagen-de funksjonelle grupper intermediært kan beskyttes.

Ved fremstillingen av disse utgangsstoffer

som også alle nødvendige mellomprodukter kommer det som beskyttelsesgrupper for de endeplaserte a-amino- og karboksylgrupper spesielt i betraktning de ved syntesen av langkjedede peptider vanlige beskyttelsesgrupper som f.eks. lett og selektivt kan avspaltes f.eks. ved solvo-lyse eller reduksjon.

Som a-aminobeskytteslesgrupper er det eksempelvis å nevne: eventuelt f.eks. med halogen, nitro, laverealkyl eller laverealkoksy, substituerte di- eller triaryllaverealkylgrupper, som difenylmetyl- eller trifenylmetylgrupper, f.eks. benzhydryl, trityl, Di-(p-metoksy)-benzhydryl, eller fremforalt fra karbonsyreaav-ledede hydrogenolytisk avspaltbare grupper, som eventu-

elt i den aromatiske rest med halogenatomet, nitrogruppen laverealkyl- eller laverealkoksygrupper substituerte

benzyloksykarbonylgrupper, feks. benzyloksykarbonyl (dvs. karbobenzoksy), p-brom- eller p-klorbenzyloksy-karbonyl, p-nitrobenzyloksykarbonyl, p-metoksybenzyloksykarbonyl; videre også 2-(p-bifenyl<y>l)-2-propyloksy-karbonyl og tilsvarende sveitsisk patent 509 266 omtalte aryloksykarbonylgrupper. Dermed må det påsees at a-aminobeskyttelsesgruppen må være selektivt avspaltbar under bibehold av det eventuelt tilstedeværende e-amino-beskyttelsesgruppe av lysinresten. Det er forøvrig også fordelaktig, når ved deres avspaltning også en eventuelt tilstedeværende karboksyl- og hydroksylbeskyttelsesgruppe bibeholdes uforandret.

Karboksyl-beskyttelsesgruppene for dette formål er de samme som ble omtalt ovenfor ved den tilsvarende betydning av symbolet D.

Beskyttelsesgruppene kan avspaltes på kjent måte. Således kan man avspalte Benzyloksykarbonylgruppen ved hjelp av hydrogenolyse, N-tr±tylgruppen med mineral-syrer, som halogenhydrogensyrer, f.eks. fluorhydrogen eller fortrinnsvis klorhydrogen, eller en organisk syre som maursyre, eddiksyre, kloreddiksyre eller trifluoreddiksyre, i vandig eller absolutt trifluoretanol som oppløsningsmiddel (sammenlign DOS 2.346.147) eller med vandig eddiksyre; tert-butyloksykarbonylgruppen med trifluoreddiksyre eller saltsyre, 2-(p-bifenylyl)-iso-propyloksykarbonylgruppen med vandig eddiksyre eller f.eks. med en blanding av iseddik, maursyre (82,8%ig) og vann (7:1:2) eller ifølge fremgangsmåten i tysk patent 2.346.147.

B-silyletylestergruppene avspaltes fortrinnsvis med fluoridion-avgivende reagenser, f.eks. fluorid-kvaternære organiske baser, som tetraetylammoniumfluorid. De kan imidlertid også, på samme måte som de vanlige alkylestere, ved hjelp av alkalisk hydrolyse, f.eks. ved hjelp av alkalimetallhydroksyder, -karbonater eller-bi-karbonater, avspaltes eller ved hjelp av hydrazinolyse, f.eks. ved hjelp av hydrazinhydrat, omdannes i de til- 13

svarende karbazo^lgrupper. Ved avspaltning av tert-butylestere anvender man fortrinnsvis acidolyse for benzylestere, deretter hydrogenolyse.

Den for fremstilling av utgangsstoffene med formel II gjennomførte kondensasjon av aminosyre- og/eller peptidenheter foregår på i og for seg kjent måte, idet man fortrinnsvis knytter en aminosyre eller et peptid med beskyttet a-aminogruppe og eventuelt aktivert terminal karboksylgruppe (= aktiv komponent) til en aminosyre eller et peptid med fri a-aminogruppe og fri eller beskyttet f.eks. forestret terminal karboksylgruppe

(= passiv komponent), i det dannede produkt frigjør den terminale aminogruppe og omsetter dette peptid, inneholdende en fri a-aminogruppe og en eventuelt beskyttet terminal karboksylgruppe, iggen med en ytterligere aktiv komponent, dvs. en aminosyre eller et peptid med aktivert terminal karboksylgruppe og fri a-aminogruppe, osv. Karboksylgruppen kan eksempelvis aktiveres ved overføring

i et syreazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoksazolid eller en aktivert ester, som en av de videre nedenfornevnte, eller ved reaksjon med et karbodiimid, som N,N-dicykloheksylkarbodiimid, eventuelt under tilsetning av N-hydroksysuccinimid, et usubstituert eller f.eks. med halogen, metyl eller metoksy substituert 1-hydroksybenzotriazol eller 4-hydroksybenzo-l,2,3-triazin-3-oksyd (o.l. sammenlign tysk patent nr. 1.917.690, 1,937.656, 2.202.613) eller spesielt av N-hydroksy-5-nor-bornen-2,3-dikarboksimid, eller med N,N'-karbonyldiimidazol.

Som den vanligste koblingsmetode skal det nevnes karbo-diimidmetoden, videre også azidmetoden, metoden med aktivert ester og anhydridmetoden, samt Merrifield-metoden og metoden av N-karboksyanhydrider eller N-tio-karboksyanhydrider.

For dannelse av aktiverte estere, som er nevnt ovenfor egner det seg f.eks. eventuelt med elektrone-tiltrekkende substituenter substituerte fenoler og tio-fenoler som fenol, tiofenol, tiokresol, p-iiitrotiofenol,

2,4,5- og 2,4,6-triklorfenol, penta(fluor eller klor) fenol, o- og p-nitrofenol, 2,4-dinitrofengl, p-cyano-fenol, videre f.eks. N-hydroksysuccinimid, N-hydroksy-ftalimid og N-hydroksypiperidin.

