NO783721L - Fremgangsmaate til syntese av oligonucleotider - Google Patents

Abstract

Triesterfremgangsmåte for syntese av oligonukleotider.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår oligonucleotider. Oppfinnelsen angår i et aspekt syntetisk desoksyribonukleinsyre

(DNA).

Videre angår oppfinnelsen oligodesoksyribonukleotider som forlopere for DNA.

Videre angår oppfinnelsen fremgangsmåter for syntese av oligonukleotider med en_definert sekvens.

Mere spesielt angår oppfinnelsen fremgangsmåte

for syntese av oligodesoksyribonukleotider.

Det er blitt et stadig okende behov for å

syntetisere oligodesoksyribonukleotider med en definert sekvens av de fire forskjellige nukleotider som inngår i DNA molekylet, ettersom det nu er mulig å sette inn relativt korte DNA segmenter i plasmid DNA slik at man kan kode nevnte plasmid DNA for en rekke formål, f.eks. for å stimulere produksjonen av peptidhormoner hos pattedyr.

En slik vellykket syntesevei er ofte blitt

betegnet "diester metoden", og den kan angis ved folgende reaksjonsskjerna hvor det dannes et dimerisk nukleotid:

hvor B er en basegruppe valgt fra tymin og beskyttet adenin, cytosin og guanin, X er en beskyttende gruppe for 5<f_>hydroksyl-funksjonen og R p er en beskyttende gruppe for 3'-hydroksyl-funksjonen. En etterfolgende kobling av det dimeriske nukleotid med et monukleotid eller med storre nukleotider kan brukes for å bygge lengere og lengere oligonukleotidkjeder. Ved et passende valg av reaktanter er det mulig å danne kjeder hvor gruppen B har den onskede sekvens. Denne diester metoden avleder selvsagt sitt navn fra det faktum at det koblede produkt er et fosfat diester.

Sekvensen i B-gruppen gir muligheter for koding for DNA. Det er således kjent at hver aminosyre i et polypeptid har en tilsvarende koding i DNA bestående av en spesifik sekvens av 3 nukleotider. Disse gruppene av tre nukleotider blir ofte betegnet som kodoner.

Selv om diester metoden er effektiv, så er den meget kritisk med hensyn til utbyttet som faller raskt med okende kjedelengde, rensingen tar meget lang tid og syntesen er meget vanskelig å utvikle til industriell skala.

En forbedret fremgangsmåte har erstattet denne diestermetoden, og blir i industrien ofte betegnet som "triestermetoden". Denne fremgangsmåten inbefatter koblingen av et nukleotid med en maskert 3t<->fosfatgruppe med et nukleosid eller nukleotid med en tilgjengelig 5'-hydroksylgruppe. Denne fremgangsmåten kan angis ved folgende reaksjonsskjerna:

hvor X, B og Ro har samme betydning som definert ovenfor, og R-^er en organisk gruppe hvis funksjon er å maskere nevnte 3'-fosfatgruppe og som kan avspaltes ved hjelp av en base. Typisk vil denne gruppen være en p-klorfenylgruppe.

Triestermetoden har sitt navn fra det faktum

at det koblede produkt er en fosfattriester. Videre detaljer ved denne fremgangsmåten kan finnes i at Itakura et al, "A Modified Triester Method For The Synthesis Of Deoxyribo-polynucleotides", Can J. Chem. 51, 3649 (1973), Itakura et al. "Chemical Sythesis And Sequence Studies Of Deoxyribonucleotides Which Constitute The Duplex Sequence Of The Lactose Operator Of E.Coli" J.Biol.Chem. 250, 4592 (1975), Bahl et al, "Chemical

And Enzymatic Synthesis Of The Lactose Operator Of E. Coli And Its Binding To The Lac Repressor", Proe. Nat. Acad. Sei. USA 73, 91 (1976), og" Itakura et al, "Improved Triester Approach For The Synthesis Of Pentadecathymidylic Acid " J.Am Chem. Soc, 97, 7327

(1975)'Disse artikler inngår her som referanser.

Skjont triestermetoden er langt bedre enn nevnte diestermetode, så er metoden dog meget langsom ettersom den krever meget tidskrevende kromatografi for å rense hver blokk av oligodesoksyribonukleotid etterhvert som det formes. Denne rensingen er nodvendig for å skille det koblede produkt fra den ikke-omsatte 5<*->hydroksylkomponent. I visse tilfelle er det også no'dvendig med en ytterligere kjemisk reaksjon og rensing for å oppnå et koblet produkt med tilstrekkelig renhet til at det kan brukes i nye koblingsreaksjoner.

