NO743433L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av influensa-vaksine.

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av levende vaksine mot influensavirus ved hjelp av stabile H3N2influensavirus-stammer som er fullstendig resistente overfor seruminhibitorer.

Beskyttelse mot virale respirasjons-infeksjoner er påvist å henge sammen med nærværet av en lokal imunitet i respirasjons-slimhinnen. Dette synspunkt er nylig kommentert av Rossen et al. (Progr. Med. Virol. 1971, 13, 194).

Atskillige forsok er i de senere år gjort for å indusere

imunitet mot influensa ved hjelp av intramasatli tilforsél av inaktiverte vaksiner (se f.eks.: Waldman et al. Nature, 1968,

218, 594; J. Immunol. 1969, 207, 520 og WHO Bull. 1969, 41, 543). Resultatene var imidlertid ikke entydige og dette var sannsynlig forårsaket av den utilstrekkelige stimulering av imunitets-systemet av det inaktiverte antistoff (Tyrrel et al. J.Hyg. 1970, 68, 359).

Levende influensa vaksiner er også kjent men de .har forskjellige beskyttelses-grader og tallrike forsok har vært gjort, f.eks.

ved rekker av passeringer i egg, på å redusere de patogene egenskaper av viruset.

Slike influensavaksiner har vært anvendt i Sovjet Unionen i

flere år og i henhold til Smorodintsev et al. (Bull. WHO, 1969, 41, 585) ble de tillagt god beskyttelse hvis det gjaldt å hindre influensaepidemier.

Fra kliniske forsok gjennomfort med virus isolert fra pasienter

i det håp at noen av disse viruser skulle vise seg å være ikke-patogene (A.A. Smorodintsev, G.A. Alexandrova, O.M. Chalkina og A.A. Selivanov, Applied Virology (1965)j forste annual Symposium, Boca Raton, Florida, 1969, utgitt av M. Saunders og E.H. Lennette, side 142, Sheboygan, Wisconsin, Ellis), ble det konkludert at virus som er resistente mot hesteserum-inhibitorer bevirker færre reaksjoner enn de virus som er sensitive overfor hesteserum-inhibitorer.

Det må imidlertid innrommes at, for å eliminere bivirkninger

ved tilforsél av en levende influensavirus-vaksine, må omdannelsen til inhibitor-resistens være fullstendig da fortsatt tilstedeværelse av endog en liten prosentandel av inhibitor-sensitive partikler kan gjore et virus for patogent for behandling av mennesker. Forskjellige forsok har vært gjort på å isolere influensavirus-stammer som er fullstendig resistente overfor hesteserium-inhibitorer og forskjellig teknikk er beskrevet for å forbedre inhibitor-resistensen av influensavirus, idet

slik teknikk hovedsakelig har gått ut på serievis passering av influensavirus-stammer i egg i nærvær av serum.

Allantoin-passeringer av blandinger av en bestemt dose av influensavirus og hesteserum har vist seg å resultere i fullstendig hesteserum-resistens av A2/Tokyo/3/67 (H2N2) influensavirus-stamme mens resultatene ikke var entydige for A2Hong-Kong (H.jN2)/l/68 vir us-stamme (A.S. Beare, M.L. Bynoe

og D.A.J. JTyrrel, British Medical Journal 4, 482, 1968).

Det er også kjent at allantoin-passeringer av eri blanding av

en bestemt dose av influensavirus A2Hong-Kong (H^N^/l/eS og marsvin-serum ikke gir positive resultater for den syttende

■passering (D.Ikic, N. Pasini, N. Rajner, B. Jancikic, ~M„ Juzbasic og M, .Hecimovic, Proe. Symposium on Acute Respiratory Diseases 1969, Yugoslav Academy of Sciences and Arts, Zagreb).

Det er også vist at det er mulig å fullstendiggjore inhibitor-resistensen i lopet av et begrenset antall passeringer når det i rekkefolge anvendes hesteserum og marsvinserum ved passasjene, d.v.s. at det er mulig å oppnå en stabil og imunogen A2Hong-Kong (H-jlS^) inf luensavirus-stamme som er fullstendig resistent mot seruminhibitorer når en A2Hong-Kong (H^N2) influensavirus-stamme som tidligere er blitt underkastet serie-passeringer i allantoin-sekken av egg i nærvær av okende konsentrasjoner hesteserum underkastes serie-passeringer i allantoin-sekken i egg i nærvær av okende konsentrasjoner av marsvinserum.

