KR20070085298A - ｐ185ｎｅｕ 단백질 서열 변이체를 암호화하는플라스미드와 그의 치료 용도 - Google Patents

Abstract

_p185^neu-과발현 종양에 대하여 면역 반응을 유발할 수 있는 185^neu 종양 단백질(oncoprotein)의 다른 단편들을 암호화하는 서열을 포함한 DNA 플라스미드(plasmids)와 그의 약제학적 조성물이 기재되어 있다.

DNA 백신(vaccine), ｐ185ｎｅｕ 단백질.

Description

ｐ185ｎｅｕ 단백질 서열 변이체를 암호화하는 플라스미드와 그의 치료 용도{Plasmids coding for p185neu protein sequence variants and therapeutic uses thereof}

본 발명은 절단되고 키메라 형태들(chimeric forms)의 _p185^neu 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터들(plasmid vectors)과, _p185^neu 단백질을 발현시키는 Her-2/neu (EebB-2)-양성 종양에 대하여 DNA 백신(vaccination)으로의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 플라스미드들(plasmids)은 _p185^neu 단백질-발현 종양에 대하여 항체 및/또는 T 림프구 유도에 기초한 보호 면역 반응을 이끌어내는 능력이 있다. 본 발명은 더 나아가 이러한 플라스미드들을 함유하는 약제학적 조성물과 _p185^neu-양성 종양의 예방 또는 치료용 그의 용도에 관한 것이다.

종양 세포들은 종종 몇몇 단백질을 비정상적으로 발현시키는 점에 있어서 정 상 세포들과 다르다. 이런 변칙적인 발현 때문에, 어떤 단백질들은 종양 관련 항원(Tumor Associate Antigens(TAA))으로 작용할 수 있다. 이것은 숙주 면역 체계가 이들 비정상들(abnormalities)을 인지할 수 있고, 종양의 개시와 발달로부터 숙주를 보호할지도 모르는 면역 반응을 유도할 수 있기 때문이다. 항종양 면역요법(antitumoral immunotherapy)의 표적이 될, 종양 관련 항원(TAA)은 :

· 종양 성장의 일정한 단계에서 발병의 역활을 갖고 ;

· 주요 조직적합 복합체(histocompatibility complex ; HLA)인 당단백질(glicoproteins)을 더 이상 발현시키지 않는 클론 변이체들에 종양이 증가를 줄 때 일지라도 면역 체계에 의해 탐지될 수 있으며 ;

· 항체뿐만 아니라 T 림프구에 의해서도 인지되어야 한다.

몇몇의 종양 관련 항원(TAA)는 근래에 인간 악성종양(carcinomas)에서 발견되어왔다. 그들 중, Her-2/neu(ErbB2) 종양유전자(oncogene)의 단백질 생성물인, _p185^neu는 면역치료(immunotherapy)를 위해 특히 적합한 대상(target) 중에 하나이다(Lollini and Forni, 2003, Trends Immunol. 24 : 62). _p185^neu는, 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor ; EGF-R 또는 ErbB-1)와 세포 증식과 분화에서 중요한 역활을 하는 다른 연관된 수용체들(ErbB-3, ErbB-4) 역시 포함하는, 1급(class Ⅰ) 티로신 키나제 과(tyrosin kinase family)의 세포막 수용체이다(hynes and Stern, 1994, BBA 1198 : 165).

_p185^neu 수용체 단백질은 3가지 도메인(domains) : 세포외 도메인(extracellular domain ; EC domain), 막간 도메인(transmembrane domain ; TM domain), 그리고 세포질내 도메인(intracytoplasmic domain ; IC domain)으로 나뉠 수 있다. 최근, 인간과 랫트(rat) _p185^neu 단백질의 EC 도메인 결정학적인 구조(EC domain crystallographic structure)가 발표되었다. 이 도메인(domain)은 모두해서 대략 630 아미노산인 4개의 하위도메인들(subdomains)(Ⅰ/L1, Ⅱ/CR1, Ⅲ/L2 그리고 Ⅳ/CR2)로 구성되는 것으로 기재되어있다. 그것은 더욱이 _p185^neu 단백질이 다른 ErbB 수용체들과 상호작용하게 하고, 이량화(dimerize)하고, 그리고 비록 이 단백질이 리간드(ligands) 없이 직접적으로 묶일지라도, 증식 신호의 형질전환을 유발하는 고정된 형태를 갖는 것을 보여준다(Cho et al., 2003, Nature 421 : 756).

Her-2/neu(ErbB2) 종양유전자(oncogene)는 배아 기관형생(embryonic organogenesis)과 상피 성장(epithelial growth)의 정상 과정에 수반되지만, 반면에 성체에서는 단지 약한 단계로 발현된다(Press et al., 1990, Oncogene 5 : 953). 인간에 있어서, 이 종양유전자(oncogene)의 과발현(overexpression)은 주로 유전자 증식으로 일어난다. Her-2/neu(ErbB2) 종양유전자(oncogene)는 유방암(mammary carcinomas)의 약 30 %에서 과발현(overexpression)되고, 그러한 과발현(overexpression)은 보다 빠른 종양의 진행과 관련이 있다(Slamon et al,, 1989, Science 244 : 707). 제안되어온 다른 전략들 중에서, DNA 백신(vaccination)은 Her-2/neu-양성 종양들에 면역 반응을 유도하는 효과적인 방법이 될 것으로 보인다. 비록 _p185^neu 단백질이 "자가" 항원, 즉 신체에 정상적으로 존재하는 단백질이다 하더라도, _p185^neu-양성 유방암(mammary carcinomas) 환자들은 종종 세포성뿐만 아니라 체액성 면역 반응을 나타낸다(Signoretti et al., 2000, J. Natl . Cancer Inst. 23 : 1918 ; Disis et al., 1994, Cancer Res. 54 : 16 ; Peoples et al., 1995, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 92 : 432). _p185^neu 단백질에 관련된 항종양성 면역요법(antitumoral immunotherapies)의 목적 중의 하나는 미리 존재하는 면역 반응을 보이는 환자에서 반응 강도를 증가시키는 것이고, 또는 이 반응을 찾을 수 없는 환자에게서 면역 반응을 발생시키는 것이다. 사실 _p185^neu 단백질은 "자가" 항원이고, 백신으로써 면역내성 단계(immunotolerant state)를 극복할 수 있어야함을 필요로 한다.

