NO344353B1 - Plasmider som koder for p185neu proteinsekvensvarianter og terapeutisk anvendelse derav - Google Patents
Plasmider som koder for p185neu proteinsekvensvarianter og terapeutisk anvendelse derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO344353B1 NO344353B1 NO20072457A NO20072457A NO344353B1 NO 344353 B1 NO344353 B1 NO 344353B1 NO 20072457 A NO20072457 A NO 20072457A NO 20072457 A NO20072457 A NO 20072457A NO 344353 B1 NO344353 B1 NO 344353B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- p185neu
- protein
- plasmid
- plasmids
- encoding
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 101001010820 Rattus norvegicus Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 title description 67
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 2
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 17
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 4
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101100501688 Homo sapiens ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000001855 preneoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000017793 embryonic organ development Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000051957 human ERBB2 Human genes 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001103—Receptors for growth factors
- A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører plasmidvektorer inneholdende DNA-sekvenser bestående av SEQ ID NO: 10 som koder for forkortede og chimeriske former av p185neu-protein, og anvendelse derav i DNA-vaksinering mot Her-2/neu (ErbB-2)-positive tumorer som uttrykker p185neu-protein. Plasmider ifølge oppfinnelsen er i stand til å fremkalle en beskyttende immunreaksjon som er baser på antistoff og/eller T-lymfocyttinduksjon mot p185neu-proteinuttrykkende tumorer. Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike plasmider og anvendelse derav for fremstilling av en DNA-vaksine anvendelig i forebyggende eller terapeutisk behandling av p185neu-positive tumorer.
Oppfinnelsens bakgrunn
Neoplastiske celler skiller seg ofte fra normale celler ved at de uttrykker flere proteiner unormalt. På grunn av denne unormale ekspresjonen, kan noen proteiner virke som tumorassosierte antigener (Tumor Associate Antigens) (TAA). Dette er fordi vertsimmunsystemet kan gjenkjenne disse misdannelsene og fremkalle en immunreaksjon som kan beskytte verten mot tumorigangsetting og utvikling. For å være et mål for antitumorimmunoterapi, må en TAA:
● ha en patogenetisk rolle i et visst trinn av neoplastisk vekst;
● kunne detekteres av immunsystemet selv når tumoren gir opphav til klonale varianter som ikke lenger uttrykker vesentlig histokompatibilitetskompleks (HLA) glykoproteiner;
● gjenkjennes av både antistoffer og T-lymfocytter.
Flere TAA har de senere år blitt oppdaget i humane karsinomer. Blant disse er p185neu, proteinproduktet av Her-2/neu (ErbB2)-onkogent, et spesielt tilpasset mål for immunterapi (Lollini og Forni, 2003, Trends Immunol. 24: 62). p185neu er en membranreseptor av klasse I-reseptortyrosinkinasefamilien, som også omfatter den epiderme vekstfaktorreseptor (EGF-R eller ErbB-1) og andre beslektede reseptorer (ErbB-3, ErbB-4) som har en nøkkelrolle i celleproliferasjon og differensiering (Hynes og Stern, 1994, BBA 1198: 165).
p185neu-reseptorprotein kan deles opp i tre domener: det ekstracellulære domenet (EC-domene), transmembrandomenet (TM-domene) og det intracytoplasmiske domenet (IC-domene). Nylig har den EC-domenekrystallografiske strukturen av hu mant og rotte p185neu-protein blitt publisert. Dette domenet har blitt beskrevet som å være sammensatt av fire underdomener (I/L1, II/CR1, III/L2 og IV/CR2) på totalt omkring 630 aminosyrer. Det har videre blitt vist at p185neu-protein har en uelastisk struktur, som tillater det å samvirke med andre ErbB-reseptorer, dimerisere og indusere overføring av proliferasjonssignal selv om dette proteinet ikke binder noen ligander direkte (Cho et al., 2003, Nature 421: 756).
Her-2/neu (ErbB2)-onkogen er involvert i normale prosesser av embryonal organgenese og epitelvekst, mens det hos voksne uttrykkes bare ved svake nivåer (Press et al., 1990, Oncogene 5: 953). I mennesker er overekspresjon av dette onkogenet hovedsakelig forårsaket av genforsterkning.
Her-2/neu (ErbB2)-onkogen overuttrykkes i omkring 30 % av brystkarsinomer og en slik overekspresjon er forbundet med en raskere tumorprogresjon (Slamon et al., 1989, Science 244: 707). Blant de ulike strategier som har blitt foreslått, synes DNA-vaksinasjon å være en effektiv fremgangsmåte for å fremkalle en immunreaksjon på Her-2/neu-positive tumorer. Selv om p185neu-protein er et “selv”-antigen, dvs. et protein som normalt er til stede i kroppen, utviser pasienter med p185neupositive brystkarsinomer ofte en immunreaksjon, både cellulær og humoral (Signoretti et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. 23: 1918; Disis et al., 1994, Cancer Res. 54: 16; Peoples et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 432). Ett av målene med antitumorimmunterapier rettet mot p185neu-protein er å øke reaksjonsintensiteten i pasienter med en tidligere eksisterende immunreaksjon, eller å skape en immunreaksjon i pasienter hvor denne reaksjonen ikke kan påvises. Det faktum at p185neuprotein er et “selv”-antigen medfører at vaksinen må være i stand til å overvinne en immuntolerant tilstand.