Ved en spesielt foretrukket fremstilling av peptidene av formel II anvender man som koblingsmetode karbodiimid-metoden med N,N'-dicykloheksylkarbodiimid i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol. Den terminale karboksylgruppe beskyttes derved i form av g-(trimetylsilyl) -etylestern, a-aminogruppen av den aktive komponent beskyttes med benzyloksykarbonylgruppen, som etter hvert ko^lingstrinn avspaltes ved hjelp av hydrogenolyse. Til beskyttelse av e-aminogruppen av lysinresten anvendes acyleringen med tert-butoksykarbonylgruppen og for hydroksylgruppen treoninresten foretringen med tert-butylgruppen. Disse to beskyttelsesgrupper kan, hvis ønsket, til slutt i et trinn avspaltes ved sur hydrolyse, f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre, saltsyre eller fluorhydrogen. 3 14 Begge svovelholdige syrerester (Bmp og Cys ) innfører man fortrinnsvis først i siste stadium, da nærvær av svovel som kjent kan påvirke aktiviteten av hydro-generingskatalysatoren og således gjøøeeanvendelsen av de forøvrig meget fordelaktige hydrogenolyttisk avspaltbare grupper tvilsomme. Merkaptogruppene i de nevnte syrer beskyttes fordelaktig med tritylgruppen, som er spesielt egnet for gjennomføringen av foretrukkede fremgangsmåte-varianter.

Alt etter arbeidsmåte får man forbindelser

i form av baser eller deres salter. Av saltene kan det på i og for seg kjent måte fremstilles basene. Av sist-nevnte igjen lar det seg ved omsetning med syrer, f.eks. med slike, som danner de ovennevnte salter utvinne terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter.

På grunn av det snevre forhold mellom de nye forbindelser i fri form i form av deres salter er det i det foregående og følgende med fri forbindelse og deres salter er det 1 foregående og følgende med fri forbindelse' og deres salter også eventuelt å forstå de tilsvarende salter resp. frie forbindelser.

Oppfinnelsen vedrører også de utførelses-former av fremgangsmåten, hvor man går ut fra en på et eller annet fremgangsmåtetrinn som mellomprodukt dannet forbindelse og gjennomfører de manglende fremgangsmåtetrinn eller idet et utgangsstoff dannes under reaksjons-betingelsene eller anvendes i form av et derivat herav, eventuelt et salt.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvender man fortrinnsvis slike utgangsstoffer som fører til de innledningsvis som spesielt verdifulle omtalte forbindelser.

Oppfinnelsen vedrører likeledes farmasøytiske preparater som inneholder forbindelser med formel I eller farmasøytisk anvendbare salter herav. Disse farmasøytiske preparater kan spesielt finne anvendelse i de ovenfor angitte indikasjoner når de administreres intraperdrtønealt, som intravenøst, intramuskulært eller subkutant, eller også intranasalt. Den nødvendige dose avhengig av den sykdom som spesielt skal behandles, dens tyngde og tera-piens varighet. Antall og mengde av enkeltdosene, samt administreringsskjerna kan best bestemmes ved en indivi-duell undersøkelse av den eventuelle pasient. Metoden til bestemmelse av disse faktorer er vanlig for fagfolk. Vanligvis ligger imidlertid ved en injeksjon en terapeutisk virksom mengde av en slik forbindelse i dosisområdet fra ca. 0,001 til ca. 0,2 mg/kg legemsvekt. Det foretrekkes område fra ca. 0,0015 til ca. 0,15 mg/kg legemsvekt og administreringen foregår ved intravenøs infusjon eller subkutan injeksjon. Følgelig inneholder farmasøytiske preparater til parenteral administrering i enkeltdosisform i avhengighet av applikasjonstypen pr. dosis ca. 0,08 til ca. 15 mg av en av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Ved siden av det virksomme stoff inneholder den vanlig vis dessuten en puffer, f.eks. en fosfatpuffer som skal holde pH mellom ca. 3,5 og 7, videre natriumklorid, mannit eller sorbit til innstilling av isotonien. De kan foreligge ge i frysetørket eller oppløst form, idet oppløsninger med fordel kanoinneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2-0,3% 4-hydroksybenzosyre-metylester eller -etylester. Skal i slike preparater det virksomme stoff foreligge i form av et kompleks med forlenget virkningstid, så kan dette dannes direkte ved tilsetning av de kompleksdannende komponenter til en indeksjonsoppløsning som f.eks. tilberedes i henhold til de ovennevnte forholdsregler. Som tilsetning egner det seg f.eks. 0,1-1,0 vektsprosent av et sink (Il)-salt (f.eks. sulfater) i forbindelse méd 0,5-5,0 vektsprosent protamin (f.eks. som sulfat), referert til det samlede volum av injeksjonsoppløsningen; tilberedningen foreligger som oppløsning av pH 3,5 til ca. 6,5 eller som suspensjon på ca. pH 7,5 til 8,0.

Et preparat for den intranasale ådministrering kan foreligge som en vandig oppløsning eller gele, en oljeaktig oppløsning eller suspensjon, eller også en fettholdig salve. Et preparat i form av en vandig oppløsning får man f.eks. ved at man oppløser det virksomme stoff med formel I, eller et terapeutisk anvendbart syreaddisjonssalt herav i en vandig pufferoppløsning av pH inntil 7,2

og tilsetter et isotonin-frembringende stoff. Den vandige oppløsning tilsettes hensiktsmessig et polymert klebe-middel, f.eks. polyvinylpyrrolidon, og/eller et koser-veringsmiddel. Enkeltdosen utgjør ca. 0,08 til ca. 15 mg, fortrinnsvis ca. 0,25 til 10 mg, som er inneholdt i ca. 0,05 ml av en oppløsning, resp. 0,05 g av en gele.

En oljeaktig applikasjonsform for den intra-nasal administrering får man f.eks. ved suspendering av et peptid med formel I eller et terapeutisk anvendbar syreaddisjonssalt herav i en olje, eventuelt av tilsetning av svellemidler som aluminiumstearat, og/eller grenseflateaktive midler (tensider), hvis HLB-verdi ("hyd-rofilik-lipofilik-balance") ligger under 10. Som fett-

c?

syremonoestere av flerverdige alkoholer, f.eks. glycerol- . monostearat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitanmonoleat. En fettholdig såpe får man f.eks. ved suspendering av det virksomme stoff ifølge oppfinnelsen i et strykbart fettgrunnlag, eventuelt under tilsetning av et tensid av HLB-verdi under 10. En emul-sjonssalve får man ved utdrivning av en vandig oppløsning av det peptidiske virksomme stof i et mykt> strykbart fettunderlag under tilsetning av et tensid, hvis HLB-verdi ligger under 10. Alle disse intranasale applika-sjonsformer kan også inneholde konserveringsmidler. Enkeltdosene utgjør ca. 0,08 til ca. 15 mg, fortrinns-

vis ca..0,25 til 10 mg, inneholdt i ca. 0,05 til ca.

0,1 g av grunnmassen.