특허 출원의 발명자들은 자발적인 유방암(mammary carcinomas)뿐만 아니라 이식 가능한 Her-2/neu-양성 종양에서 면역 보호를 유도하는 DNA 백신(vaccination)을 첫 번째로 사용했고, 그 효력을 확인했다. 이들 연구들은 발암전의 외상의 예방과 치료는 접근하기 쉬운 목표라는 것을 입증했다. 특히, 랫드(rat) Her-2/neu 종양유전자(oncogene)(FVB/neuT 쥐(mice)와 BALB-neuT 쥐(mice)로 유발된 이식유전자 쥐(transgenic mice)에서 일어나는 자발적인 유방 암(spontaneous mammary carcinomas)의 발생을 막는 것을 목표 삼는 실험에서, 랫드(rat) _p185^neu 단백질 EC와 TM 도메인(domains)에 암호화된 플라스미드(plasmid)는 전체 길이의 _p185^neu 단백질이 암호화된 플라스미드(plasmid) 또는 단지 그의 EC 도메인(domain)(분비된 항원)만이 암호화된 플라스미드(plasmid)에 비교하여 보다 효과적인 보호를 이끌어낼 능력이 있다는 것을 보여주었다(Amici et al., 2000, Gene Ther. 7 : 703 ; Rovero et al., 2000, J. Immunol . 165 : 5133). 유사한 자료가 첸 등(Chen et al.,)에 의하여 보고되어 있다(1998, Cancer Res. 58 : 1965). 더군다나, 플라스미드(plasmids)가 근육내에 접종되었을 때 매우 짧은 전기적 파동(pulse)에 의해 따르게 되면, DNA 플라스미드(plasmids)의 백신(vaccination)의 효력이 강하게 증가 되는 것을 보여주었다(Quaglino et al., 2004, Cancer Res. 64 : 2858). 티로신 키나제(tyrosine kinase) 활성을 가지지 않을 만한 변이가 만일 필요하다면, 전체 길이 _p185^neu 단백질이 암호화된 플라스미드(plasmids)가 _p185^neu-양성 암 세포의 이식에 따르는 종양의 발병을 막는데 효능이 있음을 다른 저자들은 보여주었다(Wei-Zen et al., 1999, Int . J. Cancer 81 : 748). 같은 플라스미드들(plasmids)은 소포체(endoplasmic reticulum)에서 진행되는 단백질에 원인이 되는 유도 신호(leader signal)를 빼앗겼을 때라도, _p185^neu 항원의 세포질 국소화를 가져옴에 매우 효과적임을 증명했다. 유도 신호(leader signal)의 존재 결과로 세포막에서 국소화하는 _p185^neu 단백질이 암호화된 플라스미드(plasmids)가 사용될 때, 보호는 항체들에 의지한 면역 반응에 달려있다. 반대로, 백신(vaccine)이 유도 신호(leader signal)을 포함하지 않으면, T-림프구(lymphocyte)-매개 면역 반응은 관찰되고, 그러므로 _p185^neu 단백질은 그들의 원형질 세포막 상에서 보다는 트랜스펙트된 세포(trasfected cells)의 세포질에서 국소화한다(Pilon et al., 2001, J. Immunol. 167 : 3201). 부가적으로, 조합된 백신(vaccination)는 유도 신호(leader signal)를 갖는 플라스미드들(plsmids)과 이 유도 신호(leader signal)가 삭제된 플라스미드 둘 다를 사용하여 얻으며, 종양 성장에 대하여 보호에 보다 효과적이다(Piechocki et al., 2001, J. Immunol. 167 : 3367). 이것은 _p185^neu 양성-암(carcinomas)의 예방에서 체액성과 세포질 반응 사이에 상승작용적인 효과(synergistic effect)가 있다는 것을 증명한다(Reilly et al., 2001, Cancer Res. 61 : 880).

EC와 TM 도메인(domains)(EC-TM 플라스미드)을 암호화하는 플라스미드(plasmid)를 갖는 백신(vaccination)은, 자발적인 _p185^neu 양성-암(carcinomas)의 발전을 예방하는 것뿐만 아니라, 종양 저지(tumor rejection)에 동등하게 기여하는, 주효 면역 체계 기전(헬퍼 티세포(T helper) 와 티 살세포(T killer cells), 항체(antibodies), 대식세포(macrophages), 호중구(neutrophils), 자연살세포(natural killer cells), Fc 수용체, IFN-gamma, 그리고 퍼포린(perforins)) 범위를 포함시켜, 직경 2 mm의 종양 덩어리 치료에도 효과를 증명해왔다(Curcio et al., 2003, J. Clin . Invest. 111 : 1161).

전체-길이 TM 도메인(domains)을 암호화하고 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 부분(portions)을 줄인 여러 플라스미드들(plasmids)을 구성하였다. NH₂-말단 240개의 염기쌍(bp) 또는 이 길이의 배수들을 삭제함으로써 획득된 절단 플라스미드(fruncated plasmids)가, 이식 가능한 랫드(rat) _p185^neu 단백질-과발현 종양 세포(TUBO 세포)의 성장을 막는 것을 목표로 삼는 실험에 사용되었다. 더구나, 키메릭(chimeric) _p185^neu 단백질 형태를 암호화하는 플라스미드(plasmids) 계열(series)을 전체 단백질 서열을 재구성하기 위해 랫드(rat) 단백질의 절단 형태를 암호화하는 서열에 인간 ErbB2 cDNA의 NH₂-발단 일부를 첨가함으로써 만들어졌다.

보호는 전체 길이 EC와 TM 도메인(domains)을 암호화하는 플라스미드(plasmid)의 백신화(vaccination)로 이루어진 보호는 주로 항체생산에 의한 것이고, 반면 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 절단 형태를 암호화하는 플라스미드(plasmid)를 사용하여 얻어진 보호는 많은 경우에 중요한 항체 생산에 연관이 없다.

생체 내 실험 결과에 기초하여, 항체뿐만 아니라 T-림프구 매개 둘 다, 강한 면역 반응을 일으킬 수 있는 플라스미드(plasmids)가 선택되었다.