Den erkjennelse som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse er at stabile H^N2 influensavirus-stammer som er fullstendig resistente mot seruminhibitorer og som er verdifulle for fremstilling av vaksine for intramasal tilforsél oppnås når en rekombinerende H^N2influensavirus-stamme oppnådd ved rekombinasjon fra et H^N2influensavirus og et A/PR8 influensavirus passeres gjennom allantoin-sekken i befruktede egg i nærvær av serum, idet eggene foretrukket er honse-egg og serumet foretrukket er marsvinserum.

Rekombinerende H^^ influensavirus-stammer oppnådd ved rekombinasjon fra H^^ iRfluensavirus_stammer oppnådd ved rekombinasjon fra H^^ influensavirus og A/PRg influensavirus stammen er kjent.

Det blir da mulig fra disse rekombinanter å utvelge kloner med hoy vekstevne (E.D. Kilbourne, Bull Wld. Hit. Org 41, 643-645, 1969). Noen virus-kloner som er isolert fra slike rekombinasjoner har vist seg å være svekket overfor mennesker. Hverken in vi,tro eller i vivo kan slik svekking påvises annet enn ved at de svekkede egenskaper fordi forskjellige viruskloner må proves ved

infeksjon av mennesker (A.S. Beare og T.S. Hall,Lancet 1971

r II, 1271-1273). Ved den foreliggende fremgangsmåte gjores en rekombinant H^^ influensavirus-stamme, valgt for sin hoye vekstevne, resistent mot seruminhibitorer. Det således .oppnådde modifiserte influensavirus, med sin H^^ antigene sammensetning, har bibeholdt sin hoye vekstevne. Det er således utviklet en lovende levende influensavaksine som ikke behover å gjennom-prøves på mennesker for å utvelge de virus-kloner med en aksepterbar grad av svekking og som har en stabil markering in vitro. Utgangsproduktet oppnås bare etter en eller to passeringer av den utvalgte rekombinante H3N2influensavirus i allantoin-sekken i befruktede egg i nærvær av seruminhibitorer som angitt ovenfor.

En H^N2influensavirus-stamme som er fullstendig resistent overfor seruminhibitorer fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse er blitt benevnt "Alice strain" i sokernes samling og en prove av denne Alice-stamme er .deponert i American Type Culture Collection (Rockville Maryland, USA) hvor den har fått betegnelsen ATCC VR 776.

En del av den foreliggende oppfinnelse vedrorer således en fremgangsmåte for fremstilling av H^^ influensavirus-stammér som er fullstendig resistente overfor seruminhibitorer - mer spesielt den nevnte Alice-stamme - som går ut på at man minst en gang i allantoin-sekken i befruktede egg - mer spesielt honseegg - i nærvær av serum - mer spesielt marsvinserum - innforer en rekombinant stamme (f.eks. MRC-2 klonen, deponert i American Type Culture Collection, Rockville Maryland, USA hvor den ble meddelt betegnelsen ATCC VR 777) tidligere oppnådd fra en & 2®2 '""n:^luensavirus-stamme - mer spesielt A/England/42/72 stammen - og A/PRg influensavirus-stammen - mer spesielt Mount Sinai A/PRg/34 stammen - idet dyrkingene var gjennomfort under anvendelse av forskjellige virusfortynninger varierende fra

-1-7 10 til 10 normal saltlosning i nærvær av forskjellige serum-fortynninger varierende fra 1/4 til 1/1000 normal saltlosning og isolering av de således oppnådde seruminhibitor-resistente stammer, foretrukket dem som oppnås i nærvær av den hoyeste serumkonsentrasjon og den laveste viruskonsentrasjon.

Oyensynlig kan enten den rekombinante stamme eller den isolerte resistente stamme eller begge klones eller underkastes flere fortynnings-passeringer uten å modifisere oppfinnelsen.

