DE2429380A1 - METHOD OF COUNTING AND COLORING MICRO-ORGANISMS - Google Patents
METHOD OF COUNTING AND COLORING MICRO-ORGANISMSInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zählung von Mikroorganismen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abschätzung des Gehaltes an mikrobiellen Verunreinigungen in Nahrungsmitteln oder in für die Herstellung von Nahrungsmitteln verwendeten Rohmaterialien. Jedoch ist das Gebiet der Anwendung der Erfindung nicht auf Nahrungsmittel begrenzt; die Erfindung kann in Jeder Situation angewandt werden, wo die Abschätzung von Mikroorganismen erforderlich ist, beispielsweise auf dem Gebiet der Fermentierung oder Gärung, der Hefeherstellung, der medizinischen Diagnose und der Herstellung von pharmazeutischen Produkten.The invention relates to a method for counting microorganisms. In particular, the invention relates to a method for estimating the content of microbial contaminants in food or in raw materials used in the manufacture of food. However that is Field of application of the invention not limited to food; the invention can be applied in any situation where the assessment of microorganisms is required, for example in the field of fermentation or Fermentation, yeast production, medical diagnosis and the manufacture of pharmaceutical products.
Das übliche, zur Bestimmung der Anzahl der Mikroorganismen In einem Material angewandte Verfahren umfaßt die Isolierung der Mikroorganismen aus dem Material und die KultivierungThe usual, to determine the number of microorganisms Methods used in a material include isolation the microorganisms from the material and the cultivation
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der Mikroorganismen auf einem Kulturmedium auf einer Platte. Die Zählung der Mikroorganismen nach diesem Koloniezählungsverfahren ist ein langwieriges Verfahren, welches unter normalen Umständen etwa zwei Tage für die Inkubierung in Anspruch -nimmt, was von der Art und der Anzahl der zu untersuchenden Mikroorganismen abhängig ist, jedoch ist es auch nicht ungewöhnlich bei einer Inkubierung, wenn sie eine Woche oder mehr dauert. Wenn die Inkubierung beendet ist, wird die Anzahl der Kolonien der Mikroorganismen auf den Platten visuell bestimmt. Dieses Koloniezählungsverfahren ist von sich aus ungenau, wobei die Fehler daher rühren, daß nicht sämtliche Mikroorganismen von dem zur Untersuchung stehenden Material gewonnen werden können. Einige werden während der Herstellung der Probe vor der Aufbringung auf das Kulturmedium getötet und auch die Kulturbedingungen während der Inkubierung können nicht für sämtliche Arten der Mikroorganismen in der Probe geeignet sein. Dadurch können einige der Arten keine Kolonien bilden und werden deshalb bei diesem Verfahren nicht abgeschätzt. Zusätzlich ist es bekannt, daß eine einzige Kolonie von dem Wachstum von mehr als einem Mikroorganismus herrühren kann.of the microorganisms on a culture medium on a plate. Microorganism enumeration by this colony enumeration method is a lengthy process which, under normal circumstances, takes about two days to incubate -takes what of the type and number of to be examined Microorganism dependent, however, it is also not uncommon for an incubation for a week or a week takes longer. When the incubation is over, the number of colonies of the microorganisms on the plates will be visualized certainly. This colony enumeration method is inherently imprecise, the errors arising from the fact that not all Microorganisms can be obtained from the material under investigation. Some are killed during the preparation of the sample before application to the culture medium, and the culture conditions during the incubation are not suitable for all types of microorganisms be suitable in the sample. As a result, some of the species cannot form colonies and are therefore not assessed in this method. In addition, it is known that a a single colony can result from the growth of more than one microorganism.
Bei weitem der signifikanteste Nachteil des Koloniezählungsverfahrens ist die zur Erzielung eines Ergebnisses erforderliche Zeitdauer. Es ist häufig der Fall bei einem Nahrungsmittel, daß zu dem Zeitpunkt, wo ein Analysenbericht angefordert wurde, das bis zum Eingang des Berichtes in Lagerung gehaltene Material sich hinsichtlich der Qualität verschlechtert hat. Es ist selbstverständlich, daß es äußerst unwirtschaftlich ist, große Mengen an Nahrungsmaterialien, häufig In teuren Gefrierhaueräumen, während längerer Zelträume während der Erwartung eines Laboratoriumsberichtes über deren mikrobielle Verunreinigung zu lagern. Es ist sogar besonders unwirtschaftlich, wenn das Material schließlichBy far the most significant disadvantage of the colony enumeration method is the amount of time it takes to get a result. It is often the case with food that at the time an analytical report was requested, until the report was received in storage held material has deteriorated in quality. It goes without saying that it is extremely uneconomical to have large quantities of food materials, often In expensive freezer rooms, during longer tent rooms to store while awaiting a laboratory report on their microbial contamination. It is even especially uneconomical when the material ends up
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bei dem Test versagt hat.failed the test.