첫 번째 관점에서, 발명은 _p185^neu 단백질 단편을 암호화한 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것으로, 서열은 SEQ ID NO : 1 - 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 ; 또는 키메릭(chimeric) _p185^neu 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드(plasmids)에 관한 것으로, 서열은 SEQ ID NO : 6 - 12로 이루어진 그룹에서 선택된다(인간과 랫드(rat) _p185^neu 단백질을 암호화하는 유전자 참조 서열은 유전자 은행(Gene Bank)에 기탁번호 NO. M11730 과 X03362으로 각각 기탁되어 있다).

본 발명에 따른 절단 및 키메릭(chimeric) 형태들의 _p185^neu 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 포유동물 특히, 인간에 사용에 적합한 어떠한 플라스미드(plasmid) 벡터(vectors)에도 삽입할 수 있다. 게다가 위에 암호화된 서열 외에도, 플라스미드(plasmids)는 전사를 조절하기 위한 기능적 요소들을 포함할 수 있으며, 특히 암호화된 서열, 전사(transcription) 개시와 중지 서열의 상류(upstream)에 프로모터(promoters), 바람직하게는 CMV 프로모터(promoter) ; 선택 표시자(selection marker), 바람직하게는 암피실린(ampicilline) 또는 카나마이신(kanamycine) 내성 유전자 ; CpG 모티프(motifs) ; 폴리아데닐레이션(polyadenilation) 부위 ; 그리고 증강제(enhancers) 또는 전사 활성화체(transcription activators)을 위치시킨다. 전사를 조절하는 요소들은 포유동물 특히, 인간의 벡터(vectors)로의 사용이 적합하여야 한다.

다른 관점에서, 발명은 위에서 정의한 바와 같은 DNA 플라스미드(plasmid)와, 약제학적으로 허용가능한 매개제(vehicles)와 부형제(excipients)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 변형적으로, 조성물은 절단되고 키메릭(chimeric) 형태 둘 다의 _p185^neu 단백질을 암호화하는 둘 또는 그 이상의 다른 플라스미드들(plasmids)의 혼합물(admixture)을 함유할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 형태, 바람직하게는 주사액 형태(injectable solution)의 약제학적 조성물은 DNA 백신(vaccination)이 바람직하게 사용된다. DNA 백신(vaccination)의 원리와 방법은 이 분야에서 숙련된 이들에게 잘 알려져 있고, 예를 들면 류(Liu) 2003 ; J. Int . Med. 253 : 402에 기술되었다.

_p185^neu-양성(Her-2/neu-, ErbB-2-양성) 종양에 대하여 예방과 치료적으로 백신화(vaccinate)하기 위한 _p185^neu 절단 및 키메릭(chimeric) 형태를 암호화하는 플라스미드들(plasmids)의 이용은, 그의 효능을 개선하는데 다양한 장점을 갖는다. 절단된 형태를 암호화하는 플라스미드(plasmids)에서, 이들 장점들은 :

1) 면역 반응을 발전시키는데 요구되는데 대하여 단지 한정된 TAA 일부를 암호화하는 백신(vaccine)을 얻을 수 있는 가능성이 있고 ;

이 백신(vaccine)은 자가면역 현상들을 유도하는데 적은 기회를 갖는다.

2) 면역 반응의 약간의 선택된 형태, 즉 항체-매개 형태 또는 T 림프구-매개 형태의 독점적 유도가 있으며,

3) 반드시 연속적이지는 않는, 다른 절단 형태를 암호화하는 cDNA 단편을 서로 결합시켜 정의된 면역원성(immunogenicity)을 갖는 복합 에피토프(multiple epitopes)를 조합한 백신(vaccines)의 생산 가능성이다.

다른 동물 종들(species)에서 _p185^neu의 절단 형태의 결합에 의해 야기된 키메릭(chimeric) 플라스미드들(plasmids)의 용도는 다음과 같다 :

(다음)

a) 특이적 고-친화성 반응을 유도할 수 있는, 예를 들어, 인간에게 면역성을 주기 위한 같은 종의 단백질 결정인자(determinants)를 암호화하는 플라스미드(plasmids)로 백신화(vaccinate)가 가능하며 ;

b) 다른 종의 항원 결정인자(antigenic determinants)를 암호화하는 cDNA 서열로 면역성을 주기 위한 같은 종의 항원 결정인자(antigenic determinants)를 암호화하는 플라스미드들(plasmids)을 조합하고, 다른 종들(species)에서는 단지 다른 실질적인 유사점을 보이는 항원 결정인자(antigenic determinants)이고, 따라서 내성 상태를 극복하는, 보다 격렬한 면역 반응을 유발한다. 부분적으로 외인성 원인으로 인정되는, 이들 유전적으로 다른 동종간의 결정인자(allogeneic determinants)는 보다 결렬한 반응의 유도와 사이토킨(cytokine) 방출을 촉진하는 헬퍼 결정인자(helper determinants)로 행동이 가능하며 ;

c) 몇몇 개체에서, 다른 종들(species)의 결정인자(determinants)를 암호화하여, cDNA 서열로 같은 종들(species)의 항원 결정인자(antigenic determinants)를 암호화하는 플라스미드들(plasmids)을 조합하고, HLA 분자에 높은 친화성(affinity)으로 결합된, 헤테로고리 화합물의 결정인자들(heteroclytic determinants)의 증가를 줄 수 있으며, 고친화성을 갖는 더욱 격렬한 면역 반응의 유발이 가능하고 ;

d) b)와 c) 장점들에 a)의 장점들을 결합한 백신(vaccine)을 갖을 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 적절히 조제된 DNA 플라스미드들(plasmids)은 _p185^neu-양성 암(carcinomas) 발생의 높은 위험을 보이는 인간 또는 동물, 또는 _p185^neu-양성 근본적 종양(primary tumors), 그들의 재발(relapses) 또는 전이(metastases)를 보이는 환자의 예방 또는 치료에 사용되어왔다. 예방은 종양이 아직 분명하지 않은 때, 초기에 가능하고 ; 2기는 종양이 전종양 외상(preneoplastic lesion)과 같은 초기 단계일 때이고, 만약 종양 재발 또는 전이의 진행이 관찰되면 3기이다.

