DE2728077A1 - METHOD OF COLORING MICRO-ORGANISMS - Google Patents
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Description
Patentanwälte Dipl.-Ing.W.Scherrmann Dr.-Ing.R.Rüger OO Esslingen (Neckar), Vebergasse 3, Postfach 348Patent attorneys Dipl.-Ing.W.Scherrmann Dr.-Ing.R.Rüger OO Esslingen (Neckar), Vebergasse 3, PO Box 348
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Verfahren zum Färben von MikroorganismenProcess for coloring microorganisms
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Färben von Mikroorganismen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abschätzung des Ausmaßes an mikrobieller Verunreinigung in Nahrungsmitteln oder zur Herstellung von Nahrungsmitteln verwendeten Rohstoffen. Jedoch ist das Anwendungsgebiet der Erfindung nicht auf das Nahrungsmittelgebiet begrenzt* sie kann in sämtlichen Umständen angewandt werden, wo die Abschätzung von Mikroorganismen gefordert wird, beispielsweise in der Gärindustrie, der Hefeherstellung, bei der medizinischen Diagnose und bei der Herstellung von pharmazeutischen Produkten,The invention relates to a method for coloring microorganisms. In particular, the invention relates to a method for estimating the level of microbial contamination Raw materials used in food or in the production of food. However, the field of application is the Invention not limited to the food field * it can be used in all circumstances where the estimation is required of microorganisms, for example in the fermentation industry, yeast production, in medical Diagnosis and in the manufacture of pharmaceutical products,
Das Übliche zur Bestimmung der Anzahl der Mikroorganismen InThe usual way of determining the number of microorganisms In
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einem Material angewandte Verfahren umfaßt die Isolierung der Mikroorganismen aus dem Material und die Kultivierung der isolierten Mikroorganismen auf einem Kulturmedium auf einer Platte. Die Zählung der Mikroorganismen mittels dieses "Kbloniezählungsverfahrens" ist ein langv/ieriges Verfahren, welches unter normalen Umständen etwa 2 Tage zur Inkubierung in Abhängigkeit von Art und Anzahl der in Betracht kommenden Mikroorganismen erfordert, jedoch ist es nicht ungewöhnlich, daß die Inkubierung auch eine V/oche oder länger dauert. Falls die Inkubierung beendet ist, wird die Anzahl der Kolonien der Mikroorganismen auf den Platten visuell bestimmt. Dieses "Koloniezählungsverfahren" ist von sich aus ungenau, wobei der Irrtum daher rührt, daß nicht sämtliche Mikroorganismen von dem zu untersuchenden Material gewonnen werden können. Einige werden während der Herstellung der Probe vor der Aufbringung auf das Kulturmedium getötet und auch die Kulturbedingungen während der Inkubation können nicht für sämtliche Arten von Mikroorganismen in der Probe geeignet sein. So können einige Arten keine Kolonien bilden un3 werden deshalb durch das Verfahren nicht bestimmt. Zusätzlich ist es bekannt, daß eine Einzelkolcnie vom Wachstum von mehr als einem Mikroorganismus herstammen kann.Methods used in a material include isolating the microorganisms from the material and cultivating them the isolated microorganisms on a culture medium on a plate. Counting the microorganisms by means of this "Cloning counting procedure" is a lengthy procedure, which under normal circumstances takes about 2 days to incubate, depending on the type and number of requires coming microorganisms, however, it is not uncommon for the incubation to also include a v / oche or takes longer. If the incubation is complete, the number of colonies of the microorganisms on the plates visually determined. This "colony enumeration method" is inherently imprecise, the error arising from that not all microorganisms can be obtained from the material to be examined. Some will be during the Preparation of the sample killed before application to the culture medium and also the culture conditions during the Incubation may not be suitable for all types of microorganisms in the sample. So can some types no colonies form and are therefore not affected by the procedure not determined. In addition, it is known that a single colon results from the growth of more than one microorganism can.
Bei weitem der signifikanteste Nachteil des Koloniezählungsverfahrens liegt in der Länge der zum Erhalt des Ergebnisses erforderlichen Zeit. Es ist häufig der Fall bei einem Nahrungsmittel, daß zu dem Zeitpunkt, wo der Bericht ergeht, das bis zum Eintreffen des Berichtes in Lagerung gehaltene Material sich hinsichtlich der Qualität verschlechtert hat. Es ist selbstverständlich äußerst unwirtschaftlieh, große Mengen an Nahrun,r;smlttelmaterialien, häufig in teuren gekühlten Warenhausräumen, über längere Zeiträume zu lagern, in denen der Laboratoriumsbericht über dessen mikrobielle Verunreinigung erwartet wird. Es ist noch besonders unwirtschaftlich, wenn das Material schließlich beim Test versagt.By far the most significant disadvantage of the colony enumeration method is the length of time required to get the result. It is often the case with a food that at the time the report is issued, the material held in storage until the report was received has deteriorated in quality. It is of course extremely uneconomical to use large amounts Foodstuffs, often in expensive refrigerated warehouse spaces, to be stored for longer periods of time in which the laboratory report on its microbial contamination is expected. It is particularly uneconomical when the material eventually fails the test.
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Ein weiterer Nachteil der üblichen Koloniezählungsverfahren bei der Auszählung von Mikroorganismen liegt darin, daß nur lebende Zellen gezählt werden.Another disadvantage of the usual colony enumeration methods in the enumeration of microorganisms is that only living cells are counted.
Ein anderes üblicherweise in der Nahrungsmitteltechnologie angewandtes Verfahren ist die Färbung eines Glasträgerpräparates des Nahrungsmittels mit einem Farbstoff, wie Methylenblau, wo dann der gefärbte Aufstrich mikroskopisch untersucht wird. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß das Nahrungsmittel selbst gefärbt wird, einen gefärbten Hintergrund bildet, gegen den die Mikroorganismen schwierig festzustellen sind. Das Verfahren hat einen gewissen Wert als grobe Messung der Verunreinigung in Proben mit hohen Werten an mikrobieller Verunreinigung. Bei niedrigen Werten der Verunreinigung wird der Test ungenau.Another method commonly used in food technology is the coloring of a slide preparation of the food with a dye such as methylene blue, where the colored spread is then examined microscopically will. The disadvantage of this method is that the food itself is colored, a colored background against which the microorganisms are difficult to determine. The procedure has some value as a rough measurement of contamination in samples with high levels of microbial contamination. At low levels of contamination the test becomes imprecise.
In der medizinischen Diagnose wird eine als "Fluoreszenz-Antikörpertechnik" (F.A.T.) bekannte qualitative Technik angewandt. Bei diesem Verfahren wird ein Fluorochromfarbstoff chemisch mit dem Antiserum einer spezfischen Gruppe der Mikroorganismen kombiniert. Das mit dem Fluorochrom markierte Antiserum wird mit einem Extrakt aus dem zum Test stehenden Material vermischt, und, falls die spezifische Gruppe der Mikroorganismen vorliegt, findet eine Reaktion statt, die die spezifische Gruppe der Mikroorganismen bei der Beleuchtung fluoreszierend macht. Während dieses Verfahren für die Identifizierung spezifischer Gruppen von Mikroorganismen wertvoll ist, ist es für die quantitative Bestimmung des allgemeinen mikrobieilen Gehaltes eines Materials zu spezifisch.In medical diagnosis one is called "fluorescence antibody technique" (F.A.T.) known qualitative technique. This procedure uses a fluorochrome dye chemically combined with the antiserum of a specific group of microorganisms. The one marked with the fluorochrome Antiserum is mixed with an extract from the material under test and, if the specific one If a group of microorganisms is present, a reaction takes place that affects the specific group of microorganisms which makes lighting fluorescent. During this procedure for the identification of specific groups of It is valuable for the quantitative determination of the general microbial content of a microorganism Material too specific.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Färbung von Mikroorganismen mit einem Fluorochromfarbstoff, um eine erhöhte Fluoreszenz unter UV-Beleuchtung zu erhalten.One object of the invention is a method for coloring microorganisms with a fluorochrome dye, to get increased fluorescence under UV illumination.
Gemäß der Erfindung ergibt sich ein Verfahren zur Färbung von Mikroorganismen, das darin besteht, daß die Mikroorganis-According to the invention there is a method for coloring microorganisms, which consists in that the microorganisms
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men mit einer wäßrigen Lösung eines Phosphats behandelt werden und die behandelten Mikroorganismen mit einem Fluorochromfarbstoff umgesetzt werden, wobei dieser Farbstoff mit den Mikroorganismen über die Phosphatzwischenbindungen kombiniert. men treated with an aqueous solution of a phosphate and the treated microorganisms with a fluorochrome dye are implemented, this dye combined with the microorganisms via the phosphate bonds.
