NO771237L

NO771237L - Fremgangsm}te for fremstilling av polypeptider

Info

Publication number: NO771237L
Application number: NO771237A
Authority: NO
Inventors: Anand Swaroop Dutta; James Joseph Gormley; Christopher Frederick Hayward; John Selwyn Morley; Gilbert Joseph Stacey
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1976-04-08
Filing date: 1977-04-06
Publication date: 1977-10-11

Description

" Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider"

Denne oppfinnelse angår fremstilling av polypeptid-derivater som er i besittelse av smertestillende egenskaper.

I en artikkel av Kosterlitz et al i Nature, 1975, 258, 577-579 er det beskrevet identifikasjonen av to beslektede penta-peptider som er kalt "enkefaliner" ekstrahert fra grisehjerne.

Disse to peptider har henholdsvis strukturene

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH og H-Tyr-Gly-Gly-Phé-Leu-OH og er funnet å ha kraftige opiat-lignende egenskaper i isolerte organ-preparater. Selv om disse to peptider fremkaller forbi-gående smertestillende virkninger når de injiseres i den cerebrale ventrikkel hos katter, er de inaktive når de administreres mer konvensjonelle veier, f.eks. intravenøst, på laboratoriedyr ved standard smertestillende forsøk.

Det er nu funnet at når visse aminosyre-modifikasjoner gjøres i enkefalin-molekylet, oppnås forbindelser som har smertestillende virkning når de doseres intravenøst ved en standard prøve for smertestillende virkning.

I henhold til oppfinnelsen fremstilles et polypeptid-derivat med formelen:

hvor

R2"'" betyr hydrogen eller et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer;

R betyr hydrogen eller et radikal valgt fra et alkanoylradikal med 1 til 3 karbonatomer, et alkoksykarbonylradikal med 2 til 6 karbonatomer eller en aminosyrerest som er Arg, Gly,

Glu, Asp, Phe, 3~Ala, eller Lys eller D-Lys som begge eventuelt er substituert på e-aminogruppen med et alkoksykarbonylradikal med 2 til. 6 karbonatomer, eller R 2betyr 2 til 6 a-aminosyrerester som er bundet sammen via normale peptidbindinger, idet disse aminosyrerester uavhengig av hverandre er valgt fra Gly, Lys, Pro, Phe, Gin, Glu, Leu, Arg og Asp, idet Lys og Arg restene eventuelt alternativt er bundet sammen via henholdsvis sine e-amino- og -guanidino-radikaler, og Asp og Glu restene er eventuelt alternativt

bundet sammen via henholdsvis sine 3~og ykarboksyradikaler; B er D-Ser eller D-Thr, som begge eventuelt er substituert på

3~0H med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer, eller B

er D-Ala, D-Leu,.D-Asp, D-Lys, D-Try, D-Met, 3~Ala eller Azala; E er Gly eller Azgly som begge eventuelt er substituert på

ot-amino-radikalet, eller 3~Ala som eventuelt er substituert på 3-aminoradikalet, med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer;

F er Phe, heksahydroPhe, Azphe eller heksahydroAzphe, som alle eventuelt kan være substituert på a-aminoradikalet med et

alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer;

G er Leu, D-Leu, Met, D-Met, Nie, D-Nle, Ile eller D-Ile,

som alle eventuelt kan være substituert på a-aminoradikalet med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer, eller G er

Pro, Azleu eller Azpro;

K betyr et hydroksy- eller aminoradikal, et radikal med formelen OR 3 , hvor R 3 er et alkyl-y alkenyl- eller hydroksy-alkylradikal med opptil 6 karbonatomer, et aminoalkylradikal med opptil 6 karbonatomer eller et alkylaminoalkylradikal med opptil 10 karbonatomer, hvor nitrogenatomet i begge eventuelt er substituert med et benzyloksykarbonylradikal,

3-

eller R betyr et fenylradikal eller et radikal med formelen:

hvor R 4 er et alkanoylradikal med 1 til 20 karbonatomer, 5 5 eller K betyr et radikal med formelen NHR hvor R er et alkyl- eller cykloalkylradikal med 1 til 6 karbonatomer, et radikal med formelen NR 6 R 7 , hvor R 6 og R 7 er alkylradikaler med 1 til 6 karbonatomer, eller R og R 7 er bundet sammen for å danne en 5- eller 6-leddet ring som eventuelt inneholder 4 et heteroatom, et radikal med formelen -NH-CH£~CH&0OR4, hvor R har den ovenfor angitte betydning, et hydroksyalkyl-aminoradikal med opptil 6 karbonatomer, eller et (alkylamino)alkylamino- eller (d8alkylamino)alkylamino-radikal med opptil 10 karbonatomer, eller K betyr et radikal med formelen Gly-OR<8>, D-Thr-OR<8>, Thr-OR<8>, D-Ala-OR<8>eller 8 8 Ala-OR , hvor R er et hydrogenatom, et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer eller et radikal med den ovenfor

angitte formel II, III eller IV, hvor R 4 har de ovenfor angitte betydninger, eller K er et alkylradikal med 1 til 6

karbonatomer; eller

G og K sammen betyr D- eller L-formene for et radikal med formelen:

hvor n er et helt tall fra 1 til 4, eller et radikal med

formelen:

og hvor polypeptidet med formel I inneholder en basisk funksjon, de farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter derav, og hvor polypeptidet med formel I inneholder en syrefunksjon, de farmasøytisk godtagbare baseaddisjonssalter derav.

I den ovenstående formel I og i hele denne beskrivelse og krav er aminosyrerestene betegnet med sine standard-forkortelser (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331). En a-aza-aminosyrerest er en hvor a-CH i en aminosyre er erstattet med nitrogen. Forkortelsen for en a-aza-aminosyre er avledet fra forkortelsen for den tilsvarende aminosyre ved å innføre "Az" som forstavelse. Således betyr Azala aza-alanin,

Azgly betyr aza-glycin, Azphe betyr aza-fenylalanin, Azleu

betyr aza-leucin, og Azpro betyr aza-prolin. Forkortelsene heksahydroPhe og Phe(6H) betyr en fenylalaninrest hvor benzen-ringen er erstattet med en cykloheksanring. Forkortelsen heksahydroAzphe og Azphe(6H) betyr den tilsvarende a-aza-aminosyre. Når konfigurasjonen av en spesiell aminosyre ikke er angitt, har aminosyren,(bortsett fra glycin og a-aza-aminosyrene som ikke inneholder noe asymmetrisk senter i nabostilling til karboksylgruppen) den naturlige L-konfigurasjon.