본 발명의 플라스미드들(plasmids) 또는 조성물(compositions)로 치료가능한 종양들은 상피 기원(epithelial origin), 특히 폐(pulnonary), 난소(ovarian), 그리고 유방 선암종(mammary adenocarcinomas)의 기초적 암종 ; 편평상피의 머리와 목의 암(squamous head and neck carcinomas), 그리고 보다 일반적으로 _p185^neu 단백질-발현 종양이다.

랫드 (rat) _p 185 ^neu 단백질의 절단 형태를 암호화하는 플라스미드들( plasmids )의 구조 설계.

플라스미드 중추(backbone)인 pCMV3.1(이탈리아, 밀라노, 인비트로겐(Invitrogen)사의 pcDNA3.1로 출발하여 우리 실험실에서 획득됨)은 전체-길이 TM 도메인(domain)을 암호화하고 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 일부를 감소하는 DNA 플라스미드들(plasmids)을 생산하는데 사용되었다. pCMV3.1은 랫드(rat) Her-2/neu 5' UTR 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열(단지 번역되지 않고 전사된)과 선도 서열(leader sequence)(neuL)을 포함한다. 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 분비 신호(secretion signae) DNA 단편은 주형(template)으로 pCMV-EC-TM 벡터(vector)(Amici et al.,2000, Gene Ther., 7 : 703 ; Rovero et al., 2000, J. Immunol., 165 : 5133)를, 감작 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotide)(oligonucleotide # 1)로 T7 프라이머(primer), 항감작 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)로 말단 EcoRI 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)(oligonucleotide # 2)를 사용하여 DNA를 효소 증폭시켜 얻었다. HindⅢ와 EcoRⅠ제한효소(restriction enzymes)로 정제와 소화를 시킨 후, 증폭된 단편은 같은 효소들로 소화시킨 pCMV3.1 플라스미드(plasmid) 내로 복제되고, 이렇게하여 pCMV3.1-neuL이 획득된다. 그 후, 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)과 전체-길이 TM 도메인(domain)의 삭제된 단편들을 암호화하는 7 가지 다른 서열을 EcoRⅠ와 XbaⅠ제한 효소에 의해 소화된 pCMV3.1-neuL 벡터(vector) 안의 구조에 삽입시켰다. 그래서 얻어진 새로운 플라스미드들(plasmids)은 pCMV3.1-neuL-rEC1-TM(-70개의 아미노산)(도. 1), pCMV3.1-neuL-rEC2-TM(-150개의 아미노산)(도. 2), pCMV3.1-neuL-rEC3-TM(-230개의 아미노산)(도. 3), pCMV3.1-neuL-rEC4-TM(-310개의 아미노산)(도. 4), pCMV3.1-neuL-rEC5-TM(-390개의 아미노산)(도. 5), pCMV3.1-neuL-rEC6-TM(-470개의 아미노산)(도. 6), pCMV3.1-neuL-rEC7-TM(-550개의 아미노산)(도. 7)으로 표시하였다. 이들 플라스미드들(plasmids)의 처음으로 암호화된 단편은 분비 신호 아미노산 서열을 포함하는 70개의 아미노산으로 쇼터(shorter)이다. 모든 다른 단편들은 80개의 아미노산까지 점진적으로 짧아진다.

이들 단편들은 말단 EcoRⅠ 제한부위(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #3 - #9)를 갖는 7 가지 다른 감작 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)와 pCMV3.1 복합 복제 부위의 3' 말단에 "pcDNA3.1/BGH 역시발부위(Reverse Priming Site)"(830 - 850 nt)라고 불리우는 부위를 인식하는 능력이 있는 반감작 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #10)를 사용하여 DNA를 효소 증폭시켜 생산했다. PCR을 위한 DNA 주형(tamplate)으로, pCMV-EC-TM 벡터(vector)(Amici A, et al. 2000, Gene Ther. 7 : 703 ; Rovero et al., 2000, J. Immunol. 165 : 5133)가 사용되었다. 다음 EcoRⅠ와 XbaⅠ제한 효소들로 효소적 소화를 시키고, 증폭 산물을 pCMV3.1-neuL 플라스미드(plasmid) 내로 복제시켰다.

전체-길이 EC와 TM 도메인(domains)을 암호화하는 pCMV3.1-neuL-rEC4-TM 플라스미드(plasmid)로 백신화(vaccination)와 마찬가지로 pCMV3.1-neuL-rEC-TM 플라스미드(plasmid)로 백신화(vaccination)는 TUBO 세포들을 접종시켜 야기된 발전하는 종양으로부터 BALB/c 쥐(mice)의 100 %를 보호한다. 한편으로는, _p185^neu 단백질의 처음 3 가지 절단 형태를 암호화하는 pCMV3.1-neuL-rEC1-TM, pCMV3.1-neuL-rEC2-TM, pCMV3.1-neuL-rEC3-TM 플라스미드들(plasmids)로 백신은 BALB/c 쥐(mice)의 70 - 80 %를 보호한다. 5번째 절단 형태를 암호화하는 pCMV3.1-neuL-rEC5-TM 플라스미드(plasmid)는 BALB/c 쥐(mice)의 50 %를 보호하는 반면에, 6번째와 7번째 절단 형태를 암호화하는 pCMV3.1-neuL-rEC6-TM, pCMV3.1-neuL-rEC7-TM 플라스미드(plasmids)는 보호를 유발하지 않는다. 얻어진 결과는 국소화가 세포질인 절단 형태의 _p185^neu 단백질로 활성화된 세포질 반응은 항종양 예방에 충분함을 보여주었다. 그러나, 세포와 체액성 반응의 동반하는 활성화는 보다 효과적인 치료를 할 수 있다(Rielly et al., 2001, Cancer Res. 61 : 880). 항체 생산에 이르기 위해, 백신(vaccination)은 _p185^neu 단백질의 전체-길이 EC와 TM 도메인들(domains)을 암호화하는 플라스미드(plasmid)로 수행되어야만 한다. 1 - 310개의 아아미노산이 모자르는 4번째 절단 _p185^neu 형태를 암호화하는 pCMV3.1-neuL-rEC4-TM 플라스미드(plasmid)로의 백신은 전체 보호를 하는 것이 아직 가능하지만, 항체 반응은 pCMV3.1-neuL-rEC-TM 플라스미드(plasmid)의 바응과 비교해 10배 낮다(표 1).