Det er folgelig en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en bedret kjemisk syntese for oligonukleotider, da spesielt oligodesoksyribonukleotider.

Videre er en hensikt med oppfinnelsen å mere

effekt kunne fremstille syntetiske oligodesoksyribonukleotider.

Hensikten med oppfinnelsen og de fordeler den gir,

vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedret triestermetode for syntese av oligonukleotider med en sekvens av nukleotidenheter hvor basegruppene varierer etter en foronsket sekvens. Denne forbedring oppnås ved at man kobler som en..forste gruppe, et nukleotid med en maskert 3,-f°sfa"t-diestergruppe med, som en annen gruppe, et nukleosid eller nukleotid med en tilgjengelig fri 5'-hydroksylgruppe, og hvor nevnte forste gruppe brukes i et vesentlig molart overskudd. Koblingsreaksjonen som utfores i opplosning, anvender vanlige koblingsmidler.

Ved å bruke et vesentlig overskudd av forste

gruppe, vil den andre gruppen fullstendig eller i alt vesentlig bli totalt forbrukt. Således kan dét foronskede produkt fra koblingsreaksjonen raskt skilles fra reaksjonsblandingen ettersom forste gruppe er en ladet gruppe. Fig. 1 viser reaktanter som kan brukes i foreliggende oppfinnelse.

Fig. 2-4 viser reaksjonsskjemaBt som kan brukes

i foreliggende oppfinnelse og ved hjelp av hvilke di-, tri- og hoyere oligonukleotider kan fremstilles.

Som nevnt tidligere tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en forbedret triestermetode for syntese av oligonukleotider hvor nukleotidene i oligonukleotidkjeden varierer etter en definert sekvens. Den hittil foretrukne triester syntese har innbefattet at man har koblet to mindre fragmenter, den ene et nukleotid hvor det er en maskert, men reaktiv 3'-fosfatdiestergruppe, mens den andre reaktanten er et nukleosid eller nukleotid som har en tilgjengelig fri 5,-hydroksy] gruppe, i nærvær av vanlige kjente koblingsmidler så som 2,4> 6-triisopropylbenzensulf onyltetrazolid i opplosnirg. Pyridin er vanligvis det anvendte opplosningsmiddel. Det tor være innlysende at de to reaktantene i seg selv kan være oligonukleotider som er i stand til å bli koblet slik at det dannes en lengere oligonukleotidkjede.

I den vanlige fremgangsmåten har man anvendt de

to reaktantene i stokiometrisk, eller noe nær stokiometriske

mengder. Som nevnt tidligere så har imidlertid dette resultert i en reaksjonsblanding hvor det er vanskelig å utskille det foronskede produkt. Denne vanskeligheten har sin årsak forst og fremst i at reaktanten ikke fullstendig forbrukes i reaksjonen. Som et resultat av dette vil reaksjonsblandingen inneholde den reaktive gruppen med en fri 5<*->hydroksylgruppe foruten det foronskede produkt. Begge disse komponenter er noytrale og folgelig meget vanskelig å skille.

Relativt uventet har man nu funnet at selv i opplosning så kan koblingsreaksjonen gjores helt fullstendig eller nesten fullstendig med hensyn til den gruppen som har en tilgjengelig 5-'-hydroksylgruppe, hvis man bruker et vesentlig overskudd av den andre gruppen. Den blandingen som oppstår fra reaksjonen på denne måten inneholder nesten utelukkende det koblede produkt og den uomsatte gruppen som har en maskert 3<*->fosfat diestergruppe. Ettersom den sistnevnte forbindelsen er et ladet produkt eller en ladet forbindelse så kan den hensiktsmessig og enkelt skilles fra det uladede produkt fra koblingsreaksjonen.

Triestermetoden brukes mest vanlig for å syntetisere oligonukleotider som er egnet for transformasjon til oligodes-oksyribonukleinsyrer med en definert sekvens ved at man fjerner de beskyttende grupper som har vært anvendt for å dekke forskjellige reaktive posisjoner. Detaljer i den foreliggende fremgangsmåte vil folgelig bli forklart med henvisning til eksperimentelle eksempler for fremstilling av oligodesoksyribonukleotider. Det.er imidlertid innlysende at reaksjonen kan brukes for å fremstille origoribonukleotider hvis det tas forholdsregler slik at man beskytter den 2 1-hydroksylgruppe som finnes i oligoribonukleotider.

