NO742267L

NO742267L -

Info

Publication number: NO742267L
Application number: NO742267A
Authority: NO
Inventors: J Scholefield
Original assignee: Univ Strathclyde
Priority date: 1973-06-22
Filing date: 1974-06-21
Publication date: 1974-12-27
Also published as: DK334774A; DE2429380A1; FR2234368A1; JPS5076282A; BE816657A; FR2234368B3; SE7408105L; NL7408337A

Description

Fremgangsmåte ved kvantifisering av mikroorganismer Procedure for quantifying microorganisms

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for tallmessig kvantifisering av mikroorganismer. Mere spesielt vedrorer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til å bestemme graden av mikrobiell forurensning av matvarer eller råmaterialer anvendt ved fremstilling av matvarer. Imidlertid er foreliggende oppfinnelse ikke bare begrenset til matvarer, idet den kan anvendes i hvilken som helst situasjon hvor en bestemmelse av mikroorganismer er nodvendig, eksempelvis innen forgjæringsindustrien, fremstilling av gjær, ved medisinsk diagnose og ved fremstilling av farmasoytis-keprodukter. The present invention relates to a method for the numerical quantification of microorganisms. More particularly, the present invention relates to a method for determining the degree of microbial contamination of foodstuffs or raw materials used in the manufacture of foodstuffs. However, the present invention is not only limited to foodstuffs, as it can be used in any situation where a determination of microorganisms is necessary, for example in the fermentation industry, production of yeast, in medical diagnosis and in the production of pharmaceutical products.

Den konvensjonelle fremgangsmåte anvendt ved bestemmelse av antallet av mikroo.rganismer i et materiale innbefatter isolering av mikroorganismene fra materialet, og derefter kultivering av mik roorganismene i et kulturmedium på en plate. Telling av mikroorganismene ved denne "kolonitelle"-teknikk er en tidskrevende prosedyre som under normale forhold vil kreve to dagers inkubasjonstid, avhengig av antallet og den aktuelle mikroorganisme, men det er ikke uvanlig at inkubasjonen kan ta en uke eller mere. Når inkubasjonen er fullstendig, blir antallet mikroorganismekolonier på platene bestemt visuelt. Denne "koloni-tall"-teknikk er nodvendigvis unoyaktig, og feilene oppstår fordi ikke a.11e mikroorganismene kan gjen-vinnes fra materialet som undersokes. Noen dor under fremstilling av proven for de tilsettes kulturmediet, og ytterligere kan kultive-ringsbetingelsene under inkubasjonen ikke være passende for alle mikroorganismer i proven. Således vil noen typer ikke danne kolonier, og vil således ikke bli bestemt ved denne teknikk. Ytterligere er det kjent at en enkelt koloni kan oppstå ved vekst av flere enn én mikroorganisme. The conventional method used for determining the number of micro-organisms in a material involves isolating the micro-organisms from the material, and then cultivating the micro-organisms in a culture medium on a plate. Counting the microorganisms by this "colony counting" technique is a time-consuming procedure which under normal conditions will require an incubation period of two days, depending on the number and the microorganism in question, but it is not unusual for the incubation to take a week or more. When the incubation is complete, the number of microorganism colonies on the plates is determined visually. This "colony count" technique is necessarily inaccurate, and the errors occur because the microorganisms cannot be recovered from the material being examined. Some die during preparation of the sample because they are added to the culture medium, and furthermore the cultivation conditions during incubation may not be suitable for all microorganisms in the sample. Thus, some types will not form colonies, and thus will not be determined by this technique. Furthermore, it is known that a single colony can arise from the growth of more than one microorganism.