For den intranasale administrering egner det seg videre også inhalasjons- resp. insufflasjonsprepa-rater, som insufflasjonskapsler, som muliggjør å in-sufflere det virksomme stoff i form av et pudder med åndedrett, eller aerosoler eller sprays, som kan for-

dele det farmakologisk virksomme stoff i form et pudder eller i form av dråper av en oppløsning eller suspensjon. Preparater med pudderfordelende egenskaper inneholder foruten det virksomme stoff vanligvis hjelpe-midler: Insufflasjonskapsler inneholder f.eks. faste bærestoffer, som laktose;aerosol- resp. spraytilbered-ninger inneholder f.eks. en flytende drivgass med et kokepunkt under væreIsetemperatur, samt hvis ønsket, ytterliger bærestoffer, som flytende eller faste ikke-ioniske eller anioniske tensider og/eller faste fortyn-ningsmidler. Preparater, hvori det farmakologiske virksomme stoff foreligger i oppløsning, inneholder foruten dette et egnet drivmiddel, videre, hvis nødvendig, et ekstra oppløsningsmiddel og/eller en stabilisator. I steden for drivgassen kan det også anvendes trykkluft,

som frembringes etter behov ved hjelp av eft egnet komprimerings- og avspenningsinnretning.

Oppfinnelsen vedrører likeledes anvendelsen av de nye forbindelser med formel I og terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter herav som farmakologisk aktive forbindelser, spesielt i de for somatostatin vanlige indikasjoner, fortrinnsvis i form av farmasøy-tiske preparater. Den daglige dose, som administreres et varmblodsdyr på ca. 70 kg utgjør fra ca. 0,1 til ca. 120 mg.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved

hjelp av følgende ikke-begrensende eksempler. Tempera-turen angis i Celsiusgrader; som forkortelse f.eks. til betegnelse av aminosyre, peptider, beskyttelsesgrupper etc, anvendes de vanlige, f.eks. de i "Synthese von Peptiden" (Utgiver: E. Wunsch), bind XV av "Methoden der org. Chemie" (Houben-Weyl) (1974; G. Thieme, Stuttgart), sammenstilte forkortelsesbetegnelser. Spesielt anvendes følgende forkortelser.

Bmp - 3-merkaptopropionsyre

Boe - tert-butoksykarbonyl

Bpoc - 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykarbonyl

But - tert-butyl (som eterdannende gruppe)

HONB - N-hydroksy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboksimid OBut - tert-butoksy (som esterdannende gruppe)

ONP - p-nitrofenoksy (som esterdannende gruppe) OTmse - 2-(trimetylsilyl)-etoksy( som esterdanende

gruppe)

Trt - trifenylmetyl (=trityl)

Z S benzyloksykarbonyl (karbobenzoksy)

DC - tynnskiktkromatografi

I DC anvender man om intet annet er angitt kieselgel som adsorbens og følgende systemer som eluerings-middel: System 45: sek-butylalkohol-3%-vandig ammoniakk (70:30)

101: Butanol-pyridin-eddiksyre-vann (38:24:8:30) 155: Pentanol-pyridin-vann-butanon-eddiksyre

(40:28:15:11:5)

157: Kloroform-metanol-eddiksyre-vann(70:42:0,5:10)

Eksempel 1

-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Pro-C^s-OBut opptas ved 0°C i 3,0 ml trifluoreddiksyre-vann (9:1) og oppfylles etter 30 minutter ved 20°C med 30 ml eter. Det rå trifluoracetat tørkes i

vakuum, oppløses i 5 ml IN eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anionutveksler i acetatform (f.eks. "AG" 1-X8, et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, Salif., USA). Eluatet inndampes i vakuum og residuet underkastes motstrømsfordeling i systemet n-butanol-vann-iseddik (4:5:1). Etter 800 fordelingstrinn befinner produktet seg i elementene 170-200 (K=0,26). Titelforbindelsen er tynnskiktkromatografisk enhetlig.

DC: System 157: Rf 0,15.

Utgangsstoffet fremstilles som følger:

Trinn 1. 1 Z-Phe-Thr(But)-OTmse

En oppløsning av 101,82 g Z-Phe-OH og 90,91 g H-Thr(But)-OTmse i 660 ml metylenklorid blandes med 81,65 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafUtreres utfellingen, filtratet inndampes til halvparten av volumet og blandes til uklarhet med petroleter. Tittelforbindelsen krystalliserer fine nåler, smeltepunkt 92-93°C /"a7D= -1°.

Trinn 1. 2. H-Phe-Thr(But)-OTmse

En oppløsning av 10 g Z-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.1) i 100 ml metanol hydrogeneres på 1,0 g Pd-kull (10%-ig) i en time. Reaksjonsblandingen frafiltreres fra katalysatoren og oppløsningsmidlet inndampes, idet det som residu fåes tittelforbindelsen.

DC: Karbontetraklorid-etylacetat (6:4): Rf:0,15.

Trinn 1. 3 Z-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse

En blanding av 6,12 g Z-Thr(But)-0H, 7,62 g H-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.2) og 4,48 g dicykloheksylkarbodiimid i 50 ml metylenklorid hensettes 20 timer ved 20° C og filtreres. Filtratet inndampes og den gjenblivende. oppløsning blandes dråpevis med petroleter. Det utfelte produkt fåes rent ved gjentatt gjennomfelling fra etylacetat-petroleter.

DC: Karbontetraklorid-etylacetat (6:4): Rf 0,59.

Trinn 1. 4 H-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse

En oppløsning av 1,43 g Z-Thr(But)-Phe-Thr (But)-OTmse (trinn 1.3) i 14 ml metanol hydrogeneres etter tilsetning av 0,15 g Pd-kull (10%-ig) i 2 timer. Katalysatoren frafiltreres og fra filtratet avdampes oppløsningsmicllet, idet det som residu fremkommer tittelforbindelsen.

DC: Kloroform-metanol (95:5): Rf 0,38.

Trinn 1. 5 Z-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse

Til en oppløsning av 1,15 g H-Thr(But)-Phe-Thr (But) -OTmse (trinn 1.4) og 1,24 g Z-(D-Trp)-Lys(Boe)-OH i 10 ml acetonitril setter man 0,35 g N-hydroksybenzotriazol og 0,472 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 20 timer ved 20°C filtreres den dannede utfelling fra, filtratet inndampes og residuet gjennomfelles fra varm etylacetat.

DC: Cykloheksan-aceton (7:3): Rf 0,20

Trinn 1. 6 H-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse

En oppløsning av 7,9 g Z-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr (But)-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.5) i 200 ml metanol hydrogeneres etter tilsetning av 1 g Pd-kull (10%-ig)

i 2 timer. Reaksjonsoppløsningen filtreres fra katalysatoren og oppløsningsmidlet inndampes, idet det som residu fåes tittelforbindelsen.

DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,60.

Trinn 1. 6A H-Asn-Phe-Phe-OH

En oppløsning av 20,5 g Z-Asn-Phe-Phe-OH

i 270 ml metanol og 30 ml vann hydrogeneres ved værelsetemperatur på 2 g Pd-kull (10%-ig) i 4 timer. Etter frafiltrering av katalysatoren inndampes filtratet i vakuum og residuet anvendes direkte i neste trinn.

Trinn l. S- B Z-Lys (Boe)-Asn-Phe-Phe-OH

En suspensjon av 15,6 g H-Asn-Phe-Phe-OH

(trinn 1.6A) og 27,6 g Z-Lys (Boc->-ONP i 200 ml dimetylformamid, 25 ml vann og 9,2 ml 4 N natronlut omrøres i 20 timer ved værelsetemperatur, nøytraliseres deretter

ved tilsetning av 36,8 ml IN saltsyre ved 0-5°C og blandes med 300 ml vann, hvormed råproduktet faller ut. Dette tørkes, utrøres to ganger med hver gang 300 ml

eter og tørkes igjen. Utbyttet utgjør 88% av et ifølge tynnskiktkromatografi enhetlig produkt.

DC: Butanol-eddiksyre-vann (3:1:1): Rf 0,82. Metyletylketon-pyridin-vann (65:5:20): Rf 0,53.

Trinn 1. 7 Z-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr-(But)-OTmse

En oppløsning av 5,84 g Z-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-OH (trinn 1.6b) og 6,64 g H-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.6) i 30 ml dimetylformamid blandes med 1,123 g N-hydroksybenzotriazol og 1,72 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 20 timer ved 20°Cffra-fUtrerer man og heller filtratet i 150 ml isvann. Utfellingen frafiltreres og det tørkede residu gjenutfelles to ganger fra acetonitril-etanol (8:2), idet det fremkommer tittelforbindelsen.

DC: Kloroform-metanol-vann-iseddik (88:10;5:1:0,5) Rf 0,44.

Trinn: 1.8 H-Lys (Boel-Asn-phe-Phe- (D-TrpL-Lys ( Boc)-Thr(But)-Phe-Thr-(But)-OTmse

En oppløsning av 3,53 g Z-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe- (D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.7) i 100 ml 90%-ig trifluoretanol hydrogeneres etter tilsetning av 0,4 g Pd-kull (10%-ig) i 3timer ved værelsetemperatur, reaksjonsoppløsningen filtreres fra katalysatoren og oppløsningsmidlet avdampes. Den som residu dannede tittelforbindelse viser i tynnskiktkromatogram på silikagel i systemet kloroform-metanol-vann-iseddik (88:10,5:1:0,5) en Rf-verdi på 0,24.

Trinn 1. 9 Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe) -.

Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse.

Til 0,353 g Bmp(Trt)-OH og 1,50 g H-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-(D-Trt)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.8) i 10 ml dimetylformamid gir man 0,155 ga N-hydroksybenzotriazol og 0,246 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltrerer man og heller filtratet i 100 ml isvann. Det frafiltreres og gjenutfelles fra metanol.

DC: Kloroform-metanol (9:1): Rf 0,66. Kloroform-metanol-vann-iseddik (88:10,5:1:0,5): Rf 0,71. Trinn 1. 10 Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-T Thr(But)-Phe-Thr(But)-OH

1,35 g Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OTmse (trinn 1.9) opptas

i 23 ml 0,15N-oppløsning av tetraetylammoniumfluorid i dimetylformamid. Etter 35 minutter ved 30°C helles opp-løsningen under isavkjøling til en blanding av 90 ml vann og 2,16 ml IN saltsyre, frafiltreres,ovaskes grundig med vann og tørkes. Tittelforbindelsen fåes som hvitt pulver i tynnskiktkromatografisk ren form.

DC: Kloroform-isopropanol-iseddik (70:8:2):Rf 0,28; kloroform-metanol (9:1):Rf 0,20.

Trinn 1. 10A Bpoc-Pro-Cys(Trt)-OBut

En blanding av 1,77 g Bpoc-Pro-OH og 0,63 ml N-etylmorfolin i 35 ml tetrahydrofuran blander man ved -10°C med 0,665 ml isobutylklorokarbonat, og etter 15 minutter ved -10°C tildrypper man en oppløsning av 2,135 g H-Cys(Trt)-OBut i 25 ml tetrahydrofuran, lar det reagere i 1 time ved -10°C og 15 timer ved 20°C og inndamper. Residuet opptas i 100 ml etylacetat, oppløsningen ekstraheres i rekkefølge med IN citronsyre-oppløsning,

IN natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. Produktet fåes rent ved kromatografi på en søyle av silikagel.

DC: Toluen-aceton (7:3): Rf 0,60;

etylacetat-petroleter (1:1):Rf 0,40.

Trinn 1. 10B H-Pro-Cys(Trt)-OBut

Til en oppløsning av 1,13 g Bpoc-Pro-Cys(Trt)-OBut (trinn 1.10A) i 25 ml iseddik setter man dråpevis 3 ml vann. Etter en time ved 45°C inndampes, residuet opptas i 100 ml etylacetat og oppløsningen vaskes i rekke-følge med IN natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. Det dannede produkt /DC: toluen-aceton (7:3): Rf 0, 20/ anvendes direkte i følgende kondensasjon.

Trinn 1. 11 Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Pro-Cys(Trt)-OBut

Til en oppløsning av 696 mg Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-OH)

(trinn 1.10), 266 mg H-Pro-Cys(Trt)-OBut (trinn 1.10B)

og 91 mg N-hydroksybenzotriazol i 3 ml dimetylformamid setter man 123 mg dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafUtreres, filthatet inndampes og residuet gjenutfelles fra isopropanol. Man får tittelforbindelsen i tynnskiktkromatografisk ren form i et utbytte på 85%.

DC: Kloroform-metanol (9:1): Rf 0,70.

Trinn 1. 12 Bmp-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr (But) -Phe-Thr (But) -Pro-Cy^s-OBut

660 mg Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe_Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Pro-Cys(Trt)-OBut (trinn 1.11) oppløses i 30 ml dimetylformamid og dryppes til den omrørte oppløsning av 711 mg jod i 400 ml metanol i løpet av 15 minutter. Etter ytterligere 10 minutter heller man en oppløsning av 556 mg ascorbinsyre i 27 ml vann til, inndamper den farveløse oppløsning til 20 ml og utfeller med 100 ml vann. Residuet tørkes og underkastes en motstrømsfordeling i systemet metanol-puffer (28,6 ml iseddik, 193 g ammoniumacetat, 1 liter vann)-kloroform-lkTrbolitetraklorid (4:1:2:2). Etter 900 fordelingstrinn befinner stoffet seg i elementene 160-195 (K^O,22) .