Oppfinnerne i foreliggende patentsøknad var de første til å anvende og validere effektiviteten av DNA-vaksinasjon ved å fremkalle en immunbeskyttelse både i spontane brystkarsinomer og transplanterbare Her-2/neu-positive tumorer. Disse studiene har vist at forebyggingen og behandlingen av preneoplastiske lesjoner er et mål som kan nås. I eksperimenter som sikter mot å forebygge utviklingen av spontane brysttumorer som oppstår i transgene mus grunnet rotte Her-2/neuonkogen (FVB/neuT mice and BALB-neuT mice), har det spesielt blitt vist at plasmidet som koder for rotte p185neu-protein EC- og TM-domener er i stand til å fremkalle en mer effektiv beskyttelse sammenlignet med plasmidet som koder for fullengde p185neu-protein eller plasmid som kun koder for dets EC-dome (utskilt antigen) (Amici et al., 2000, Gene Ther. 7: 703; Rovero et al., 2000, J. Immunol. 165: 5133). Lignende data har blitt rapportert av Chen et al. (1998, Cancer Res. 58: 1965). Det har videre blitt vist at effektivitet av vaksinasjon med DNA-plasmider har økt kraftig dersom den blir etterfulgt av en svært kort elektrisk puls når plasmider inokuleres intramuskulært (Quaglino et al., 2004, Cancer Res. 64: 2858).
Andre forfattere har vist at plasmider som koder for fullengde p185neu-protein, om nødvendig mutert slik at det ikke innehar tyrosinkinaseaktivitet, er effektive i å forebygge igangsettingen av tumorer etter transplantasjonen av p185neu-positive cancerceller (Wei-Zen et al., 1999, Int. J. Cancer 81: 748). De samme plasmidene har vist seg å være svært effektive selv når, berøvet for ledersignalet som er ansvarlig for proteinprosessering i det endoplasmiske reticulum, de står for den cytoplasmiske lokaliseringen av p185neu-antigen. Når plasmider som koder for p185neuprotein som befinner seg i membran takket være nærværet av et ledersignal anvendes, avhenger beskyttelser av en immunreaksjon som baserer seg på antistoff. Tvert imot observeres en T-lymfocyttmediert immunreaksjon dersom vaksine ikke inneholder et ledersignal, og følgelig samler p185neu-protein seg i cytoplasmaet av transfekterte celler heller enn på deres plasmamembran (Pilon et al., 2001, J. Immunol. 167: 3201). I tillegg blir en kombinert vaksinasjon oppnådd ved anvendelse av begge plasmider med et ledersignal og de hvori dette ledersignalet har blitt slettet, mer effektiv for beskyttelse mot tumorvekst (Piechocki et al., 2001, J. Immunol. 167: 3367). Dette viser at det finnes en synergistisk effekt mellom humorale og cellulære reaksjoner i forebyggingen av p185neu-positive karsinomer (Reilly et al., 2001, Cancer Res. 61: 880).
Vaksinering med plasmidet som koder for EC- og TM-domener (EC-TM-plasmid) har vist seg å være effektiv ikke bare i å forebygge utviklingen av spontane p185neupositive karsinomer, men også i å behandle tumormasser på 2 mm i diameter ved å involvere en rekke av effektorimmunsystemmekanismer (T-hjelper og T-nøytralisatorceller, antistoff, makrofager, nøytrofiler, naturlige nøytralisatorceller, Fc-reseptorer, IFN-gamma og perforiner), som koordinerende medvirker til tumoravstøting (Curcio et al., 2003, J. Clin. Invest. 111: 1161).
Beskrivelse av oppfinnelsen
Flere plasmider som koder for fullengde TM-domenet og stadig mindre deler av EC-domene av rotte p185neu-protein har blitt utformet. De avkortede plasmidene, oppnådd ved å slette de NH2-terminale 240 baseparene (bp) eller flere med denne lengden, ble anvendt i eksperimenter rettet mot forebygging av vekst av transplanterbare rotte p185neu-proteinoveruttrykkende tumorceller (TUBO-celler). Videre ble en serie av plasmider som koder for chimeriske p185neu-proteinformer dannet ved å tilsette NH2-terminale deler av humant ErbB2 cDNA til sekvenser som koder for de avkortede formene av rotteprotein for å rekonstruere hele proteinsekvensen.
Beskyttelse oppnådd etter vaksinasjon med plasmid som koder for fullengde EC- og TM-domenen er hovedsakelig grunnet antistoffremstilling, mens beskyttelse oppnådd ved anvendelse av plasmider som koder for de avkortede formene av rotte p185neu-protein i mange tilfeller ikke er forbundet med en vesentlig antistoffremstilling.
På grunnlag av resultatene av in vivo-eksperimentene ble plasmider i stand til å indusere en sterk immunreaksjon, både antistoff- og T-lymfocyttmediert valgt.
Oppfinnelsen refererer til plasmider inneholdende en kodingssekvens for et p185neuproteinfragment, hvilken sekvens er SEQ ID NO: 10 (referansesekvenser for gener som koder for humane og rotte p185neu-proteiner er avsatt i Gene Bank med henholdsvis aksesjonsnummer M11730 og X03362).
DNA-sekvenser som koder for den avkortede og chimeriske formen av p185neuprotein ifølge oppfinnelsen, kan innføres i enhver plasmidvektor passende for anvendelse i pattedyr, spesielt i mennesker. I tillegg til ovennevnte kodingssekvenser, kan plasmider inkludere funksjonelle elementer for å kontrollere transkripsjon, spesielt promotere, fortrinnsvis CMV-promoteren, plassert oppstrøms for kodingssekvensen, transkripsjonsinitiering og stoppsekvenser; en seleksjonsmarkør, fortrinnsvis ampicillin- eller kanamycinresistente gener; CpG-motiver; et polyadenyleringssted; og i tilfeller med forsterkere eller transkripsjonsaktivatorer. Elementene for å kontrollere transkripsjon må være passende for anvendelse med vektorer i pattedyr, spesielt i mennesker.