표 1

플라스미드(plasmid)	쥐의 수	보호도	항체
pCMV3.1-neuL	5	0 %	-
pCMV3.1-neuL-rEC-TM	5	100 %	+++
pCMV3.1-neuL-rEC1-TM	5	80 %	-
pCMV3.1-neuL-rEC2-TM	5	75 %	-
pCMV3.1-neuL-rEC3-TM	5	70 %	-
pCMV3.1-neuL-rEC4-TM	5	100 %	+
pCMV3.1-neuL-rEC5-TM	5	50 %	-
pCMV3.1-neuL-rEC6-TM	5	0 %	-
pCMV3.1-neuL-rEC7-TM	5	0 %	-

_p 185 ^neu 단백질의 7 개의 다른 융합 형태를 암호화하는 키메릭 (chimeric) 인간-랫드(rat) 플라스미드( plasmid )의 구조 설계( HuRT1 -7)

HLA에 의해 존재되는 에피토프(epitopes)의 대다수는 _p185^neu 단백질의 첫번째 서브도메인(subdomain)(I/L1)상에 존재한다. 따라서, NH₂-끝(EC 도메인(domain)의 가장 바깥쪽 부분)에서 시작하여 점점 길어지는 인간 ErbB2 단백질의 서열을 암호화하는 키메릭 플라스미드들(chimeric plasmids)을 이들 에피토프(epitopes)에 대하여 특정한 면역 반응을 유도하기 위해 구성되었다. 표시된 HuRT(인간 랫드 트랜스세포막(Human Rat Transmembrane))인, 이들 새로운 플라스미드들(plasmids)은 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 절단 형태를 암호화하는 서열에 인간 ErbB2 cDNA의 부족한 부분을 가하여 제조되었다.

전체-길이 TM 도메인(domain)을 암호화하고 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 단편을 감소시키는 첫 번째 5 가지 절단 플라스미드들(plasmids)을 HindⅢ과 EcoRⅠ 제한 효소로 소화시켰다. PCR과 그들 끝의 소화에 의해 얻어진 5 가지 다른 인간 cDNA 단편들을 5 개의 절단 플라스미드들(plasmids) 내로 복제되고, 그래서 판독 플레임(reading frame)이 유지되었다. 5' UTR 영역과 소포체(endoplasmic reiculum)을 통한 전달을 위한 분비 신호를 포함하는, 삽입될 인간 _p185^neu 단백질의 부분을 암호화하는 cDNA 단편들을 주형(template)으로 pcDNA3.1erbB2 플라스미드(plasmid)를 사용하여 증폭시켜 생산되었다. 6 개 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)가 프라이머(primers)로 사용되었다. 감작 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotides)는 모든 6 개 프라이머(primers)로 같고, T7 프라이머(primers)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #1)와 일치하는 반면에, 5 개 반감작 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides)가 표시되어 있고, 그래서 그들은 인간 ErbB2 종양유전자(oncogene) cDNA를 서열의 점점 앞선 위치에서 인식되었고, 그들의 3' 끝(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #11 - #15)에서 EcoRⅠ 제한 부위를 갖았다. 다음 HindⅢ와 EcoRⅠ 제한 효소로 정제와 소화를 시키고, 증폭된 단편들을 동일한 제한 효소들로 미리 소화시킨 상응하는 플라스미드들(plasmids)(pCMV3.1-rEC1-TM, pCMV3.1-rEC2-TM, pCMV3.1-rEC3-TM, pCMV3.1-rEC4-TM, pCMV3.1-rEC5-TM) 내로 삽입시켰다. 이렇게 하여 5 개의 새로운 플라스미드는, 인간과 랫드(rat) DNA들을 결합시키는데 사용된 EcoRⅠ제한 부위에 속하는 2개의 아미노산(Glu-Phe), 길이에 있어서 689개의 아미노산의 키메릭 단백질(chimeric proteins)을 암호화하는 (pCMV3.1-HuRT1-5)가 획득되었다. 이들 키메릭 플라스미드들(chimeric plasmids)에 의해 암호화되는 단백질들은 인간 _p185^neu 단백질의 부위를 증가시키고 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 부위를 감소시켜 각각 서로 다르다.

랫드(rat) _p185^neu 단백질의 6 번째와 7 번째 절단 형태를 암호화하는 키메릭 플라스미드들(chimeric plasmids)을 얻기 위해, 두 새로운 플라스미드들(plasmids)이 EcoRⅠ사용되는 것과는 다른 부위들을 복제하여 구성하고, 마찬가지로 EcoRⅠ 제한 부위는 인간 ErbB2 유전자 서열의 1450 위치에 존재한다. pCMV3.1은 감작 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotides)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #16)과 반감작 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #17)로 만들어진 합성 서열을 사용하여 수정되었고, 그래서 PmeⅠ 효소의 두 제한 부위들 중 하나는 삭제되고, 복합 복제 부위(multiple cloning site) 상에 위치한 HindⅢ와 NheⅠ 제한 효소들의 제한 부위는 반전되었다. 그래서 획득된 새로운 플라스미드(plasmid) 중추(backbone)는 pCMV3.1H/N로 표시되었다. 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 6 번째와 7 번째 절단 형태의 단편들은, 그들의 끝(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #18과 #19)의 NheⅠ 제한 부위의 두 다른 감각 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotides)와 반감작 올리고뉴클레오타이드 # 10(antisense oligonucleotides # 10)와 주형(tmplate)으로 pCMV-EC-TM 플라스미드(plasmid)(Amici et al., 2000, Gene Ther., 7 : 703 ; Rovero et al., 2000, J. Immunol., 165 : 5133)를 사용하여 증폭시켜 생산되었다.