Den mest betydningsfulle ulempe ved kolonitelleteknikken er den nodvendige tid for å oppnå et resultat.^ .For matvarer vil det ofte være tilfelle at på det tidspunkt en rapport er avgitt, vil materialet som holdes på lager i påvente av rapporten ha fått en dårligere kvalitet. Det vil forståes at det er meget uokonomisk å lagre store mengder matvarer, ofte i kostbare kjolelagerhus, i len-gere perioder i påvente av en laboratorierapport vedrbren.de dens mi-kr obielle forurensning. Det er ennu mere uokonomisk hvis materialet tilslutt ikke består proven. The most significant disadvantage of the colony counting technique is the time required to obtain a result.^ .For foodstuffs, it will often be the case that by the time a report is issued, the material held in stock pending the report will have acquired a poorer quality. It will be understood that it is very uneconomical to store large quantities of food, often in expensive warehouses, for long periods pending a laboratory report regarding its microbial contamination. It is even more uneconomic if the material ultimately fails the exam.

En annen vanlig anvendt teknikk innen matvareteknologien er å farve et glassplatepreparat av matvaren med en farve såsom methylenblått og derefter undersoke den farvede prove under mikroskopet. Ulempen ved denne metode er at farvestoffet selv blir farvet og dan-ner en farvet bakgrunn mot hvilken mikroorganismene er vanskelig å oppdage. Metoden har en viss verdi ved en grovbestemmeIse av forurensning i prover med et hoyt nivå av mikrobiell forurensning. Ved lavere forurensningsgrader er proven unoyaktig.. Another commonly used technique in food technology is to color a glass plate preparation of the food with a color such as methylene blue and then examine the colored sample under the microscope. The disadvantage of this method is that the dye itself is colored and forms a colored background against which the microorganisms are difficult to detect. The method has a certain value for a rough determination of contamination in samples with a high level of microbial contamination. At lower levels of contamination, the test is inaccurate.

Innen den diagnostiske medisin er en kvalitativ teknikk kjent som "fluoxescens-antistoffteknikken" (F.A.T.) anvendt. Ved denne teknikk forbindes kjemisk et fluorokrom med antiserumet til en spesifikk gruppe mikroorganismer. Det f lu or okr orne merkede antiserum blandes med et ekstrakt fra materialet som skal undersokes, og en reaksjon finner sted som resulterer i at den spesielle gruppe mikroorganismer fluoriserer ved belysning. Selvom denne teknikk er nyt- txg ror xdentxfxsering av spesifikke grupper mikroorganismer, er den for spesifikk for kvantifisering av et materiales generelle inn-hold av mikroorganismer. Når teknikken innbefatter anvendelse av en våt film, vil mikroorganismenes bevegelse gjore telling vanskelig. 1" tillegg når den våte film undersokes under mikroskopet, vil dybde-skarphetsproblemer gjore tellingen vanskelig. Få mikroskopiske tek-nikker er effektive med hensyn til å skille mellom levende og ikke-levende mikroorganismer. In diagnostic medicine, a qualitative technique known as the "fluoxescence antibody technique" (F.A.T.) is used. In this technique, a fluorochrome is chemically linked to the antiserum of a specific group of microorganisms. The fluorescently labeled antiserum is mixed with an extract from the material to be examined, and a reaction takes place that results in the particular group of microorganisms fluorescing when illuminated. Although this technique is useful for identifying specific groups of microorganisms, it is too specific for quantifying a material's general content of microorganisms. When the technique involves the use of a wet film, the movement of the microorganisms will make counting difficult. 1" addition when the wet film is examined under the microscope, depth-of-field problems will make counting difficult. Few microscopic techniques are effective in distinguishing between living and non-living microorganisms.

En annen ulempe ved konvensjonelle koloni-tallmetoder er at kun levende celler telles, og der kjennes ingen praktisk metode som skjelner mellom levende mikroorganismer og ikke-levende typer. Another disadvantage of conventional colony count methods is that only living cells are counted, and there is no known practical method that distinguishes between living microorganisms and non-living types.

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å unngå eller nedsette de ovenfor nevnte ulemper. One purpose of the present invention is to avoid or reduce the above-mentioned disadvantages.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er tilveiebragt en fremgangsmåte for farvning av mikroorganismer som omfatter en kjemisk behandling av et preparat inneholdende mikroorganismene for å modifisere de farvemottagelige centra i mikroorganismene og fa.^ve det således behandlede prep£\rat med en farve. According to the present invention, a method for staining microorganisms is provided which comprises a chemical treatment of a preparation containing the microorganisms in order to modify the dye-receptive centers in the microorganisms and to color the thus treated preparation.