DC: Kloroform-metanol (9:1): Rf 0,40; Kloroform-isopropanol-iseddik (70:8:2): Rf 0,30.

Eksempel 2 Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys-OH

100 mg Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr-(But)-Pro-Cys(Trt)-OBut (trinn 1.11) oppløses ved 0°C i 1,0 ml konsentrert saltsyre og blandes etter 2 minutter ved 0°C med 50 ml vann. Etter tre gangers ekstrahering med hver gang 50 ml eter innstilles den vandige fase ved tilsetning av 12,5 ml IN natronlut på pH 7,4 og luft føres gjennom i 24 timer. Reaksjonsblandingen inndampes i vakuum, residuet oppløses i 3 ml eddiksyre og filtreres gjennom 70 ml anionutveksler i acetatform (f.eks. "AG" 1-X8, et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif., USA.) Eluatet inndampes i vakuum og residuet underkastes motstrømsfordeling i systemet n-butanol-vann-iseddik (4:5:1). Etter 800 fordelingstrinn befinner produktet seg i elementene 165-195 (K<v>O,23). Ifølge tynnskiktkromatografien er produktet enhetlig.

DC: System 157: Rf 0,15.

Eksempel 3

Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-Thr-Phe-Thr-Tpo-Cys-OH

(Tpo = 4-tiaprolin)

173 mg Bmp-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-(Boc) -Thr (But) -Phe-Thr (But) -Tpo-C^s-OBut opptas ved 0°C i 9,0 ml trifluoreddiksyre-vann (9:1) og utfelles etter 30 minutter ved 20°C med 50 ml eter. Det rå trifluoracetat tørkes i vakuum og underkastes motstrømfor-deling i systemet n-butanol-vann-éseddik (4:5:1). Etter 386 fordelingstrinn befinner produktet seg i elementet 225-280 (K = 1,58). Tittelforbindelsen er tynnskikt-kromatograf isk enhetlig.

DC: System 45: Rf 0,15

101: Rf 0,47

155: Rf 0,60

Utgangsstoffet fremstilles som følger:

Trinn 3. 1 Boc-Tpo-OH (som cykloheksylammoniumsalt) En suspensjon av 2,66 g 4-tiaprolin og 2,12 g Na2CC>2 i en blanding av 20 ml 1^0 og 40 ml dioksan blandes med 4,80 g di-tert-butyl-dikarbonat. Etter 30 minutter ved 20°C avkjøles til 0-5°C og innstilles med 17,5 ml 2-N HC1 på pH 2,0, oppløsningen ekstraheres med etylacetat, etylacetat-ekstraktet tørkes og inndampes til volum på 20 ml. Deretter tilpipetteres ved 0-5°C 2,30 ml cyklo-heksylamin, krystallinsk utfelling frafiltreres og tørkes. Smeltepunkt = 202°-203°C.

/~a7g: -105 - 1° (c = 0,59% i CHC13)

Trinn 3. 2 Boc-Tpo-OTmse

En oppløsning av 2,33 g Boc-Tpo-OH (som cykloheksylammoniumsalt, trinn 3.1), 1,61 ml pyridin og 1,59 ml 2-trimetylsilyl-etanol i 30 ml acetonitril blandes ved - 5°C i løpet av 15 minutter porsjonsvis med 2,27 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 5°C frafiltreres utfellingen, filtratet inndampes, opptas i 200 ml etylacetat, ekstraheres i rekkefølge med 1-N HC1, vann, 1-N natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes.

DC: kloroform-metanol (8:2): Rf 0,7

Trinn 3. 3 H-Tpo-OTmse (hydroklorid)

En oppløsning av 1,64 g Boc-Tpo-OTmse (trinn 3.2) i 4 ml etylacetat blandes ved 0°C med 23,4 ml 2,1-N HC1 i etylacetat. Etter 1 1/4 time ved 20°C avkjøles til 0°C og felles med 200 ml petroleter.

DC: toluen-aceton (7:3): Rf 0,58

Trinn 3. 3A /Bpoc-Thr(But) Z?2°

En oppløsning av 2,48 g Bpoc-Thr(But)-OH i 25 ml kloroform blandes med 0,62 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltreres utfellingen og filtratet inndampes.