Den nevnte Alice vxsus stamme er således den som oppnås fra MRC-2-klonen som tidligere er underkastet 5 avsluttede fortynnings passeringer for den passeres en gang ved en 10 _3 konsentrasjon

i nærvær av en 1/16 fortynning av marsvinserum i normal salt-

_7

losning og en gang ved 10 konsentrasjon i nærvær av 1-/4 fortynning av marsvingserum i normal saltlosning og videre underkastet to avsluttede fortynningspasseringer i fravær av serum pluss en ytterligere passering i fravær av serum for kimporsjon-fremstilling. Denne porsjon tilsvarer den 12. passering av MRC-2-klonen, idet den stamme som anvendes videre fra den 7. passering er resistent mot seruminhibitorer.

De således oppnådde virus-stammer som er fullstendig resistente overfor seruminhibitorer er ikke patogene, imunogene og verdifulle for fremstilling av levende influensavirus-vaksihe,

under anvendelse av en hvilken som helst kjent teknikk for fremstilling av.levende influensa vaksine og/eller stabilisering av dette. Den foreliggende oppfinnelse vedrorer særlig fremstilling av svekkede influensavirus-vaksiner inneholdende minst en av de nevnte seruminhibitor-resistente virus-stammer.

Oppfinnelsen vedrorer således en fremgangsmåte for fremstilling av svekket influensavirus-vaksine, og det særegne ved frem-gangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at det i allantoin-sekken i befruktede honseegg inkuberes en seruminhibitor-resistent H-N» influensavirus-stamme erholdt ved den ovenfor beskrevne prosess, idet inkuberingen skjer i et tidsrom tilstrekkelig til å tillate vekst av en stor mengde av det nevnte virus, det resulterende virus-material isoleres og frysetorres eventuelt.

De således erholdte svekkede influensa^virusvaksiner tilfores utvortes i nese-svelg.

For bruk som vaksine oppbevares viruset foretrukket i fryse-tørret form og vaksinen rekonstitueres uten videre ved tilsetning av enten vann eller hvilke som helst andre farmasoytiske for-tynningsmidler eller blandinger vanlig kjent for fremstilling av nesepreparater for tilforsél i dråpe- eller dusj form.

Det folgende eksempler illustrer oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Fremgangsmåte^

En prove av en MRC-2-klon som var underkastet 5 avsluttede fortynnings-passeringer og som var påvist å være sterkt sensitive overfor normale seriuminhibitorer ble anvendt som utgangs-virusmaterial. Forskjellige fordelinger (d.v.s. 10 -1 ,10 -3,

10 -5 og 10 -7) for det nevnte utgangs-virusmaterial i normal saltlosning blandes med forskjellige fortynninger ( d.v.s. 1/4, 1/8, 1/16, 1/40, 1/200 og 1/4000) av sterilt normalt marsvin^ serum (i normal saltlosning) som på forhånd var innstilt til i/4 fortynning og deretter holdt i 15 minutter i et kokende vannbad og videre var fortynnet, homogenisert og sentrifugert ved 200 omdreininger pr. min i 30 minutter. Det overliggende væskesjikt anvendes for det videre trinn som består i å inkubere virus-serumblandingen ved 37°C i en time for inokulering av 0,2 ml delmengder av blandingen i allantoin-sekken ^i en serie befruktede honseegg som tidligere var inkubert i 9-10 dogn ved 37°C og gjennomlyst (bare de overlevende egg ble inokulert).

Eggene ble så videre inkubert i en tid som varierte mellom 24 og 96 timer.

Ved slutten av denne inkubasjonsperiode ble eggene gjennomlyst

og de overleyende egg ble avkjolt ved 4°C. Allantoinsekk-væsken av hver av seriene av overle<y>ende egg isoleres separat og proves for tilstedeværelse av influensavirus ved hjelp av hemagglut hemagglutinasjonsmetoden. Det isolerte virus fremstilt ved inokulatet fra den hoyeste virusfortynning i nærvær av dén hoyeste serumkonsentrasjon som viser hemagglutinasjonsaktivitet

(d.v.s. virusfortynning 10 og serumfortynning 1/16) anvendes for en ytterligere passering gjennomfort under de samme arbeidsbetingelser. Det isolerte virus frembragt fra inokulatet ved den hoyeste virusfortynning (d.v.s. 10 -) i nærvær av den hoyeste serumkonsentrasjon (d.v.s serumfortynning 1/4) viser hemagglutinasjonsaktivitet og er fullstendig resistent overfor normale'seruminhibitorer som .angitt i.den folgende tabell I. Tre ytterligere passeringer ved endelige fortynninger gjennomfores i fravær av serum for kloning av den oppnådde resistente mutant og for kontroll av stabiliteten av den resistente egenart. Som angitt i den folgende tabell I er det virus som isoleres ved hver passering fullstendig resistent overfor inhibitorene i normalt serum. Virus ved det siste passeringsnivå anvendes som inokulat for fremstilling av kimporsjoner av Alice-stammen. De isolerte allantoinsekk-væskene samles og blandes, proves på sterilitet og sikkerhet, og blandes med pepton til en sluttkonsentrasjon på 5% av pepton. Et volum på 0,5 ml av virussuspensjonen fordeles i 3 ml anhuller og frysetorres.