En særlig betydning for R"<*>" er hydrogen eller et metyl-radikal. ;En særlig betydning for R 2 er hydrogen eller et acetyl-radikal eller en Arg-, Gly-, Glu-, Asp-, Phe-, 3~Ala-, D-Lys-, Lys- (som eventuelt er substituert på e-aminogruppen med et t-butoksykarbonylradikal) , H-Glu-Gly-OH H-Lys-, H-Phe-I H-Lys-, H-Gly-Gly-Gly—I H-Lys-, H-Asp-1 H-Lys-, H-Lys-l H-Lys-, H-Gly-Gly-, H-Ley-Ley-Leu-, H-Arg-Pro-Lys-, H-Pro-Gln-Gln-, H-Gly-Gly-Gly-, H-Lys-Gly-Gly-Gly-, H-Asp-Gly-Gly-Gly-, H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-eller H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-rest. ;En særlig betydning for B er D-Ser som eventuelt er substituert på sitt 3-OH med et t-butylradikal, D-Ala, D-Thr, D-Leu, D-Asp, D-Lys, D-Try, D-Met, 3~Ala eller Azala. ;En særlig betydning for E er Gly, 3_Ala eller Azgly.;En særlig betydning for F er Phe, heksahydroPhe eller Azphe. ;En særlig betydning for G er Leu, D-Leu, Met, NLe,;Pro, Azleu eller Azpro.;En særlig betydning for K er et hydroksy-, amino-, metoksy-, t-butoksy-, isopentyloksy-, allyloksy-, 2-hydroksy-etoksy-, 2-aminoetoksy-, 2-(metylamino)etoksy-, 2-(N-fenoksy-karbonylamino)etaoksy-, 2-(N-metyl-N-fenoksykarbonylamino)-etoksy-, fenoksy-, 1,3-diacetoksy-prop-2-yloksy-, 2,3-diacetoksy-proposky-, 1,3-diheksanoyloksyprop-2-yloksy-, 2,3-dipalmitoyloksy-propoksy-, 2-acetoksyetoksy-, 2-palmitoyloksyetoksy-, etylamino-, cykloheksylamino-, dietylamino-, pyrrolidino-, morfolino-, 2-hydroksyetylamino-, 2-(metylamino).etylamino-, 2-(dimetylamino)-etylamino- eller metyl-radikal, eller en Gly-OCH^, Thr-OH, D-Thr-OH, Ala-OCH3eller D-Ala-OCH3rest. ;En særlig betydning for G og K sammen er D- og L-formene for et radikal med formelen: eller et radikal med formelen: ; De følgende 7 grupper av forbindelser faller inn under de ovenstående definisjoner av de nye forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen: ;Gruppe 1. De hvor B er D-Ala.;Gruppe 2. De hvor B er D-Ser.;Gruppe 3. De hvor B er D-Ser substituert på (3-OH med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer. ;Gruppe 4. De hvor B er Azala.;Gruppe 5. De hvor B er D-Thr som eventuelt er substituert på ;3-OH med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer.;Gruppe 6. De hvor B er D-Leu eller 3-Ala.;Gruppe 7. De hvor B er D-Asp, D-Lys, D-Try eller D-Met.;Under hver av de ovenstående 7 grupper av forbindelser faller de følgende 4 undergrupper: ;Undergruppe 1. De hvor R er hydrogen og R betyr 2 til 6,;og særlig 3, a-aminosyrerester som er bundet sammen via normale peptidbindinger, idet disse aminosyrerester uavhengig av hverandre er valgt fra Gly, Lys, Pro, Phe, Gin, Glu, Leu, Arg og Asp, idet Lys og Arg restene eventuelt alternativt er bundet sammen via henholdsvis sine e-amino- og -guanidino-radikaler, og Asp og Gin restene er eventuelt alternativt bundet sammen via henholdsvis sine og ykarboksyradikaler. ;2 I " 3 ;En særlig betydning for R er en H-Glu-Gly-OH H-Lys, ; H-Gly-Gly, H-Leu-Leu-Leu, H-Arg-Pro-Lys, H-Pro-Gln-Gln, H-Gly-Gly-Gly, H-Lys-Gly-Gly-Gly, H-Asp-Gly-Gly-Gly, H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln eller H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly rest, og en foretrukket betydning for R 2er en H-Leu-Leu-Leu eller H-Gly-Gly-Gly rest. ;1 2 ;Undergruppe 2 . De hvor R er hydrogen og R betyr en Arg,;Gly, Glu, Asp, Phe, p-Ala eller en Lys eller D-Lys som begge eventuelt er substituert på e-aminogruppen med en H-dlu-Gly-OH, H-Phe-, H-Gly-Gly-Gly-, H-Asp- eller H-Lys- rest. ;1 2 ;Undergruppe 3. De hvor R og R begge er hydrogen.;Undergruppe 4. De hvor R"<*>" betyr et alkylradikal med 1 til 6

2

karbonatomer og R er hydrogen.

Under hver av de ovenfor beskrevne 7 grupper og

4 undergrupper faller de følgende 9 klasser forbindelser:

Klasse 1. De hvor G er Pro.

Klasse 2. De hvor G er Azpro.

Under klassene 1 og 2 er en foretrukket verdi for K

3 3

et aminoradikal, et radikal med formelen OR hvor R er et alkyl-, alkenyl-, hydroksyalky 1- eller aminoalkylradikal med opptil 6 karbonatomer eller et alkylaminoalkylradikal med opptil 10 karbonatomer, et fenylradikal, et radikal med formelen

5 5

NHR hvor R er et alkylradikal med. 1 til 6 karbonatomer eller

6 7 6 7

et radikal med formelen NR R hvor R og R er alkylradikaler med 1 til 6 karbonatomer eller R 6 . og R 7er bundet sammen for å danne en ring som eventuelt inneholder et heteroatom.

Klasse 3. De hvor G og K sammen betyr D- eller L-formene for et radikal med de ovenfor angitte formler V eller VI hvor n har den ovenfor angitte betydning, eller G og K betyr sammen et radikal med den ovenfor angitte formel VII.

Klasse 4. De hvor G er Met, Leu eller NLe og K er et (alkylamino)alkylamino- eller (dialkylamino)alkylamino-radikal med opptil 10 karbonatomer.

Klasse 5. De hvor G er Met, Leu eller NLe og K er et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer.

Klasse 6. De hvor G er Met, Leu eller NLe og K er et hydroksy-eller aminoradikal eller et radikal med formelen OR 3 hvor R 3 er et alkyl-, alkenyl-, hydroksyalkyl- eller aminoalkylradikal med opptil 6 karbonatomer, et alkylaminoalkyIradikal med opptil 10 karbonatomer eller et fenyIradikal.

Klasse 7. De hvor G er Met, Leu eller NLe og K er et radikal med formelen NHR^ hvor R^ er et alkylradikal med 1 til 6 karbon-6 7 6 V

atomer eller et radikal med formelen NR R hvor R og R er

6 7 alkylradikaler med 1 til 6 karbonatomer eller R og R er bundet sammen- for å danne en 5- eller 6-leddet ring som eventuelt inneholder et ytterligere heteroatom.

Klasse 8. De hvor G er Met, Leu eller Ile og K er Gly-OR g,

g o n R 8

D-Thr-OR , Thr-OR , D-Ala-OR eller Ala-OR hvor R er hydrogen eller et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer.

Klasse 9. De hvor G er Met, Leu eller Ile og K er et radikal med den ovenfor angitte formel II, III eller IV hvor R 4har den ovenfor angitte betydning..

Særlige forbindelser ifølge oppfinnelsen er angitt i eksemplene 1-9 3, og av disse er foretrukne forbindelser som følger:

Et særlig farmasøytisk godtagbart syreaddisjonssalt av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er f.eks. et hydroklorid, jfosfat, citrat, acetat eller trifluoracetat.

Et særlig farmasøytisk godtagbart baseaddisjonssalt av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er f.eks. et ammonium- eller meglumin-salt.

Polypeptid-derivatene med formel I fremstilles ved i og for seg kjente metoder for fremstilling av kjemisk analoge forbindelser. De følgende fremgangsmåter, hvor R 1 , R 2, B, E,

3 4 5 6 V

F, G, K, R, R, R, R, R og n har de ovenfor angitte betydninger, anvendes for fremstilling av forbindelsene: (a) Fjernelse av én eller flere vanlige peptid-beskyttende grupper fra et beskyttet polypeptid for å danne en forbindelse med formel I. (b) For fremstilling av de forbindelser hvor K er forskjellig fra et hydroksyradikal, eller når K betyr et radikal

g 8 R 8

med formelen Gly-OR , D-Thr-OR , Thr-OR , D-Ala-OR eller Ala-OR 8 , hvor R 8 er forskjellig fra et hydrogenatom, og for de forbindelser hvor G og K sammen betyr radikaler med formel V, VI og VII, omsetning av en karboksylsyre med formelen:

eller

eller et. aktivert derivat derav, med en egnet alkohol eller et amin.