Die Färbung kann durch zusätzliche Behandlung der Mikroorganismen mittels einer oder mehreren der folgenden chemischen Behandlungsverfahren aus der Gruppe von Methylierung, Veresterung, Hydrolyse, Oxidation und Behandlung mit Schwefeldioxid erhöht werden.The coloring can be achieved by additional treatment of the microorganisms using one or more of the following chemical Treatment process from the group of methylation, esterification, hydrolysis, oxidation and treatment with sulfur dioxide increase.
Die Methylierung kann durch Behandlung der Probe auf einer Trägerplatte mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan bewirkt werden. Die Veresterung kann mit einem Schwefelsäureester, vorzugsweise unter Steuerung von Zeit, Temperatur und pH, durchgeführt werden.The methylation can be carried out by treating the sample on a carrier plate with an ethereal solution of diazomethane be effected. The esterification can be carried out with a sulfuric acid ester, preferably under control of time, temperature and pH.
Die Hydrolyse kann durch 'Behandlung der Probe auf einer Trägerplatte mit einer der Säuren Salzsäure, Perchlorsäure, PerJodsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure bewirkt werden. Die Oxidation kann mit einem oxidierenden Mittel ausgeführt werden. Vorzugsweise werden Zeit, Temperatur und pH-Wert der Behandlung gesteuert.The hydrolysis can be carried out by treating the sample on a carrier plate with one of the acids hydrochloric acid, perchloric acid, periodic acid, Sulfuric acid or nitric acid. The oxidation can be carried out with an oxidizing agent. The time, temperature and pH of the treatment are preferably controlled.
Die Behandlung mit Schwefeldioxid kann einfach die Aussetzung der Probe auf der Trägerplatte an eine Lösung von Schwefeldioxid oder einem Salz derselben, das zur Freisetzung von Schwefeldioxid fähig ist,oder eine Lösung von Thionylchlorid umfassen. Zeit, Temperatur und pH-Wert der Behandlung werden vorzugsweise gesteuert.Treatment with sulfur dioxide can simply expose the sample on the support plate to a solution of sulfur dioxide or a salt thereof capable of releasing sulfur dioxide or a solution of thionyl chloride include. The time, temperature and pH of the treatment are preferably controlled.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann zur Herstellung von feuchten Probestücken oder alternativ trockenen fixierten Probestücken auf der Trägerplatte angewandt werden. Das Naßverfahren hat den Vorteil der Schnelligkeit, während der Vorteil des Trockenverfahrens darin besteht, daß die Probe einerThe method according to the invention can be used for the production of wet specimens or alternatively dry fixed ones Test pieces are applied to the carrier plate. The wet process has the advantage of speed, while the advantage of the dry process is that the sample is a
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Mehrzahl von Behandlungsstufen unterworfen werden kann, ohne daß sich große Volumen an Reagentienlösungen ansammeln. Bei der Herstellung von fixierten Probepräparaten kann zwischen jeder Behandlungsstufe die Probe auf der Platte in Wasser oder einer Pufferlösung, vorzugsweise unter geregelten Bedingungen von Zeit, Temperatur und pH-Wert, gewaschen werden.Multiple treatment steps can be subjected to without accumulating large volumes of reagent solutions. at In the preparation of fixed specimens, the specimen can be placed on the plate in water between each treatment stage or a buffer solution, preferably under controlled conditions of time, temperature and pH.
Das Trockenpräparat kann durch Aufbringung einer flüssigen Probe der Phosphatderivate der Mikroorganismen auf die Trägerplatte, wie einen mikroskopischen Träger, Kunststoffolien oder opake Platten oder Streifen hergestellt werden. Zur Zählung der Mikroorganismen wird ein bekanntes Probevolumen auf eine bekannte Fläche der Trägerplatte aufgebracht. Nach der Auftragung der Probe auf die Platte wird die Flüssigkeit der Abdampfung bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur überlassen. In der Praxis wird ein Einheitsvolumen der Flüssigkeitsprobe auf die Trägerplatte aufgetragen und die Flüssigkeit entweder der Verdampfung von sich aus oder durch Anwendung von Wärme unterzogen. Die Zellen der Mikroorganismen können dann auf dem Träger durch Erhitzen desselben oder durch Eintauchen in ein Lösungsmittel, wie Alkohol, Aceton, Aceton-Alkohollösungen, Alkohol-Essigsäurelösungen und Formaldehyd mit anschließender Trocknung des fixierten Präparates fixiert werden.The dry preparation can be prepared by applying a liquid sample of the phosphate derivatives of the microorganisms to the carrier plate, such as a microscopic support, plastic films or opaque plates or strips. To count of the microorganisms, a known sample volume is applied to a known area of the carrier plate. After application the sample on the plate is left to evaporate at room temperature or elevated temperature. In practice, a unit volume of the liquid sample is applied to the carrier plate and the liquid subjected either to evaporation by itself or by the application of heat. The cells of the microorganisms can then be applied to the support by heating it or by immersing it in a solvent such as alcohol, acetone, acetone-alcohol solutions, Alcohol-acetic acid solutions and formaldehyde fixed with subsequent drying of the fixed preparation will.
Der Fluorochromfarbstoff kann aus der Gruppe von Lissamin-Rhodamin B, Acridinorange, Acridingelb, Primulin, Äthidiumbromid, Acriflavin, Eosin Y, Auramin, Tetramethylexamethincyaninester, Rhodamin B, Rhodamin 3G, Fluoreszein, Fluoreezeindiacetat und Thionin gewählt werden. Die Färbung kann einfach durch Zusatz einer Lösung des Fluorochromfarbstoffee oder mehrerer Fluorochromfarbstoffe zur Suspension des Phosphatderivates oder durch Eintauchung der die fixierte Probe tragenden Platte in eine Lösung oder mehrere Lösungen des Farbstoffes oder der Farbstoffe, Entnahme der Platte, Abwaschung des Überschusses an Farbstoff oder Farbstoffen undThe fluorochrome dye can be selected from the group of lissamine-rhodamine B, acridine orange, acridine yellow, primulin, ethidium bromide, acriflavine, eosin Y, auramine, tetramethylamethine cyanine ester, Rhodamine B, Rhodamine 3G, fluorescein, fluorescein diacetate and thionine can be chosen. The coloring can be easy by adding a solution of the fluorochrome dye or several fluorochrome dyes to suspend the phosphate derivative or by immersing the ones carrying the fixed sample Plate in one or more solutions of the dye or dyes, removal of the plate, washing off the excess of dye or dyes and
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Trocknung der Platte in Luft oder durch Anwendung von Wärme ausgeführt werden. Die Färbung kann unter gesteuerten Zeit-, Temperatur-, pH- und Lichtbedingungen durchgeführt werden.Drying of the plate can be carried out in air or by the application of heat. The coloring can be under controlled Time, temperature, pH and light conditions can be performed.
Es ist möglich, bei der Ausführung dar vorliegenden Erfindung die traditionellen Färbungsverfahren, v/ie Gegenfärbung zur Maskierung der Hintergrundstörung anzuwenden. Auch ist es bisweilen vorteilhaft, eine Behandlung mit einem optischen Aufheller zur Intensivierung der Fluoreszenz des Farbstoffes anzuwenden.It is possible to use traditional staining methods, v / ie counterstaining, in practicing the present invention to mask the background interference. It is also sometimes beneficial to have a treatment to use an optical brightener to intensify the fluorescence of the dye.
Das gefärbte Präparat wird unter dem Mikroskop zur Zählung oder Untersuchung der darin befindlichen Mikroorganismen untersucht.The colored specimen is used under the microscope to count or examine the microorganisms it contains examined.