I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning inneholdende et DNA-plasmid definert som over, sammen med farmasøytisk akseptable vehikler og eksipienser. Alternativt kan sammensetningene inneholde tilsetninger av to eller flere forskjellige plasmider som koder for både de avkortede og chimeriske formene av p185neu-protein. De farmasøytiske sammensetningene i en passende form for parenteral administrasjon, fortrinnsvis i form av en injiserbar løsning, anvendes fortrinnsvis for DNA-vaksinasjon. Prinsipper og fremgangsmåte for DNA-vaksinasjon er kjent for fagmannen, og er beskrevet i f.eks. Liu, 2003; J. Int. Med. 253: 402.
Anvendelse av plasmider som koder for de p185neu-amplifiserte og chimeriske formene for forebyggende og terapeutisk å vaksinere mot p185neu-positive (Her-2/neu-, ErbB-2-positive) tumorer har mange fordeler som forbedrer dets effektivitet. For plasmider som koder for avkortede former er disse fordelene:
1) Muligheten for å oppnå en vaksinekoding bare for definerte TAA-deler mot hvilke det er ønsket å utvikle en immunreaksjon; denne vaksinen har en mindre sjanse til å fremkalle autoimmune fenomener.
2) Den eksklusive induksjonen av noen valgte former av immunreaksjon, dvs. en antistoffmediert form eller en T-lymfocyttmediert form.
3) Muligheten til å fremstille vaksiner som kombinerer flere epitoper med en definert immungenisitet ved å binde cDNA-fragmenter til hverandre som koder for forskjellige avkortede former, ikke nødvendigvis sekvensielt.
Anvendelsen av chimeriske plasmider generert ved en kombinasjon av avkårne former av p185neu fra en forskjellig dyreart tillater å:
a) vaksinere med plasmider som koder for proteindeterminanter av den samme arten som skal immuniseres, f.eks. mennesker, og som er i stand til å fremkalle en spesifikk høyaffinitetsreaksjon;
b) kombinere plasmider som koder for antigeniske determinanter av den samme arten som skal å immuniseres med cDNA-sekvenser som koder for antigeniske determinanter fra andre arter, hvor de antigeniske determinantene viser en vesentlig likhet, men som atskiller seg ved at de fra andre arter fremkaller en mer intens immunreaksjon, således overvinnes toleransetilstanden. Disse allogeniske determinantene, som gjenkjennes som delvis eksogene, virker som hjelpedeterminanter som forenkler induksjonen av en mer intens reaksjon og cytokinfrigiving;
c) kombinere plasmider som koder for antigeniske determinanter av den samme arten med cDNA-sekvenser som, ved å kode determinanter av en annen art, i noen individer kan forårsake heteroclytiske determinanter som binder med høyere affinitet til HLA-molekyler og induserer mer intense immunreaksjoner med en høyere affinitet;
d) ha en vaksine som kombinerer fordeler fra a) med de fra b) og c).
Riktig formulerte DNA-plasmider ifølge oppfinnelsen anvendes i preventiv eller terapeutisk behandling av mennesker eller dyr som utviser en høy risiko for å utvikle p185neu-positive karsinomer eller pasienter som bærer p185neu-positive primære tumorer, deres tilbakefall eller metastaser. Forebygging kan være primær, når tumoren ikke ennå er tydelig; sekundær når tumoren er i dens begynnerstadier som en preneoplastisk lesjon eller tertiære, der et tumortilbakefall eller en metastatisk prosess observeres.
Tumorer som kan behandles med plasmider eller sammensetninger ifølge oppfinnelsen er hovedsakelig de av epitelopprinnelse, spesielt lunge-, eggstokks- og brystadenokarsinomer; skvamøse hode- og halskarsinomer og mer generelt p185neu -proteinuttrykkende tumorer.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Konstruksjon av plasmider som koder for avkortede former av rotte p185neu-protein
Plasmidstammen pCMV3.1 (oppnådd i vårt laboratorium startende fra pcDNA3.1 fra Invitrogen, Milano, Italia) ble anvendt for å fremstille DNA-plasmidene som koder for fullengde TM-domenet og minkende deler av EC-domene av rotte p185neuprotein. pCMV3.1 inneholder rotte Her-2/neu 5’ UTR-nukleotidsekvensen (som er transkribert, men ikke translatert) og ledersekvensen (neuL). Sekresjonssignal DNA-fragmentet av rotte p185neu-protein ble oppnådd ved enzymatisk amplifisering av DNA ved anvendelse av pCMV-EC-TM-vektoren (Amici et al., 2000, Gene Ther., 7: 703; Rovero et al., 2000, J. Immunol., 165: 5133) som en modell, T7-primer som et sense-oligonukleotid (oligonukleotid #1) og et oligonukleotid (oligonukleotid #2) med et terminalt EcoRI-sete som et antisense-oligonukleotid. Etter rensing og spalting med HindIII og EcoRI restriksjonsenzymer, ble det amplifiserte fragmentet klonet inn i pCMV3.1-plasmid som hadde blitt spaltet med de samme enzymene, således ble pCMV3.1-neuL oppnådd. Deretter har syv forskjellige sekvenser som koder for de slettede fragmentene av EC-domene og fullengde TM-domene av rotte p185neu-protein blitt innført i leseramme i pCMV3.1-neuL-vektor spaltet med EcoRI og XbaI-restriksjonsenzymer. De nye plasmidene oppnådd på denne måten ble kalt pCMV3.1-neuL-rEC1-TM (-70 aminosyrer) (fig. 1), pCMV3.1-neuL-rEC2-TM (-150 aminosyrer) (fig. 2), pCMV3.1-neuL-rEC3-TM (-230 aminosyrer) (fig. 3), pCMV3.1-neuL-rEC4-TM (-310 aminosyrer) (fig. 4), pCMV3.1-neuL-rEC5-TM (-390 aminosyrer) (fig. 5), pCMV3.1-neuL-rEC6-TM (-470 aminosyrer) (fig. 6) og pCMV3.1-neuL-rEC7-TM (-550 aminosyrer) (fig. 7). Fragmentet kodet ved det første av disse plasmidene er 70 aminosyrer kortere, inklusive sekresjonssignal-aminosyresekvensen. Alle andre fragmenter er progressivt kortere med 80 aminosyrer.