Ein weiteres Üblicherweise in der Nahrungsmitteltechnologie angewandtes Verfahren besteht in der Färbung eines Glasträgerpräparates des Nahrungsmittels mit einem Farbstoff, wie ' Methylenblau ,und in der anschließenden mikroskopischen Untersuchung des gefärbten Abstriches. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß, da das Nahrungsmittel selbst gefärbt wird» es einen gefärbten Hintergrund bildet, gegen den die Mikroorganismen schwierig festzustellen sind. Das Verfahren hat einigen Wert als grobe Bestimmung der Verunreinigung in Proben mit hohen Werten von mikrobieller Verunreinigung. Bei niedrigen Verunreinigungswerten ist der Test ungenau.Another method commonly used in food technology is to color a glass slide preparation of the food with a dye such as 'Methylene blue, and in the subsequent microscopic examination of the stained smear. The disadvantage of this method is that, since the food itself is colored, it forms a colored background against which the microorganisms are difficult to identify. The method has some value as a rough determination of contamination in samples with high levels of microbial contamination. If the contamination levels are low, the test is inaccurate.
In der diagnostischen Medizin wird ein qualitatives Verfahren angewandt/ das als "Fluoreszenz-Antikörper-Verfahrenn (F.A.T.) bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird ein Fluorochrom chemisch mit dem Antiserum einer spezifischen.Gruppe von Mikroorganismen kombiniert. Das mit dem Fluorochrom gekennzeichnete Antiserum wird mit einem Extrakt aus dem Material unter Test vermischt und es findet eine Reaktion statt, welche die spezifische Gruppe der Mikroorganismen bei der Beleuchtung zum Fluoreszieren bringt. Obwohl dieses Verfahren zur Identifizierung spezifischer Gruppen von Mikroorganismen brauchbar ist, ist es zu spezifisch für die quantitative Bestimmung des allgemeinen mikrobiellen Gehaltes eines Materials. Falls die Verfahren die Anwendung eines feuchten Filmes umfassen, macht die Bewegung der Mikroorganismen die Zählung schwierig. Wenn weiterhin ein feuchter Film unter einem Mikroskop untersucht wird, machen Brennpunktstiefen-Probleme die Zählung schwierig. Wenige mikroskopische Verfahren sind wirksam zur Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nichtlebensfähigen Mikroorganismen.In diagnostic medicine, a qualitative method is applied / called "fluorescent antibody method n (FAT) is known. In this method, a fluorochrome is chemically combined with the antiserum a spezifischen.Gruppe of microorganisms. The antiserum labeled with the fluorochrome is mixed with an extract from the material under test and a reaction takes place which causes the specific group of microorganisms to fluoresce when illuminated.Although this method is useful for identifying specific groups of microorganisms, it is too specific for the quantitative determination of the general microbial content of a material. If the methods involve the application of a wet film, the movement of the microorganisms makes counting difficult. Furthermore, if a wet film is examined under a microscope, depth of focus problems make the counting difficult. Few microscopic methods n are effective in distinguishing between viable and non-viable microorganisms.
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Ein weiterer Nachteil der üblichen Koloniezählungsverfahren bei der Zählung von Mikroorganismen liegt darin, daß lediglich lebensfähige Zellen gezählt werden und es ist kein praktisches Verfahren bekannt, welches zwischen lebensfähigen Mikroorganismen und nichtlebensfähigen Typen unterscheidet.Another disadvantage of common colony enumeration methods in counting microorganisms is that only viable cells are counted and it is not practical method known which distinguishes between viable microorganisms and non-viable types.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Beseitigung oder Abschwächung der vorstehenden Nachteile.It is an object of the invention to obviate or mitigate the above disadvantages.
Gemäß der Erfindung ergibt sich ein Verfahren zur Färbung von Mikroorganismen, wobei chemisch die mikroorganismenhaltigen Präparate behandelt werden, um die Farbstoffrezeptorstellen in den Mikroorganismen zu modifizieren und die behandelten Präparate mit einem Farbstoff zu färben.According to the invention there is a method for coloring microorganisms, wherein the microorganism-containing preparations are chemically treated in order to modify the dye receptor sites in the microorganisms and to color the treated specimens with a dye.
Die Modifizierung der Farbstoffrezeptorstellen kann durch eine oder mehrere der folgenden chemischen Behandlungen der Probe bewirkt werden:The modification of the dye receptor sites can be carried out by one or more of the following chemical treatments are effected on the sample:
(1) Methylierung(1) methylation
(2) Veresterung(2) esterification
(3) Hydrolyse(3) hydrolysis
(4) Oxidation und(4) oxidation and
(5) Behandlung mit Schwefeldioxid.(5) Treatment with sulfur dioxide.
Die vorstehenden Behandlungen (1) und (2) können durch Behandlung der Proben auf der Trägerplatte mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan oder mit einem Schwefelsäureester, vorzugsweise unter Kontrolle von Zeit, Temperatur und pH-Wert, durchgeführt werden.The above treatments (1) and (2) can be carried out by treating the samples on the carrier plate with an ethereal solution of diazomethane or with a sulfuric acid ester, preferably with control of time, temperature and pH.