På fig. 1 er det vist med formel I og formel II, mononukleotider og ligonukleotider som kan brukes i den foreliggende fremgangsmåte som den forbindelse som har en maskert 3f<->fosfat diestergruppe. I disse formler er gruppen B valgt fra gruppen bestående av tymin eller beskyttet adenin, cytosin eller guanin. Tymin, adenin, cytosin og guanin er som kjent,

de fire basegruppene som karakteriserer nukleotidfragmentene i en desoksyribonukleinsyre (DNA). Vanligvis er adenin og cytosin benzoylert for å beskytte de frie aminogruppene mens

aminogruppen i guanin vanligvis er beskyttet med en isobutyryl-gruppe. Thymin som ikke har noen fri aminogruppe, trenger ingen slik beskyttelse.

Gruppen X i formelen I og II er en beskyttende gruppe for 5'-hydroksylgruppen, og er vanligvis en organisk gruppe. Fortrinnsvis bor gruppen være en som lar seg fjerne i et svakt surt medium. Slike grupper inbefatter tetrahydropyrenyl, 1-metoksycykloheksyl, 4-monometoksytrityl\ og 4>4'-dimetbksy-trityl. Nevnte 4j4,_dimetoksytritylgruppe er mest foretrukket av disse og kan lett fjernes i et svakt surt medium, f.eks.

i 2% benzen sulfonsyre.

R"<*>"er en maskerende gruppe for 3'-fosfatgruppen. Fortrinnsvis bor dette være en gruppe som lar seg fjerne ved å bruke et basisk medium. Blandt egnede grupper kan nevnes fenyl, ortoklorofenyl, 2,4-diklorfenyl og tiofenyl. En spesielt foretrukket gruppe er p-klorfenyl. I formel II, er n 0 eller et tall. Således angir formel II både dimerer og hoyere oligonukleotider.

Formlene III og IV på fig 1 representerer nukleosider og nukleotider, heri inngår oligonukleotider, som kan brukes som den reaktive forbindelsen som har en tilgjengelig 5'-hydroksylgruppe. I formel III og IV er B som definert tidligere, og R 2 er enten en gruppe for å o beskytte d'en angitte 3'-hydroksylgruppen og som lar seg spalte i et basisk medium eller en gruppe med formelen

hvor R 1 er som definert ovenfor og R^ ? er en gruppe som lar seg avspalte, vanligvis i et basisk medium. Fortrinnsvis er R^ en, gruppe som lar seg selektivt fjerne uten at man fjerner

1 2

gruppen R og R . Se i denne forbindelse Itakura et al, "Improved Triester Approach For The Synthesis of Pentadecathymidylic Acid", J.Am. Chem. Soc, 97, 7327 (1975). En spesielt lett gruppe for fjerning på denne måten er en |3-cyanoetylgruppe, og denne gruppen er av denne årsak mest foretrukket. Man kan imidlertid også bruke en l-metyl-3-ketobutyl-

gruppe eller en 2,2,2-tribrometylgruppe (lar seg fjerne ved å bruke Zn). Gruppen R er fortrinnsvis en benzoylgruppe, men andre egnede grupper inbefatter acetyl, para-metoksy-benzoyl,

og monokloracetyl. I formel IV er n 0 eller et tall, og folgelig vil man både inbefatte dimerer og hoyere oligonukleotider.

Egnede koblingsmidler som kan brukes i foreliggende oppfinnelse er de som er velkjent fra tidligere synteser. Som nevnt tidligere er det foretrukket å bruke.. 2 ,4 > 6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid. Blandt andre egnede midler kan nevnes para-nitrobenzensulfonyltriazolid, benzensulfonyltriazolid, benzensulfonyl 4-nitroimidazolid, 2,4>6-trimetylbenzensulfonyl-tetrazolid, 2,4,6-triisopropylbenzensulfonylklorid og 2,4)6-trimetylbenzensulfonylklorid.