Disse fragmentene har blitt fremstilt ved enzymatisk amplifisering av DNA ved anvendelse av syv forskjellige senseoligonukleotider alle med et terminalt EcoRI-restriksjonssted (oligonukleotider #3-#9) og et antisenseoligonukleotid (oligonukleotid #10) i stand til å gjenkjenne et sete kalt “pcDNA3.1/BGH Reverse Priming Site” (830-850 nt) på den 3’ enden av pCMV3.1 multiple kloningssetet. Som en DNA-modell for PCR ble pCMV-EC-TM-vektor (Amici A. et al. 2000, Gene Ther. 7: 703; Rovero et al., 2000, J. Immunol. 165: 5133) anvendt. Etter enzymatisk spalting med EcoRI og XbaI-restriksjonsenzymer, ble amplifiseringsprodukter klonet til pCMV3.1-neuL-plasmid.
Vaksinasjon med pCMV3.1-neuL-rEC4-TM-plasmid samt vaksinasjon med pCMV3.1-neuL-rEC-TM-plasmid som koder for fullengde EC- og TM-domenene, beskytter 100 % av BALB/c-mus mot å utvikle tumorer indusert ved inokulasjon av TUBO-celler. På den andre side beskytter vaksinasjon med pCMV3.1-neuL-rEC1-TM, pCMV3.1-neuL-rEC2-TM og pCMV3.1-neuL-rEC3-TM-plasmider som koder for de første tre avkortede formene av p185neu-protein 70-80 % av BALB/c-mus. pCMV3.1-neuL-rEC5-TM-plasmid som koder for den femte avkortede formen beskytter 50 % av BALB/c-mus, mens pCMV3.1-neuL-rEC6-TM- og pCMV3.1-neuL-rEC7-TM-plasmider som koder for den sjette og syvende avkortede formen induserer ingen beskyttelse. Resultatene som er oppnådd viser at cellulær reaksjon aktivert ved de p185neuprotein-avkortede formene, hvis lokalisering er cytoplasmisk, er tilstrekkelig i antitumorforebygging. Medfølgende aktivering av cellulære og humorale reaksjoner tillater imidlertid å oppnå en mer effektiv terapi (Reilly et al., 2001, Cancer Res.
61: 880). For å oppnå fremstilling av antistoff, må vaksinasjon utføres med plasmidkoding for fullengde EC- og TM-domenene av p185neu-protein. Vaksinasjon med pCMV3.1-neuL-rEC4-TM-plasmid som koder for den fjerde avkortede p185neuformen som mangler aminosyrer 1-310 er fremdeles i stand til å gi en full beskyttelse, men antistoffreaksjon er 10-ganger lavere sammenlignet med den for pCMV3.1-neuL-rEC-TM-plasmid (tabell 1).
Tabell 1
Konstruksjon av chimerisk human-rotteplasmider i stand til å kode for syv forskjellige fusjonsformer av p185neu-protein (HuRT1-7)
Flertallet av epitoper presentert av HLA er plassert på det første underdomenet (I/L1) av p185neu-protein. Chimeriske plasmider som koder for sekvenser av humant ErbB2-protein som er stadig lenger startende fra NH2-ende (den ytterste delen av EC-domene), har derfor blitt konstruert for å indusere en spesifikk immunreaksjon overfor disse epitopene. Disse nye plasmidene, kalt HuRT (Human Rat Transmembrane), ble dannet ved å tilsette de manglende delene av humant ErbB2 cDNA til sekvenser som koder for de avkortede formene av rotte p185neu-protein.