Ohne auf irgendeine spezielle Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, daß das Färbungsverfahren gemäß der Erfindung grundsätzlich die Umsetzung des Farbstoffes mit DNA-Molekülen in den Zellen der Mikroorganismen umfaßt. Falls ein Mikroorganismus an einem Farbstoff ausgesetzt wird, bindet sich ein Molekül des Farbstoffes an den Mikroorganismus an jeder bestimmten Stelle in dem DNA-Molekül (Färbst off rezeptorstellen). Die Behandlung mit dem Phosphation bildet an ,jeder Farbstoff rezeptorstelle eine Phosphatbrücke, an die mehr als ein Molekül des Farbstoffes dann gebunden werden kann. Dadtirch wird die Aufnahme des Farbstoffes durch die Mikroorganismen erhöht, sodaß sich eine erhöhte Fluoreszenz jedes Mikroorganismus einstellt, wenn er unter UV-Licht betrachtet wird.Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that the staining method according to the invention basically includes the implementation of the dye with DNA molecules in the cells of the microorganisms. If When a microorganism is exposed to a dye, a molecule of the dye binds to the microorganism at any particular location in the DNA molecule (dye off receptor sites). Treatment with the phosphate ion forms a phosphate bridge at every dye receptor site, to which more than one molecule of the dye can then be bound. Dadtirch is taking up the dye increased by the microorganisms, so that an increased fluorescence of each microorganism adjusts itself when it is below UV light is viewed.
Jede der vorstehend aufgeführten zusätzlichen Behandlungen, d.h., Methylierung, Veresterung, Hydrolyse, Oxidation und Behandlung mit Schwefeldioxid dürfte das DNA-Molekül unter Bildung zusätzlicher Farbstoff rezeptorstellen modifizieren. Es wird angenommen, daß die Bildung zusätzlicher Aldehyd- undAny of the additional treatments listed above, i.e., methylation, esterification, hydrolysis, oxidation and Treatment with sulfur dioxide is likely to modify the DNA molecule with the formation of additional dye receptor sites. It is believed that the formation of additional aldehyde and
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Carbonsäuregruppen zum Reaktionsraechanismus beiträgt.Carboxylic acid groups contribute to the reaction mechanism.
Die Erfindung erlaubt axich eine Unterscheidung zwischen lebenden und nicht-lebenden Mikroorganismen und das kann möglicherweise wie folgt erläutert werden: Falls ein Mikroorganismus lebt, bewirkt die Zellenmembran eine Verzögerung des Eindringens des Farbstoffes in die Zelle, sodafl dadurch der Kontakt zwischen dem Farbstoff und dem DNA beschränkt wird, wodurch sich eine verminderte Aufnahme an Farbstoffen einstellt. Falls der Mikroorganismus nicht-lebend ist, liegt die Zellenmembran in einem gebrochenen Zustand vor und stellt deshalb keine Sperrschicht für das Eindringen durch den Farbstoff dar, sodaß sich eins erhöhte Färbstoffaufnähme ergibt. Es tritt die Wirkung ein, daß aufgrund der unterschiedlichen Absorption die gefärbten lebenden und nicht-lebenden Mikroorganismen in unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren·, z.B., fluoreszieren bei Anwendung von Acridinorange als Farbstoff, die lebenden Mikroorganismen grün mit einer Wellenlänge von 540 nm und die nicht-lebenden Mikroorganismen fluoreszieren orange-rot mit einer Wellenlänge von 665 nra.The invention allows axich a distinction between living and non-living microorganisms and this can possibly be explained as follows: If a microorganism lives, the cell membrane causes a delay in the penetration of the dye into the cell the contact between the dye and the DNA is restricted, resulting in a reduced uptake of dyes adjusts. If the microorganism is dead, the cell membrane is in a broken state and becomes therefore does not constitute a barrier to the penetration of the dye, so that there is an increased dye uptake. There is an effect that, due to the difference in absorption, the colored living and non-living microorganisms fluoresce in different wavelengths, E.g., when acridine orange is used as a dye, the living microorganisms fluoresce green with a wavelength of 540 nm and the non-living microorganisms fluoresce orange-red with a wavelength of 665 nra.
Falls ein Trockenpräperat der Mikroorganismen verwendet wird, sind es möglicherweise sterische Effekte im DNA-Molekül, welche die Unterscheidung lebend/nicht-lebend erlauben. Der Effekt der Fixierung der phosphatbehandelten Mikroorganismen auf einen Träger tötet diese, jedoch behalten diejenigen, welche vor der Behandlung mit dem Phosphat und der Fixierung der DNA-Moleküle lebend waren, die hoch geordnete Doppslhelixstruktur bei, während in denjenigen, die nicht-lebend waren, die Helixstrukturen desorganisiert sind. Die Desorganisation der DNA-Struktur ergibt eine verringerte Anzahl verfügbarer Farbstoffrczeptorstellen wahrscheinlich aufgrund von sterisdier Hinderung für die Absorption von Phosphat und Farbstoff. Somit sind lebende Mikroorganismen durch ein hohes Absorptionsausmaß mit verbundener hoher Fluoreszenz ausgezeichnet (beispielsweise gelb-orange, 630 nm mit Acriflavin) und die nicht-lebenden durch eine niedrige Fluoreszenz (beispiels-If a dry preparation of the microorganisms is used, there may be steric effects in the DNA molecule which allow the distinction between living and non-living. The effect of fixing the phosphate-treated microorganisms on a support kills these, but keep those that are prior to treatment with the phosphate and fixation of the DNA molecules were alive, the highly ordered double helix structure at, while in those who were non-living, the helical structures are disorganized. The disorganization of the DNA structure results in a reduced number of available dye receptor sites, probably due to sterility Hindrance for the absorption of phosphate and dye. Thus, living microorganisms are characterized by a high degree of absorption associated with high fluorescence (for example yellow-orange, 630 nm with acriflavin) and the non-living due to a low fluorescence (e.g.
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weise grün, 540 nm mit ^criflavin).white green, 540 nm with ^ criflavin).
Ein Vorteil der Erfindung liegt darin, daß sie nicht nur die Zählung von lebenden Mikroorganismen, wie bei dem Standard-Koloniezählungsverfahren, erlaubt, sondern auch von nicht-lebenden Mikroorganismen. Die Zählung nicht-lebendsr Zellen ist von Bedeutung insofern, als sie die mikrobiologische Entwicklung der Probe angibt. Falls beispielsweise ein Hersteller ein verdorbenes Nahrungsmittel sterilisieren würde, dann würde eine Standard-Koloniezählung das Fehlen lebender Mikroorganismen anzeigen. Aufgrund der vorliegenden Erfindung ergibt sich hingegen, daß zu irgendeiner Zeit das Nahrungsmittel eine Anzahl Mikroorganismen enthalten hat.An advantage of the invention is that it not only enables the enumeration of living microorganisms, as in the standard colony enumeration method, allowed, but also from non-living microorganisms. The non-living count Cells are important in that they indicate the microbiological evolution of the sample. If for example If a manufacturer were to sterilize a spoiled food, then a standard colony count would be the lack of it show living microorganisms. Due to the present invention, however, it follows that at any time the Food has contained a number of microorganisms.
Zur Zählung der Mikroorganismen in der Probe kann die Fläche des gefärbten Präparates visuell unter dom Mikroskop von oben nach unten und von Seite zu Seite gerast art werden. Alternativ können die Mikroorganismen mittels eines Bildanalyslersystems unter Anwendung einer Photomultiplikatorabfühleinrichtung gezählt werden, welcher eine Digitalablesung der Einheiten, beispielsweise der bei einer gegebenen Wellenlänge fluoreszierende Mikroorganismen^liefert.To count the microorganisms in the sample, the area of the colored specimen can be viewed visually under a dom microscope from be snapped from top to bottom and from side to side. Alternatively, the microorganisms can be detected by means of an image analyzer system using a photomultiplier sensor counted which is a digital reading of the units, for example that at a given Wavelength fluorescent microorganisms ^ supplies.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden Beispiele erläutert.The invention is illustrated below with the aid of the following examples.
1. a) Eine Fläche von 10 mm χ 10 mm wird auf Glasträgern1. a) An area of 10 mm 10 mm is placed on glass slides
(76 χ 25 mm χ 0,8 bis 1,0 mm dick) geätzt, b) Alternativ kann die geätzte Aufbringungsfläche 40 mm χ 2,5 mm sein.(76 χ 25 mm 0.8 to 1.0 mm thick) etched, b) Alternatively, the etched application area can be 40 mm 2.5 mm.
2. Die Träger werden über Nacht in eine frische 2%ige Lösung von "RBS 25 +" (Warenzeichen) als Reinigungsmittel eingetaucht. Die Träger werden in der Lösung schwach gewaschen und gut In kaltem und dann in heißem Wasser gespült. Die Träger werden in einem warmen Ofen auf Ablaufgestellen2. The slides are in a fresh 2% solution overnight immersed by "RBS 25 +" (trademark) as a detergent. The slides are lightly washed in the solution and rinsed well in cold and then hot water. the Carriers are placed in a warm oven on drain racks
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während 10 bis 15 min getrocknet.dried for 10 to 15 minutes.