Som nevnt tidligere anvender foreliggende fremgangsmåte en forste forbindelse som har en maskert 3'-fosfatdiestergruppe i en molar mengde som ivesentlig grad overstiger den molare mengden av den andre forbindelsen med en fri 5f-hydroksylgruppe.' Mengden vil variere ifolge reaktantenes type, men i ethvert tilfelle brukes forste forbindelse i en mengde som er tilstrekkelig til at den andre reaktanten i alt vesentlig blir forbrukt. Koblingsmidlet brukes i en molar mengde som er minst lik mengden av den forste forbindelsen og brukes fortrinnsvis i en mengde som er minst den dobbelte av den man bruker av den forste forbindelsen.

Det relative overskudd av den forste forbindelse

som er nodvendig for å få til et i alt vesentlig fullstendig forbruk av den andre forbindelsen oker etter hvert som kjedelengden på de nukleotider man bruker i koblingsreaksjonen oker. Skjont man teoretisk kan fremstille enhver onsket kjedelengde

ved å bruke denne fremgangsmåte, så er det en praktisk ovre grense for en koblingslengde som altså fremstilles ved å koble kortere fragmenter, ved ca. 21 nukleotideenheter. Denne praktiske ovre grense er også en funksjon av vanskeligheter

med å fjerne de beskyttende grupper fra det maskerte fosfat etterhvert som kjedelengden på oligonukleotidet oker. Vanligvis er det molare forhold mellom den forste forbindelsen og den andre minst 2:1. Selvsagt kan forholdet være storre, men vanligvis ikke over 4;1j selv når man har koblet fragment som inneholder opptil ca. l8 nukleotidenheter.

Den reaksjonstid som er nodvendig for å frembringe

et i alt vesentlig fullstendig forbruk av den andre forbindelsen vil også variere alt avhengig av reaktantenes type, og er spesielt en funksjon av kjedelengden på de nukleotidenheter som kobles. Således kan koblingen for å gi dimeriske nukleotider være fullstendig i lopet av 60 minutter eller mindre. I motset-ning til dette så kan en kobling av to trimerblokker kreve tre eller flere timer for den er fullstendig. Bestemmelsen av egnet reaksjonstid kan lett bestemmes ettersom reaksjonens fremgang let;t kan undersokes ved å bruke tynnskiktkromatografi.

Den storste fordel ved den foreliggende fremgangs-', måte ligger i det at man lett kan separere reaksjonsblandingen slik at man får fremstilt rent eller i alt vesentlig rent koblet produkt. Denne fordel skyldes at de to komponentene i reaksjonsblandingen består av et koblet produkt som er en noytral forbindelse, og uomsatte mengder av den forste forbindelsen som er en ladet forbindelse. Når den ladede forbindelsen er en som er opploselig i vann, så er det mulig å fjerne den fra det koblede produkt ved enkel ekstraksjon ved å bruke vandig ekstrak-sjonsmiddel, f.eks. natriumbikarbonat eller lignende. I det tilfelle at den laveste gruppen ikke er vannopploselig, kan separasjonen oppnås ved å bruke annen teknikk, f.eks. kolonnekromatografi på silisiumdioksydgel.

Eksempel 1

Syntese av di- og trinukleotider.

Figurene 2 og 3 illustrerer, henholdsvis bruken

av fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av di- og tridesoksyribonukleotider. Det koblingsmiddel som ble brukt var triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe). Den beskyttende gruppe for 5<*->hydroksylgruppen var den angitte 4>4,-dimetoksytritylgruppe (DMTr). I de reaksjoner som ble^utfort var R^enten benzoyl (gruppe b) eller gruppen med folgende formel

gruppe a) og det opplosningsmiddel som ble brukt, var pyridin.

I det reaksjonsskjerna som er vist;på fig. 2 brukte man et overskudd av forbindelse 1 (2mmol), og den koblede reaksjonen med forbindelse 2 (1 mmol) var i alt vesentlig fullstendig i lopetj av 60 minutter ved hjelp av koblingsreagensen TPSTe (4 mmol), hvorved man fikk dannet det koblede produkt 3