De første fem avskårne plasmidene som koder for fullengde TM-domene og stadig mindre fragmenter av EC-domene av rotte p185neu-protein, ble spaltet med HindIII og EcoRI-restriksjonsenzymer. De fem forskjellige humane cDNA-fragmentene oppnådd ved PCR og spaltet ved deres ender ble klonet innen disse fem avkortede plasmidene, slik at leseramme ble opprettholdt. cDNA-fragmentene som koder for deler av humant p185neu-protein som skal innføres, inklusive 5’ UTR-området og sekresjonssignal for å passere gjennom endoplasmisk reticulum, ble fremstilt ved amplifisering ved anvendelse av pcDNA3.1erbB2-plasmid som en modell. Seks oligonukleotider ble anvendt som primere. Senseoligonukleotidet er det samme for alle seks primere og tilsvarer T7-primer (oligonukleotid #1), mens de fem antisenseoligonukleotidene ble utformet slik at de gjenkjenner humant ErbB2 onkogen cDNA i stadig mer fremskutte stillinger på sekvensen og hadde et EcoRI-restriksjonssete på deres 3’-ender (oligonukleotider #11-#15). Etter rensing og spalting med HindIII og EcoRI-restriksjonsenzymer ble de amplifiserte fragmentene innført i tilsvarende plasmider (pCMV3.1-rEC1-TM, pCMV3.1-rEC2-TM, pCMV3.1-rEC3-TM, pCMV3.1-rEC4-TM, pCMV3.1-rEC5-TM), som hadde tidligere blitt spaltet med de samme restriksjonsenzymene. På denne måten har det blitt oppnådd fem nye plasmider (pCMV3.1-HuRT1-5) som koder for chimeriske proteiner av 689 aminosyrer i lengde, 2 aminosyrer hvorav (Glu-Phe) tilhører EcoRI-restriksjonsstedet anvendt for å sammenføye humane og rotte-DNAer. Proteinene kodet for ved disse chimeriske plasmidene atskiller seg fra hverandre ved økende deler av humant p185neu-protein og minkende deler av rotte p185neu-protein.
For å oppnå de chimeriske plasmidene som koder for de sjette og syvende avkortede formene av rotte p185neu-protein, ble to nye plasmider konstruert, hvori kloningssteder andre enn EcoRI kan anvendes, etter som et EcoRI-restriksjonssted er til stede i stillingen 1450 i human ErbB2-gensekvens. pCMV3.1 ble endret ved anvendelse av en syntetisk sekvens laget av et senseoligonukleotid (oligonukleotid #16) og et antisenseoligonukleotid (oligonukleotid #17), slik at ett av de to restriksjonsstedene for PmeI-enzym ble slettet og restriksjonsstedene for HindIII- og NheI-restriksjonsenzymene, plassert på dets multiple kloningssete, ble invertert. Den nye plasmidstammen oppnådd på denne måten ble kalt pCMV3.1H/N. Fragmenter for de sjette og syvende avkortede formene av rotte p185neu-protein ble fremstilt ved amplifisering ved anvendelse av pCMV-EC-TM-plasmid (Amici et al., 2000, Gene Ther., 7: 703; Rovero et al., 2000, J. Immunol., 165: 5133) som en modell og to forskjellige senseoligonukleotider med et NheI-restriksjonssete på deres ender (oligonukleotider #18 og #19), og antisenseoligonukleotid #10.
Etter enzymatisk spalting med restriksjonsenzymer NheI og PmeI, ble utvidelsesproduktene klonet til pCMV3.1H/N-plasmid, for således å oppnå de nye pCMV3.1H/N-rEC6-TM- og pCMV3.1H/N-rEC7-TM-plasmidene. cDNA-fragmentene som koder for deler av humant p185neu-protein som skal innføres for å generere de chimeriske pCMV3.1H/N-HuRT6 og pCMV3.1H/N-HuRT7-plasmidene, ble oppnådd ved amplifisering ved anvendelse av pcDNA3.1erbB2-plasmid som en modell, T7-primer som et senseoligonukleotid (oligonukleotid #1) og to primere fremstilt slik at de gjenkjenner human cDNA på passende stillinger og hadde et NheI-restriksjonssted på deres ender (oligonukleotider #20 og #21), som antisenseoligonukleotider.
Etter rensing og spalting med HindIII- og NheI-restriksjonsenzymer, ble de amplifiserte fragmentene innført i tilsvarende plasmider (pCMV3.1H/N-rEC6-TM; pCMV3.1H/N-rEC7-TM), som tidligere hadde blitt spaltet med de samme restriksjonsenzymene. På denne måten ble de to nye chimeriske pCMV3.1H/N-HuRT6- og pCMV3.1H/N-HuRT7-plasmidene oppnådd, som koder for proteiner av 689 aminosyrer i lengde, 2 aminosyrer hvorav (Val-Ser) tilhører NheI-restriksjonsstedet anvendt for å sammenføye humane og rotte-DNAer.
Disse manipulasjonene førte til følgende plasmider:
● pCMV3.1-HuRT1-plasmid (fig. 8), som koder for 70 aminosyrer av EC-domene av humant p185neu-protein, 2 aminosyrer tilhørende EcoRI-sete og 618 aminosyrer av rotte p185neu-protein
● pCMV3.1-HuRT2-plasmid (fig. 9), som koder for 150 aminosyrer av humant p185neu-protein EC-domene og 538 aminosyrer av rotte p185neuprotein
● pCMV3.1-HuRT3-plasmid (fig. 10), som koder for 230 aminosyrer av EC-domene av humant p185neu-protein og 458 aminosyrer av rotte p185neuprotein
● pCMV3.1-HuRT4-plasmid (fig. 11), som koder for 310 aminosyrer av EC-domene av humant p185neu-protein og 378 aminosyrer av rotte p185neuprotein
● pCMV3.1-HuRT5-plasmid (fig. 12), som koder for 390 aminosyrer av EC-domene av humant p185neu-protein og 298 aminosyrer av rotte p185neuprotein
● pCMV3.1H/N-HuRT6-plasmid (fig. 13), som koder for 470 aminosyrer av EC-domene av humant p185neu-protein og 218 aminosyrer av rotte p185neu-protein
● pCMV3.1H/N-HuRT7-plasmid (fig. 14), som koder for 550 aminosyrer av EC-domene av humant p185neu-protein og 138 aminosyrer av rotte p185neu-protein.
Det indirekte beviset på en membranekspresjon av de chimeriske humanrotteproteinene kodet for av disse plasmidene har blitt oppnådd ved å immunisere mus med de syv nye plasmidene (pCMV3.1-HuRT1-5 og pCMV3.1H/N-HuRT6-7).