Modifisering av de farvemottagelige centra kan utfores ved hjelp av én. eller flere av de folgende kjemiske behandlinger av proven. Modification of the color-receptive centers can be carried out using one. or several of the following chemical treatments of the sample.

(1) methy lerin g(1) methyl lerin g

(2) esterifisering(2) esterification

(3) hydrolyse(3) hydrolysis

(4) oxydasjon, og(4) oxidation, and

(5) behandling med svoveldioxj^d.(5) treatment with sulfur dioxj^d.

Behandlingsmåtene (1) og (2) kan utfores ved å behandle en prove på en bærerplate med en etherisk opplosning av diazomethan eller med en svovelsyreester, fortrinnsvis under tids-, temperatur-og pH-kontroll. Treatment methods (1) and (2) can be carried out by treating a sample on a carrier plate with an ethereal solution of diazomethane or with a sulfuric acid ester, preferably under time, temperature and pH control.

Behandlingsmåtene (3) og (4) kan utfores ved å behandle en prove på en bærerplate med en syxe omfattende saltsyre, perklorsyre, perjodsyre, svovelsyre eller salpetersyre eller med et oxyderings-middel. Fortrinnsvis kontrolleres tiden, temperaturen og pH under behandlingen. Treatment methods (3) and (4) can be carried out by treating a sample on a carrier plate with a solution comprising hydrochloric acid, perchloric acid, periodic acid, sulfuric acid or nitric acid or with an oxidizing agent. Preferably, the time, temperature and pH are controlled during the treatment.

Behandling (5) kan utfores ved å utsette en prove på en bærerplate for en opplosning av svoveldioxyd eller et salt derav som er istand til å frigjore svoveldioxyd, eller med en opplosning av thionylklorid. Tid, temperatur og pH ved behandlingen kontrolleres fortrinnsvis. Treatment (5) can be carried out by exposing a sample on a carrier plate to a solution of sulfur dioxide or a salt thereof which is capable of liberating sulfur dioxide, or with a solution of thionyl chloride. Time, temperature and pH during treatment are preferably controlled.

Mellom trinn i metoden kan proven på platen vaskes med vann eller en pufferopplosning, fortrinnsvis under kontrollerte tids-, temperatur- og pl-I-betingelser. Between steps in the method, the sample on the plate can be washed with water or a buffer solution, preferably under controlled time, temperature and pl-I conditions.

Fremstillingen kan skje ved å påfore en væskeprove på en bærerplate, såsom et mikroskopobjektglass, en plastfilm eller en opak plate eller strimmel. For telling av mikroorganismene påfores et kjent volum av proven til et kjent areal på bærerplaten. Efter påforing av proven på platen får væsken inndampe ved den. omgivende temperatur eller ved forhoyet temperatur. The preparation can take place by applying a liquid sample to a carrier plate, such as a microscope slide, a plastic film or an opaque plate or strip. To count the microorganisms, a known volume of the sample is applied to a known area on the carrier plate. After applying the sample to the plate, the liquid is allowed to evaporate on it. ambient temperature or at elevated temperature.

I praksis påfores et enhetsvolum av væskeproven på bærerplaten, hvorefter væsken får fordampe enten naturlig eller ved til-foring av varme. Mikroorganismeceliene kan derefter fikseres til 'platen ved å oppvarme denne, eller ved neddypning i et opplosnings-middel såsom alkohol, aceton, aceton-alkoholopplosning, alkohol-ed-diksyreopplosning og formaldehyd, hvorefter det fikserte preparat torkes. In practice, a unit volume of the liquid sample is applied to the carrier plate, after which the liquid is allowed to evaporate either naturally or by applying heat. The microorganism cells can then be fixed to the plate by heating it, or by immersion in a solvent such as alcohol, acetone, acetone-alcohol solution, alcohol-acetic acid solution and formaldehyde, after which the fixed preparation is dried.