DC: kloroform-metanol (8:2): Rf 0,85

Trinn 3. 4 Bp6-Thr(But)-Tpo-OTmse

En oppløsning av 0,74 g H-Tpo-OTmse (som hydroklorid, trinn 3.3), 347 ^ul N-etylmorfolin og 2,66 g /Bpoc-Thr (Butjy^""0 (trinn 3*3A) i 17 ml dimetylf ormamid hensettes i 15 timer ved 20°c. Oppløsningen inndampes, residuet oppløses i etylacetat og ekstraheres med vann. Etter tørkning over natriumsulfat inndampes produktet ;og fåes rent ved kromatografi på en silikagel-søyle. ;DC: toluen-aceton (7:3): Rf 0,73 ;DC: kloroform-metanol (8:2): Rf 0,81 ;Trinn 3. 5 Bpoc-Thr(But)-Tpo-OH ;En oppløsning av 1,0 g Bpoc-Thr(But)-Tpo-OTmse (trinn 3,4) i 2 ml dimetylformamid blandes med 0,7 mol. tetraetylammoniumfluoridoppløsning i dimetylsulfoksyd. Etter 1 1/2 time ved 20°C avkjøles til 0°C og utfelles ;med 100 ml 0,01-N HC1. ;DC: kloroform-metanol (8:2): Rf 0,32 ;Trinn 3. 6 Bpoc-Thr(But)-Tpo-Cys(Trt)-OBut ;En oppløsning av 382 mg Bpoc-Thr(But)-TpoØQH (trinn 3.5), 331 mg H-Cys(Trt)-OBut og 141 mg N-hydroksybenzotriazol i 7 ml dimetylformamid blandes med 117 mg dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltreres utfellingen og filtratet inndampes. Residuet oppløses i etylacetat, vaskes med vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. Produktet renses ved søyle-kromatografi på silikagel. ;DC: tetraklormetan-etylacetat (6:4): Rf 0,57. ;Trinn 3. 7 H-Thr(But)-Tpo-Cys(Trt)-OBut 'hydroklorid ;En oppløsning av 307 mg Bpoc-Thr(But)-Tpo-Cys (Trt) -OBut i 20 ml 90%-ig 2,2,2-trifluoretanol holdes ved 20°C i 35 minutter ved langsom tilsetning av 2 76 ^,ul 1-N HC1 ved pH 1,0. Blandingen innstilles med pyridin på pH 4,3 og lyofiriseres fra tert-butanol. ;DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf = 0,61 ;Trinn 3. 7A Z-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But) ;-Phe-OTmse ;En oppløsning av 3,25 g Z-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-OH (trinn 1.6B) og 3,44 g H-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse i 70 ml dimetylformamid blandes med 0,81 g HONB og 1,02 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20° C frafiltreres utfellingen og filtratet inndampes. Residuet utdrives med en blanding av 50 ml metanol og ;150 ml etylacetat, frasuges og tørkes. ;DC: Kloroform metanol (8:2): Rf 0,87 ;Trinn 3. 7B H-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse ;En oppløsning av 5,0 g Z-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boe) -Thr (But) -Phe-OTmse (trinn 3.7A) i 80 ml 90%-ig trifluoretanol hydrogeneres etter tilsetning av 1,0 g Pd-Kull (10%-ig) i løpet av 17 timer ved værelsetemperatur, reaksjonsoppløsningen frafiltreres fra katalysatoren og oppløsningsmidlet avdampes. Som residu får man tittelforbindelsen. ;DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,54. ;Trinn 3. 7C Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys (Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse ;Til 1,19 g Bmp(Trt)-OH og 4,58 g-H-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 3.7B) og 0,61 g HONB i 30 ml dimetylformamid setter man til 1,23 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltrerer man og heller filtratet i 250 ml isvann. Det frafiltreres, tørkes og renses ved søyle-kromatografi på silikagel. ;DC: kloroform-metanol (8:2): Rf 0,85. ;Trinn 3. 7D Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH ;2,50 g Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 3.7C) opptas i en oppløsning av 1,48 g tetraetylammoniumfluorid i 55 ml dimetylformamid. Etter 20 minutter ved 30°C helles opp-løsningen under isavkjøling til 200 ml 0,01-N saltsyre, frafiltreres og tørkes. ;DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,4 2 ;Trinn 3. 8 Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)- Phe-Thr(But)-Tpo-Cys(Trt)-OBut ;Til en oppløsning av 426mg Bmp(Trt)-Lys(Boe)- ;Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-I(iBoc) -Thr (But) -Phe-OH (trinn 3.7D),. 240 mg H-Thr(But)-Tpo-Cys(Trt)-OBut"HC1 (trinn 3.7), 41,8^il lN-etylmorfolin og 50 mg HONB i 6 ml dimetylformamid setter man 62 mg dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltreres utfellingen, filtratet inndampes til halvparten og utfelles med vann. Etter frasugning og tørkning renses tittelforbindelsen dessuten søylekromato-grafisk på silikagel. ;DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,82 ;Kloroform-metanol (95:5): Rf 0,10 ;Trinn 3. 9 ;I ;Bmp-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Tpo-Ci<ys>-OBu<t>;590 mg Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Tpo-Cys(Trt)-OBut (trinn 3.8) oppløses i en blanding av 400 ml metanol og 10 ml dimetylformamid og den omrørte oppløsning blandes med 99,2 ml 0,1-N jod i metanol dråpevis. Etter ytterligere 10 minutter heller man til 13 ml av en 10%-ig oppløsning av ascorbinsyre i vann, inndamper den farveløse oppløsning til ca. 40 ml og utfeller med 100 ml vann. Residuet tørkes og underkastes en motstrømsfordeling i systemet metanol-puffer (28,6 ml iseddik, 19?3 g ammoniumacetat, 1 liter vann)-kloroform-karbontetraklorid (2700:675:900:1575). Etter 500 fordelingstrinn befinner stoffet seg i elementene 60-84 (K^0,15) . ;DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,75 ;Eksempel 4 ;Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-Thr-Phe-Thr-MeLeu-Cys-OH ;(MeLeu = N-Metyl-leucin) ;118 mg Bmp-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-' o Thr(But)-Phe-Thr(But)-MeLeu-Cys-OBut opptas ved 0 C i 60ml trifluoreddiksyre-vann (9:1) og inndampes, etter 30 minutter ved 30°C, og residuet utdrives med 30 ml eter. Det rå ;trifluoracetat tørkes i vakuum og underkastes motstrøm-fordeling i systemet n-butanol-vann-iseddik (4:5:1). Etter 260 fordelingstrinn befinner produktet seg i elementene 35-65 (K<*>vi,95). Tittelf orbindelsen er tynnskiktkromatografisk enhetlig.

DC: System 101: Rf 0,55.

Utgangsstoffet fremstilles som følger:

Trinn 4. 1 Z-MeLeu-OMe

En oppløsning av 25,13 g Z-Leu-OH i 275 ml tetrahydrofuran-dimetylformamid (10:1) blandes med 50 ml metyljodid. Til denne oppløsning settes under intens om-røring i løpet av 3 timer ved 20-40°C porsjonsvis 14,4 g av en dispersjon av natriumhydrid, blandingen oppvarmes til tilbakeløp og utrøres i 20 timer. Reaksjonsblandingen inndampes, residuet blandes 3 ganger med hver gang 300 ml eter ogiinndampes. Deretter fordeles residuet mellom 250 ml vann og 250 ml eter, eterfasen vaskes 2 ganger med hver gang 100 ml vann og de vandige faser ettterekstra-heres med 100 mleeter. Forenede eterfaser tørkes over natriumsulfat, frafiltreres og inndampes. Produktet renses ved søylekromatografi på silikagel.

DC: Kloroform-etylacetat (1:1): Rf 0,67

Kloroform-metanol (1:1): Rf 0,80.

Trinn 4. 2 Z-MeLeu-OH

23,29 g Z-MeLeu-OMe (trinn 4.1) oppløses i

215 ml dioksan, fortynnes med 72 ml vann og blandes med 44 ml 2-N natriumhydroksyd-oppløsning. Etter 10 minutters omrøring ved 20°C avkjøles oppløsningen til 0-5°C og behandles dråpevis med 21,8 ml 2-N saltsyre. Den klare gul-aktige oppløsning inndampes, blandes med 150 ml etylacetat og 150 ml vann og behandles dråpevis i isbad med 21,8 ml 2-N saltsyre. Den vandige fase adskilles og etterekstraheres med 100 ml etylacetat. Forenede organiske faser vaskes tre ganger med hver gang 100 ml vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. Produktet omkrystalli-seres fra cykloheksan. Smeltepunkt 74-75°C.

DC: Kloroform-etylacetat (1:1): Rf 0,13

Kloroform-metanol (1:1): Rf 0,54.