Die vorstehenden Behandlungen (3) und (4) können durch Behandlung der Probe auf der Trägerplatte mit Salzsäure, Per-The above treatments (3) and (4) can be carried out by treating the sample on the carrier plate with hydrochloric acid, per-
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chlorsäure, Perjodsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure als Säure oder mit einem oxidierenden Mittel durchgeführt werden. Vorzugsweise werden hierbei Zeit, Temperatur und pH-Wert der Behandlung gesteuert.chloric acid, periodic acid, sulfuric acid or nitric acid be carried out as an acid or with an oxidizing agent. Time, temperature and Treatment pH controlled.
Die Behandlung (5) kann durch Aussetzung der Probe auf der Trägerplatte an eine Lösung von Schwefeldioxid oder einem Salz hiervon, welches zur Freisetzung von Schwefeldioxid fähig ist, oder einer Lösung von Thionylchlorid bewirkt werden. Zeit, Temperatur und pH-Wert der Behandlung werden vorzugsweise gesteuert.The treatment (5) can be carried out by exposing the sample on the carrier plate to a solution of sulfur dioxide or a Salt thereof, which is capable of releasing sulfur dioxide, or a solution of thionyl chloride. The time, temperature and pH of the treatment are preferably controlled.
Zwischen den Stufen des Verfahrens kann die Probe auf der Platte in Wasser oder einer Pufferlösung, vorzugsweise unter gesteuerten Bedingungen von Zelt, Temperatur und pH-Wert,gewaschen werden.Between the steps of the method, the sample can be applied to the plate in water or a buffer solution, preferably under controlled conditions of tent, temperature and pH, to be washed.
Das Präparat kann durch Auftragung einer flüssigen Probe auf die Trägerplatte, beispielsweise einen Hikroskopträger, eine Kunststoffolie oder eine opakte Platte oder einen derartigen Streifen hergestellt werden. Zur Zählung der Mikroorganismen wird ein bekanntes Volumen der Probe auf einem bekannten Bereich der Trägerplatte aufgetragen. Nach der Auftragung der Probe auf die Platte wird die Flüssigkeit der Abdampfung bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur überlassen.The preparation can by applying a liquid sample to the carrier plate, for example a microscope carrier, a Plastic film or an opaque plate or such a strip can be produced. For counting the microorganisms a known volume of the sample is applied to a known area of the carrier plate. After applying the Sample on the plate, the liquid is left to evaporate at room temperature or elevated temperature.
In der Praxis wird ein Einheitsvolumen einer flüssigen Probe auf der Trägerplatte aufgetragen und die Flüssigkeit der Verdampfung entweder von selbst oder unter Anwendung von Wärme überlassen. Die Zellen der Mikroorganismen können dann auf dem Träger durch Erhitzen desselben oder durch Eintauchung in ein Lösungsmittel wie Alkohol, Aceton, Aceton-Alkohollösungen, Alkohol-Essigsäurelösungen, und Formaldehyd fixiert werden, worauf anschließend das fixierte Präparat getrocknet wird.In practice, a unit volume of a liquid sample is applied to the carrier plate and the liquid is the Let evaporation either by itself or with the application of heat. The cells of the microorganisms can then the support by heating it or by immersion in a solvent such as alcohol, acetone, acetone-alcohol solutions, Alcohol-acetic acid solutions, and formaldehyde are fixed, after which the fixed preparation is then dried.
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Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise,ist der Farbstoff ein Fluorochrom und Beispiele für geeignete Farbstoffe sind Lissamine-Rhodamin B, Acridinorange, Primulin, Methylenblau, Acriflavin, Eosin Y, Auramin, Rhodamin B, Rhodamin 30, Fluorescein und Thionin. Die Färbung kann einfach durch Eintauchung in eine Lösung eines Farbstoffes oder Lösungen von Farbstoffen der probetragenden Platte, Abnahme der Platte, Abwaschung des Überschusses der Farbstofflösungen und Behandlung der Platte in Luft oder durch Anwendung von Wärme erfolgen. Die Färbung kann unter gesteuerten Zeit-, Temperatur-, pH- und Lichtbedingungen ausgeführt werden.Preferably, but not necessarily, the dye is a fluorochrome and examples of suitable dyes are lissamine-rhodamine B, acridine orange, primulin, methylene blue, acriflavine, eosin Y, auramine, rhodamine B, rhodamine 30, fluorescein and thionin. The coloring can be done simply by immersion in a solution of a dye or solutions of dyes of the sample-bearing plate, removing the plate, washing off the excess of the dye solutions and treating the plate in air or by applying heat. The staining can be carried out under controlled time, temperature, pH and light conditions.