다음 제한 효소 NheⅠ으로 PmeⅠ의 효소 소화시키고, 증폭 생산물은 pCMV3.1H/N 플라스미드(plasmid) 안으로 복제되고, 그래서 새로운 pCMV3.1H/N-rEC6-TM과 pCMV3.1H/N-rEC7-TM 플라스미드들(plasmids)이 획득됐다. 키메릭(chimeric) pCMV3.1H/N-HuRT6와 pCMV3.1H/N-HuRT7 플라스미드들(plasmids)을 형성하기 위해 삽입되는 인간 _p185^neu 단백질의 일부를 암호화하는 cDNA 단편들을, 주형(template)으로 pcDNA3.1erbB2 플라스미드(plasmid), 감작 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotides)(올리고뉴크레오타이드(oligonucleotide) #1)로 T7를 사용하여 증폭시켜 획득되고, 두 프라이머(primers)는 표시되었으며, 그래서 그들은 적합한 위치에서 인간 cDNA를 인식하고, 반감작 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides)로 그들의 끝(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #20와 #21)에서 NheⅠ 제한 부위를 갖는다.

다음 제한 효소 HindⅢ과 NheⅠ로 정제와 소화시키고, 증폭된 단편들을,동일한 제한 효소로 사전에 소화시킨, 대응하는 플라스미드들(plasmids)(pCMV3.1H/N-rEC6-TM ; pCMV3.1H/N-rEC7-TM) 안으로 삽입되었다. 이렇게 하여 인간과 랫드(rat) DNA들을 결합시키는데 사용된 NheⅠ제한 부위에 속하는 2개의 아미노산(Val-Ser), 길이에 있어서 689개의 아미노산의 단백질을 암호화하여, 2 개의 새로운 키메릭(chimeric) pCMV3.1H/N-HuRT6와 pCMV3.1H/N-HuRT7 플라스미드들(plasmids)이 획득되었다.

이들 조작들은 다음 플라스미드들(plasmids)에 도입되었다 :

·인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 70개의 아미노산, EcoRⅠ 부위에 속하는 2개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 618개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1-HuRT1 플라스미드(plasmid)(도. 8)

· 인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 150개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 538개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1-HuRT2 플라스미드(plasmid)(도. 9)

· 인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 230개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 458개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1-HuRT3 플라스미드(plasmid)(도. 10)

· 인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 310개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 378개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1-HuRT4 플라스미드(plasmid)(도. 11)

· 인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 390개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 298개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1-HuRT5 플라스미드(plasmid)(도. 12)

· 인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 470개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 218개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1H/N-HuRT6 플라스미드(plasmid)(도. 13)

· 인간 _p185^neu 단백질의 EC 도메인(domain)의 550개의 아미노산과 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 138개의 아미노산을 암호화하는 pCMV3.1H/N-HuRT1 플라스미드(plasmid)(도. 14).

이들 플라스미드들(plasmids)로 암호화된 키메릭 인간-랫드 단백질들(chimeric human-rat proteins)의 세포막 발현의 간접적인 증거가 7 개의 새로운 플라스미드(plasmids)(pCMV3.1H/N-HuRT1-5와 pCMV3.1H/N-HuRT6-7)로 쥐(mice)를 면역화시켜 얻어졌다. 모든 백신된 쥐(mice)의 혈청들은 키메릭(chimeric) 인간과 랫드(rat) _p185^neu 단백질에 대하여 특이적인 항체들을 갖는다. 더군다나, 7 가지 다른 키메릭 단백질들(chimeric proteins)을 암호화하는 플라스미드들(plasmids)로 백신된 동물들은 TUBO 및/또는 인간 _p185^neu 단백질-과발현 종양 세포(D2F2-E2 세포들)의 치사접종(lethal inoculation)으로부터 보호되었다.

도. 1은 pCMV3.1-neuL-rECD1-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 2는 pCMV3.1-neuL-rECD2-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 3은 pCMV3.1-neuL-rECD3-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 4는 pCMV3.1-neuL-rECD4-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 5는 pCMV3.1-neuL-rECD5-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 6은 pCMV3.1-neuL-rECD6-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 7은 pCMV3.1-neuL-rECD7-TM 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 8은 pCMV3.1-HURT1 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 9는 pCMV3.1-HURT2 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 10은 pCMV3.1-HURT3 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 11은 pCMV3.1-HURT4 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 12는 pCMV3.1-HURT5 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 13은 pCMV3.1-HURT6 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

도. 14는 pCMV3.1-HURT7 플라스미드(plasmid)에 관한 도이다.

실시예 1 : pCMV3 .1- HURT5 플라스미드( plasmid )의 구조

랫드(rat) _p185^neu 단백질의 5 번째 절단 형태를 암호화하는 pCMV3.1-neuL-rECD5-TM 플라스미드(plasmid)를 5' UTR 지역과 neuL 서열을 삭제하기 위해 HindⅢ과 EcoRⅠ 제한 효소(BioLabs, Beverly, MA)로 소화시켰다.

5' UTR 지역과 neuL 서열이 결실한 pCMV3.1-rEC5-TM 플라스미드(plasmid)에 상응하는 4794 bp DNA 밴드(band)는 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분리시키고, 퀴아퀵 젤 추출 키트(Qiaquick gel extraction kit)(Qiagen, Italy)을 사용하여 용리 시켰다.

5' UTR 구역의 cDNA, 리더(leader) 서열과 인간 ErbB2 유전자의 결실 부분을 암호화하는 서열이 PCR에 의해 얻어졌다. pcDNA3.1 ErbB2 플라스미드(plasmid)를 주형(template)으로 사용되었고, T7 프라이머(primer)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #1)가 감작 올리고뉴클레오타이드(sense oligonucleotide)로 사용되었으며, 그의 5' 끝(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #15)에 EcoRⅠ 제한 부위를 갖는 프라이머(primer)는 반감작 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)로 사용되었다. PCR 반응을 실행하기 위해서, 시약들과 핀자임(Finnzymes)의 교정 택(Taq) 폴리메라제(CELBIO, Milan, Italy)가 쓰인다.

PCR 반응 후, 증폭된 DNA는 표준 방법들로 정제되고 침전시킨 후, 50 μl H₂O에서 재현탁시키고, HindⅢ과 EcoRⅠ 제한 효소로 소화시킨다. 인간 ErbB2의 관련된 일부를 암호화는 cDNA 단편과 직선화된 pCMV3.1-rEC5-TM 플라스미드(plasmid)를 T4 DNA 리가제(ligase)(BioLabs, Beverly, MA)를 사용하여 결찰 반응(ligation reaction)에 의해 복제시켰다.