Fortrinnsvis, men ikke nodvendig, er farven en fluorokrom, eksempler på passende farver er lissamin-rhodamin B, acridinorange, primulin, methi^lenblått, acriflavin, eosin Y, auramin, rhodamin. B, rhodamin 3G, fluorescein og thionin. Farvningen kan enkelt utfores ved å neddyppe platen med proven i en. opplosning eller opplosninger av farven eller farvene, fjerne platen, vaske av overskudd av far-veopplosning eller opplosninger, og derefter torke platen i luft eller ved tilforsel av varme. Farvningen kan utfores under kontrollerte tids-, temperatur-, pH- og lysbetingeIser. Preferably, but not necessarily, the dye is a fluorochrome, examples of suitable dyes are lissamine-rhodamine B, acridine orange, primulin, methylene blue, acriflavin, eosin Y, auramine, rhodamine. B, rhodamine 3G, fluorescein and thionin. The staining can be easily carried out by immersing the plate with the sample in one. solution or solutions of the color or colors, remove the plate, wash off excess color solution or solutions, and then dry the plate in air or by applying heat. The staining can be carried out under controlled time, temperature, pH and light conditions.

Det farvede preparat und,ersokes under et mikroskop for telling eller studium av mikroorganismene deri. The colored preparation is examined under a microscope for counting or studying the microorganisms therein.

Ved valg av forskjellige trinn og ved valg av passende fluorokrom er det mulig å fremstille farvede preparater i hvilke levende og ikke-levende mikroorganismer fluoriserer ved forskjellige bbl-gelengder, hvilket gjor det mulig å telle ikke bare levende celler By choosing different steps and by choosing the appropriate fluorochrome, it is possible to prepare colored preparations in which living and non-living microorganisms fluoresce at different bbl gel lengths, which makes it possible to count not only living cells

(slik det er tilfelle for standard koloni-tallteknikk), men også ik-ke-levende celler. Tallet på ikke-levende celler er av betydning, idet det indikerer provens mikrobiologiske historie. F.eks. hvis en fabrikant skulle sterilisere en odelagt matvare, så ville en standard koloni-te Iling vise fravær av levende mikroorganismer, imidler- (as is the case for the standard colony count technique), but also non-viable cells. The number of non-living cells is important, as it indicates the sample's microbiological history. E.g. if a manufacturer were to sterilize an unopened food product, then a standard colony test would show the absence of live microorganisms, although

tid ville foreliggende metode vise at matvaren en gang hadde inne-holdt et antall mikroorganismer. For å telle mikroorganismene i time, the present method would show that the food had once contained a number of microorganisms. To count the microorganisms in

proven kan området av det farvede preparat skannes visuelt under mikroskopet fra topp til bunn, og fra side til side. Alternativt kan mikroorganismene telles ved hjelp av et bildeanalyserende system under anvendelse av en fotomultiplikatoravfolingsanordning, hvilket vil gi en tallmessig utlesning av enhetene, såsom mikroorganismer som fluoriserer ved en gitt bolgelengde. sample, the area of the stained preparation can be visually scanned under the microscope from top to bottom, and from side to side. Alternatively, the microorganisms can be counted using an image analyzing system using a photomultiplier detection device, which will give a numerical reading of the units, such as microorganisms that fluoresce at a given wavelength.

Oppfinnelsen vil beskrives ved det folgende eksempel. The invention will be described by the following example.

Eksempe1Example 1

1. a) en flate på 10 x 10 mm etses på glassplater (76 x 25 x x 0,'8 - 1 mm) 1. a) an area of 10 x 10 mm is etched on glass plates (76 x 25 x x 0.8 - 1 mm)