In vitro_og_in_vivo_egenskaper_av det modifiserte virus.

1) inhibitor- resistens.

For proving av resistens mot inhibitorer til stede i normalt oppvarmet dyreserum (hest, marsvin og kalveserum på forhånd oppvarmet ved 75°C i 1 time){ble serierer av dobbelte fortynninger av oppvarmede serum blandet med 4 hemagglutinerende enheter av utgangsstammen og det modifserte virus. Etter inkubasjon i en time ved romtemperatur ble rode blodlegemer fra nons tilsatt og resultatet opptegnet. Disse resultater er vist i den folgende tabell I:

Disse data viser fullstendig resistens for kim-porsjonen og to etterfølgende ekspermintelle porsjoner frembragt fra denne kimporsjon.

2) Stabilitet av den inhibitor- resistente karakter.

Den resistente karakter av Alice-stammen ble bekreftet i egg og laboratoriedyr (ildere). - i egg ble Alice stammen underkastet 5 ytterligere passeringer i befruktede honseegg uten endring av den resistente karakter. - i ildere ble virus isolert 3 dager etter intranasal inokulering (10 — 7 EID^q) også funnet å være fullstendig resistent mot seriuminhibitorer.

3) Antigenisitet og fravær av bivirkninger.

En forste gruppe på 4 ildere ble inokulert intranasalt med

10 EID5oav Alice-Stammen« Dyrenes temperatur ble bestemt daglig i 5 dager p.i. Ingen særlig temperaturstigning ble iakttatt (maksimal tempertur 39,8°C). En ytterligere gruppe på 2 ildere ble inokulert intranasalt med 10~<7>EIDj-q av A^En<g..>/4272 utgangs-stammen. To dogn etter inokuleringen viste de to dyr temperaturer på henhv. 40,8 og 41,2°C. En' tredje gruppe av to ..ildere ble inokulert intranasalt med 10 7 'EID5Q av en stamme isolert i Australia i 1972 (A2/Victoria/101/72). Begge ildere viste en positiv reaksjon på den annen dag etter inokuleringen (temperaturer hoyere enn 40,5°C). Hemagglutinasjons-inhibisjons-prover viste at inhibitor-resistensen ikke endrer antigenisisteten av virus i ildere: 14 dager etter den intranasale inokulering var antistoff-innholdet i serum meget hoye blandt de inokulerte dyr (innhold 1/1024) i motsetning til kontrollgruppen (innhold

>i/8)..

Eksempel 2.

Ved å gå ut fra det frystetorrede material oppnådd i eksempel 1

( d.v.s. Alice-stammen) som kime-porsjon for vaksinefremstilling i stor målestokk, ble en ytterligere passering gjennomfort i allantoin-sekkfluidet av et annet sett befruktede honseegg som

ble inkubert ved 36°c i tre dager. ,

Allantoin-sekkfluidene ble isolert, samlet, provet på sterilisert og sikkerhet, blandet med pepton for å nå en endelig konsentrasjon på 5% av peptonet og fordelt i 3 ml glassampuller for å oppnå en enttitsdose (d.v.s. minst 10 7EID^q); av virus. Produktet ble så frysetorret og ampullene forseilet eller forsynt med tett kork.

Dette passeringsnivå anvendes som vaksine-sats. For vaksine-tilforsel rekonstitueres innholdet av hver ampulle ved å tilsette 0,5 ml av vann eller saltlosning eller en 5% sukrose losning og tilfores som dråper i neseborene.

Alternativt fordeles allantoin-sekkerfluids pepton-preparatet

i storre glassampuller for å oppnå mengder som var et visst antall ganger så store som enhetsdosen av virus for å tilsvare tilsvarende, multi-dose vaksinepreparater.