Trinn 4. 3 Z-MeLeu-OTmse

En oppløsning av 2,79 g Z-MeLeu-OH (trinn 4.2), 1,61 ml pyridin og 1,59 ml 2-trimetylsilyletanol i 40 ml acetonitril blandes ved -5°C i løpet av 30 minutter porsjonsvis med 2,27 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 0-5°C frafiltreres den dannede utfelling. Filtratet fortynnes med 300 ml etylacetat og vaskes 4 ganger med hver gang 25 ml 2-N saltsyre, 4 ganger med hver gang 50 ml vann, 4 ganger med hver gang 50 ml 1-N natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og 5 ganger med hver gang 50 ml vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,80.

Trinn 4. 4 H-MeLeu-OTmse'hydroklorid

En oppløsning av 3,70 g Z-MeLeu-OTmse (trinn 4.3) i 40 ml metanol hydrogeneres på 0,37 g Pd-kull (10%-ig) i 15 minutter, idet pH holdes konstant ved 4,5 ved etterhvert tilsetning av fortynnet HC1. Reaksjonsblandingen befries for katalysatoren ved filtrering og inndampes. Som residu fremkommer jpraktisk talt ren tittelforbindelse.

DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,71

Trinn 4. 5 Bpoc-Thr(But)-MeLeu-OTmse

En oppløsning av 0,70 g H-MeLeu-OTmse-hydroklorid (trinn 4.4) og 0,316 ml N-etylmorfolin i 16 ml

_JL

dimetylf ormamid blandes med 2,43 g /Bpoc-Thr (But) Z7^2°

(trinn 3.3A). Etter 15 timer ved 20°C inndampes reak-sjonsoppløsningen og residuet renses ved søylekromatografi på silikagel.

DC: toluen-etylacetat (7:3): Rf 0,70

Trinn 4. 6 Bpoc-Thr(But)-MeLeu-OH

En oppløsning av 617 mg Bpoc-Thr(But)-MeLeu-OTmse (trinn 4.5) i 2 ml dimetylformamid blandes med en 0,70-molar oppløsning av tetraetylammoniumfluorid i dimetylsulfoksyd. Etter 1 time ved 20°C utfelles med 50 ml 0,01-N saltsyre, frafiltreres og tørkes.

DC: Toluen-etylacetat (7:3): Rf 0,23 Trinn 4. 7 Bpdc-Thr(But)-MeLeu-Cys(Trt)-OBut

En oppløsning av 344 mg Bpoc-Thr(But)-MeLeu-

OH (trinn 4.6), 294 mg H-Cys(Trt)-OBut og 125 mg HONB i

6 ml dimetylformamid blandes med 157 mg dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltreres utfellingen og filtratet inndampes. Residuet renses ved søylekromatografi på silikagel.

DC: karbontetraklorid-etylacetat (6:4): Rf 0,70.

Trinn 4. 8 H-Thr(But)-MeLeu-Cys(Trt)-OBut• hydroklorid

En oppløsning av 350 mg Bpoc-Thr(But)-MeLeu-Cys (Trt)-OBut i 20 ml av en blanding av 2,2,2-trifluoretanol-vann (9:1) holdes ved tilsetning etterhvert av 0,350 ml 1-N saltsyre i løpet av 30 minutter ved pH 1,0. Reaksjonsblandingen innstilles med pyridin på pH 4,3, inndampes og lyofyliseres fra tert-butylalkohol.

DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,74

Trinn 4. 9 Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-MeLeu-Cys(Trt)-OBut

Til en oppløsning av 486 mg Bmp (Trt)-Lys (Boe) - Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (Trinn 3.7D) 275 mg H-Thr(But)-MeLeu-Cys(Trt)-OBut.Hel (trinn 4.8), 0,472 ml N-etylmorfolin og 56,2 mg HONB i 7 ml dimetylformamid setter man 70,6 mg dicykloheksylkarbodiimid. Etter 15 timer ved 20°C frafiltreres, filtratet inndampes og residuet renses ved søylekromatografi på silikagel.

DC: Klorofocm-metanol (8:2): Rf 0,82

Kloroform-metanol (95:5): Rf 0,30

Trinn 4. 10

Bmp-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-

1

Thr(But)-Phe-Thr(But)-MeLeu-Cys-OBut

382 mg Bmp(Trt)-Lys(Boe)-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Thr(But)-MeLeu-Cys(Trt)-OBut (trinn 4.9) oppløses i 17 ml dimetylformamid og dryppes til den omrørte oppløsning av 406 mg jod i 230 ml metanol i løpet av 2 minutter. Etter ytterligere 15 minutter ved 20°C

tilsettes en oppløsning av. 318 mg ascorbinsyre i 15 ml vann, den farveløse oppløsning inndampes til ca. 40 ml og utfelles fra 50 ml vann. Residuet tørkes og underkastes en motstrømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700:675:900:7575). Etter 380 fordelingstrinn befinner sluttstoffet seg i elementene 26-45 (K^/0,08) .

DC: Kloroform-metanol (8:2): Rf 0,70

Eksempel 5

A) En injeksjonsoppløsning inneholdende 2,0 mg av et ifølge et av eksemplene 1-4 oppnådd peptid, som

I 1 Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys-OH, videre i eksemplene 5-11 betegnet som "virksomt stoff", fåes som følger: Man oppløser l,0mmg iseddik, 0,8 mg natriumacetat, 8,0 mg natriumklorid og 2,0 mg virksomtstoff i 0,7 ml destillert vann og fyller opp med destillert vann til 1 ml. Oppløsningen oppvarmes ved 120°C i 20 minutter i autoklav. pH etter sterilisering er 4,5.

B) En injeksjonsoppløsning inneholdende 0,5 mg av det

v virksomme stoff fåes som følger:

Man oppløser i 0,7 ml fysiologisk natrium-kloridoppløsning 0,5 mg virksomt stoff og surgjør opp-løsningen med 0,1-N saltsyre til pH 4,0. Med destillert vann oppfylles til 1 ml og sterilfiltreres.

Eksempel 6

A) En gelatin-holdig injeksjonsoppløsning inneholdende 0,1 mg virksomt stoff fåes som følger: En sterilfiltrert vandig oppløsning av det virksomme stoff blandes under oppvarming med en steril gelatinoppløsning, som som konserveringsmiddel inneholder fenol, under aseptiske betingelser, således at 1,0 ml oppløsning kar følgende sammensetning :

Blandingen fylles aseptisk i Vialer inntil 1,0 ml. B) En analog injeksjonsoppløsning inneholdende 0,5 mg a av det virksomme stoff får man.på samme måte som an gitt ovenfor, idet man fremstiller en blanding av følgende sammensetning:

Blandingen fylles i aseptiske vialer til 1,0 ml.