Das gefärbte Präparat wird unter einem Mikroskop zur Zählung oder Studierung der darin enthaltenen Mikroorganismen untersucht.The colored preparation is examined under a microscope to count or study the microorganisms it contains.
Durch Wahl der verschiedenen Stufen und durch Wahl eines geeigneten Fluorochroms ist es möglich, ein gefärbtes Präparat herzustellen, worin lebensfähige Mikroorganismen und nichtlebensfähige Mikroorganismen bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren, so daß es möglich wird, nicht nur lebende Zellen, wie bei dem Standard-Koloniezählungsverfahren, sondern auch nichtlebensfähige Zellen zu zählen. Die Zählung der nichtlebensfähigen Zellen ist insofern von Bedeutung, als sie die mikrobiologische Historie der Probe angibt. Falls beispielsweise ein Hersteller ein verdorbenes Nahrungsmittel sterilisieren mußte, dann würde eine Standard-Koloniezählung die Abwesenheit von lebensfähigen Mikroorganismen zeigen. Nach-dem vorliegenden Verfahren würde sich jedoch hierbei ergeben, daß zu einem bestimmten Zeitpunkt das Nahrungsmittel zahlreiche Mikroorganismen enthalten hat.By choosing the different levels and choosing a suitable fluorochrome, it is possible to produce a colored specimen to produce wherein viable microorganisms and non-viable microorganisms fluoresce at different wavelengths so that it becomes possible to identify not only living cells, as in the standard colony counting method, but also to count non-viable cells. The count of the non-viable cells is important in that it indicates the microbiological history of the sample. For example, if a manufacturer has spoiled food had to sterilize, then a standard colony count would show the absence of viable microorganisms. According to the present method, however, the result would be that at a certain point in time the food has contained numerous microorganisms.
Zur Zählung der Mikroorganismen in der Probe kann die Fläche des gefärbten Präparates visuell unter dem Mikroskop vonTo count the number of microorganisms in the sample, the area of the colored specimen can be viewed visually under the microscope from
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oben bis zum Boden und der Seite zur Seite gerastert werden. Andererseits können die Mikroorganismen mittels eines Bildanalysier syst emes unter Anwendung einer Photomultiplizierabfühleinrichtung gezählt werden, welche eine Digitalablesung der Einheit, beispielsweise Mikroorganismen, welche bei einer gegebenen Wellenlänge fluoresziert, liefert.be gridded up to the bottom and the side to the side. On the other hand, the microorganisms can be counted by means of an image analyzing system using a photomultiplier sensing device which provides a digital reading of the unit, for example microorganisms which are at fluoresces at a given wavelength.
Die Erfindung wird nachfolgend zur Erläuterung anhand des folgenden Beispieles erklärt.The invention is explained below with reference to the explained in the following example.
1. a) Ein Bereich von 10 mm im Quadrat wird auf einer Glasscheibe (76 χ 25 x 0,8 bis 1,0 mm dick) geätzt, b) Alternativ kann der beätzte Bereich der Auftragung 40 mm χ 2,5 mm sein.1. a) An area 10 mm square is etched on a sheet of glass (76 χ 25 x 0.8 to 1.0 mm thick), b) Alternatively, the etched area of the application can be 40 mm 2.5 mm.
2. Die Träger werden über nacht in eine frische 2#ige Lösung von RBS 25 + Reinigungsmittel eingetaucht. Unter Anwendung von Kautschukhandschuhen werden die Träger mäßig in der Lösung gebürstet und gut in kaltem und dann in heißem Wasser gespült. Die Träger werden in einem warmen Ofen auf Ablaufgesteilen während 10 bis 15 min getrocknet. Die Träger müssen sorgfältig gehandhabt werden, um sicherzustellen, daß die Finger nicht in Kontakt mit dem geätzten Bereich kommen.2. The slides are immersed in a fresh 2 # solution of RBS 25 + detergent overnight. Under Using rubber gloves, the wearer is brushed moderately in the solution and well in cold and well then rinsed in hot water. The carriers are placed in a warm oven on drain racks for 10 to Dried for 15 min. The carriers must be handled carefully to ensure that the fingers do not come into contact with the etched area.
3. a) FleischstUcke mit einem Gewicht von 10 g wurden aseptisch von einem größeren Stück geschnitten, mit Testorganismen inokuliert und dann während 2 min mittels - Hand in einer Gesamtmenge von 100 ml Ringer-Lösung3. a) Pieces of meat weighing 10 g were aseptically cut from a larger piece, inoculated with test organisms and then for 2 minutes by means of - Hand in a total of 100 ml of Ringer's solution
verquirlt.whisked.
b) 10 Mikroliter der gut vermischten Probe wurden in die Mitte des geätzten Bereiches gebracht und sorgfältig unter Anwendung eines feinen geraden Drahtes ausgebreitet, um vollständig den geätzten Bereich zu be-b) 10 microliters of the well mixed sample was added to the Center of the etched area and carefully spread out using a fine straight wire to completely cover the etched area.