3. a) Fleischstücke mit einem Gewicht von 10g wurden aseptisch aus größeren Stücken herausgeschnitten, mit TestOrganismen inokuliert und dann während 2 min mit der Hand in insgesamt 100ml Ringer-Lösung verquirlt.3. a) Pieces of meat weighing 10 g were aseptically cut out of larger pieces with test organisms inoculated and then whisked by hand in a total of 100 ml of Ringer's solution for 2 min.
b) 10 Mikroliter der erhaltenen Flüssigkeit wurden in die Mitte des geätzten Bereiches gebracht und sorgfältig unter Anwendung eines feinen geraden Drahtes zur vollständigen Abdeckung des geätzten Bereiches ausgebreitet.b) 10 microliters of the resulting liquid was poured into the Center of the etched area and carefully using a fine straight wire for complete coverage of the etched area.
c) Des Präparat wird zur Trockenheit während 15 min bei 200D gebracht.c) The preparation is brought to dryness for 15 min at 20 ° C.
d) Des Präparat wird mit 9696igem Äthylalkohol während 10 min bei 20"C fixiert.d) The preparation is with 9696igem ethyl alcohol during Fixed at 20 ° C for 10 min.
e) Der Alkohol wird abgezogen und der Träger zur Trockenheit während 10 min bei 200C gebracht.e) The alcohol is drawn off and the carrier is brought to dryness at 20 ° C. for 10 min.
f) Eine Lösung von 0,01% Acriflavin in je -Phosphatpuffer, pH 7,2, wurde auf den Träger während 10 min bei 200C gebracht.f) A solution of 0.01% acriflavine in each phosphate buffer, pH 7.2, was applied to the carrier for 10 minutes brought at 20 0 C.
g) Das gefärbte Präparat wurde in laufendem Wasser schwach während 15 see gespült.g) The colored preparation was gently rinsed in running water for 15 seconds.
h) Das Wasser wurde abgezogen und der Träger zur Trockenheit während 10 min bei 20°C gebracht.h) The water was drawn off and the support was brought to dryness for 10 minutes at 20 ° C.
4. Das Präparat wurde mit einem Leitz-Orthoplanmikroskop unter Anwendung eines Spezialfluoritobjektivs Χ4θ/θ,85 für unabgedeckte fluoreszierende Aufstriche, das eine Gesamtvergrößerung von 500X ergibt, untersucht. Als Lichtquelle wurde eine Hochdruckquecksilberdampflampe HB200 mit auffallender Beleuchtung über eine Ploem-Einheit unter Anwendung von BG12 3 mm + BG38 als Erregungsfilter verwendet. Es wurde der Ploem-Spiegel Nr. 3 zusammen mit dem Sperrfilter K53O verwendet.4. The preparation was made with a Leitz orthoplan microscope using a special fluorite lens Χ4θ / θ, 85 for uncovered fluorescent spreads giving an overall magnification of 500X. As a light source was a high pressure mercury vapor lamp HB200 with conspicuous lighting via a Ploem unit using BG12 3 mm + BG38 used as an excitation filter. It was the Ploem mirror No. 3 together with the blocking filter K53O used.
Das vorstehend in Absatz 3 beschriebene Färbungsverfahren wurde in einem verdunkelten Raum ausgeführt (falls der TrägerThe staining procedure described in paragraph 3 above was carried out in a darkened room (if the wearer
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nicht unmittelbar untersucht wurde oder für eine weitere Untersuchung erforderlich war, wurde er im Dunkeln gelagert). Sonnenlicht oder künstliches Licht verursacht eine Verblassung des gefärbten Präparates.was not examined immediately or was required for further examination, it was stored in the dark). Sunlight or artificial light will cause the colored specimen to fade.
Die lebenden Zellen in der Probe fluoreszierten mit einer Orangefarbe, während die nicht-lebenden Zellen grün waren.The living cells in the sample fluoresced with an orange color, while the non-living cells were green.
Die Zellen wurden visuell unter dem Mikroskop unter Anwendung des Rasterverfahrens gezählt. Zum Vergleich wurden die gleichen Proben auch mit dem üblichen Koloniezählungsverfahren gezählt. Die Ergebnisse wurden statistisch analysiert und verglichen.The cells were visually counted under the microscope using the grid method. For comparison, they were the same Samples also counted using the standard colony enumeration method. The results were statistically analyzed and compared.
Zahlreiche Proben zeigten eine enge Beziehung zwischen dem Mittelwert der Koloniezählung und der mikroskopischen Zählung nach dem erfindungsgemäßen Vorfahren, wobei der letztere stets innerhalb der entsprechenden Werte der Koloniezählungen - Standardabweichung lag.Numerous samples showed a close relationship between the mean value of the colony count and the microscopic count according to the ancestor of the invention, the latter always being within the corresponding values of the colony counts - standard deviation.
Im allgemeinen war die Zählung unter Anwendung des mikroskopischen Verfahrens höher als die entsprechende Koloniezählung. Dies kann darauf zurückzuführen sein, daßIn general, counting was done using the microscopic one Method higher than the corresponding colony count. This can be due to the fact that
a) das mikroskopische Verfahren unter Anwendung von erfindungsgemäß gefärbten Trägern die Mikroorganismen einzeln zählt, während die Kolonien von einem einzigen Mikroorganismus oder von einer Gruppe von Bakterien herstammen können,a) the microscopic method using the invention colored carriers counts the microorganisms individually, while the colonies of a single microorganism or may come from a group of bacteria,
b) die Wahrscheinlichkeit gegeben ist, daß ein bestimmter Anteil lebender Zellen nicht in Laboratoriumsgewinnungsmedien wächst, obwohl er sich in Nahrungsmitteln vermehrt. Dies gilt besonders für unter Streß stehende Bakterien und Bakteriensporen. Die Einheiten sind noch lebend und werden gezählt.b) the probability is given that a certain proportion living cells does not grow in laboratory recovery media, although it does multiply in food. This is especially true for stressed bacteria and bacterial spores. The units are still alive and are counted.
Mikroskopzählungen von fleischlichen oder pflanzlichen Waschflüssigkeiten stellen hinsichtlich der Hintergrundsfluoreszenz und der physikalischen Maskierung von fluoreszierenden Mikroorganismen keine großen Probleme. Jedoch besitzen andere Nahrungs-Microscope counts of carnal or vegetable washing liquids issues with regard to background fluorescence and the physical masking of fluorescent microorganisms no big problems. However, other nutritional
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mittel, wie Milch oder Eipulver eine solch hohe Hintergrundfluoreszenz, daß die Zählungen bei Anwendung der Standardtechnik schwierig werden. Kurze Fixierungszeiten in Alkohol mit anschließender Behandlung in 296iger Essigsäure entfernen diese Hintergrundfluoreszenz erfolgreich. Leider verursacht dieses Verfahren auch, daß zahlreiche Mikroorganismen von dem Träger entfernt werden. Gemäß weiteren Versuchen zeigte die Eintauchung des Präparates in einen Coplin-Behälter mit Wasser während 1 min nach der Behandlung mit Alkohol-Essigsäure während 30 min, daß mit Modifizierungen die mikroskopische Technik auf Nahrungsmittel auf der Basis von Milch und Ei anwendbar war.medium, such as milk or egg powder, such a high background fluorescence, that the counts become difficult using the standard technique. Short fixation times in alcohol remove with subsequent treatment in acetic acid 296 this background fluorescence succeeds. Unfortunately, this process also causes numerous microorganisms to be killed removed from the carrier. According to further tests, the immersion of the preparation in a Coplin container showed Water for 1 min after treatment with alcohol-acetic acid for 30 min that with modifications the microscopic Technique was applicable to milk and egg based foods.