b) alternativt kan det etsede påforingsområde være 40 x 2,5 mm. 2. Glassplatene neddykkes over natten i en fersk 2 %'s opplosning av "RBS 25 + et vaskeaktivt middel. Under anvendelse av gummihansker bors tes platene forsiktig i opplosningen og skylles godt i koldt, og .derefter varmt vann. Platene torkes i en varm ovn på avdrypningsholdere i 10 - 15 minutter. Platene bor håndteres forsiktig for å sikre at fingre ikke kommer i kontakt med det etsede område. 3. o a) Kjottstykker med,vekt på 10 g ple fjernet aseptisk fra storre stykker, inokulert med proveorganismene og derefter svinget i 2 minutter for hånden i en mengde på ialf 100 ml "Ringer's"'Opplosning. b) 10lxI av den godt blandede prove plaseres i sentret av det etsede område og fordeles forsiktig under anvendelse av en fin, rett metalltråd for fullstendig å dekke det etsede område. b) alternatively, the etched overlay area may be 40 x 2.5 mm. 2. The glass plates are immersed overnight in a fresh 2% solution of "RBS 25 + a washing active agent. Using rubber gloves, the plates are carefully brushed in the solution and rinsed well in cold, then hot water. The plates are dried in a warm oven on drip trays for 10 - 15 minutes. The plates should be handled carefully to ensure that fingers do not come into contact with the etched area. 3. o a) Pieces of meat weighing 10 g ple removed aseptically from larger pieces, inoculated with the test organisms and then swirled for 2 minutes by hand in an amount of 100 ml of "Ringer's" solution. b) 10lxI of the well-mixed sample is placed in the center of the etched area and spread carefully using a fine, straight metal wire to completely cover it etched area.

c) Preparatet får torke 15 minutter ved 20°C.c) The preparation is allowed to dry for 15 minutes at 20°C.

d) Preparatet fikseres i 96 %'s ethylalkohol 10 minutter ved 20°C. e) Alkoholen helles av, og platen får tbrke 10 minutter ved 20°C. f) Preparatet farves med 0,01 % acriflavin i m/15 fosfet-buffer, pH 7,2<*>10 minutter ved 20°C. g) Preparatet renses forsiktig i rennende vann 15 sekunder. d) The preparation is fixed in 96% ethyl alcohol for 10 minutes at 20°C. e) The alcohol is poured off, and the plate is allowed to soak for 10 minutes at 20°C. f) The preparation is stained with 0.01% acriflavine in m/15 phosphate buffer, pH 7.2<*>10 minutes at 20°C. g) The preparation is carefully cleaned in running water for 15 seconds.

h) Proven. får avdryppe og torke 10 minutter ved 20°C.h) Evidence. allowed to drain and dry for 10 minutes at 20°C.

4. Preparatet eksamineres med efLeitz Ortboplan" mikroskop under anvendelse av et spesielt fluorit objektiv X40/0,85 for udekkede fluorescerende flekker, hvilket gav en total forstørrelse på 500X. En hbytrykks kvikksolvdamplampe 4. The preparation is examined with an efLeitz Ortboplan" microscope using a special fluorite objective X40/0.85 for uncovered fluorescent spots, which gave a total magnification of 500X. A high-pressure mercury vapor lamp

HB200 lyskilde ble anvendt med innfallende lys via en'Ploem" enhet under anvendelse av BG.12 3mm + BG38 som eksiterings-filtere. "Ploem" speil nr. 3 anvendes sammen med et sperre-fi Iter K530. HB200 light source was used with incident light via a 'Ploem' unit using BG.12 3mm + BG38 as excitation filters. 'Ploem' mirror No. 3 used together with a blocking filter Iter K530.

Farveprosedyren bor utfores i et svakt belyst rom. Hvis platen ikke skulle undersokes umiddelbart, eller være nodvendiq for ytterligere undersbkelser, bor den lagres mbrkt. Solskinn og kunst-lys vil forårsake en svekkelse av preparatets reaksjon. The coloring procedure should be carried out in a dimly lit room. If the plate is not to be examined immediately, or is necessary for further examinations, it should be stored safely. Sunshine and artificial light will cause a weakening of the preparation's reaction.

Levende celler i proven fluorescerer med en orange farve, mens ikke-levende celler fluorescerer gront. Living cells in the sample fluoresce with an orange colour, while non-living cells fluoresce green.