Ved fremgangsmåte (a) kan det være så mange beskyttende grupper -i utgangsmaterialet som det er radikaler som kan kreve beskyttelse, f.eks. de radikaler som eksisterer i produktet som frie OH-radikaler eller basiske NH-radikaler.

Ved fremgangsmåte (a) kan den beskyttende gruppe eller de beskyttende grupper være de som er beskrevet i en standard lærebok vedrørende'peptidkjemi, f.eks.: M. Bodansky og M.A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966, kapittel IV; F. M. Finn og K. Kaufmann, "The Proteins", bind II, utgitt av H. Neurath og R. L. Hill, Academic Press Inc.,

New York, 19 7.6, s. 106; "Amino-acids, Peptides and Proteins"

(Specialist Periodical Reports), The Chemical Society, London, bind 1 til 8.. Forskjellige metoder for fjernelse av de beskyttende grupper er også beskrevet i disse bøker.

Ved fremgangsmåte (a) er særlig egnet NH-beskyttende gruppe et benzyloksykarbonylradikal, og en særlig egnet 0H-beskyttende gruppe er et.benzylradikal. Begge disse beskyttende grupper kan lett fjernes ved hydrogenolyse, f.eks. ved hydrogenolyse i nærvær av en palladium-på-karbon katalysator, f.eks. 5% vekt/vekt palladium-på-karbon, i et fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel så som vann, metanol, etanol, butanol, dimetylformamid, eddiksyre, kloroform eller en blanding av hvilke som helst av disse. Omsetningen kan eventuelt utføres i nærvær av en syre så som hydrogenklorid eller toluen-p-sulfonsyre, og utføres mest hensiktsemssig ved atmosfærisk trykk.

Ved fremgangsmåte (a) er en annen særlig egnet NH-beskyttende gruppe et t-butoksykarbonylradikal og en ytterligere særlig egnet OH-beskyttende gruppe er et t-butyl-radikal. Begge disse beskyttende grupper kan lett fjernes ved behandling med en syre så som hydrogenklorid eller trifluoreddiksyre. Hydrogenkloridet kan anvendes i form av en vandig oppløsning, f.eks. ved konsentrasjon mellom IN og en mettet oppløsning, eller hydrogenkloridet kan alternativt anvendes som en oppløsning i et fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel så som etylacetat, metanol, eddiksyre, eter, dioksan eller en blanding av hvilke som helst av disse. Den anvendte konsentrasjon kan være en hvilken som helst konsentrasjon opptil metningspunktet for fortynningsmidlet eller oppløsningsmidlet, og er fortrinnsvis i området 2 til 6N. Omsetningen utføres fortrinnsvis ved en temperatur mellom 0°C og omgivelsestemperatur, og kan finne sted i nærvær av et spylemiddel så som 2-merkaptoetanol. Trifluor-eddiksyren kan anvendes direkte uten fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel eller den kan fortynnes med 5-10% vann. Omsetningen utføres fortrinnsvis ved omgivelsestemperatur, eventuelt i nærvær av et spylemiddel så som 2-merkaptoetanol.

Ved fremgangsmåte (a) er en ytterligere særlig egnet NH-beskyttende gruppe et benzyloksykarbonyl- eller t-butoksy-karbonyIradikal, og en særlig egnet OH-beskyttende gruppe er et t-butylradikal. Disse beskyttende grupper kan lett fjernes ved behandling med HBr i eddiksyre. En foretrukket konsentrasjon er 1 til 3N, og en særlig foretrukket konsentrasjon er 2N.

Ved fremgangsmåte (a) er en særlig egnet beskyttende gruppe for en karboksygruppe en ester, f.eks. en metyl- eller etylester. Estergruppen fjernes hensiktsmessig ved base-hydrogenolyse, f. eks', med natrium- eller kaliumhydroksyd i et fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel så som vandig metanol, vandig cellosolve, vandig dioksan eller vandig dimetylformamid. Omsetningen utføres hensiktsmessig ved omgivelsestemperatur.

Ved fremgangsmåte (b) er et egnet aktivert derivat av utgangsmaterialet f.eks. en ester eller et anhydrid. Ved anvendelse av et aktivert derivat kan omsetningen utføres ved å bringe det aktiverte derivat i kontakt med en passende alkohol eller det passende amin i nærvær av et fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel. I de tilfeller hvor utgangsmaterialet er den frie syre med formel X eller XI, frembringes omsetningen med den passende alkohol eller det passende amin hensiktsmessig ved hjelp av et standard peptid-koblingsreagens så som N,N'-dicykloheksylkarbodiimid. Fremgangsmåten er særlig egnet for .fremstilling av forbindelser med formel I hvor K er et aminoradikal eller et radikal med formel NHR5 eller NR<5>R<6.>I dette tilfelle blandes en ester, f.eks. en metylester, av forbindelsen med formel X med et overskudd av ammoniakk eller det passende substituerte amin i et oppløsningsmiddel så som metanol eller dimetylformamid ved en temperatur mellom 0°C og omgivelsestemperatur i opptil 3 dager.

Utgangsmaterialene som anvendes ved fremgangsmåten

i henhold til oppfinnelsen, kan fremstilles fra kjente forbindelser ved standard peptid-koblingsreaksjoner, standard peptid-beskyttelsesreaksjoner og standard peptid-beskyttelses-fjerningsreaksjoner som er velkjent for fagfolk, f.eks. som angitt i eksempel 94. Det skal særlig henvises til fremstilling av mellomprodukt nr. 175 hvor metylketonet ble fremstilt fra

den tilsvarende syre ved en Dakin-West-reaksjon med eddiksyreanhydrid i pyridin.

Som angitt ovenfor har de nye forbindelser fremstilt

i henhold til oppfinnelsen smertestillende virkning i varmblodige dyr. Dette kan påvises ved en standard prøve for påvisning av smertestillende virkning, så som varmeplateprøven på mus

(Eddy og Leimbach, J. Pharmac. Exp. Therap., 1953, 107, 385-393). Dette forsøk .utføres som følger: Grupper på tre hunnmus med en vekt på 22-25 g anvendes for å undersøke hver forbindelse. Hver mus anbringes på en oppvarmet termostatregulert kobberoverflate med en temperatur på 56°C, og den tid det tar før musen reagerer på varme-påvirkningen (f.eks. ved å slikke sine bakpoter) nedtegnes. Normale reaksjonstider er i området 3 til 5 sekunder.

Hver av de tre mus gis derefter en intravenøs dose på 100 mg/kg av en oppløsning av prøveforbindelsen. Ved tidspunktene 5, 10 og 30 minutter efter administreringen anbringes hver mus igjen på varmeplaten, og reaksjonstiden bestemmes. Hvis musen ikke reagerer efter 20 sekunder, fjernes musen fra varmeplaten. I dette tilfelle ansees forbindelsen å ha maksimum aktivitet

ved denne dose.

En forbindelse som frembringer en gjennomsnittlig økning i reaksjonstid på minst 3 sekunder, ansees som aktiv.

En aktiv forbindelse undersøkes derefter påny ved lavere doser.