Unter Anwendung des Färbungsverfahrens gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß alte Kulturen, insbesondere gram-negative Stäbchen, eine leuchtende Orange-Fluoreszenz zusammen mit dumpfgrün fluoreszierenden Zellen zeigten. Kulturen von gramnegativen Bakterien, die durch Erhitzen auf 10O5C während 30 min sterilisiert worden waren, fluoreszierten einheitlich dunkelgrün. Es konnte gezeigt werden, daß diese Änderung von oranger zu grüner Fluoreszenz in Beziehung mit der Lebensfähigkeit der Testkultur stand. Während alte Kulturen von Staphylococcus aureus sowohl orange als auch grün fluoreszierende Zellen zeigten, zeigten nach einer Wärmebehandlung eine? jungen Kultur durch Erhitzen während 30 min mit anschließender Färbung sämtlich Mikroorganismen eine orange Fluoreszenz. Jedoch verhindert die Vorbehandlung des Präparates mit Pufferlösungen derartige "falsch-lebende" Reaktionen. Die Unterschiedlichkeiten der Reaktionen zwischen gram-negativen und gram-positiven Bakterien gegenüber dsn Fluorochromen zeigt wichtige kompositioneile Differenzen zwischen den beiden Gruppen.Using the staining method according to the invention, it was found that ancient cultures, particularly gram-negative rods, exhibited bright orange fluorescence along with dull green fluorescent cells. Cultures of gram-negative bacteria which had been sterilized by heating at 10O 5 C for 30 min fluoresced uniformly dark green. It was shown that this change from orange to green fluorescence was related to the viability of the test culture. While old cultures of Staphylococcus aureus showed both orange and green fluorescent cells, after heat treatment showed a? young culture by heating for 30 min with subsequent staining of all microorganisms an orange fluorescence. However, the pretreatment of the preparation with buffer solutions prevents such "false-living" reactions. The differences in the reactions between gram-negative and gram-positive bacteria towards dsn fluorochromes show important compositional differences between the two groups.
Ein Vorteil der Erfindung liegt in der Schnelligkeit, womit deren Ergebnisse erhältlich sind. Das Färbungsverfahren gemäß der Erfindung dauert weniger als 1 Std. für das tatsächliche Färbungsverfahren, während bei der üblichen Koloniezählung einige Tage zur Inkubierung erforderlich sind. Es besteht auch die Möglichkeit, ein rasches optisches Raster-One advantage of the invention is the speed with which the results thereof can be obtained. The staining procedure according to of the invention takes less than 1 hour for the actual staining procedure, while for the usual colony count a few days are required for incubation. There is also the possibility of a quick optical raster
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instrument zur Zählung oder Feststellung der fluoreszierenden Zellen einzusetzen. Durch Einstellung der WellenlSngenempfindlichkeit eines derartigen Instrumentes wird es möglich, getrennt-lebende und nicht-lebende Zellen zu bestimmen.to use an instrument to count or detect the fluorescent cells. By adjusting the wavelength sensitivity Such an instrument makes it possible to determine separated-living and non-living cells.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, die lediglich die Färbungsstufen und die erhaltenen Ergebnisse beschreiben, ohne daß das Zählverfahren abgehandelt wird.The following examples serve to further illustrate the invention, showing only the dyeing stages and those obtained Describe results without discussing the counting procedure.
Verfahrenprocedure
1. Eine Mikroorganismen enthaltende Milchprobe wurde mit O,62m-Phosphatpuffer, pH 7,2, zu einer gegebenen Verdünnung vorgemischt.1. A milk sample containing microorganisms was used with 0.62m phosphate buffer, pH 7.2, at a given dilution premixed.
2. 1ml der Probe wurde in einem Behälter pipettLert, zu dem 1ml einer O,O1#igen Lösung von Acridinorange in einem O,62m-Fhosphatpuffer, pH 7,2, zugesetzt wurde.2. 1ml of the sample was pipetted into a container to which 1ml of an O, O1 # solution of acridine orange in one 0.62m phosphate buffer, pH 7.2, was added.
3. Nach Rühren während 2 min bei 25PC wurden 0,02ml des Probegemisches auf die gereinigte und getrocknete Trägerplatte pipettLert.3. After stirring for 2 min at 25PC, 0.02 ml of the Pipette the sample mixture onto the cleaned and dried carrier plate.
4. Die aufgelegte Probe wurde dann mit einem sauberen trokkenen Deckglas abgedeckt.4. The applied sample was then covered with a clean, dry cover slip.
5. Die Mikroorganismen im Präparat wurden dann in auffallendem Licht durch ein X4O-Objektiv unter Anwendung eines ErregungsfiÄsrs von 45Onm, einem dichroitischen Spiegel PIoem Nr. 3 und einem Sperrfilter mit 53Onm gezählt.5. The microorganisms in the specimen were then seen in incident light through an X4O lens using a Excitation fiÄsrs from 45Onm, a dichroic mirror PIoem No. 3 and a blocking filter with 53Onm counted.
Dieses Färbungsverfahren, das auch auf Nahrungsmittel- und Urinproben anwendbar ist, ergibt lebende Mikroorganismen, die überwiegend grün (54Onm) sind, während die nicht-lebenden Mikroorganismen überwiegend orange?-rot (665nm) gefärbt sind.This staining process, which can also be used on food and urine samples, reveals living microorganisms, which are predominantly green (54Onm) while the non-living ones Microorganisms are predominantly orange? -Red (665nm) in color.
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Die Einstellung des pH-Wertes der Acridinorangelösung von 7,2 von dem normalen pH-Wert von 4,5 erhöht die Aufnahme des Fluorochroms durch das Kernmaterial der Mikroorganismen und die Anwendung der Phosphationen in dem Verdünnungspuffer unterstützt bei der Aufnahme des Fluorochroms und verbessert das Niveau der Emission der fluoreszierenden Mikroorganismen.The adjustment of the pH of the acridine orange solution of 7.2 from the normal pH of 4.5 increases uptake of the fluorochrome through the core material of the microorganisms and the use of the phosphate ions in the dilution buffer assists and enhances the uptake of the fluorochrome the level of emission of the fluorescent microorganisms.
Dieses Verfahren ist für Materialien geeignet, die niedrige Mengen an verunreinigenden Proteinen, Fetten und anderen Hintergrundmaterialien enthalten.This method is suitable for materials that contain low levels of contaminating proteins, fats and others Background materials included.
Der Mechanismus der Färbung durch Acridinorange bei diesem Naßpräparat erfolgt primär durch Verbindung mit der Nucleinsäure. In lebenden Mikroorganismen reguliert die Zellenmembran die Aufnahme des Fluorochroms und der hochgeordnete Zustand der Nucleinsäuren und der Proteine erlaubt eine minimale Bindung des Fluorochroms, was eine Emission einer Grünfluoreszenz bei rund 54Onm ergibt. Die nicht-lebenden Mikroorganismen verlieren die selektive Durchlässigkeit der Zellenmembran, wodurch die Bindung des Fluorochroms in großen Mengen erlaubt wird, sodaß eine orange-rote Fluoreszenz bei 665nm erhalten wird.The mechanism of staining by acridine orange in this wet preparation is primarily through connection with the nucleic acid. In living microorganisms, the cell membrane regulates the uptake of fluorochrome and the highly ordered state of the nucleic acids and proteins allows minimal binding of the fluorochrome, resulting in the emission of green fluorescence at around 54Onm. The non-living microorganisms lose the selective permeability of the cell membrane, which allows the binding of the fluorochrome in large quantities so that an orange-red fluorescence at 665 nm is obtained.
Verfahrenprocedure
ι. Urinprobon wurden mit 1:1 Volumen an O,5m-Phosphorsäure und O,2m-Cto:alsäure, pH 2,0, zur sauren Hydrolyse verdünnt.ι. Urine samples were made with 1: 1 volume of O, 5m-phosphoric acid and O, 2m-Cto: als acid, pH 2.0, diluted for acidic hydrolysis.
2. Es wurden 0,2ml einer 0,01%igen Äthidlumbromidlösung zugesetzt und bei 4O3C während 10min gehalten.2. 0.2 ml of a 0.01% strength ethereal bromide solution were added and the mixture was kept at 40 3 C for 10 minutes.
3. Die Probe wurde auf pH 6,5 unter Anwendung einer 0,5m-Dinatriumhydrogenphosphatlöstuig eingestellt.3. The sample was dissolved to pH 6.5 using 0.5M disodium hydrogen phosphate set.
4. Die weiteren Stufen wurden wie in Beispiel 2 bei pH-Wert 7,2 durchgeführt.4. The further steps were carried out as in Example 2 at pH 7.2.
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Dieses Verfahren war zur Desorganisation der Nucleinsäure und der Tertiärstruktur von Proteinen in den mikrobiellen Zellen durch saure Hydrolyse bestimmt, wodurch sich die Ausbildung von seuren Gruppen und Aldehydgruppen einstellt. Diese Gruppen binden in Gegenwart von Phosphatgruppen bei pH 6,5 eine große Anzahl von Äthidiumbromidmolekülen, wodurch sämtliche Mikroorganismen eine orange-rote Fluoreszenz zeigen.This procedure was used to disorganize the nucleic acid and the tertiary structure of proteins in the microbial Cells determined by acid hydrolysis, which leads to the formation of acid groups and aldehyde groups. These groups bind in the presence of phosphate groups pH 6.5 a large number of ethidium bromide molecules, which gives all microorganisms an orange-red fluorescence demonstrate.