Cellene ble tellet visuelt under anvendelse av en skan-ningsteknikk på fSigende måte: Avhengig av antallet tilstedeværende bakterier i proven er antallet av undersokte felt generelt i området 16-40. Grunnen for dette valg av feltområder vil bli forklart i diskusjonen. Bevegel-sen mellom feltene bit. utfort i blinde for å sikre tilfeldig valg av feltene. The cells were counted visually using a scanning technique as follows: Depending on the number of bacteria present in the sample, the number of examined fields is generally in the range of 16-40. The reason for this choice of field areas will be explained in the discussion. Move between the fields bit. carried out blindly to ensure random selection of the fields.

Det midlere antall organismer pr. felt kan beregnes når man kjenner det totale antall bakterier tellet, og antall betraktede felt. Dette tall multipliseres med en faktor på 982 til å gi det totale antall bakterier i en IO jxl. Graden av presisjon for hver beregning ble bestemt under henvisning til tabellene i "Schedules of Precision, Cassel". The average number of organisms per fields can be calculated when you know the total number of bacteria counted, and the number of considered fields. This number is multiplied by a factor of 982 to give the total number of bacteria in an IO jxl. The degree of precision for each calculation was determined by reference to the tables in "Schedules of Precision, Cassel".

Eksempler på resultater er angitt i den efterfolgende tabell, som for sammenlignings skyld angir resultatene erholdt ved en koloni-te Iling på den samme prove. Examples of results are given in the following table, which, for the sake of comparison, indicates the results obtained with a colony on the same sample.

Tabellene 1-4 viser resultatene for koloni-telling og mikroskopitellinger (orange-fluorescerende celler) av kjottprbver inokulert med forskjellige provestammer. Kolonne A viser det midlere kolonitall pr. gram, og kolonne B viser standard avvikelse for denne verdi. Kolonne C viser det beregnede antall levende mikroorganismer erholdt ved teknikken ifolge foreliggende oppfinnelse, og kolonne D gir 90 % konfidensintervall for denne verdi. Kolonne E viser antall mikroorganismer tellet, og antall betraktede felt. Tables 1-4 show the results for colony counts and microscope counts (orange-fluorescent cells) of meat samples inoculated with different sample strains. Column A shows the average number of colonies per grams, and column B shows the standard deviation for this value. Column C shows the calculated number of living microorganisms obtained by the technique according to the present invention, and column D gives a 90% confidence interval for this value. Column E shows the number of microorganisms counted, and the number of fields considered.

Gjentatte tellinger av mikroorganismer ved platetelling under et mikroskop folger en Poisson-fordeling, men denne kan tilnær-mes med normalfordelingen når mere enn 15 organismer telles. Konfidensintervallet (kolonne D) angir med 90 % sannsynlighet grensen for de "sanne" verdier for mikroorganismer/gram fra de observerte verdier (kolonne C). Repeated counts of microorganisms by plate counting under a microscope follow a Poisson distribution, but this can be approximated with the normal distribution when more than 15 organisms are counted. The confidence interval (column D) indicates with 90% probability the limit of the "true" values for microorganisms/gram from the observed values (column C).

Det kan sees at jo storre det te Hede antall mikroorganismer er, desto mindre er verdien for 90 % konfidensintervallet, og desto storre er teknikkens presisjon. It can be seen that the greater the number of microorganisms, the smaller the value for the 90% confidence interval, and the greater the precision of the technique.

Reproduserbarheten av metoden ifolge oppfinnelsen er vist i tabell 1, eksperiment 1; tabell 2, eksperimentene 1, 2, 3; tabell 3, eksperimentene 1, 4, og tabell 4, eksperiment 1, hvor to eller flere preparater bJ.e tellet for hver prove. The reproducibility of the method according to the invention is shown in table 1, experiment 1; Table 2, Experiments 1, 2, 3; table 3, experiments 1, 4, and table 4, experiment 1, where two or more preparations were counted for each sample.

Kolonitalimetoden synes å gi mindre variasjon, uttrykt som s.tandard avvikelse, enn fremgangsmåten i.folge oppfinnelsen. Imidlertid kan ikke standard avvikelse og 90 % konfidensintervall sam-menlignes. Det kan sies at nøyaktigheten for platetelling ble under-streket på en kunstig måte ved å anvende 5 paralleller, en. situasjon som ikke finner sted ved rutinekvalitetskontrollfremgangsmåter. The colonial method seems to give less variation, expressed as standard deviation, than the method according to the invention. However, standard deviation and 90% confidence interval cannot be compared. It can be said that the accuracy of plate counting was artificially emphasized by using 5 parallels, a. situation that does not occur with routine quality control procedures.