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decken.cover.
c) Das Präparat wurde 15 min bei 2CK der Trocknung überlassen.c) The preparation was left to dry for 15 min at 2CK.
d) Es wurde in 96tfigem Äthylalkohol während 10 min bei 2CK fixiert.d) It was fixed in 96tfigem ethyl alcohol for 10 min at 2CK.
e) Es wurde ablaufen gelassen und 10 min bei 2CK trocken gelassen.e) Drain and dry at 2CK for 10 min.
f) Es wurde mit 0,01 % Acriflavin in tpr-Phosphatpuffer, pH 7,2 während 10 min bei 2CK gefärbt.f) It was stained with 0.01% acriflavin in tpr phosphate buffer, pH 7.2 for 10 min at 2CK .
g) Es wurde mäßig in laufendem Wasser während 15 sek gespült.g) It was moderately rinsed in running water for 15 seconds.
h) Es wurde ablaufen gelassen und 10 min bei 20Ό getrocknet.h) It was allowed to run off and dried for 10 min at 20Ό.
4. Das Präparat wurde mit einem Leitz-Orthoplan-Mikroskop unter Anwendung des Spezialfluorit-Objektivs X 40/0,85 für unabgedeckte fluoreszierende Abstriche, das eine Gesamtvergrößerung von 500X ergab, untersucht. Eine Hochdruckquecksilberdampflampe HB200 wurde als Lichtquelle verwendet, mit auffallender Beleuchtung über die Ploea-Einheit unter Verwendung von BG12 3 mm + BG38 als Exzitationsfilter. Der Ploem-Spiegel Nr. 3 wurde zusammen mit dem Sperrfilter K53O verwendet.4. The specimen was taken with a Leitz Orthoplan microscope using the special fluorite objective X 40 / 0.85 for uncovered fluorescent smears, the one Overall magnification of 500X was examined. A HB200 high pressure mercury vapor lamp was used as the light source, with conspicuous lighting across the ploea unit using BG12 3mm + BG38 as an excitation filter. The Ploem Mirror No. 3 was used together with the blocking filter K53O.
Das Färbungsverfahren sollte in einem schwach beleuchteten Raum ausgeführt werden. Falls der Träger nicht unmittelbar untersucht werden soll und für weitere Untersuchung erforderlich ist, muß er im Dunkeln gelagert werden. Sonnenlicht oder künstliches Licht würde eine Verblassung der Reaktion des Präparates verursachen.The staining process should be carried out in a dimly lit room. If the carrier does not immediately is to be examined and is required for further examination, it must be stored in the dark. Sunlight or artificial light would cause the reaction of the preparation to fade.
Die lebensfähigen Zellen In der Probe fluoreszierten mit oranger Farbe, während die nichtlebensfähigen Zellen grün waren.The viable cells in the sample also fluoresced orange in color, while the non-viable cells were green.
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Die Zellen wurden unter Anwendung der Rastertechnik in folgender Weise gezählt:The cells were scanned using the scanning technique in the following Way counted:
In Abhängigkeit von der Anzahl der in der Probe vorhandenen ■Bacterien lag die Anzahl der untersuchten Felder allgemein 'zwischen 16 und 40. Der Grund für die Auswahl dieses Bereiches der Felder wird in der Diskussion erläutert. Die Bewegung zwischen den Feldern wurde blind ausgeführt, um eine wahllose Wahl der Felder sicherzustellen.Depending on the number of those present in the sample ■ Bacteria, the number of fields examined was general 'between 16 and 40. The reason for choosing this range of fields will be explained in the discussion. The movement between the fields was carried out blind to ensure a random choice of fields.
Die mittlere Anzahl an Organismen je Feld kann unter Kenntnis der gesamten Anzahl der gezählten Bacterien und der Anzahl der untersuchten Felder berechnet werden. Dieser Wert wird mit einem Faktor von 982 multipliziert, um die gesamte Anzahl der Bacterien in 10 /ul zu erhalten. Das Ausmaß der Genauigkeit jeder Berechnung wurde unter Bezugnahme auf die Tabellen von Schedules of Precision, Cassel, bestimmt.The mean number of organisms per field can be calculated with knowledge of the total number of bacteria counted and the number of the examined fields can be calculated. This value is multiplied by a factor of 982 to get the total Get the number of bacteria in 10 / ul. The extent of the Accuracy of each calculation was determined with reference to the tables of Schedules of Precision, Cassel.
Beispiele der Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen angegeben, welche zum Vergleich die bei einer Koloniezählung der gleichen Probe erhaltenen Ergebnisse angeben.Examples of the results are in the tables below indicated which, for comparison, were those in a colony count report the results obtained on the same sample.