Verfahrenprocedure
1. 1ml einer Hefe in wäßriger Suspension enthaltenden Probe wurde mit 1ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Fluoreszeindiacetat in einem O,62m-Phosphatpuffer bei pH 6,8 vereinigt und bei 29^C während 30 see gehalten.1. Containing 1ml of a yeast in aqueous suspension The sample was washed with 1 ml of a saturated aqueous solution of fluorescein diacetate in a 0.62m phosphate buffer combined at pH 6.8 and held at 29 ^ C for 30 seconds.
2. Zu der vorstehenden Suspension wurden 2ml einer 0,01%igen Acri· dinorangelösung in m/15-Phosphatpuffer bei pH 7,2 zugezugesetzt. 2. 2 ml of a 0.01% strength Acri were added to the above suspension. added dinorangeal solution in m / 15 phosphate buffer at pH 7.2.
3. Es wurden die Stufen wie in Beispiel 2 ausgeführt.3. The steps as in Example 2 were carried out.
4. Die Präparatprobe wurde bei 45Onm während 5 see bestrahlt.4. The preparation sample was irradiated at 45Onm for 5 seconds.
5. Die Präparatprobe wurde bei 36Onm bestrahlt und die Hefezellsn wurden unter Anwendung des dichroitischen Spiegsls Ploem Nr. 1 und eines Sperrfilters mit 43Onm gezählt.5. The preparation sample was irradiated at 36Onm and the yeast cells were counted using the Ploem No. 1 dichroic mirror and a notch filter to be 43Onm.
Der Grund für die Erhöhung des Niveaus der Emission der Hefezellen durch eine Vorbestrahlung bei 45Onm ist nicht klar. Es wird angenommen, daß die vorhergehende Behandlung der Hefezellen mit Fluoreszeinacetat eine Anfangsbindung mit aktiven Stellen lieferty der Effekt von Acridinorange in Gegenwart von Phosphationen besteht in der Verbindung mit dem Fluores-The reason for the increase in the level of emission of the yeast cells by pre-irradiation at 45Onm is not clear. It is believed that the previous treatment of the yeast cells with fluorescein acetate an initial bond with active The effect of acridine orange in the presence of phosphate ions consists in the connection with the fluorescent
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zeindiacetat. Die Vorbestrahlung bei 45Onm photokatalysieren, die in thermische Energie umgewandelte Menge an Erregungsenergie verringern, wodurch sich eine höhere Quantenausbeute dar Fluoreszenz bei der längeren Wellenlänge ergibt.zinc diacetate. Photocatalyze the pre-irradiation at 45Onm, reduce the amount of excitation energy converted into thermal energy, resulting in a higher quantum yield that gives fluorescence at the longer wavelength.
Naßpräparat; Gesamtfärbung der Bakterien in Milch- oder UrinprobenWet preparation; Overall staining of bacteria in milk or urine samples
Verfahrenprocedure
1. "1^l Milch wurde mit 1ml einer 0,025^igen wäßrigen Lösung von Acridingelb in O,62m-Phosphatpuffer bei pH 5,6 vermischt und 30 see bei 2JZ gehalten.1. " 1 ^ l milk was mixed with 1 ml of a 0.025% aqueous solution of acridine yellow in 0.62m phosphate buffer at pH 5.6 and kept at 2JZ for 30 seconds.
2. 2ml eines Gemisches aus 2%iger Orthophosphorsäure und 8% Weinsäure wurde zu dem Präparat zugesetzt, um einen pH-Wert von 1,5 zu ergeben und bei 4OT während 10 min gehalten.2. 2ml of a mixture of 2% orthophosphoric acid and 8% tartaric acid was added to the preparation to provide a to give a pH of 1.5 and held at 40 for 10 min.
3. Der pH-Wert wurde auf 6,5 unter Anwendung einer 0,5m-Natriumdihydrogenphosphatlösung eingestellt.3. The pH was adjusted to 6.5 using a 0.5M sodium dihydrogen phosphate solution set.
4. 0,02ml der Probe wurden auf eine gereinigte und getrocknete Trägerplatte pipcttiert.4. 0.02 ml of the sample were pipetted onto a cleaned and dried carrier plate.
5. Die weiteren Stufen 4 und 5 erfolgten wie in Beispiel 2.5. The other stages 4 and 5 were carried out as in Example 2.
Sämtliche Bakterien fluoreszierten mit einheitlich leuchtend gelb (575nm) gegenüber einem dunklen Hintergrund ohne Färbung der Fettkügelchen oder des Milchproteins.All bacteria fluoresced with a uniformly bright yellow (575 nm) against a dark background without color the fat globules or milk protein.
Acridingelb hat eine ähnliche Affinität für mikrobielles DNA wie Acridinorange, gibt jedoch eine weit niedrigere nichtspezifische Hintergrundfluoreszenz bei diesem Naßpräparat. Acridine yellow has a similar affinity for microbial DNA as acridine orange, but gives a far lower non-specific background fluorescence for this wet preparation.
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Verfahrenprocedure
1. 1ml einer Milehprobe wurde auf 1:10 mit Wasser verdünnt.1. 1 ml of a Mileh sample was diluted 1:10 with water.
2. Es wurde eine 1%ige Lösung von Sudanschwarz B in Cellosolve hergestellt und auf 0,1 % in Wasser mit einem Gehalt von 0,25% Natriumhexamethaphosphat, pH 6,5, verdünnt. Unter Rühren wurde 1ml dieses Systems zur Milehprobe zugegeben und während 1min bei 250C gehalten.2. A 1% solution of Sudan Black B in Cellosolve was prepared and diluted to 0.1% in water containing 0.25% sodium hexamethaphosphate, pH 6.5. With stirring, 1 ml of this system was added to the Milehprobe and kept at 25 0 C for 1min.
3. Unter Rühren wurde 1ml einer wäßrigen 0,15%igen Tetramethyloxamethincyaninesterlösung in V/asser zugesetzt und während 1 min bei 250C gehalten.3. With stirring, 1 ml of an aqueous 0.15% Tetramethyloxamethincyaninesterlösung in v / ater was added and held 25 min at 0 C for 1 hour.
4. 0,02ml der Probe wurden dann auf eine gereinigte und getrocknete Trägerplatte pipettlert.4. 0.02ml of the sample was then cleaned and dried Carrier plate pipettles.
5. Es wurden die Stufen 4 und 5 wie in Beispiel 2 unter Anwendung einer Erregung bei 36Onm, einem dichroitischen Spiegel Ploem Nr. 1 und einem Sperrfilter mit 43Onm.5. Steps 4 and 5 as in Example 2 were used an excitation at 36Onm, a dichroic mirror Ploem No. 1 and a blocking filter at 43Onm.
Die Behandlung der Milehprobe mit Sudanschwarz B vermeidet die Hintergrundverfärbung durbh Fettkügelchen und das Rühren während der Zugabe der Reagentien stellt die submikroskopische Ausfällung der Kaseinfraktion sicher. Die Bakterien sind mit einer intensiv blauen Farbe (480nm) gegenüber einem schwarzen Hintergrund gefärbt.Treatment of the Mileh sample with Sudan Black B avoids background discoloration due to fat globules and stirring during the addition of the reagents ensures the submicroscopic precipitation of the casein fraction. The bacteria are with an intense blue color (480nm) against a black background.
Verfahrenprocedure
1. Zu 1ml einer 1:10-Verdünnung von Milch in V/asser wurden 1ml einer 1$igen wäßrigen Lösung von Chlorxylenol, pH 8,5,zugesetzt. Die Einwirkung erfolgte während 30 see1. To 1ml of a 1:10 dilution of milk in v / ater was added 1 ml of a 1% aqueous solution of chloroxylenol, pH 8.5, was added. The action took place for 30 seconds
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bei 250C unter Rühren. Chlorxylenol ist ein Entfettungsmittel,at 25 0 C with stirring. Chlorxylenol is a degreaser,
2. 1ml einer 0,5%igen Malachitgrünlösung (Hintergrundfärbung) in Wasser von pH 3,5 vmrde zugesetzt und der Einwirkung während 30 see bei 35^ unter Rühren überlassen.2.1ml of a 0.5% malachite green solution (background staining) in water of pH 3.5 vmrde added and the action left for 30 seconds at 35 ^ with stirring.