Eksempel 3.

Vaksinering med svekket influensavaksine, Alice- stammen.

Materialer og metode.

Ti personer med alder mellom 18 og 44 år (gjennomsnittsalder:

28 år) og med et H.I. antistoff-innhold 32'b£e valgt for forsoket. Disse ti personer mottok med 14 dagers mellomrom to tilforsier av særskilt rekonstituert vaksine, Alice-stammen. For hver tilforsél mottok alle personer vaksinen oppnådd i eksempel 2 (5 dråper pr. nesebor).

Nese-utflod og blodprover for antistoff-bestemmelse (A/England 42/72 stammen) ble tatt den 14. dag etter den forste tilforsél (d.v.s. på dagen for den annen inokulering) og 3-4 uker etter den annen tilforsél.

I. Klinisk.

Temperaturen ble tatt i 5 dager etter hver tilforsél. Som angitt i den folgende tabell II viste bare en person (nr. 3) en liten forhoyelse i temperaturen (37,2°C den forste dag).

Syv personer fremviste enkelte milde kliniske manifestasjoner: 6 a<y>dem hadde en serumaktirinitisk eller nasal tilstopping i

en eller to dager og en person klaget over svak hodepine med faryngial hypersekresjon.

II. Virus- isolasjon.

Nesé- og strupe-preparater ble samlet på dag 2 i åtte personer nr. 3, 5, 6, 9, 12, 14, 22 og 27). Alle prover forble negative etter to blinde-passeringer i befruktede egg.

III. Serologiske resultater.

a. Hemagglutinasj2ns-inhibéring_^5i5i2_555i?t2ÉÉli?}^2iÉi Fjorten dager etter den forste tilforsél ble sero-omdannelse i iakttatt i seks av ti personer.

Etter den annén tilforsél hadde syv personer av ti sero-konvertert.

b. Serum-no,y.etalisering_^S_.N_.2 an^istoff-innhold^

Fjorten dager etter den forste tilforsél ble det iakttatt en

merkbar stigning i antistoff-innholdet i seks av ti personer, og etter den annen tilforsél i ni personer av ti.

Ved betraktning av H.I.-innholdet og S.N.-innholdet, var det bare en person (nr. 6) av ti frivillige som ikke serokonverterte etter to tilforsler.

IV. Lokale antistoffer.

Lokale N antistoff-innhold for alle ti forsokspersoner er gjengitt i tabell III.

En merkbar stigning i antistof f--innholdet ble iakttatt i syv personer av ti, fjorten dager etter den forste tilforsél og i åtte av ti personer 21-22 dager etter den annen tilforsél.

o

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av svekket influensavirus-vaksine,karakterisert vedat det i allantoin-sekken i befruktede egg inkuberes en seruminhibitor-resistent H_N 2 influensavirus-stamme i en tid tilstrekkelig til å tillate vekst av en stor mengde av det nevnte virus, det resulterende virusmaterial isoleres og frystetorres eventuelt, idet den seruminhibitor-resistenten H^N2influensavirus-stamme er oppnådd ved at man minst en gang i allantoin-sekken av befruktede egg i nærvær av serum passerer en rekombinant stamme som tidligere er oppnådd fra en H^K^ influensavirus-stamme og A/PRQinfluensavirusstamme, idet dyrkingene gjennomfores ved å a -1 bruke forskjellige virusfortynninger varierende fra 10 til 10 i normal saltlosning i nærvær av forskjellige serumfor- tynninger varierende fra 1-4 til 1-1000 i normal saltlosning og deretter isoleres den således oppnådde seruminhibitor-resistente s tamme.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det som befruktede egg anvendes befruktede honseegg.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det som serum anvendes marsvin-serum.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-3,karakterisert..-\ ved at det som influensavirus-stamme anvendes A/Eng]aid/42/72-stammen.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-4,karakterisert vedat det som A/PRg influensa-virusstamme anvendes Mount Sinai A/PRg/34-stammen.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-5,karakterisert vedat den rekombinante stamme er MRC-2-stammen.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-6,karakterisert vedat den isolerte stamme er en av de som oppnås i nærvær av den hoyeste serumkonsentrasjon og den laveste viruskonsentrasjon.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2,karakterisert vedåt den.seruminhibitor-resistente H^N2influensavirus-stamme er Alice-stammen.