Die Tabellen I bis IV zeigen die Ergebnisse von Koloniezählungen und Mikroskopzählungen (orange-fluoreszierende Zellen) von Fleischproben, welche mit unterschiedlichen Teststämmen inokuliert wurden. Die Spalte A zeigt die mittlere Koloniezählung je g und die Spalte B zeigt die Standardabweichung dieses Wertes. Die Spalte C zeigt die berechnete Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen nach dem Verfahren gemäß der Erfindung und die Spalte D gibt den 9056-Zuverlässigkeitsabstand dieses Wertes an. Die Spalte E zeigt die Anzahl der gezählten Mikroorganismen und die Anzahl der untersuchten Felder. Tables I to IV show the results of colony counts and microscope counts (orange fluorescent cells) of meat samples inoculated with different test strains. Column A shows the mean colony count each g and column B shows the standard deviation of this value. Column C shows the calculated number of viable Microorganisms according to the method according to the invention and column D gives the 9056 confidence interval this value. Column E shows the number of counted Microorganisms and the number of fields examined.
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2 4 2 93 8 C - ίο - 2 4 2 93 8 C - ίο -
Die Replikate der Plattenzählungen ergeben eine normale Verteilung der Mikroorganismen gemäß dem Poisson-System, können jedoch die normale Verteilung angenähert erreichen, wenn mehr als 15 Organismen gezählt werden. Der Zuverlässigkeitsab- -stand (Spalte D) sagt mit 90 % Wahrscheinlichkeit die Grenzen der "wahren" Werte der Mikroorganismen je g aus dem beobachteten Wert (Spalte C) an.The replicates of the plate counts show a normal distribution of the microorganisms according to the Poisson system, but can approximate the normal distribution if more than 15 organisms are counted. The reliability distance (column D) indicates the limits of the “true” values of the microorganisms per g from the observed value (column C) with a 90% probability.
Es ist ersichtlich, daß, je höher die Anzahl der gezählten Mikroorganismen ist, desto kleiner der Wert des 90 %-Zuverlässigkeitsabstandes ist und desto größer die Genauigkeit des Verfahrens wird.It can be seen that the higher the number of microorganisms counted, the smaller the value of the 90 % confidence interval and the greater the accuracy of the method.
Die Reproduzierbarkelt des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich aus Tabelle I, Versuch 1, Tabelle II, Versuch 1, 2, 3, Tabelle III, Versuch 1, 4 und Tabelle IV, Versuch 1, wo zwei oder mehr Präparate für jede Probe gezählt wurden.The reproducibility of the method according to the invention results from Table I, Experiment 1, Table II, Experiment 1, 2, 3, Table III, Experiment 1, 4 and Table IV, Experiment 1, where two or more preparations were counted for each sample.
297297
Versuchattempt
11,4 χ 106 +0,711.4 χ 10 6 +0.7
11,2 χ 10* 10,0 χ 10*11.2 χ 10 * 10.0 χ 10 *
D) 90%-Zuverläs- E) Anzahl an gezählten
slgkeltsabstand, Bacterlen und Feldern D) 90% reliability E) Number of counted
slgkeltsistant, bacteria and fields
: 17: 17
+ 1,34 (+ 12 #)
+ 1,20 (+ 12 96)+ 1.34 (+ 12 #)
+ 1.20 (+ 12 96)
: 16: 16
kontrollemeat
control
- 6,6 χ 101.0 χ 10 2 2
- 6.6 χ 10
4 χ 103 less than
4 χ 10 3
ro -fr roro -fr ro
Ps. Fluores- A) Mittel/g B) S.D. zenz Ps. Fluores- A) mean / g B) S.D. zenz
O CO OO OOO CO OO OO
C) Anzahl/gC) number / g
2,17 x 1OC
1,60 χ 10* 2.17 x 10 C
1.60 χ 10 *
D) 90#-Zuverläs- E) Anzahl an gezählten sigkeitsabstand Bacterien u. Feldern D) 90 # reliability E) Number of counted liquid distance bacteria and fields
+ 0,36 (+ 15 %) + 0,32 (+ 20 %) + 0.36 (+ 15 %) + 0.32 (+ 20 %)
: 40 : 32: 40 : 32
9,7 x 105 8.6 χ 10 5
9.7 x 10 5
3,13.1
32 %) 32 %)
2424
: 27: 27
4,25 x 105 4.25 x 10 5
1,511.51
31 %) 31 %)
2626th
: 34: 34
kontrollecontrol
4 χ 103 less than
4 χ 10 3
ro j> ro ro j> ro
CO CO OO OCO CO OO O
Staph.
aureuoStaph.
aureuo
Fleischkontrolle Meat control
KoloniezählungColony count
Zählung nach dem erfindungsgemäßen VerfahrenCounting according to the method according to the invention
A) Mittel/g B) S.D. C) Anzahl/gA) Medium / g B) S.D. C) number / g
Versuch 1 1,21 χ 10° t 0,27Trial 1 1.21 χ 10 ° t 0.27
1,95 X 1ÖC 1,92 x 10*1.95 X 1Ö C 1.92 x 10 *
D) 90^-Zuverläs- E) Anzahl an gezählten sigkeltsabstand Bacterlen u. Feldern D) 90 ^ -Zuverläs- E) Number of counted signal spacing bacteria and fields
+ 0,30 (+ 18 %)
+ 0,38 (+22 %y. + 0.30 (+ 18 %)
+ 0.38 (+ 22 % y.