Mange prover utviser en nær korrelasjon mellom midlere kolonitall og telling ved fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse, idet den sistnevnte alltid er innenfor de tilsvarende verdier for kolonnetall + standarawikelse. Many samples show a close correlation between mean colony numbers and counting by the method according to the present invention, the latter always being within the corresponding values for column numbers + standard deviation.

Generelt var tellingene oppnådd ved fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse hoyere enn de tilsvarende kolonnetall. Dette kan tilskrives: a) fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse vil bestemme enkeltmikroorganismene, mens kolonier kan avledes fra en enkelt mikroorganisme eller en gruppe bakterier. a) der er en viss sannsynlighet for at en. viss del av levende celler ikke vil vokse i laboratorievekstmedia, men •vil formere seg i forstoff. Dette er spesielt tilfelle for "stressede" bakterier og bakteriesporer. Disse en-heter er fremdeles levende og telles ved fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse. In general, the counts obtained by the method according to the present invention were higher than the corresponding column numbers. This can be attributed to: a) the method according to the present invention will determine the individual microorganisms, while colonies can be derived from a single microorganism or a group of bacteria. a) there is a certain probability that a. certain part of living cells will not grow in laboratory growth media, but •will multiply in precursor material. This is especially the case for "stressed" bacteria and bacterial spores. These units are still alive and are counted by the method according to the present invention.

For telling av mikroorganismer under anvendelse av mikro-skopteknikken ble våtpreparater og andre farveteknikker på fikserte preparater undersokt, men ble generelt funnet å være dårligere enn den beskrevne teknikk. Våtpreparater, og spesielt de hvori anvendes acridin orange i forskjellige puffere eller media kan være an-vendbare ved undersdkelse av vekst av bakterier eller gjærsopp, eller for studier av bakteriofager. Imidlertid, vanskelighetene ved fremstilling av mikroskoppreparater, sammen med dem som er forbun-det med dybdeskarphet og bevegelighet, gjor denne teknikk mindre egnet for automatisk skanning og telleteknikker. For counting microorganisms using the microscope technique, wet preparations and other staining techniques on fixed preparations were investigated, but were generally found to be inferior to the described technique. Wet preparations, and especially those in which acridine orange is used in various buffers or media, can be used for investigating the growth of bacteria or yeasts, or for studies of bacteriophages. However, the difficulties in preparing microscope slides, along with those associated with depth of field and mobility, make this technique less suitable for automatic scanning and counting techniques.

MikroskopiteIlinger av kjott eller vegetabilavvaskninger byr ikke på storre problemer med hensyn til bakgrunnfluorescens og fysikalsk maskering av fluorescerende mikroorganismer. Imidlertid andre matvarer, såsom melk eller eggepulver gav så hoy bakgrunnfluorescens at telling var vanskelig ved anvendelse av standard teknikk. Korte fikserings tider i alkohol med efterfolgende behandling i 2 %'s eddiksyre fjernet med hell slik bakgrunnsfluorescens. Uheldigvis vil denne fremgangsmåte også forårsake at mange mikroorganismer vaskes bort fra platen. I ytterligere forsok med neddyk-ning av preparatet i en "Coplin"'krukke med vann i 1 minutt efter behandling med alkohol-eddiksyre i 30 minutter indikerte at med modi-fikasjoner kan teknikken ifolge foreliggende oppfinnelse med hell anvendes for melk og eggbaserte næringsmidler. Microscopy of meat or vegetable washings does not present major problems with regard to background fluorescence and physical masking of fluorescent microorganisms. However, other foodstuffs, such as milk or egg powder, gave such a high background fluorescence that counting was difficult using standard techniques. Short fixation times in alcohol with subsequent treatment in 2% acetic acid successfully removed such background fluorescence. Unfortunately, this method will also cause many microorganisms to be washed away from the plate. In further experiments with immersion of the preparation in a "Coplin" jar with water for 1 minute after treatment with alcohol-acetic acid for 30 minutes, it was indicated that with modifications the technique according to the present invention can be successfully used for milk and egg-based foods.