3. Es wurde 1ml von 0,01% Acridinorangc in m/i5-Phosphatpuffer, pH 7,2, zugesetzt. Die Einwirkung erfolgte während 3min bei3. 1ml of 0.01% acridine orange in m / i5 phosphate buffer, pH 7.2 added. The action took place for 3 minutes
k . 0,02ml der Probe wurden dann auf eine gereinigte und getrocknete Trägerplatte pipeiüert. k. 0.02 ml of the sample were then piped onto a cleaned and dried carrier plate.
5. Die Stufen 4 und 5 erfolgten dann wie in Beispiel 2, wobei eine Erregung bei 45Onm, ein dichroitischer Spiegel Ploem Nr. 3 und ein Sperrfilter von 53Onm angewandt wurden.5. Steps 4 and 5 were then carried out as in Example 2, with an excitation at 45Onm, a dichroic mirror ploem No. 3 and a blocking filter of 53Onm were applied.
Bei diesem Verfahren wurde die Eignung von Malachitgrün zur Reaktion mit Milchfett und Kasein ausgenützt, um den Zutritt dec Fluorochroms zu blockieren.In this process, the suitability of malachite green was utilized for reaction with milk fat and casein to the access to block dec fluorochrome.
Durch die Anwendung einer Vorbehandlung mit Chlorxylenol wurde die Durchlässigkeit der Bakterien gegenüber Acridinorange erhöht.By applying a pretreatment with chloroxylenol, the permeability of the bacteria to acridine orange was made elevated.
Unter Anwendung dieses Systems fluoreszierten die Bakterien hellgrüngelb (565nm) gegen einen blaugrünen Hintergrund (52Onm). Es waren kaum Anzeichen von Fettkügelchen oder Kasein in diesen Präparaten.Using this system, the bacteria fluoresced light green-yellow (565nm) against a blue-green background (52Onm). There was little evidence of fat globules or casein in these supplements.
Verfahrenprocedure
1. 1ml Urin wurde mit etwa 1ml einer O,75m-Orthophosphorsäureauf pH 2,0 vermischt.1. 1 ml of urine was diluted with approximately 1 ml of 0.75m-orthophosphoric acid pH 2.0 mixed.
2. Es wurden 0,5ml einer 0,1%igen wäßrigen Natriumthiosulfatlösung und 0,2ml einer 0,01%igen wäßrigen Äthidiumbromidlösung zugesetzt und das Gemisch bei 4CTC während 10 min gehalten. 2. There were 0.5 ml of a 0.1% strength aqueous sodium thiosulfate solution and 0.2 ml of a 0.01% strength aqueous solution of ethidium bromide were added and the mixture was kept at 4CTC for 10 minutes.
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Es wurden 0,5ml einer 0,05%igen wäßrigen watriumhypochloritlösung zugesetzt und der pH-Wert auf 6,5 unter Anwendung einer O,5m-Dinatriumhydrogenphosphatlösung eingestellt. 4. Die weitere Arbeitsweise und Untersuchung erfolgte- wie in Beispiel 7, Stufen 4 und 5.There were 0.5 ml of a 0.05% strength aqueous sodium hypochlorite solution added and the pH adjusted to 6.5 using an O, 5m disodium hydrogen phosphate solution. 4. The further procedure and investigation took place as in Example 7, stages 4 and 5.
Verfahrenprocedure
1. Eine Mikroorganismen enthaltende Milchprobe wurde mit einem O,62m-Phosphatpuffer bei pH 7,2 zu einer bekannten Verdünnung vorgemischt.1. A milk sample containing microorganisms was with a 0.62m phosphate buffer at pH 7.2 to a known dilution premixed.
2. Ein 0,01 ml-Aliquot der Probe wurde auf eins saubere trockene2. A 0.01 ml aliquot of the sample was put on a clean dry
2 Trägerplatte aufgetragen und auf 1cm unter Anwendung eines sterilen Applikators ausgebreitet.2 Carrier plate applied and spread to 1cm using a sterile applicator.
3. Die aufgetragene Probe wurde bei 250C getrocknet.3. The applied sample was dried at 25 ° C.
4. Die aufgetragene Probe wurde auf der Trägerplatte durch Abdeckung mit 95%igem Äthanol (w/v) während 10 min bei 25^ fixiert.4. The applied sample was on the carrier plate by covering with 95% ethanol (w / v) for 10 min at 25 ^ fixed.
Gleichfalls verwendbare Alternativfixierlösungen umfassenAlso include usable alternative fixing solutions
a) Volumenverhältnis 1:1 von 95% Äthanol : 20% Essigsäure,a) 1: 1 volume ratio of 95% ethanol: 20% acetic acid,
b) 10biges Formalin.b) 10biges formalin.
5. Das fixierte Präparat wird dann abgezogen und mit einem 0,62m-Phosphatpuffer zu pH 7,2 gespült.5. The fixed specimen is then peeled off and filled with a 0.62m phosphate buffer Rinsed to pH 7.2.
6. Das Präparat wird dann mit einer 0,01%igen Acriflavinlösung in einem O,62m-Phosphatpuffer bei pH 7,2 während 10 min bei 250C bedeckt.6. The preparation is then covered with a 0.01% Acriflavinlösung in an O, 62m-phosphate buffer at pH 7.2 for 10 min at 25 0 C.
7. Dann wird das Präparat mit Wasser gewaschen und zur Trocknung an Luft bei 250C stehengelassen.7. The preparation is then washed with water and left to stand in air at 25 ° C. to dry.
8. Das Präparat wird dann mit auffallender Beleuchtung ohne Deckglas durch ein X40-0bjekt.lv mit einer Erregung von 45Onm mit einem dichroitischen Spiegel Ploem Nr. 3 und einem Sperrfilter von 53Onm gezählt.8. The specimen is then used with conspicuous lighting without a cover slip through an X40-0bjekt.lv with an excitation of 45Onm counted a dichroic mirror Ploem No. 3 and a blocking filter of 53Onm.
Dieses Färbungsverfahren, welches auch auf Nahrungsmittel- undThis dyeing process, which also applies to food and
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Urinproben anwendbar ist, ergibt, daß lebende Mikroorganismen überwiegend gelborange gefärbt v/erden, während nicht-lebende Mikroorganismen überwiegend grün gefärbt, werden.Urine samples is applicable, reveals that living microorganisms predominantly yellow-orange in color, while non-living microorganisms are predominantly colored green.
Unter den Bedingteren der Färbung der Mikroorganismen bei diesem Trcckonpräparat ist anzunehmen, daß die Bindung des Fluorocbrcms Acriflavin an der Zelilenwand erfolgt, wo die Schichten des Flucrochroms aufgebaut werden. In lebenden Zellen ergibt dies eins hohe Konzentration an Acriflavineinheiten, die eine gelborange Emission mit einer Wellenlänge von 63Onm verursachen. In nicht-lebenden Zellen ergibt die Desorganisation der Bindungsstellen an der Zellwand die Absorption von Acriflavin lediglich i.n niedrigen Mengen, sodaß eine Grünfluoreszenz bei 5^0nm geliefert wird.Among the more conditional of the coloring of the microorganisms in this one Trcckonpräparat is to be assumed that the binding of the Fluorocbrcms Acriflavin occurs on the cell wall where the layers are of the flucrochrome. Results in living cells this is a high concentration of acriflavin units, which cause a yellow-orange emission with a wavelength of 63Onm. In non-living cells, the disorganization of the binding sites on the cell wall merely results in the absorption of acriflavin in low quantities, so that a green fluorescence at 5 ^ 0nm is delivered.
£raHi-negativen Bakterien £ ra Hi-negative bacteria
Verfahrenprocedure
1-5 Die Probe wurde wie in Beispiel 7, Stufen 1-5, hergestellt.1-5 The sample was prepared as in Example 7, steps 1-5.
6. Das Präparat vrurde dann in ein Bad, welches 1n-Salzsäure von 60"C enthielt, während 5 min zur Säurehydrolyse eingetaucht .6. The preparation was then placed in a bath containing 1N hydrochloric acid of 60 "C, immersed for 5 minutes for acid hydrolysis.