6,0 χ6.0 χ
weniger als
χ 103 less than
χ 10 3
78 : 24 54 : 17 78: 24 54: 17
CD
OOO
CD
OO
0 :' 300: '30
Bacillus sp.Bacillus sp.
Versuch 1Attempt 1
5,9 x5.9 x
+ 1,8+ 1.8
C) Anzahl/gC) number / g
1,58 χ ΙΟΙ, 97 x 10! 1.58 χ ΙΟΙ, 97 x 10 !
D) 9096-Zuverläs- E) Anzahl an gezählten sigkeltsabstand Bacterien u. FeldernD) 9096-Reliable E) Number of counted sigkeltsistant bacteria and fields
(50 96) (50 %) (50 96) (50 %)
6 : 38 6 : 286:38 6:28
Versuch 2 4,2 χExperiment 2 4.2 χ
+ 0,6+ 0.6 5,4 χ 3,96 χ5.4 χ 3.96 χ
(50 96) (50 96)(50 96) (50 96)
2 : 36 2 : 452:36 2:45
co Fleischkontrolle co meat inspection
2x2x weniger als 4 χ 103 less than 4 χ 10 3
0 : 300:30
242S38C242S38C
Die Koloniezählungsmethode scheint eine geringere Variierung im Hinblick auf die Standardabweichung zu ergeben als das erfindung^gemäße Verfahren. Jedoch sind Standardabweichung und 90#-Zuverl&ssigkeitsabstand nicht vergleichbar. Es ist noch darauf hinzuweisen» daß die Genauigkeit der PlattenzShlung künstlich durch Anwendung von fünf Replikaten künstlich erhöht wurde, eine Situation, die bei Poutine-Qualitätskontrollverfahren nicht vorkommt.The colony counting method appears to give less variation in standard deviation than the method according to the invention. However, the standard deviation and the 90 # confidence interval are not comparable. It should also be pointed out that the accuracy of the Plate count was artificially increased by applying five replicas, a situation that occurred with Poutine quality control procedure does not occur.
Zahlreiche Proben zeigten eine enge Beziehung zwischen den mittleren Koloniezählungen und der Zählung nach dem Verfahren gemäß der Erfindung, wobei die letztere stets innerhalb der entsprechenden Werte von Koloniezählung + Standardabweichung lag.Numerous samples showed a close relationship between the mean colony counts and the count by the method according to the invention, the latter always within the corresponding values of colony count + standard deviation.
Im allgemeinen war die Zählung unter Anwendung gemäß der Erfindung höher als die entsprechende Koloniezählung. Das kann auf folgende Gründe zurückzuführen sein:In general, the enumeration used was in accordance with Invention higher than the corresponding colony count. This can be due to the following reasons:
(a) Das erfindungsgemäße Verfahren schätzt die Mikroorganismen einzeln ab, während die Kolonien von einem einzigen Mikroorganismus oder einer Gruppe von Bacterien herstammen können.(a) The method according to the invention estimates the microorganisms individually, while the colonies of a single one Microorganism or a group of bacteria.
(b) Es besteht die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmter Betrag von lebensfähigen Zellen nicht in Laboratoriumsgewinnungsmedien wächst, sich jedoch in Nahrungsmitteln vermehren kann. Dies 1st besonders zutreffend für "einem Stress unterzogene11 Bacterien und Bacteriensporen. Diese Einheiten sind noch lebensfällig und werden nach dem Verfahren gemäß der Erfindung gezählt.(b) There is a likelihood that a certain amount of viable cells will not grow in laboratory recovery media but can multiply in food. This 1st especially true for "a stress subjected to 11 bacteria and Bacteriensporen. These units are still alive and due to the invention are by the method of counted.
"40988471 297"40988471 297
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Mikroskopverfahren wurden auch Feuchtpräparate und die anderen Färbungsverfahren auf fixierten Präparaten untersucht, jedoch wurde gefunden, daß sie allgemein schlechter als das beschriebene Verfahren sind. Feuchte Präparate und insbesondere solche unter Anwendung von Acridinorange in verschiedenen Puffern oder Medien können auf die Untersuchung des Wachstums von Bacterien oder Hefen oder für das Studium von Bacteriophagen anwendbar sein. Jedoch machen Schwierigkelten bei der Präparierung der Träger zusammen mit den mit der Tiefe der Focussierung und der Beweglichkeit auftretenden Schwierigkeiten dieses Verfahren weniger für die automatischen Rasterungs- und Zählverfahren geeignet.Microscope methods were also used to examine wet specimens and the other staining methods on fixed specimens, however, they have been found to be generally inferior to the method described. Moist preparations and especially those using acridine orange in various buffers or media can be used for the examination the growth of bacteria or yeasts or for the study of bacteriophages. However do Together with the difficulties associated with depth of focus and mobility, this procedure was less of a difficulty in preparing the slides suitable for automatic screening and counting processes.