Alle forbindelsene som er beskrevet i eksemplene,

er aktive ved denne prøve ved en dose som er lik eller mindre

enn 100 mg/kg av den frie syre eller base. Den intravenøse LD^o. hos mus for forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen er også betraktelig høyere enn den laveste dose som frembringer maksimum smertestillende virkning, som vist i den følgende tabell:

De nye polypeptid-derivater fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan sammen med et ugiftig farmasøytisk godtagbart fortynningsmiddel eller bæremiddel tilberedes i form av et farmasøytisk preparat.

Det farmasøytiske preparat kan f.eks. være i en form som er egnet for parenteral administrering, for hvilket formål den kan tilberedes ved^hjelp av kjente metoder i form av sterile, injiserbare, vandige eller oljeaktige oppløsninger eller suspensjoner."

Det farmasøytiske preparat kan i tillegg til polypeptid-derivatet også inneholde ett eller flere kjente midler som er valgt fra andre smertestillende midler, f.eks. aspirin, paracetamol, fenacetin, kodein, petidin og morfin, anti-inflammatoriske midler, f.eks. naproxen, indometacin og ibuprofen, neuroleptiske midler så som klorpromazin, proklorperazin, tri-fluoperazin og haloperidol og andre bedøvende midler og beroligende midler så som klordiazepoksyd, fenobårbiton og amylobarbiton.

Et.foretrukket farmasøytisk preparat er et som er egnet for intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon, f.eks. eii steril, vandig oppløsning inneholdende mellom 1 og 50 mg/ml av aktiv bestanddel.

Det farmasøytiske preparat vil normalt administreres på mennesker for behandling eller forhindring av smerte i en slik dose at hver pasient mottar en intramuskulær eller subkutan dose på mellom 2 og 150 mg aktiv bestanddel eller en intravenøs dose på mellom 1 og 100 mg aktiv bestanddel.

Preparatet kan administreres i henhold til en plan som bestemmes av den biologiske halveringstid for polypeptid-derivåtet, f.eks. med mellomrom på fra 0,5 til 4 ganger den biologiske halveringstid, f.eks. 2 til 6 ganger daglig.. Preparatet er særlig egnet til å lindre den smerte som oppstår under og umiddelbart efter en kirurgisk operasjon og vil i denne situasjon normalt administreres under selve operasjonen og i den første post-operative periode.

Det injiserbare preparat kan administreres i en samlet dose, enten direkte på injeksjonsstedet eller i et på forhånd anbragt arrangement for intravenøs infusjon, eller det kan

administreres mer langsomt i fortynnet oppløsning som en komponent av den intravenøse infusjonsvæske.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av de følgende eksempler 1 til 94.

I de følgende eksempler henviser R,, til stigende tynnskiktkromatografi på silikagelplater ("Kieselgel G"). Oppløsningsmiddelsystemene som ble anvendt ved denne kromatografi, var butan-1-ol/eddiksyre/vann (4:1:5 volum/volum) (R^A), butan,,l,ol/eddiksyre/vann/pyridin (15:3:12:10 volum/volum (R^B), butan-2-ol/3% vekt/volum vandig ammoniumhydroksyd (3:1 volum/volum)

(R^C), acetonitril/vann (3:1 volum/volum) (R^D),

aceton/kloroform (1:1 volum/volum) (R^E), kloroform/etanol (1:4 volum/volum) (R^F) , cykloheksan/etylacetat (1:1 volum/volum)

(R^G), cykloheksan/etylacetat/metanol (1:1:1 volum/volum) (R^H), kloroform/metanol/vann (11:8:2 volum/volum) (R^K) , kloroform/metanol (19:1 volum/volum) (R^P) og kloroform/metanol (9:1 volum/volum (R^Q). (Noen av disse oppløsningsmidler ble også anvendt for kolonnekromatografi på kiselsyre og er i fotnotene betegnet som oppløsningsmidler G, K, Q og P). I alle tilfeller ble platene undersøkt under ultrafiolett lys og behandlet med fluorescamin, ninhydrin og klor-stivelse-jod-reagenser. Hvis ikke annet er angitt, betyr angivelse av en R^ at en enkel flekk ble funnet ved disse metoder.

Syrehydrolysater for alle produkter beskrevet i eksemplene 1 til 93 ble fremstilt ved oppvarmning av peptidet eller det beskyttede peptid med 6N saltsyre inneholdende 1% vekt/volum fenol i et lukket, evakuert rør i 16 timer ved 110°C. Aminosyre-sammensetningen av hvert hydrolysat ble bestemt med en såkalt LoCarte Amino-Acid Analyser og var i hvert tilfelle i.overensstemmelse med den ventede sammensetning.

I eksemplene er de følgende symboler anvendt:

Z - benzyloksykarbonyl

Bzl - benzyl

OCp - 2 , 4,5-triklorfenoksy

Boe - t-butoksykarbonyl

ONp - p-nitrofenoksy

ONSu- succinimido-oksy

TosOH-toluen-p-sulfonsyre

DMF - dimetylformamid

TFA - trifluoreddiksyre

Eksempler 1- 42

Det beskyttede polypeptid ble underkastet reduktiv spaltning under anvendelse av en av fremgangsmåtene Hl til Hil som er beskrevet nedenfor. Polypeptid-derivatene angitt i tabell I ble således oppnådd.

Hl. Utgangsmaterialet (angitt med nummer i tabell I) ble oppløst i etanol inneholdende opptil 25% vann, og, under en atmosfære avjiitrogén, ble 5% vekt/vekt palladium-på-karbon-katalysator (150 mg/g) tilsatt, og en mild strøm av hydrogen ble boblet gjennom den omrørte reaksjonsblanding ved 20-25°C. En tid på 5 til 6 timer var tilstrekkelig til å sikre at reaksjonen var fullstendig. Hydrogenatmosfæren ble erstattet med nitrogen før fjernelse av katalysatoren ved filtrering gjennom et lag av diatoméjord. Produktet ble isolert ved inndampning av filtratet i.vakuum.

H2. Som i Hl, men under anvendelse av vandig metanol istedenfor vandig etanol.

' H3. Som i Hl, men under anvendelse av metanol som reaksjonsmedium.

H4. Som i Hl, men under anvendelse av vandig etanol med tilsetning av en ekvivalent hydrogenklorid.

H5. Som i Hl, men under anvendelse av vandig metanol med tilsetning av en ekvivalent hydrogenklorid.

H6. Som i Hl, men under anvendelse av dimetylformamid med tilsetning av en ekvivalent toluen-p-sulfonsyre.

H7. Som i Hl, men under anvendelse av metanol med tilsetning av en ekvivalent hydrogenklorid.

H8. Som i Hl, men under anvendelse av en dimetylformamid/ butanol-blanding som reaksjonsmedium.

H9. Som i Hl, men under anvendelse av vandig 90 eller 95% volum/volum eddiksyre som reaksjonsmedium.

HlO. Som i H9, men med tilsetning av 1 til 2 ekvivalenter hydrogenklorid.

Hil. Som i Hl, men under anvendelse av vandig dimetylformamid som reaksjonsmedium.

H12. Som i Hl, men under anvendelse av en blanding av vandig etanol og kloroform som reaksjonsmedium.

H13. Som i Hl, men under anvendelse av metanol/dimetylformamid som reaksjonsmedium.

Eksempler 43- 69

Det beskyttede polypeptid ble underkastet spaltning med hydrogenklorid under anvendelse av en av fremgangsmåtene El til ElO som er beskrevet nedenfor. Polypeptid-derivatene som er angitt i tabell II, ble således oppnådd.