7. Das Präparat wurde dann entnommen und in Wasser gewaschen.7. The preparation was then removed and washed in water.
8. Das Präparat wurde dann in eine Lösung, die 1ml einer 5%igen Acriflavinlösung und Λ0% Kaliummetabisulfit in O,In-SaIzsäure enthielt, eingetaucht, und mit 5?^-Kaliummetabisulfit in O,1n-Salzsäure während 10 min bei 250C verdünnt.8. The preparation was then immersed in a solution containing 1 ml of a 5% acriflavine solution and Λ 0% potassium metabisulphite in O, In-hydrochloric acid, and 5? ^ - potassium metabisulphite in O, 1N hydrochloric acid for 10 min at 25 0 C diluted.
9. Das Präparat wurde dann entnommen, mit Wasser gewaschen und in Luft bai 250C getrocknet.9. The preparation was then removed, washed with water and dried to 25 ° C. in air.
10. Das Präparat wurde dann wie in Beispiel 9, Stufe 8, untersucht .10. The preparation was then examined as in Example 9, step 8 .
Dieses Färbungsverfabren ergibt eine bessere Differenzierung von lebenden (orangefluoreοzierenden) von nicht-lebenden (grün-This staining procedure gives better differentiation from living (orange fluorescent) from non-living (green
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- ge -- ge -
^ 2778077^ 2778077
fluoreszierenden) gram-negativen Mikroorganismen.fluorescent) gram-negative microorganisms.
Die Behandlung mit saurer Hydrolyse (Stufe 6) εβΐζΐ verfügbare
Aldehydgruppen im DNA-Molekül frei und es bildet sich im Effekt ein Polyaldehyd. In lebenden Mikroorganismen ist die DNA hochgeordnet und der erhaltene Polyaldehyd ist gleichfalls hochgeordnet.
Das in der Stufe 8 angewandte Schwefeldioxid vereinigt sich mit den Aldehydgruppen und ermöglicht es dem Fluorochrom,
eine Matrix im gleichen Abstand zu bilden und der verbundene
Komplex ergibt eine massive Aufnahme des Acriflavins mit der
resultierenden gelborangen Fluoreszenz.The treatment with acid hydrolysis (step 6) releases available aldehyde groups in the DNA molecule and a polyaldehyde is formed in effect. In living microorganisms , the DNA is highly ordered and the polyaldehyde obtained is also highly ordered. The sulfur dioxide applied in step 8 combines with the aldehyde groups and enables the fluorochrome to form a matrix at the same distance as the connected one
Complex results in a massive uptake of acriflavin with the
resulting yellow-orange fluorescence.
In den nicht-lebenden gram-negativen Mikroorganismen ist die
DNA denaturiert und sie und der erhaltene Polyaldehyd stark
ungeordnet, sodaß sich eine schlechte Association des Acriflavins und eine niedrige Aufnahme einstellt und infolgedessen sich eine
niedrige Emission der Grünfluoreszenz ergibt. Bei Anwendung von Wärme an die Probe während 10 min bei "M 50^ vor der Stufe 6 kann
eine Differenzierung zwischen gram-positiven und gram-negativen Bakterien erhalten werden. Entsprechend diesem Verfahren fluoreszieren
gram-positive Bakterien orange und gram-negative Bakterien fluoreszieren grün.In the non-living gram-negative microorganisms is the
DNA denatures and it and the resulting polyaldehyde become strong
disordered, so that there is a poor association of the acriflavin and a low uptake, and consequently a low emission of green fluorescence results. In the application of heat to the sample during 10 5 0 ^ min at "M prior to the step 6, a differentiation between gram-positive and gram-negative bacteria can be obtained. According to this method fluoresce gram-positive bacteria orange and fluoresce gram-negative bacteria green.
gram-positiven Bakteriengram positive bacteria
Verfahrenprocedure
1. Proben, die Kulturen von gram-positiven Mikroorganismen,zum
Beispiel Staphylococcus-aureus enthielten, wurden auf 1:1
mit einem Ο,ΐΐη-Natriumbarbiton-Salzsäurepuffer bei pH 5 mit
einem Gehalt von 100 ppm Calcium verdünnt. Jede Suspension
wurde während 10 min auf 1210C erhitzt und dann rasch auf A0C
abgekühlt.1. Samples containing cultures of gram-positive microorganisms, for example Staphylococcus aureus, were reduced to 1: 1
diluted with a Ο, ΐΐη sodium barbitone hydrochloric acid buffer at pH 5 with a content of 100 ppm calcium. Any suspension
was heated to 121 ° C. for 10 min and then rapidly cooled to A ° C.
2. Es erfolgten dann die Stufen 2 bis 5 entsprechend Beispiel2. Steps 2 to 5 then followed according to the example
3. Es erfolgten dann die Stufen 6 bis 10 entsprechend Beispiel3. Steps 6 to 10 then followed according to the example
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ErläuterungenExplanations
Die Färbung von gram-positiven Bakterien durch Acriflavin unterscheidet sich von der durch gram-negativenBakterion gezeigten. Staph.aureus unterscheidet sich von gram-negativen Bakterien insofern, als er Teichoinsäure, ein Ribitolphosphatpolymeres, in der Zellvand enthält und auch größere Mengen an Polysacchariden enthalt, als die3 bei gram-negativen Bakterien der Fall ist.The staining of gram-positive bacteria is differentiated by acriflavin differs from that exhibited by gram-negative bacteria. Staph.aureus differs from gram-negative bacteria in that it contains teichoic acid, a ribitol phosphate polymer, in the cell wall and also contains larger amounts of polysaccharides than is the case with gram-negative bacteria.
Bei Staph.aureus wird angenommen, daß Acriflavin sich stark mit der Teichoinsäure über die Phosphatesterbindungen und/oder mit der Polysaccharidfraktion gleichfalls durch Phosphat- oder Esterbindungen kombiniert.At Staph.aureus it is believed that acriflavin is strongly related to the teichoic acid via the phosphate ester bonds and / or with the polysaccharide fraction also combined by phosphate or ester bonds.
Der Ersatz des Phosphatpuffers durch einen Barbitonpuffer verringert die Stabilität dieser Esterbindungen und das im Erhitzungssystem enthaltene Calcium blockiert andere Phosphatgruppen. Somit zeigt entsprechend Stufe 1 Staph.aureus eine nicht-lebende, d.h., grUnfluoreszierende Färbungsreaktion im Vergleich zu ein3r in dessen Abwesenheit gezeigten lebenden Färbungsreaktion.Replacing the phosphate buffer with a barbitone buffer decreases the stability of these ester bonds and the calcium contained in the heating system blocks other phosphate groups. Thus, corresponding to level 1, Staph.aureus shows a non-living, i.e., green-fluorescent staining reaction in the Compared to a living staining reaction shown in its absence.
Verfahrenprocedure
1. Es wurde eine Verdünnung 1:10 von Milch in Wasser hergestellt und mit Alkohol fixiert, wie in Beispiel 9, Stufen 1 bis 5 beschrieben.1. A 1:10 dilution of milk in water was made and fixed with alcohol, as in Example 9, steps 1 to 5 described.
2. Das fixierte Präparat wurde in eine I^ige '.'/äßrige 4,4'-Diamino-2,2'-stilbendisulfonsäureesterlösung während 5 min bei 25"C eingetaucht.2. The fixed preparation was immersed in an aqueous 4,4'-diamino-2,2'-stilbene disulfonic acid ester solution immersed for 5 min at 25 ° C.
3. Das Präparat wurde dann in Wasser von 250C gespült.3. The preparation was then rinsed in water at 25 ° C.
4. Das Präparat wurde dann in eine 0,01%ige Acridinorangelösung in einem O,62m-Phosphatpuffer bei pH 7,2 während 5 min bei 29"C eingetaucht.4. The preparation was then immersed in a 0.01% acridine orange solution in a 0.62m phosphate buffer at pH 7.2 for 5 min 29 "C immersed.
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5. Ds ε Präparat wurde dann wie in Beispiel 2, Stufe 5, unter sucht.5. The ε preparation was then examined as in Example 2, step 5.
Unter Anwendung dieses Verfahrens zeigten gram-positive Bakterien eine orange Fluoreszenz, während gram-negative Bakterien eine tiefbraune Farbe zeigten. Der allgemeine Hintergrund war grün/ blau mit niedriger Störung durch Kasein und die Milchfettkügelchenmenbran. Die Aufnahme von Acridinorange durch Kasein und die Fettkügelchen wurde durch die Stufe 2 blockiert.Using this procedure, gram positive bacteria showed orange fluorescence while gram negative bacteria showed deep brown color. The general background was green / blue with low interference from casein and the milk fat globule membrane. The uptake of acridine orange by casein and the fat globules was blocked by stage 2.
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