Ved anvendelse av teknikken ifolge foreliggende fremgangsmåte ble der funnet at gamle kulturer, spesielt gramnegative staver, utviste en sterk orange fluorescens sammen med mbrkegront fluorescerende celler. Kulturer av gramnegative bakterier sterilisert ved kokning i 100°C i 30 minutter fluorescerte jevnt morkegront. D<-nne forandring fra orange til gronn fluorescens ble vist å stå i forhold til levbarheten av forsokskulturen. Selvom gamle kulturer av Staphylococcus aureus utviste både orange og gront fluorescerer.de celler, viste en varmebehandling av unge kulturer, ved kokning i 30 minutter, med efterfolgen.de farvning, at alle organismer fluorescerte orange. Imidlertid, en forbehandling med bufferopplosninger under prepareringen fjernet,slikt "falsk liv" reaksjoner. Forskjellen i reaksjonene mellom gramnegative og grampositive bakterier med hensyn til fluor-okromene viser viktige forskjeller med hensyn til sam-mensetning for de to grupper. When applying the technique according to the present method, it was found that old cultures, especially gram-negative rods, exhibited a strong orange fluorescence together with mbrkegront fluorescent cells. Cultures of Gram-negative bacteria sterilized by boiling at 100°C for 30 minutes fluoresced uniformly as plantain. This change from orange to green fluorescence was shown to be in relation to the viability of the trial culture. Although old cultures of Staphylococcus aureus exhibited both orange and green fluorescerer.de cells, a heat treatment of young cultures, by boiling for 30 minutes, with efterfolgen.de staining, showed that all organisms fluoresced orange. However, a pretreatment with buffer solutions during the preparation removed such "false life" reactions. The difference in the reactions between Gram-negative and Gram-positive bacteria with regard to the fluorochromes shows important differences with regard to composition for the two groups.

En fordel ved foreliggende oppfinnelse er den raskhet hvor-med resultatene kan erholdes.. Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen tar mindre enn 1 time for den aktuelle farvningsprosedyre, mens kon-vensjonell kolonite Iling krever flere dagers inkubasjon. Der eksi-.sterer også muligheten for å anvende et raskt optisk skannende instrument for å telle eller påvise fluorescerende celler. Ved å ju-stere bblgelengdefolsomheten for et slikt instrument vil det væie mulig å bestemme separat levende og ikke-levende celler. An advantage of the present invention is the speed with which the results can be obtained. The method according to the invention takes less than 1 hour for the staining procedure in question, while conventional colonite Iling requires several days of incubation. There also exists the possibility of using a fast optical scanning instrument to count or detect fluorescent cells. By adjusting the wavelength sensitivity of such an instrument, it will be possible to determine living and non-living cells separately.

Claims

1. Method for quantitative determination of microorganisms by counting, and coloring them, characterized by reacting the microorganisms with a dye, at least one of the reactants being chemically modified in advance to allow such a reaction.

2. Method according to claim 1, characterized by treating preparations containing the micro-organisms to modify colour-receiving centers in the micro-organisms and coloring the treated preparation with a dye.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized by subjecting the preparation to a chemical treatment which includes methylation, esterification, hydrolysis, oxidation or treatment with sulfuric acid.

4. Method according to claims 1 - 3, characterized in that the preparation containing the microorganisms is treated by applying a liquid sample to a carrier plate and then evaporating the liquid from the plate.

5. Method according to claim 4, characterized in that the sample is fixed to the carrier plate by heating or by treatment in a dissolution chamber 1.

6. Method according to claims 1-5, characterized in that the sample is colored with a fluorochrome dye.

7. "Procedure according to claims 1-6, characterized in that lissamine-rhodamine B, acridine orange, primulin, methylene blue, acriflavin, eosin Y, auramine, rhodamine B, rhodamine 3G, fluorescein or thionin are used as dyes.