Mikroskopische Auszählungen von Fleischauswaschungen oder pflanzlichen Auswaschungen ergeben keine großen Probleme hinsichtlich der Hintergrundfluoreszenz und der physikalischen Maskierung der fluoreszierenden Mikroorganismen. Jedoch ergaben andere Nahrungsmittel wie Milch oder Eipulver eine solch hohe Hintergrundfluoreszenz, daß Zählungen unter Anwendung des Standardverfahrens schwierig waren. Kurze Fixierungszeiten in Alkohol mit anschließender Behandlung in 2#iger Essigsäure entfernten jedoch erfolgreich diese Hintergrundfluoreszenz. Leider verursacht dieses Verfahren auch, daß zahlreiche Mikroorganismen von dem Träger gewaschen werden. Bei weiteren Versuchen ergab die Eintauchung des Präparates in einen Coblin-Behälter mit Wasser während 1 min nach der Behandlung mit Alkohol-Essigsäure während 30 min, daß mit Modifizierungen das Verfahren gemäß der Erfindung auch erfolgreich auf Nahrungsmittel auf Milch- und Eibasis angewandt werden kann.Microscopic counts of meat or vegetable washings do not pose much of a problem in terms of background fluorescence and the physical masking of the fluorescent microorganisms. However, other foods such as milk or powdered eggs gave such high background fluorescence that counts were difficult using the standard procedure. However, short fixation times in alcohol with subsequent treatment in 2% acetic acid successfully removed this background fluorescence. Unfortunately, this process also causes numerous microorganisms to be removed from the Carriers are washed. In further experiments, immersion of the preparation in a Coblin container also revealed Water for 1 min after the treatment with alcohol-acetic acid for 30 min, that with modifications the method according to the invention can also be successfully applied to foods based on milk and egg.
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Unter Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung wurde festgestellt, daß alte Kulturen, insbesondere gram-negative Stäbe, eine helle orange Fluoreszenz zusammen mit dumpfgrün fluoreszierenden Zellen zeigten. Kulturen von gramnegativen Bacterien, welche durch Erhitzen auf 10OC während 30 min sterilisiert waren, fluoreszierten einheitlich dunkelgrün. Diese Änderung von oranger zu grüner Fluoreszenz zeigte sich in Beziehung zur Lebensfähigkeit der Testkultur stehend. Während alte Kulturen von Staphylococcus aureus sowohl orange als auch grün fluoreszierende Zellen zeigten, ergab sich bei der Wärmebehandlung einer jungen Kultur durch Erhitzen während 30 min mit anschließender Färbung, daß sämtliche Organismen orange fluoreszierend waren. Jedoch beseitigte eine Vorbehandlung der Präparate mit Pufferlösungen diese "falsch-lebensfähigen" Reaktionen. Die Unterschiedlichkelten der Reaktionen zwischen gram-negativen und gram-positiven Bacterien zu den Fluorochromen zeigten wichtige kompositioneile Unterschiedlichkeiten zwischen den beiden Gruppen.Using the method according to the invention found that old cultures, particularly gram negative rods, exhibited bright orange fluorescence along with dull green fluorescent cells. Cultures of gram-negative bacteria, which had been sterilized by heating to 10OC for 30 min, fluoresced uniformly dark green. This change from orange to green fluorescence was related to the viability of the Test culture standing. While ancient cultures of Staphylococcus aureus showed both orange and green fluorescent cells, heat treatment resulted in one young culture by heating for 30 min with subsequent staining that all organisms were fluorescent orange. However, pretreatment of the preparations with buffer solutions eliminated these "false-viable" reactions. The differences in the reactions between gram-negative and gram-positive bacteria to the Fluorochromes showed important compositional differences between the two groups.
Ein Vorteil der Erfindung ist die Schnelligkeit, womit die Ergebnisse erhalten werden können. Das Verfahren gemäß der Erfindung benötigt weniger als 1 Std. für das tatsächliche Färbungsverfahren, während bei der üblichen Koloniezählung einige Tage der Inkubierung erforderlich sind. Es besteht auch die Möglichkeit der Anwendung eines raschen optischen Rasterinstrumentes zur Zählung oder Feststellung der fluoreszierenden Zellen. Durch Einstellung der Wellenlängenempfindlichkeit eines derartigen Instrumentes wird es möglich, getrennt lebensfähige und nichtlebensfähige Zellen zu bestimmen.An advantage of the invention is the speed with which the Results can be obtained. The method according to the invention takes less than 1 hour for the actual one Staining procedure while in the usual colony count a few days of incubation are required. There is also the possibility of using a rapid optical Scanning instrument for counting or determining the fluorescent cells. By adjusting the wavelength sensitivity of such an instrument, it becomes possible to separate viable and non-viable cells to determine.
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