El. Utgangsmaterialet (angitt.med nummer i tabell II) ble oppløst i etylacetat, og en oppløsning av hydrogenklorid i etylacetat i en mengde tilstrekkelig til å gi en total styrke på 2N til 6N syre, ble tilsatt. Reaksjonen fikk finne sted ved 20-25°C i en periode på 1 til 2 timer, idet for lang reaksjonstid ble unngått for å minimalisere uønskede bireaksjoner. Hydro-klbridet av produktet falt ofte ut av oppløsningen og ble oppsamlet ved filtrering. ' Ellers ble isoleringen foretatt ved inndampning i vakuum.

E2. Som i El, men under anvendelse av metanol som reaksjons- . medium istedenfor etylacetat.

E3. Som i El, men under anvendelse av hydrogenklorid i métanol/etylacetat.

E4. Som i El, men under anvendelse av eddiksyre for å opp-løse utgangsmaterialet og derefter tilsetning av hydrogenklorid i etylacetat-oppløsning.

E5. Som i E2, men under nitrogen og i nærvær av et spylemiddel, f.eks. 2-merkaptoetanol.

E6. Som i El, men under anvendelse av dietyleter som reaksjonsmedium istedenfor etylacetat.

E7. Som i El, men under anvendelse av dioksan som reaksjonsmedium istedenfor etylacetat.

E8. Som i El, men under anvendelse av eddiksyre som reaksjonsmedium istedenfor etylacetat.

E9. Som i El, men under nitrogen og i nærvær av et spylemiddel (2-merkaptoetanol).

ElO. Det beskyttede materiale ble omrørt med konsentrert saltsyre (ca. 10 ml/g) ved 0°C i 10 minutter. Overskudd av syre ble derefter avdestillert i vakuum ved så lav temperatur som mulig, og produktet ble erholdt ved frysetørring.

Eksempler 70- 88

Det beskyttede polypeptid ble underkastet spaltning med trifluoreddiksyre under anvendelse av en av de nedenfor beskrevne fremgangsmåter. Polypeptid-derivatene angitt i tabell III ble således fremstilt.

Fl Utgangsmaterialet (angitt med nummer i tabell III) ble oppløst i trifluoreddiksyre (10 ml/g), og reaksjonen fikk finne sted ved 20-25°C i en periode på 1-2 timer. Produktet ble isolert som trifluoracetatet ved inndampning av oppløsningen i vakuum. Eventuelt ble frysetørring i nærvær av et lite overskudd av saltsyre anvendt for å danne hydrokloridet.

F2. Som i Fl, men under anvendelse av vandig 90 eller 95% volum/volum trifluoreddiksyre.

F3. Som i Fl, men under anvendelse av vandig 90 eller 95% volum/volum trifluoreddiksyre under nitrogen i nærvær av et spylemiddel, f.eks. 2-merkaptoetanol.

Eksempel 89

Vandig N natriumhydroksyd (1,0 ml, 3 ekvivalenter)

ble satt til en oppløsning av H-Tyr-D-Ser-Gly-Phe(6H)-Leu-OMe (utgangsmateriale 110) (235 mg, 330 ymol) i metanol (5 ml), og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 3 timer. Opp-løsningen ble inndampet i vakuum, fortynnet med vann og surgjort med fortynnet saltsyre. Efter klaring ved filtrering ble opp-løsningen frysetørret, og produktet ble avsaltet ved å bli ført ned gjennom en "Sephadex" G15 kolonne i vandig 5% volum/volum eddiksyre og en sluttelig frysetørring for å gi H-Tyr-D-Ser-Gly-Phe (6H)-Leu-OH, RfC 0,38.

Eksempel 90

Ved behandling av. H-MeTyr-D-Ser-Gly-Phe(6H)-Leu-OMe (utgangsmateriale 102) i vandig oppløsning med natriumhydroksyd (2 ekvivalenter) og bearbeidelse som i eksempel 89, fikk man H-MeTyr-D-Ser-Gly-Phe(6H)-Leu-OH, RfCO,44.

E ksempel 91 Ac-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OMe (utgangsmateriale 123)

(140 mg, 224 ymol) ble oppløst i varm dioksan (10 ml) og fikk avkjøles til omgivelsestemperatur før tilsetning av vann (2 ml)

og vandig N natriumhydroksyd (0,75 ml, 3,5 ekvivalenter). Blandingen ble kraftig omrørt ved omgivelsestemperatur i 2,5 timer,

og mesteparten av dioksanet ble avdestillert i vakuum. Den gjen-værende oppløsning ble surgjort ved tilsetning av N saltsyre; og den resulterende suspensjon ble konsentrert i vakuum. En klar oppløsning ble oppnådd ved tilsetning av vandig ammoniakk, sammen med vandig 0,05M ammoniumacetat. Overskudd av ammoniakk ble fjernet ved avdampning, og rensning ble foretatt på en kolonne av "Sephadex" G25 i vandig 0,05M ammoniumacetat. Fryse-tørring av materiale fra de passende fraksjoner ga Ac-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH, RfD 0,56, RfD 0,47.

Eksempel 9 2

En oppløsning av H-MeTyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OMe.HC1 (eksempel 1) (100 mg, 157 ymol) i metanol (15 ml) ble avkjølt til 4°C og mettet med tørr ammoniakk. Efter lagring ved 4°C i 2 dager ble oppløsningen inndampet i vakuum, og residuet ble renset kromatografisk på en kolonne av kiselsyre under anvendelse av system Q, fulgt av system K, som eluéringsmidler. Inndampning av de passende fraksjoner og frysetørring av residuet ga H-MeTyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-NH2, RfH 0,22, RfK 0,70.

Eksempel 9 3

Etylamin (50 ekvivalenter) ble satt til en oppløsning av H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OMé (eksempel 47) (100 mg) i dimetylformamid (1 ml), og blandingen ble omrørt ved 4°C i 3 dager. Oppløsningsmidlet ble avdestillert i vakuum, og residuet ble befridd for spor av forurensninger ved kromatografi på en kolonne av kiselsyre under anvendelse av system K som eluerings-middel. Inndampning av de passende fraksjoner og frysetørring av residuet ga H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-NHEt, RfD 0,62, RfH 0,50, RfK 0,90.

E ksempel 9 4

I dette eksempel er beskrevet fremstilling, fra kjente forbindelser, av alle de nummererte utgangsmaterialer i eksemplene 1 til 93. Utgangsmaterialene er anbragt i tabellene i henhold til antall aminosyrerester som hver inneholder. I hver tabell er hver forbindelse identifisert med et bestemt nummer som benyttes enten den anvendes ved fremstilling av et annet utgangsmateriale som beskrevet i dette eksempel, eller ved fremstilling av en forbindelse beskrevet i et av eksemplene 1 til 93.

I tabellene er fremgangsmåtene angitt med symboler

Hl til H13, El til ElO og Fl til F3, de samme som beskrevet i

henholdsvis eksempler 1-42, 43-69 og 70-88. De andre symboler for fremgangsmåter har de nedenfor angitte betydninger.

Aktiv- Ester- Reaksjoner

Al. En oppløsning av den passende aminokomponent (1 mmol) og den ønskede.aktive ester (1,1 mmol) i dimetylformamid (minimum volum) ble holdt ved 20-25°C inntil en positiv reaksjon ikke lenger ble oppnådd med ninhydrin (15-50 timer). Reaksjonsblandingen ble inndampet i vakuum i en utstrekning tilstrekkelig til å tillate isolering av råproduktet, enten ved utfelning ved tilsetning av et egnet organisk oppløsningsmiddel eller ved behandling med vann eller en blanding av vann og et egnet organisk oppløsningsmiddel, f.eks. eter. Eventuelt ble ytterligere rensning foretatt som angitt i tabellene.