Eksempel 7

Preparat inneholdende 0,5 mg virksomt stoff som sterilt tørrstoff til injeksjon fåes som følger:

Man oppløser 0,5 mg virksomt stoff i 1 ml

i en vandig oppløsning av 20 mg mannit. Oppløsningen sterilfiltreres og fylles under aseptiske betingelser i en 2 ml ampulle, dypkjøles og lyofiliseres. Før bruk oppløses lyofilisatet i destillert vann. Oppløsningen anvendes intramuskulært eller intravenøst.

Eksempel 8

Injeksjonspreparat inneholdende det virksomme stoff som polyfosfat-suspensjon fåes som følger:

A) Med 1,0 mg virksomt stoff:

Man blander en oppløsning av 1,0 mg virksomt stoff og 9,0 mg natriumklorid i 0,5 ml destillert vann med en oppløsning av 2 mg natriumpolyfosfat "Calgon N" i 0,5 ml destillert vann. Den danned suspensjon har følgende sammensetning:

Suspensjonen har en pH på 6,9. Den er egnet for intramuskulær anvendelse.

B) Med 0,5 mg virksomt stoff:

På samme måte som angitt ovenfor fremstilles en suspensjon av følgende sammensetning:

Suspensjonens pH utgjør 5,9.

Eksempel 9 Injeksjonspreparatet inneholdende 0,3 mg frirksomt stoff i form av en oljeaktig aluminiumstearat-gel.

En 2%-ig aluminiumstearat-gel fremstilles

på vanlig måte ved suspensdering av 1,0 g aluminiummono-stearat i 49,0 g jordnøttolje og etterfølgende oppvarming ved 130°C i 10 minutter. 15,0 mg virksomt stoff suspenderes med 0,3 g av ovennevnte aluminiumstearat-gel, homogeniseres og fortynnes med den resterende mengde aluminiumstearat-gel. Den således dannede gel har føl-gende sammensetning:

Den oljeaktige aluminiumstearat-gel-suspensjon er egnet for intramuskulær anvendelse.

Eksempel 10.Injeksjonspreparat inneholdende 0,5 mg virksomt stoff som en depot-suspensjon med dekstransulfat.

Man oppløser i 0,4 ml destillert vann 0,36 mg eddiksyre, 1,9 mg natriumacetat-trihydrat, 0,8 mg natriumklorid og 0,5 mg virksomt stoff og fyller opp med destillert vann til 0,5 ml. Til denne oppløsning has under omrøring 0,5 ml av en 0,1%-ig oppløsning av dekstransulfat (molekylvekt 500.000), hvormed det danner seg en homogen utfelling. Den dannede suspensjon har følgende sammensetning :

Den vandige suspensjon er egnet for intramuskulær og subkutan injeksjon.

Eksempel 11 Nasal-spray

30 g finmalt virksomt stoff suspenderes i en blanding av 75 mg benzylalkohol og 1,395 g miglyol 812. _Med denne suspensjon innfylles aluminium-monoblokkdoser (innehold 10 ml) lukkes med en doseringsventil og fylles med 6,0 g freon 12/114 (40:60) under nitrogentrykk. Aluminiumsbeholderen med en fyllvekt på tilsammen 7,5 g inneholder 100 enkeltdoser a 0,3 mg virksomt stoff. Forstøvningsbeholderen er innstillet ved hjelp av ventiler således at ved engangs trykk utsprøytes en enkeltdose.

På samme måte fremstilles nesespray, som

i steden for Miglyol inneholder den samme mengde isopro-pylmyristat eller isopropylpalmitat eller "Labrafac WL 1219" (en blanding av glycerol- og polyoksyetylenglykol-estere av fettsyre med 8 og 10 karbonatomer).

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser med den generelle formel

hvori Bmp betyr desaminocystein-resten, X betyr Asn eller His, trp betyr D-Trp, som i benzenringen kan være substituert med et halogenatom, og Y betyr resten av en sekundær a-aminosyre med maksimalt 8 karbonatomer, de tilsvarende peptidamider, samt av syreaddisjonssalter og komplekser av alle disse forbindelser,karakterisertved at i en forbindelse med den generelle formel

hvori X, trp og Y har ovennevnte betydning og A og A' uavhengig av hverandre hver betyr en e-amino-beskyttelsesgruppe eller hydrogen, B og B<1>betyr uavhengig av hverandre hver en hydroksyl-beskyttelsesgruppe eller hydrogen, C og C<1>betyr hver en merkapto-beskyttelsesgruppe eller hydrogen og D betyr en karboksyl-beskyttelsesgruppe, aminogruppen eller hydroksyl, i vilkårlig rekkefølge a) avspaltes tilstedeværende beskyttelsesgrupper og b) dannes mellom merkaptogrupper og begge endeplaserte syrer eventuelt under samtidig avspaltning av tilstedeværende merkapto-beskyttelsesgrupper disulfid-broen og hvis ønsket, omdannes et som syreaddisjonssalt resulterende sluttprodukt i den tilsvarende frie base eller en som base fremkommet sluttstoff i et syreaddisjonssalt og/eller, hvis ønsket, isoleres et sluttstoff i form av et kompleks.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det fremstilles en forbindelse med formel I, hvori X betyr Asn, trp betyr D-Trp eller 5-fluor-D-Trp og Y betyr Pro, resten av 4-tiaprolin eller N-metyl-Leu.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det fremstilles /_ desamino-Cys 3-D-Trp<i->Pro<13>_7-somatostatin(3-14).

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det fremstilles /_ desamino-Cys 3-13 (5-fluor-D-Trp) -Pro _/-somatostatin(3-14).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det fremstilles /_ desamino-Cys 3-D-Trp -Tpo _/-somatostatin(3-14).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, k a r akk terisert ved at det fremstilles /_ desamino-Cys 3-D-Trpi-MeLeu"'"3_/-somatostatin (3-14) .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det fremstilles farmasøytisk anvendbare syreaddisjonssalter eller komplekser av forbindelser ifølge et av kravene 2-6.

8. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 - 7,karakterisert vedat disulfidbroen dannes oksydativt.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av farma-søytiske preparater inneholdende minst en av de ifølge et av kravene 1-8 oppnåelige forbindelser,karakterisert vedat man sammenblander minst en av disse forbindelser med minst et farmasøytisk anvendbart hjelpe- eller bæremateriale.

10. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-8, gjennomført prinsippielt som angitt i eksemplene 1-4.