Seraene fra alle vaksinerte mus har spesifikke antistoff mot det chimeriske humane og rotte p185neu-proteinet. Videre blir dyr vaksinert med plasmider som koder for de syv forskjellige chimeriske proteinene, beskyttet mot en dødelig inokulasjon av TUBO-celler og/eller humane p185neu-protein-overuttrykkende tumorceller (D2F2-E2 celler).
EKSEMPLER
Eksempel 1: Konstruksjon av pCMV3.1-HuRT5-plasmid
pCMV3.1-rEC5-TM-plasmid, som koder for den femte avkortede formen av rotte p185neu-protein, ble spaltet med HindIII og EcoRI-restriksjonsenzymer (BioLabs, Beverly, MA) for å slette 5’ UTR-området og neuL-sekvensen.
4794 bp-DNA-båndet tilsvarende pCMV3.1-rEC5-TM-plasmid som mangler 5’ UTR-området og neuL-sekvensen ble separert ved agarosegelelektroforese og eluert ved anvendelse av et Qiaquick-gelekstraksjonskit (Qiagen, Italia). cDNA for 5’ UTR-området, leadersekvens og sekvens som koder for den manglende delen av humant ErbB2-gen ble oppnådd ved PCR. pcDNA3.1ErbB2-plasmid ble anvendt som en modell, T7-primer (oligonukleotid #1) ble anvendt som et sanseoligonukleotid og en primer med et EcoRI-restriksjonssted ved dets 5’ ende (oligonukleotid #15) ble anvendt som et antisenseoligonukleotid. For å utføre PCR-reaksjonen, ble reagenser og en korrekturlesing med Taq-polymerase av Finnzymes (CELBIO, Milano, Italia) anvendt. Etter PCR-reaksjonen ble den amplifiserte DNA renset og presipitert ved standard metoder, resuspendert i 50µl H2O spaltet med HindIII- og EcoRI-restriksjonsenzymer. cDNA-fragmentet som koder for den relevante delen av human ErbB2 og det lineariserte pCMV3.1-rEC5-TM-plasmidet, ble klonet ved ligeringsreaksjon ved anvendelse av T4 DNA-ligase (BioLabs, Beverly, MA).
Ligeringsproduktet ble deretter anvendt for å omdanne DH5α-stamme E. colibakterie som hadde blitt gjort kompetent ved kalsiumkloridteknikken.
Klonene oppnådd på denne måten ble analysert ved alkalisk lysering for å påvise klonene som inneholder det chimeriske pCMV3.1-HuRT5-plasmidet.
pCMV3.1-HuRT5 ble deretter analysert ved Sanger-sekvenseringsmetoden ved anvendelse av en ABI PRISM 310-genetisk analysator automatisert sequencer (Applied Biosystem) for å verifisere at innføring av human sekvensdel som koder for ErbB2-gen i plasmid som koder for den femte beskårne formen av rotte p185neuprotein hadde funnet sted korrekt og uten å forandre leserammen.
Liste over oligonukleotider:
#1 T7 primer (SEQ ID No: 13)
#2 neu leader antisense EcoRI (SEQ ID No: 14)
#3 rECD1 sense EcoRI (SEQ ID No: 15)
#4 rECD2 sense EcoRI (SEQ ID No: 16)
#5 rECD3 sense EcoRI (SEQ ID No: 17)
#6 rECD4 sense EcoRI (SEQ ID No: 18)
#7 rECD5 sense EcoRI (SEQ ID No: 19)
#8 rECD6 sense EcoRI (SEQ ID No: 20)
#9 rECD7 sense EcoRI (SEQ ID No: 21)
#10 pcDNA3.1/BGH Reverse priming site (SEQ ID No: 22)
#11 His-Myc sense EcoRI mut (SEQ ID No: 23)
#12 His-Myc antisense EcoRI (SEQ ID No: 24)
#13 70 erbB2 antisense EcoRI (SEQ ID No: 25)
#14 150 erbB2 antisense EcoRI (SEQ ID No: 26)
#15 230 erbB2 antisense EcoRI (SEQ ID No: 27)
#16 310 erbB2 antisense EcoRI (SEQ ID No: 28)
#17 390 erbB2 antisense EcoRI (SEQ ID No: 29)
#18 HindIII-NheI sense (SEQ ID No: 30)
#19 HindIII-NheI antisense (SEQ ID No: 31)
#20 rECD6 sense HheI (SEQ ID No: 32)
#21 rECD7 sense HheI (SEQ ID No: 33)
#22 470 erbB2 antisense HheI (SEQ ID No: 34)
#23 550 erbB2 antisense HheI (SEQ ID No: 35).
Eksempel 2: in vivo-testing
Dyr
BALB/c-stamme hunnmus omkring 7 uker gamle ble anvendt i alle eksperimentene. Dyr kom fra Charles River Laboratories (Calco, Milano, Italia), hvor de hadde blitt alt opp aseptisk og i henhold til reglene etablert av EF (European Community).