A2. Som i Al bortsett fra at etylacetat ved 4°C ble anvendt som reaksjonsmedium.

A3. Som i Al, men med tilsetning av 1-hydroksybenzotriazol (ca. 0,2 mmol). . A4. Som i Al, men reaksjonsblandingen ble holdt ved 4°C. A5. Som i Al, men med.tilsetning av 1-hydroksybenzotriazol (ca. 0,2 mmol), og det hele ble holdt ved 4°C.

Blandet- Anhydrid- Reaksjoner

Bl. En oppløsning av den passende karboksykomponent (1 mmol) i dimetylformamid (ca. 5 ml) ble avkjølt til -20° til -40°C og behandlet med N-metylmorfolin (1,05 mmol), fulgt av isobutyl-klorformiat (1,05 mmol). Blandingen ble omrørt ved -20 til -40°C i 5 minutter før tilsetning av en oppløsning av aminokomponenten

(1 mmol) i dimetylformamid. Når et salt av aminokomponenten ble anvendt, ble også N-metylmorfolin (1 mmol) tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 20-25°C i opptil 2 4 timer for å fullføre omsetningen og ble derefter inndampet i. vakuum. Residuet ble fordelt mellom fortynnet vandig sitronsyre og et egnet ublandbart organisk opp-løsningsmiddel, vanligvis etylacetat. Produktet i den organiske fase ble vasket efter tur med vandig sitronsyre og méd vandig natriumhydrogenkarbonat og ble til slutt isolert ved inndampning

av den tørrede oppløsning i vakuum. Hvis et egnet oppløsnings-middel ikke kunne finnes, ble vaskingen utført på det faste stoff som derefter ble isolert ved filtrering efter en siste vasking med vann.

B2. Som i Bl, men under anvendelse av trietylamin som tertiær base.

B3. Som i Bl, men under anvendelse av etyl-klorformiat

for å danne det blandede anhydrid.

B4. Som i Bl, mén under dannelse av det.blandede.anhydrid med etyl-klorformiat og N-metylmorfolin i tetrahydrofuran.

B5. Som i Bl, men under dannelse av det blandede anhydrid med etyl-klorformiat og anvendelse av trietylamin som tertiær base.

Azid- Reaksjoner

Cl. Hydrazidet (1 mmol) av karboksykomponenten ble oppløst i dimetylformamid (ca. 5 ml), avkjølt til -20°C og omdannet til sitt azid ved behandling med en 6M oppløsning av hydrogenklorid (5-6 mmol) i dioksan, fulgt av t-butylnitritt (1,2 mmol). Forsvinning av hydrazidet fra oppløsningen ble kontrollert ved

å påføre noen flekker på filtrerpapir og undersøke med jern(III)-klorid/kalium-jern(III)cyanid-dusj. I løpet av 10 minutter ble blandingen, som ble omrørt ved -10°C, nøytralisert ved tilsetning av en ekvivalent mengde trietylamin (dvs. 5-6 mmol), og den ønskede aminokomponent (1 mmol), oppløst i dimetylformamid (3 ml), ble tilsatt. Når et salt av aminokomponenten ble anvendt, ble den nødvendige mengde trietylamin (1 mmol) også tilsatt på dette trinn. Reaksjonsblandingen ble derefter omrørt ved 0-4°C i 18-24 timer. Efter filtrering ble filtratet inndampet i vakuum, og residuet ble oppløst, hvis mulig, i et ikke-vannblandbart oppløsningsmiddel, ble vasket efter tur med vandig sitronsyre, vandig natriumhydrogenkarbonat og vann, og ble utvunnet ved inndampning eller filtrering.

N, N'- dicykloheksylkarbodiimid- reaksjoner

Dl. Den passende karboksykomponent (1 mmol) ble oppløst i dimetylformamid (5 ml) og omrørt ved 4°C, mens N,N'-dicyklo-heksy lkarbodiimid (1,1 mmol) og den ønskede aminokomponent

(]>mmol) ble tilsatt. Blandingen ble derefter omrørt ved 4°C (eller i noen tilfeller ved 20-25°C) inntil man ikke lenger fikk en positiv ninhydrin-reaksjon (opptil 18 timer). Hvis aminokomponenten var i form av sitt salt, ble trietylamin (1 mmol) også tilsatt ved reaksjonens begynnelse. Efter filtrering ble produktet isolert ved inndampning av filtratet i vakuum, opp-løsning påny av residuet i et egnet organisk oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat, og vasking efter tur med vandig sitronsyre, vandig natriumhydrogenkarbonat og vann, fulgt av inndampning av den tørrede ekstrakt, eller ved utfelning ved tilsetning av et passende middel, f.eks. petroleter (k.p. 60-80°C).

D2. Som i Dl, men med tilsetning av 1-hydroksybenzotriazol (2 mmol) til reaksjonsblandingen.

D3. Den passende karboksyforbindelse (1 mmol) ble oppløst

i tørr tetrahydrofuran (2 ml) , og N-hydroksys.uccinimid (1 mmol) ble tilsatt, fulgt av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (1 mmol) i tetrahydrofuran (1 ml). Efter i5 minutter ble aminokomponenten (1 mmol) tilsatt, og blandingen ble omrørt ved 20-25°C i 15-25 timer. Efter filtrering ble produktet isolert ved inndampning i vakuum, oppløsning påny i et egnet oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat, og vasking efter tur med vandig sitronsyre, vandig natriumhydrogenkarbonat og vann, fulgt av inndampning av den tørrede ekstrakt i vakuum.

Reduksjoner

Gl. For fremstilling av heksahydrofenylalanin-derivatene ble det passende fenylalanin-holdige mellomprodukt (som angitt i tabellene) (1 mmol) oppløst i vandig 80%ig eddiksyre, eventuelt inneholdende noe saltsyre, Adams platinaoksyd-katalysator (50-150 mg) ble tilsatt med de vanlige forholdsregler, og reduksjonen ble utført ved å føre en strøm av hydrogen gjennom den omrørte blanding ved 20-25°C inntil reaksjonen var fullstendig (15-50 timer). Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom et lag av diatoméjord, og råproduktet ble isolert ved inndampning av filtratet i .vakuum.

Ester- hydrolyser

Jl. Esteren (1 mmol) ble oppløst i vandig 75% volum/volum aceton (10-15 ml) inneholdende natriumhydroksyd (1,1 til 1,2 mmol), og oppløsningen ble omrørt ved 20-25°C inntil det ikke lenger fant sted noen reaksjon som bedømt ved tynnskiktkromatografi (2-3 timer). Mesteparten av acetonet ble avdestillert i vakuum, og den gjen-værende vandig oppløsning ble. vasket med etylacetat."Den ble derefter surgjort, f.eks. ved tilsetning av sitronsyre, og produktet ble enten ekstrahert inn i et egnet oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat, eller isolert ved inndampning hvis dette ikke var mulig. Ekstraktene ble vasket med mettet saltoppløsning, tørret og inndampet i vakuum for å gi den ønskede karboksyforbindelse.

J2. Som i Jl, men under anvendelse av en vann/metanol/aceton-blanding.

J3. Som i Jl, men under anvendelse av vandig metanol som reaksjonsmedium.

J4. Hydrolyse ble utført med en ekvivalent natriumhydroksyd

i vann, og produktet ble isolert som natriumsaltet ved inndampning i vakuum.

J5. Som i Jl, men under anvendelse av vandig dioksan som reaksjonsmedium.