i en blanding inneholdende uomsatt 1. Reaksjonsblandingen ble så behandlet med 2.% benzensulfonsyreopplosning i 10 minutter ved 0°C for å fjerne 4>4T<->dimetoksytritylgruppene i forbindelsane 1 og 3i hvorved man fikk fremstillet forbindelsene 4 og 5- Ved å fjerne de beskyttende grupper blir forbindelsen 4 opploselig i en vandig natriumbikarbonatopplosning. Således kan 4 og 5 skilles ved at man ganske enkelt ekstraherer 4 ut ^ra kloroform ved å bruke en vandig natriumbikarbonatopplosning. Det angitte 5'-hydroksyldinukleotid 5 i kloroformopplosning kan så utfelles fra eter, hvorved man får et homogent farvelost produkt, noe som kan påvises ved tynnskiktkrornatografi på silisiumdioksydgel. Det tor være onskelig at i de tilfelle hvor det er onskelig å beholde den angitte 4>4f<->dimetoksytritylgruppen på det koblede produkt, så kan reaktanten 1 skilles fra det koblede produkt 3

ved hjelp av kolonne krornatografi, f.eks. hvor man bruker silisiumdioksydgel som en fast fase.

Som vist på fig. 3 b]_e så den fult beskyttede trimerblokken 6 fremstillet fra dinukleotidet 5 (1 mmol),

og forbindelse 1 (2 mmol) i nærvær av(4 mmol) TPSTe. Separasjon fra 1 ble utfort ved hjelp av kort kolonnekromatografi på silisiumdioksydgel. Etter separasjonen kunne man vise at produktet var homogent ved hjelp av tynnskiktkrornatografi på silisiumdioksydgel, og etter fjerning av de beskyttende grupper ved tynnskiktkromatografi på cellulose. Utbyttet av fult beskyttede trimerer 6 basert på utgangsforbindelsene , dvs. forbindelse 2,

er vist i tabell 1. Denne modifikasjon av triestermetoden,

hvor man bruker et overskudd av 3'-fosfodiesterkomponenten 1

forer til en okning av det totale utbyttet såvel som en senkning

av den tid som brukes for opparbeidelsen, med minst en faktor 2 sammenlignet med den konvensjonelle og vanlige triestermetoden.

Evnen til å syntetisere trinukleotidblokker med ' hoyt utbytte ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte er spesielt viktig fordi en riktig plassering av trimerblokkene i DNA vil kode dette molekyl, slik at man får stimulert produksjonen av en spesifik aminosyre som del av en polypeptidkjede. Således vil blokken TTT stimulere produksjonen av fenylalanin.

På lignende måte vil blokken GGA stimulere produksjonen av glycin. Folgelig kan trimerblokker fremstillet ved foreliggende fremgangsmåte kobles i serier, slik at det dannes et oligonukleotid, hvor man etter fjerning av de beskyttende grupper, får dannet et DNA molekyl, som hvis det passende innsettes i plasmid DNA,

vil stinulere dannelsen av en polypeptidkjede med den foronskede sekvens av aminosyrer. Koblingen av trimerblokkene slik at det dannes lengere oligonukleotider med en definert sekvens er beskrevet i eksempel II.

Eksempel II

Syntese av oligodesoksyribonukleotider

En syntese for oligodesoksyribonukleotider ved foreliggende fremgangsmåte er vist på fig. 4- Koblingen av et overskudd av 3 1-f°sfodiestertrimerblok X (n = 1, 1,5 mmol)

med den angitte 5'-hydroksyltrimerblokken Y (m = 1, 0,5 mmOl)

i nærvær av 3 mmol TPSTe i pyridin som et opplosningsmiddel,

kan i alt vesentlig ble fullstendig i lopet av ca. 3 timer.

Forsok'.-på å fjerne de uomsatte utgangsmaterialet

X fra produktet Z, en heksamer, ved forst å riste reaksjonsblandingen i en ioneutbytningsharpiks så som Dowex 1-X8 og DEAE-cellulose i forskejllige vandige organiske opplosningsmidler fulgt av filtrering, var ikke vellykket, ettersom man ikke fikk en fullstendig fjerning av reaktanten X. Imidlertid så

kunne den laveste komponenten X fjernes ved å fore reaksjonsblandingen gjennom en meget kort (3 cm) og bred (7 cm) silisiumdioksydgelkollonne.

Kolonnen ble forst vasket med 100 ml kloroform

for å eluere sideprodukter og koblingsreagens, og så med et mere polart elueringsmiddel CHCl^-MEOH (95:5 V/V, 250 ml) får å eliminere nesten alt av den fult beskyttede heksamer Z. Den ladede komponent X forblir på kolonnen.