Intramuskulær administrasjon etterfulgt av in vivo-elektroporering
For å unngå smerte og uønskede kontraksjoner av tibialmuskler, ble hver mus bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av 300 μl Avertin, en løsning bestående av 0,58 g tribrometanol (Sigma-Aldrich) og 310 μl tert-amylalkohol (Aldrich) i 39,5 ml deionisert H2O. Tibialmuskler i bedøvde mus ble barbert og 20 μl av en løsning inneholdende 25 μg DNA ble inokulert i hver muskel. Den DNA-inneholdende løsningen ble fremstilt rett før anvendelse i henhold til Dr. F. Pericles instruksjoner (Valentis, Inc., The Woodlands, Texas, USA). Denne løsningen inneholdt plasmid DNA ved en konsentrasjon på 1,25 mg/ml, poly-L-glutamatnatriumsalt (Sigma-Aldrich, S.r.l., Milano, Italia) ved en konsentrasjon på 6 mg/ml, natriumklorid ved en konsentrasjon på 150 mM (Fluka, BioChemika, Buchs, Sveits) og endotoksinfritt destillert vann (Nucleare Free Water, Promega Corporation) til et sluttvolum på 1ml. Etter omkring 5 minutter inokulasjon, ble to elektriske pulser, 375 V/cm2 i intensitet og 25 msek i varighet hver, generert av en Electro Square Porator-elektroporator (T820, BTX, San Diego, CA, USA) påført på begge tibialmusklene på mus ved anvendelse av to stålelektroder plassert 3 mm fra hverandre i en firkantet ordning lateralt i benet. Genimmunisering ved elektroporering ble utført to ganger i hvert dyr 21 og 7 dager før inokulasjon av tumorceller.
Inokulasjon av tumorceller
Venstre side på mus ble inokulert med 0,2 ml av en suspensjon inneholdende 2 x 105 TUBO-celler.
In vivo tumorvekstevaluering
Tumorvekst ble evaluert ukentlig ved palpasjon, og tumorstørrelse ble målt langs to perpendikulære diametre med en gauge. Neoplastiske masser på en størrelse større enn 1 millimeter ble vurdert som tumorer. Tumorvekst ble overvåket i 100 dager fra tumorinokulasjon eller til tumorstørrelse oversteg 10 millimeter i diameter, tiden når dyr ble avlivet. De oppnådde resultatene viser at chimerisk pCMV3.1-HuRT5-plasmid er i stand til å beskytte 100 % av vaksinerte BALB/c-mus fra en dødelig inokulasjon av TUBO-celler (tabell 2).
Tabell 2
Evaluering av Anti-p185neu-antistoff til stede i sera av vaskinerte dyr
Dagen før inokulasjonen av tumorceller ble det tatt blodprøve av dyr vaskinert med chimerisk pCMV3.1-HuRT5-plasmid. Sera ble analysert for å fastsette nærværet av rotte anti-p185neu-antistoff. Sera ble inkubert i 45 minutter ved 4 °C med celler som overuttrykker rotte p185neu. Etter vasking med en løsning kalt vaskebufferen, som består av fosfatbuffersaline (PBS) inneholdende 0,2 % bovint serumalbumin (BSA, Sigma, Milano, Italia) og 0,1 % natriumazid (NaN3, Sigma, Milano, Italia), ble prøver inkubert i 20 minutter ved 4 °C med et antimus immunglobulin FITC-konjugert antistoff, vasket med vaskebuffer og analysert med et FACScancytofluorimeter (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA). Samtidig ble de samme cellene inkubert med stadig mindre konsentrasjoner av monoklonalt anti-c-ErbB2/c-neu-antistoff (Ab4, Oncogene), slik at et forhold mellom fluorescensintensiteter oppnådd gjennom cytofluorimeteranalyse og konsentrasjon av anti-p185neu-antistoff i dyresera kunne avledes. De oppnådde dataene viser at alle vaksinerte dyr utviser høye nivåer av anti-rotte p185neu antistoff, og derfor er chimerisk pCMV3.1-HuRT5-plasmid effektivt for å indusere avstøting av transplanterbare p185neu-positive tumorer og for å fremkalle en spesifikk antistoffreaksjon.
Claims (10)
1. Plasmidvektor for DNA-overføring, hvilket plasmid inneholder en sekvens bestående av SEQ ID NO: 10 som koder for et chimerisk p 185neu-protein.
2. Plasmidvektor ifølge krav 1, ytterligere inneholdende en transkripsjonspromoer.
3. Plasmidvektor ifølge krav 2, hvor nevnte promoter er CMV-promoteren.
4. Plasmidvektor ifølge krav 1 – 2 som er egnet for anvendelse i pattedyr, spesielt i mennesker.
5. Farmasøytisk sammensetning inneholdende en plasmidvektor ifølge krav 1 – 3 sammen med farmasøytisk akseptable vehikler og eksipienter.
6. Sammensetning ifølge krav 5, som er egnet for parenteral administrasjon.
7. Sammensetning ifølge krav 6, i form av en injiserbar oppløsning.
8. Sammensetning ifølge krav 5, i form av en DNA-vaksine.
9. Anvendelse av plasmidvektor ifølge krav 1 – 4 for fremstilling av et terapeutisk middel som skal anvendes ved forebygging eller behandling av individer som har risiko for å utvikle p 185neu-positive tumorer eller pasienter som bærer primærtumorer, metastaser eller p 185neu-positive tilbakevendende tumorer.