Acyleringer

Kl. Til en iskold oppløsning av den passende glyceryl-mpnoester (1 mmol) i kloroform (1 ml) inneholdende pyridin

(3 mmol) ble satt acetylklorid (3 mmol), og blandingen ble omrørt ved 20-25°C i 18 timer. Oppløsningsmidlet ble avdestillert i vakuum, og residuet ble oppløst påny i etylacetat og ble vasket efter tur méd vann, mettet vandig natriumhydrogenkarbonat og vann. Den tørrede ekstrakt ble inndampet i vakuum for å gi råproduktet

som ble utgnidd med en liten mengde metanol og oppsamlet ved filtrering.

Glyceryl-monoesteren som ble anvendt for denne acylering ble erholdt som følger. Den tilsvarende isopropyliden-beskyttede ester (50 mmol) i 2-metoksyetanol (300 ml) ble oppvarmet på dampbad i 6 timer med borsyre (500 mmol). Oppløsningsmidlet ble av-dampet i vakuum og erstattet med etylacetat. Efter vasking med vann ble oppløsningen tørret og inndampet i vakuum for å gi esteren som en olje som ble renset videre ved kromatografi på en kiselsyre-kolonne.

K2. Som i Kl, men under anvendelse av palmitoylklorid istedenfor acetylklorid.

K3. Den benzyliden-beskyttede glyceryl-monoester (1 mmol) og borsyre (4 mmol) i trimetylborat (5 ml) ble oppvarmet på dampbad i 20 minutter. Trimetylboratet ble avdestillert, og residuet ble oppvarmet i ytterligere 20 minutter på dampbad.

Det ble derefter oppløst påny i etylacetat (30 ml), vasket med vann og utvunnet som fri glyceryl-monoester ved inndampning. Acetylering ble derefter foretatt ved hjelp av acetylklorid som

i Kl.

K4. Som i K3, men under anvendelse av héksanoylklorid for den siste acylering.

F orestringer

Li. Den vannfrie, beskyttede aminosyre (10 mmol) ble oppløst i tørr pyridin (10 ml) ved 0°C, og benzensulfonylklorid (10 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 15 minutter før tilsetning av den passende alkohol (som angitt i tabellen) (10 mmol). Det hele ble derefter omrørt ved 4°C i 18 timer før avdestil-lering av pyridinet i vakuum. Residuet, oppløst i etylacetat (150 ml), ble vasket efter tur med vann, N saltsyre, vann,

2N vandig kaliumhydrogenkarbonat og til slutt med vann. Avdampning av etylacetatet efter tørring ga råproduktet.

L2. Til en omrørt oppløsning av den passende, beskyttede aminosyre (5 mmol) i pyridin (5 ml) ved 0°C ble satt fenol (10 mmol) og N.,N<1->dicykloheksylkarbodiimid (10 mmol), og det hele ble omrørt ved 4°C i 18 timer. Efter filtrering og avdampning av pyridinet i vakuum ble residuet oppløst i etylacetat (100 ml) og vasket efter tur med vann, vandig 2N kaliumhydrogenkarbonat og vann. Den tørrede ekstrakt ble inndampet for å gi den rå ester.

L3. Den passende, beskyttede aminosyre (10 mmol) ble opp-løst i acetonitril ved 0°C, og den ønskede alkohol (10 ml) ble tilsatt sammen med pyridin (20 mmol) og N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (11 mmol). Blandingen ble omrørt ved 4°C i 18 timer og derefter filtrert og inndampet i vakuum. Residuet ble opptatt i etylacetat og vasket efter tur med vandig sitronsyre, vandig kaliumhydrogenkarbonat og vann. Inndampning av den tørrede etyl-

acetat-ekstrakt ga den rå ester.

L4. Som i L3, men under anvendelse av aceton som reaksjonsmedium istedenfor acetonitril.

Omsetning med ammoniakk

Ml. • Den angitte peptid-metylester ble oppløst i minimums-mengden av dimetylformamid og holdt i kontakt med et overskudd av konsentrert"etanolisk ammoniakk i 3 dager ved 20-25°C. Produktet ble isolert ved utfeining med vann.

Omsetning med hydrazin

Ni. Peptid-metylesteren (10 mmol) ble oppløst i dimetylformamid (25 ml), og vandig 60% hydrazin-hydrat (50 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 20-25°C i 18 timer, eventuelt konsentrert til ca. halvt volum i vakuum, og produktet ble utfelt ved tilsetning av vann.

Andre reaksjoner

Pl. Boc-Tyr(But)-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH (utgangsmateriale nr. 161) (729 mg, 1 mmol), ren, tørt pyridin (0,55 ml, 7 mmol) og nydestillert eddiksyreanhydrid (0,9 ml, 6,7 mmol) ble omrørt sammen ved 20-22°C i 10 minutter. Den resulterende oppløsning ble oppvarmet ved 90-92°C i 6 timer og ble derefter avkjølt og behandlet med vann (15 ml). Den gummi som ble utskilt, ble befridd for væsken på toppen ved dekantering, vasket med vann (5 x 15 ml) med dekantering og oppløst i etylacetat (50 ml). Oppløsningen ble vasket suksessivt med 10% vekt/volum vandig sitronsyre (4 x 10 ml), vann (1x5 ml), 10% vekt/volum vandig kaliumhydrogenkarbonat (3 x 10 ml) og vann (3 x 10 ml), derefter tørret (vannfritt magnesiumsulfat) og inndampet. Det kjerne-magnetiske resonansspektrum for det resulterende faste residuum (530 mg) viste at det var en blanding av L, D, L, L og L, D, L, D formene av

Ql. Z-Tyr(Bufc)-OH (isolert fra 55,2 g, 100 mmol, av sitt dicykloheksylaminsalt) ble oppløst i tørr tetrahydrofuran (300 ml), og metyljodid (50 ml, 800 mmol) ble tilsatt. Natrium-hydrid (8,6 g, 80% vekt/vekt dispersjon i olje, dvs. 300 mmol) ble derefter tilsatt, og blandingen ble oppvarmet under tilbake-løspkjøling i 18 timer i et bad ved 75°C. Overskudd av natrium-hydrid ble derefter ødelagt ved tilsetning av etylacetat til den avkjølte suspensjon, fulgt av vann slik at man fikk en nesten klar oppløsning. Denne ble konsentrert i vakuum for å gi en vandig oppløsning som ble fortynnet ytterligere med vann (150 ml) og

vasket to ganger med eter for å fjerne eventuelt tilstedeværende metylester. Den vandige oppløsning ble bragt til pH 3 ved tilsetning av sitronsyre og ekstrahert med etylacetat (400 ml,

200 ml x 2). Ekstraktene ble vasket efter tur med vann (100 ml), vandig 10% vekt/volum natriumtiosulfat (100 ml) og derefter med vann inntil vaskevannene var nøytrale. inndampning av ekstrakten efter tørring over magnesiumsulfat ga en olje som ble suspendert i varm bensin (200 ml, k.p. 60-80°C) og behandlet med etylacetat for å gi en klar oppløsning. Ved avkjøling til 4°C ble

Z-MeTyrfB.uS-0H utskilt som et fast stoff, sm.p. 96-99°C.

Denne fremstilling var basert på metyleringsprosessen beskrevet av J.R. McDermott og N.L. Benoiton, Can. J. Chem., 1973, 51, 1915.