Den fraksjon som inneholdt heksameren ble

fordampet slik at man fikk et farvelost fast stoff som ble behandlet med 2% benzensulfonsyreopplosning i CHCl^-MEOH

(7:3 V/V) for å fjerne den 5,-hydroksylbeskyttende gruppe,

hvorved man fikk forbindelsen Y (m = 4)• Denne heksamer kunne utfelles fra eter og brukes i en etterfolgende koblende reaksjon uten ytterligere rensning.

Repetisjon av denne cyklus 4 ganger, dvs. hvor

man brukte X hvor n = 1 med Y hvor m = 1, 4»7 og 10 henholdsvis, ga en fult beskyttet pentadekamer Z (n = 1, m = 12) i utbytter på ca. 40 - 5°% totalt fra den angitte 5f<->hydroksyltrimer blokk Y (m = l) bare i_lopet av 4 dogn. Sluttproduktet, dvs. penta-dekameren ble renset ved hoytrykksvæskekromatografi etter fjerning av alle de beskyttende grupper. Ved denne fremgangsmåten kunne man syntetisere oligonukleotider d (Tp)-^T og d

ApCpApCpCpCpApAp GpApCpCpCpGpT, og d TpTpTpGpTpCpApApTpCpApGpGpApC.

Et bekreftende bevis på strukturen i pentadeka-mersne ble oppnådd ved homokronratografi på tynnskikt DEAE-cellulose og ved gel elektroforesi på et 20% akrylamidstykke etter inkubering av pentdekamerene med (^--^p)-adenosin 5'-trifosfat i nærvær av T4-fosfokinase. Man fikk et merket produkt fra hvert

substrat.

Videre ble de merkede produkter delvis oppbrutt med venom f osf odiesterase, og de oppbrutte produkter ble overfort til todimensjonal homokronratografi som viste det forventede sekvensmonster i de to pentadekamerer.

De oppnådde resultater i dette eksempel viser at koblingsreaks joner mellom en kort oligomerb-lokk (trimeren X,

n = l) og lengere oligomerblokker kan gjores i alt vesentlig fullstendige ved å bruke et overskudd av trimerblokken, og at hoyere oligomerer kan syntetiseres raskt og uten at det er nodvendig å utfore omfattende rensningstrinn på intermediære produkter. Ved et passende valg av trimerblokker som kan brukes i etterfølgende koblingsreaksjon, så kan man raskt fremstille oligonukleotider som inneholder kodoner for spesifike aminosyrer i en foronsket sekvens.

Claims (22)

1. Fremgangsmåte for syntese av polynukleotider med en definert sekvens som består av at man kobler som en forste forbindelse, et nukleotid med en maskert 3, _fosfatdiestergruppe, med som en annen forbindelse, et nukleosid eller nukleotid med en tilgjengelig fri 5 1-hydroksylgruppe, og hvor koblingen utfores i nærvær av et koblingsmiddel, karakterisert ved at man bruker nevnte forste forbindelse i et vesentlig molart overskudd i forhold til nevnte andre forbindelse.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, k..a rakteriseri ved at den andre forbindelsen i alt vesentlig blir fullstendig forbrukt under koblingsreaksjonen.

3- Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at det molare forhold mellom nevnte forste forbindelse og nevnte andre forbindelse er minst ca. 2:1.

4« Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at koblingsreaksjonen utfores i opplosning.

5« Fremgangsmåte ifolge krav 4)karakterisert ved at koblingsmidlet er triisopropylbenzensulfonyltetrazolid.

6. Fremgangsmåte ifolge krav ^ karakterisert ved at koblingsreaksjonen utfores i pyridin som opplosningsmiddel.

7- Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at nevnte forste forbindelse velges fra gruppen bestående av

nevnte andre forbindelser velges fra gruppen bestående av hvor gruppen B kan være den samme eller forskjellig og velges av gruppen bestående av tymin og beskyttet adenin, cytosin og guanin; hvor X er en organisk gruppe som er labil i et surt medium, hvor R"*" er en organisk gruppe som er labil i et basisk medium; hvor R^ er valgt fra gruppen bestående av organiske grupper som er labile i et basisk medium og grupper med strukturen

hvor R 1 er som definert ovenfor og RJ ? er en gruppe som er labil i et basisk medium under betingelser hvor nevnte grupper R"<*>" og nevnte gruppe R 2ikke lar seg fjerne, og hvor n og m uavhengig av hverandre er 0 eller et tall.

8. Fremgangsmåte ifolge krav 7> karakteris er1 ved at X uavhengig velges fra gruppen bestående av tetrahydropyrenyl, 1-metoksycykloheksyl, 4-monometoksytrityl.log' 4,4T <-> dimetoksytrityl.