10. Anvendelse ifølge krav 9 for fremstilling av en DNA-vaksine.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT001965A ITMI20041965A1 (it) | 2004-10-15 | 2004-10-15 | "dna codificante forme tronche e chimeriche della proteina p185neu e suoi usi terapeutici" |
| PCT/IB2005/003052 WO2006040660A2 (en) | 2004-10-15 | 2005-10-13 | Plasmids coding for p185neu protein sequence variants and therapeutic uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20072457L NO20072457L (no) | 2007-07-13 |
| NO344353B1 true NO344353B1 (no) | 2019-11-11 |
Family
ID=35539028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20072457A NO344353B1 (no) | 2004-10-15 | 2007-05-14 | Plasmider som koder for p185neu proteinsekvensvarianter og terapeutisk anvendelse derav |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7985582B2 (no) |
| EP (2) | EP1809668A2 (no) |
| JP (1) | JP5597346B2 (no) |
| KR (1) | KR101337706B1 (no) |
| CN (2) | CN101065399A (no) |
| AT (1) | ATE524494T1 (no) |
| AU (1) | AU2005293218B2 (no) |
| CA (1) | CA2583499C (no) |
| DK (1) | DK1939217T3 (no) |
| ES (1) | ES2370540T3 (no) |
| HK (1) | HK1150627A1 (no) |
| HR (1) | HRP20110729T1 (no) |
| IL (1) | IL182510A0 (no) |
| IT (1) | ITMI20041965A1 (no) |
| NO (1) | NO344353B1 (no) |
| PL (1) | PL1939217T3 (no) |
| PT (1) | PT1939217E (no) |
| RU (1) | RU2383620C2 (no) |
| SG (1) | SG148195A1 (no) |
| SI (1) | SI1939217T1 (no) |
| WO (1) | WO2006040660A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200703875B (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101638440B (zh) * | 2008-07-29 | 2011-10-26 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原-Fc融合蛋白及其应用 |
| EP2777711A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-09-17 | Icon Genetics GmbH | Her2/Neu cancer vaccine |
| US11667960B2 (en) * | 2016-04-20 | 2023-06-06 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Methods and systems for RNA or DNA detection and sequencing |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000044899A1 (en) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Corixa Corporation | Her-2/neu fusion proteins |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5518885A (en) * | 1994-04-19 | 1996-05-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | ERBB2 promoter binding protein in neoplastic disease |
| US7820180B2 (en) * | 2004-09-24 | 2010-10-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Listeria-based and LLO-based vaccines |
| US7794729B2 (en) | 1994-11-08 | 2010-09-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for immunotherapy of cancer |
| US20020177551A1 (en) * | 2000-05-31 | 2002-11-28 | Terman David S. | Compositions and methods for treatment of neoplastic disease |
| AU2003286770A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-06-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | METHODS FOR PROPHYLAXIS AND TREATMENT OF HER-2/neu TUMORS |
| DE10251520A1 (de) * | 2002-11-04 | 2004-05-13 | Valeo Wischersysteme Gmbh | Adapter für ein Wischblatt |
| AU2003298786A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-06-18 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators |
| ITMI20031942A1 (it) * | 2003-10-09 | 2005-04-10 | Indena Spa | Dna codificante p185^neu e suoi usi terapeutici |
-
2004
- 2004-10-15 IT IT001965A patent/ITMI20041965A1/it unknown
-
2005
- 2005-10-13 US US11/665,301 patent/US7985582B2/en active Active
- 2005-10-13 ES ES08004513T patent/ES2370540T3/es active Active
- 2005-10-13 PT PT08004513T patent/PT1939217E/pt unknown
- 2005-10-13 RU RU2007117894/13A patent/RU2383620C2/ru active
- 2005-10-13 AU AU2005293218A patent/AU2005293218B2/en active Active
- 2005-10-13 DK DK08004513.1T patent/DK1939217T3/da active
- 2005-10-13 SI SI200531425T patent/SI1939217T1/sl unknown
- 2005-10-13 ZA ZA200703875A patent/ZA200703875B/xx unknown
- 2005-10-13 CA CA2583499A patent/CA2583499C/en active Active
- 2005-10-13 EP EP05795953A patent/EP1809668A2/en not_active Withdrawn
- 2005-10-13 AT AT08004513T patent/ATE524494T1/de active
- 2005-10-13 CN CNA2005800400573A patent/CN101065399A/zh active Pending
- 2005-10-13 SG SG200808639-9A patent/SG148195A1/en unknown
- 2005-10-13 CN CN2010101923839A patent/CN101886090B/zh active Active
- 2005-10-13 EP EP08004513A patent/EP1939217B1/en active Active
- 2005-10-13 PL PL08004513T patent/PL1939217T3/pl unknown
- 2005-10-13 KR KR1020077010630A patent/KR101337706B1/ko active IP Right Grant
- 2005-10-13 JP JP2007536284A patent/JP5597346B2/ja active Active
- 2005-10-13 WO PCT/IB2005/003052 patent/WO2006040660A2/en active Application Filing
-
2007
- 2007-04-12 IL IL182510A patent/IL182510A0/en active IP Right Grant
- 2007-05-14 NO NO20072457A patent/NO344353B1/no unknown
-
2011
- 2011-05-09 HK HK11104573.4A patent/HK1150627A1/xx unknown
- 2011-06-30 US US13/173,339 patent/US8207141B2/en active Active
- 2011-10-11 HR HR20110729T patent/HRP20110729T1/hr unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000044899A1 (en) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Corixa Corporation | Her-2/neu fusion proteins |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AMICI A., et al., DNA vaccination with full-length or truncated Neu induces protective immunity against the Development of spontaneous mammary tumors in HER-2/neu transgenic mice, Gene Therapy 2000, Vol. 7, side 703-706, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7662586B2 (en) | Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof | |
| US8207141B2 (en) | Plasmids coding for p185neu protein sequence variants and therapeutic uses thereof | |
| US8389494B2 (en) | p185neu-encoding DNA and therapeutical uses thereof | |
| JP2006525787A (ja) | アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ、これをコードするヌクレオチド及びその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RE | Reestablishment of rights (par. 72 patents act) |