다음 결찰(ligation) 생성물을 칼슘 클로라이드 기법(calcium chloride technique)으로 적합하게 만들어진 DH5α 계통 E. coli 박테리아(bacteria)를 변형시키는데 사용되었다.

그래서 얻어진 클론들(clones)은 키메릭(chimeric) pCMV3.1-HuRT5 플라스미드(plasmid)를 포함하는 클론들(clones)을 확인하기 위해 알칼리 분해(alcaline lysis)시켜 분석되었다.

다음 pCMV3.1-HuRT5는 랫드(rat) _p185^neu 단백질의 5 번째 절단 형태를 암호화 하는 플라스미드(plasmid) 내부에 ErbB2 유전자를 암호화하는 인간 서열 일부의 삽입이 올바른 장소에, 판독 플레임(reading frame)을 바꾸지 않고, 이루어졌음을 입증하기 위해 에이비아이 프리즘 310 유전자분석기(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer)의 자동화된 순서결정기(automated sequencer)(Biosystem이 적용된)를 사용하는 생거 서열법(Sanger sequencing method)에 의해 분석되었다.

실시예 2: 생체 내 실험

동물

약 7-주된 BALB/c 계통 암컷 쥐(mice)가 모든 실험에 사용되었다. 동물들은 찰스 리버 래보리토리스(Charles River Laboratories)(Calco, Milan, Italy)에서 무균 사육되고 유럽 공동체(European Community)에 의해 제정된 규정에 따른 것들이다.

근육내 투여 다음의 생체 내 전기착공( eletroporation )

경골 근육(tibial muscles)의 고통과 바라지않는 수축을 피하기 위해, 각각의 쥐(mouse)는 300 μl 알버틴(Avertin), 탈이온화된 물(H₂O) 39.5 ml에 트리브로모에탄올(tribromoethanol)(Sigma-Aldrich) 0.58 g과 터트-아밀 알코올(Tert-Amyl alcohol)(Aldrich) 310 μl로 구성된 용액을 복막내 주사(intraperitoneal injection)로 마취시켰다. 마취된 쥐(mice)의 경골 근육(tibial muscles)을 면도하고, 25 μg DNA를 함유하는 용액 20 μl를 각각의 근육에 접종했다. DNA-함유 용액은 에프.페리클 박사의 지시(Dr. F. Pericles's instructions)(Valentis, Inc., The Woodlands, Texas, USA)에 따라 사용 전에 바로 준비되었다. 이 용액은 1 ml의 최종 부피로 1.25 mg/ml 농도의 플라스미드(plasmid) DNA, 6 mg/ml 농도의 폴리-엘-글루타메이트 소디움 염(poly-L-glutamate sodium salt)(Sigma-Aldrich, S.r.l., Milan, Italy), 150 mM 농도의 소디움 클로라이드(sodium chloride)(Fluka, BioChemika, Buchs, Switzerland), 그리고 내 독소가 없는 증류수(endotoxin-free distilled water)(Nucleare Free Water, Promega Corporation)를 함유한다. 접종 약 5 분 후, 일렉트로 스퀘어 포레이터 전기착공기(Electro Square Porator electroporator)(T820, BTX, San Diego, CA, USA)로 발생된 각각 강도 375 V/cm²와 지속 25 msec의 두 전기 파동(electrical pulses)을, 다리에 측면으로 사변형의 배치에서 3 mm 떨어진 위치에 두 강철(steel) 전극을 사용하여 쥐(mice)의 양쪽 경골 근육에 적용했다. 전기착공(electroporation)에 의한 유전자 면역성부여(gene immunication)는 종양 세포들의 접종 전 21일 과 7일에 각각의 동물에 2회 실행하 였다.

종양 세포들의 접종

쥐(mice)의 왼쪽 부위에 2 × 10⁵ TUBO 세포를 함유하는 현탁액 0.2 ml를 접종했다.

생체 내의 종양 성장 평가

종양 성장은 매주 촉진(palpation)으로 평가되었고, 종양 크기는 게이지(gauge)로 두 개의 수직 지름(perpendicular diameters)을 따라 측정하였다. 1 밀리미터(millimeter) 보다 큰 크기의 종양 덩어리(neoplastic masses)를 종양(tumors)으로 취급하였다. 종양 성장은 종양 접종에서 100 일 동안 또는 직경 10 밀리미터(millimeters)를 초과된 종양 크기까지 감시하고, 그때 동물들을 희생시켰다. 얻어진 결과들은 키메릭(chimeric) pCMV3.1-HuRT5 플라스미드(plasmid)는 TUBO 세포들의 치사 접종에서 백신화된 BALB/c 쥐(mice)의 100 % 보호가 가능하다는 것을 보였다(표 2).

표 2

플라스미드(plasmid)	쥐의 수	보호도	생존(일)
pCMV3.1-neuL	5	0 %	+ 35
pCMV3.1-neuL-rEC-TM	5	100 %	+ 100
pCMV3.1-HuRT5	5	100 %	+ 100

백신화된 동물의 혈청에서 항- _p 185 ^neu 항체 존재 평가

종양 세포들의 접종 바로 전일, 혈액을 키메릭(chimeric) pCMV3.1-HuRT5 플 라스미드(plasmid)로 백신화된 동물들에서 뽑아냈다. 혈청은 랫드(rat) 항-_p185^neu 항체의 존재를 평가하기 위해 분석되었다. 혈청은 랫드(rat) _p185^neu를 과발현하는 세포러 4 ℃에서 45 분 동안 배양했다.