RI.. Z-NHNH-C0-C1 (3,87 g., 17 mmol) ble satt til en opp-løsning av Phe-Azleu-NH2.HC1 (5,33 g, 17 mmol) og trietylamin (2,45 ml, 17 mmol) i kloroform (50 ml).Blandingen ble holdt ved omgivelsestemperatur i 16 timer, og etylacetat (400 ml) ble derefter tilsatt. Oppløsningen ble vasket efter tur med vann og vandig 20% vekt/volum sitronsyre, tørret over natriumsulfat og inndampet i vakuum. Residuet ble renset ved silikagel-kolonnekromatografi under anvendelse av kloroform, 2% volum/volum metanol i kloroform og systemene P og Q som elueringsmidler. Z-Azgly-Phe-Azleu-NH2ble erholdt som et fast stoff, sm.p. 116-120°C (spaltn.)

Sl. En oppløsning av Z-Tyr(Bzl)-OCp (17,5 g, 30 mmol) og Boc-NMeNH2(4,38 g, 30 mmol) i dimetylformamid (50 ml) ble holdt i 18 timer ved omgivelsestemperatur. Efter fortynning med etylacetat (500 ml) ble oppløsningen vasket efter tur med vann, vandig 20% vekt/volum sitronsyre og vann. Inndampning av den tørrede ekstrakt i vakuum ga et fast stoff som ble behandlet direkte med en oppløsning av hydrogenklorid (100 mmol) i etylacetat i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Avdampning av oppløsningsmidlet i- vakuum ga Z-Tyr(Bzl)-NHNHMe.HC1; sm.p. 223-224°C. RfD 0,82, RF 0,64, R£Q0,63.

Det foregående hydroklorid (9,4 g, 20 mmol) ble oppløst i kloroform (200 ml), og trietylamin (2,8 ml, 20 mmol) ble tilsatt, fulgt av_metyl-isocyanatoacetat (2,3 g, 20 mmol). Blandingen ble omrørt i 18 timer ved omgivelsestemperatur før fjernelse av oppløsningsmidlet ved avdampning i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat og vasket efter tur med vann,, vandig 20% vekt/volum sitronsyre, mettet vandig natriumhydrogenkarbonat og vann. Inndampning av den tørrede ekstrakt i vakuum ga Z-Tyr(Bzl)-Azala-Gly-OMe som efter krystallisering fra metanol/eter hadde sm.p. 107-108°C.

I tabellene IV til XIX er det spesielle nummer for hvert utgangsmateriale angitt i den første spalte og følges i den neste eller de to neste spalter av sin struktur. "Metode"-spalten beskriver den spesielle fremgangsmåte som ble anvendt og angir derefter nummeret eller strukturen på utgangsmaterialet som fremgangsmåten ble utført på. De neste spalter gir opplysning om R^-verdier, og den siste spalte refererer til spesielle punkter som er angitt umiddelbart efter tabell XIX. Således ble f.eks.,

i tabell IV, utgangsmateriale nr. i3, hvis struktur er gitt i annen og tredje spalte, fremstilt ved å utføre fremgangsmåten Hl på utgangsmateriale nr. 24. Produktet ble omkrystallisert fra isopropanol/eter og hadde sm.p. 181-183°C.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av et fysiologisk aktivt polypeptid med formelen:

hvor R" <*> " betyr hydrogen eller et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer; R betyr hydrogen eller et radikal valgt fra et alkanoyl radikal med 1 til 3 karbonatomer, et alkoksykarbonylradikal med 2 til 6 karbonatomer eller en aminosyrerest som er Arg, Gly, Glu, Asp, Phe, 3~ Ala eller en Lys eller D-Lys som begge eventuelt er substituert på e-aminogruppen med et alkoksykarbonylradikal med 2 til 6 karbonatomer, eller R 2betyr 2 til 6 a-aminosyrerester som er bundet sammen via normale peptidbindinger, idet disse aminosyrerester er uavhengig valgt fra Gly, Lys, Pro, Phe, Gin, Glu, Leu, Arg og Asp, idet Lys og Arg restene eventuelt alternativt er bundet sammen via henholdsvis sine e-amino- og -guanidino-radikaler, og Asp og Glu restene er eventuelt alternativt bundet sammen via henholdsvis sine 3- og y-karboksyradikaler; B er D-Ser eller D-Thr som begge eventuelt er substituert på 3~ 0H med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer, eller B er D-Ala, D-Leu, D-Asp, D-Lys, D-Trp, D-Met, 3-Ala eller Azala; E er Gly eller Azgly som begge eventuelt er substituert på a-amino- radikalet, eller 3-Ala som eventuelt er substituert på 3-aminoradikalet, med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer; F er Phe, heksahydroPhe, Azphe eller heksahydroAzphe, som alle eventuelt kan være substituert på a-aminoradikalet med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer; G er Leu, D-Leu, Met, D-Met, Nie, D-Nle, Ile eller D-Ile> som alle eventuelt kan være substituert på a-aminoradikalet med et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer, eller G er Pro, Azleu eller Azpro; K betyr et hydroksy- eller aminoradikal, et radikal med 3 3 formelen OR hvor R er.et alkyl-, alkenyl- eller hydroksy- alkyIradikal med opptil 6 karbonatomer, et aminoalkyIradikal med opptil 6 karbonatomer eller et alkylaminoalkylradikal med ■ opptil 10 karbonatomer, hvor i begge nitrogehatomet eventuelt er substituert med et benzyloksykarbonylradikal, eller R <3> betyr et fenylradikal eller et radikal med formelen:

hvor R 4 er et alkanoyIradikal med 1-20 karbonatomer, eller K betyr, et radikal med formelen NHR 5 hvor R 5 er et alkyl-eller cykloalkyIradikal med 1 til 6 karbonatomer, et radikal med formelen NR 6 R 7 hvor R 6 og R 7 er alkylradikaler med .1 til 6 karbonatomer, eller R og R er bundet sammen for å danne en 5- eller 6-leddet ring som eventuelt inneholder et ytterligere heteroatom, et radikal med formelen -NH-CHo CHo 0R <4> 4 12 . hvor R har den ovenfor angitte betydning, et hydroksyalkyl-aminoradikal med opptil 6 karbonatomer eller et (alkylamino)-alkylamino- eller (dialkylamino)alkylamino-radikal med opptil 10 karbonatomer, eller K betyr et radikal med formelen Gly-OR8, D-Thr-OR8, Thr-OR <8> , D-Ala-OR <8> eller Ala-OR <8> hvor R 8er et hydrogenatom, et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer eller et radikal med formel II, III eller IV angitt ovenfor hvor R 4har den ovenfor angitte betydning, eller K er et alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer; eller G og K sammen betyr D- eller L-formene av et radikal med formelen:

hvor n er et helt tall fra 1 til 4, eller et radikal med formelen: ~

og når polypeptidet med formel I inneholder en basisk funksjon,, de farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter derav, og når polypeptidet med formel I inneholder en sur funksjon, de farmasøytisk godtagbare baseaddisjonssalter derav, karakterisert ved (a) fjernelse av én eller flere konvensjonelle peptid-beskyttende grupper fra et beskyttet polypeptid for å danne forbindelsen med formel I; eller b) for fremstilling av de forbindelser hvor K er forskjellig fra et hydroksyradikal eller, når K betyr et radikal med formelen Gly-OR8, D-Thr-OR8, Thr-OR <8> , D-Ala-OR <8> eller Ala-OR <8> , R g er forskjellig fra et hydrogenatom, og for fremstilling av de forbindelser hvor G og K sammen betyr radikaler med de ovenfor angitte formler V, VI eller VII, omsetning av en karboksylsyre med formelen:

eller et aktivert derivat derav, med en egnet alkohol eller amin, og eventuelt omdannelse av den fremstilte forbindelse til et farmasøytisk godtagbart salt derav.