9« Fremgangsmåte ifolge krav 8, karakt eri-sertvedatXer 4>4 '-dimetoksytrityl.

10. Fremgangsmåte ifolge krav 7»karakterisert ved at R p uavhengig velges fra gruppen bestående av fenyl, o-klorfenyl, 2,4-diklorfenyl, p-nitrofenyl, 2,2,2-tri-kloretyl og p-klorfenyl.

11. Fremgangsmåte ifolge krav 10, karakterisert ved at R"*" er p-klorfenyl.

12. Fremgangsmåte ifolge krav 7»karakterisert ved at R p er en gruppe som er labil i et basisk medium og ved at gruppen er valgt fra gruppen bestående av acetyl, p-metoksybenzosyl, monokloracetyl, 2,2,2-tribrometyl,

og benzoyl.

13* Fremgangsmåte ifolge krav 12, karakterisert ved at R p er benzoyl.

14• Fremgangsmåte ifolge krav 7>karakterisert ved at R 2 er

og R^ er -0-CH2 CH2 CN.

15' Fremgangsmåte ifolge krav 14, k a r; a k t e r i-s e r t ved at R"1" er p-klorfenyl.

l6. Fremgangsmåte ifolge krav 7>karakterisert ved at koblingsmidlet er triisopropylbenzensulfonyltetrazolid, X er 4>4<*-> dimetoksytrityl, R <1> er p-klorfenyl, n er 1 og m er et tall valgt fra gruppen bestående av 1, 4> 7 og 10.

17' Fremgangsmåte ifolge krav 16, karakter i-2 sert vedatR er benzoyl.

l8. Fremgangsmåte ifolge krav 16, karakt eri-2 sert ved at R er

19' Fremgangsmåte for fremstilling av nukleotider, karakterisert ved at man:a) kobler i nærvær av et koblingsmiddel forste og andre forbindelse., med f olgende formler:

hvor X er en organisk gruppe labil i et surt medium, R"<*>" er en gruppe labil i et basisk medium og R 2 er en gruppe labil i et basisk medium' eller gruppen

hvor R 3 er en gruppe som er labil i et basisk medium 1 2 under betingelser hvor R og R ikke lar seg fjerne, og hvor B er valgt fra gruppen bestående av tymin og beskyttet adenin, cytosin og guanin, og hvor forste forbindelse brukes i et vesentlig molart overskudd i forhold til nevnte andre forbindelser, og hvor koblingsreaksjonen kjores i tilstrekkelig langt tidsrom til at man i alt vesentlig forbruker nevnte andre forbindelse, og får fremstilt et koblet produkt med formelen

b) fjerner gruppen X fra det koblede produkt og uomsatt forste forbindelse ved at man kontakter reaksjonsblandingen med et surt medium, hvorved man får fremstilt en blanding bestående av den ladede forbindelsen

og; c) skille dinukleotidet fra trinn b) fra blandingen.

20. Fremgangsmåte ifolge krav 19>karakterisert ved at^ separasjonen utfores ved at man ekstraherer blandingen med vandig bikarbonat slik at man fjerner den ladede forbindelse.

21. Fremgangsmåte ifolge krav 20, k, a r a k t e r i-sert vedå inbefatte ytterligere trinn hvor man kobler nevnte forste forbindelse og nevnte dinukleotid, og hvor nevnte forste•gruppe brukes i et vesentlig molart overskudd i forhold til nevnte andre dinukleotid, og hvor koblingen utfores i nærvær av et koblingsmiddel i tilstrekkelig langt tidsrom til at man i alt vesentlig forbruker nevnte dinukleotid fullstendig, hvorved man får fremstilt en blanding bestående av uomsatt forste forbindelse og et trinukleotid med folgende formel

hvoretter man skiller dette trinukleotid fra nevnte blanding.

22. Fremgangsmåte ifolge krav 21, k a r a k t e:ri-sert ved at den uomsatte forste forbindelsen og trinukleotidet skilles ved hjelp av kolonnekronratografi.

23» Fremgangsmåte ifolge krav 19 > karakterisert ved at koblingsmidlet er triisopropylbenzensulfonyltetrazolid, X er 4>4 '-dimetoksytrityl, R"*" er p-klorfenyl og R 2 er valgt fra gruppen bestående av benzoyl og gruppen