0.2 % 소 혈청 알부민(bovine serume albumin ; BSA, Sigma, Milan, Italy)와 0.1 % 소디움 아지드(sodium azide)(NaN₃, Sigma, Milan, Italy)를 포함하는 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline ; PBS)로 구성된 세척 완충제(washing buffer)로 불리우는 용액으로 세척 후, 시료들을 항-쥐 면역글로불린 FITC-접합 항체(anti-mouse immunoglobulin FITC-conjugated antibody)로 4 ℃에서 20 분 동안 배양하고, 세척 완충제(washing buffer)로 세척하고, 다음 팩스캔 싸이토후루오리메타(FACScan cytofluorimeter)(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, Califonia, USA)로 분석했다. 동시에, 동일 세포들을 모노크로날 항-c-ErbB2/c- neu 항체(Ab4, 종양 유전자(oncogene))의 농도를 감소시켜 배양하고, 그래서, 싸이토후루오리메타(cytofluorimeter) 분석을 통해 획득된 형광도(fluorescence intensities)와 동물 혈청의 항-_p185^neu 항체의 농도 사이의 관계가 추론될 수 있었다. 얻어진 자료들은 모든 백신화된 동물들이 항-랫드(rat) _p185^neu 항체를 높은 수준으로 나타내고 있음을 보여주고, 그런 까닭에 키메릭(chimeric) pCMV3.1-HuRT5 플라스미드(plasmid)는 이식가능한 _p185^neu-양성 종양의 거부를 유발하고 특이적 항체 반응을 이끌어내는데 효과적이다.

<110> AMICI, AUGUSTO MARCHINI, CRISTINA QUAGLINO, ELENA CAVALLO, FEDERICA FORNI, GUIDO <120> PLASMIDS CODING FOR P185NEU PROTEIN SEQUENCE VARIANTS AND THERAPEUTIC USES THEREOF <130> 7353MEUR <150> PCT/IT MI2004A001965 <151> 2004-10-15 <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1951 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60 cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcgga attcctctca ttcctgcagg acatccagga 120 agttcagggt tacatgctca tcgctcacaa ccaggtgaag cgcgtcccac tgcaaaggct 180 gcgcatcgtg agagggaccc agctctttga ggacaagtat gccctggctg tgctagacaa 240 ccgagatcct caggacaatg tcgccgcctc caccccaggc agaaccccag aggggctgcg 300 ggagctgcag cttcgaagtc tcacagagat cctgaaggga ggagttttga tccgtgggaa 360 ccctcagctc tgctaccagg acatggtttt gtggaaggac gtcttccgca agaataacca 420 actggctcct gtcgatatag acaccaatcg ttcccgggcc tgtccacctt gtgcccccgc 480 ctgcaaagac aatcactgtt ggggtgagag tccggaagac tgtcagatct tgactggcac 540 catctgtacc agtggttgtg cccggtgcaa 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cttcggggcc aggagtgtgt ggaggagtgc cgagtatgga aggggctccc 1680 ccgggagtat gtgagtgaca agcgctgtct gccgtgtcac cccgagtgtc agcctcaaaa 1740 cagctcagag acctgctttg gatcggaggc tgatcagtgt gcagcctgcg cccactacaa 1800 ggactcgtcc tcctgtgtgg ctcgctgccc cagtggtgtg aaaccggacc tctcctacat 1860 gcccatctgg aagtacccgg atgaggaggg catatgccag ccgtgcccca tcaactgcac 1920 ccactcctgt gtggatctgg atgaacgagg ctgcccagca gagcagagag ccagcccggt 1980 gacattcatc attgcaactg tagagggcgt cctgctgttc ctgatcttag tggtggtcgt 2040 tggaatccta atcaaacgaa ggagacagaa gatccggaag tatacgatgt aa 2092 <210> 10 <211> 2092 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> homo sapiens/rattus norvegicus chimera <400> 10 cggagccgca gtgagcacca tggagctggc ggccttgtgc cgctgggggc tcctcctcgc 60 cctcttgccc cccggagccg cgagcaccca agtgtgcacc ggcacagaca tgaagctgcg 120 gctccctgcc agtcccgaga cccacctgga catgctccgc cacctctacc agggctgcca 180 ggtggtgcag ggaaacctgg aactcaccta cctgcccacc aatgccagcc tgtccttcct 240 gcaggatatc caggaggtgc agggctacgt gctcatcgct cacaaccaag tgaggcaggt 300 cccactgcag aggctgcgga ttgtgcgagg cacccagctc tttgaggaca actatgccct 360 ggccgtgcta gacaatggag acccgctgaa caataccacc cctgtcacag gggcctcccc 420 aggaggcctg cgggagctgc agcttcgaag cctcacagag atcttgaaag gaggggtctt 480 gatccagcgg aacccccagc tctgctacca ggacacgatt ttgtggaagg acatcttcca 540 caagaacaac cagctggctc tcacactgat agacaccaac cgctctcggg cctgccaccc 600 ctgttctccg atgtgtaagg gctcccgctg ctggggagag agttctgagg attgtcagag 660 cctgacgcgc actgtctgtg ccggtggctg tgcccgctgc aaggggccac tgcccactga 720 ctgctgccat gagcagtgtg ctgccggctg cacgggcccc aagcactctg actgcctggc 780 ctgcctccac ttcaaccaca gtggcatctg tgagctgcac tgcccagccc tggtcaccta 840 caacacagac acgtttgagt ccatgcccaa tcccgagggc cggtatacat tcggcgccag 900 ctgtgtgact gcctgtccct acaactacct ttctacggac gtgggatcct gcaccctcgt 960 ctgccccctg cacaaccaag aggtgacagc agaggatgga acacagcggt gtgagaagtg 1020 cagcaagccc tgtgcccgag tgtgctatgg tctgggcatg gagcacttgc gagaggtgag 1080 ggcagttacc agtgccaata tccaggagtt tgctggctgc aagaagatct ttgggagcct 1140 ggcatttctg ccggagagct ttgatgggga cccagcctcc aacactgccg aattcgctcc 1200 gctgaggcct gagcagctcc aagtgttcga aaccctggag gagatcacag gttacctgta 1260 catctcagca tggccagaca gtctccgtga cctcagtgtc ttccagaacc ttcgaatcat 1320 tcggggacgg attctccacg atggcgcgta ctcattgaca ctgcaaggcc tggggatcca 1380 ctcgctgggg ctgcgctcac tgcgggagct gggcagtgga ttggctctga ttcaccgcaa 1440 cgcccatctc tgctttgtac acactgtacc ttgggaccag ctcttccgga acccacatca 1500 ggccctgctc cacagtggga accggccgga agaggattgt ggtctcgagg gcttggtctg 1560 taactcactg tgtgcccacg ggcactgctg ggggccaggg cccacccagt gtgtcaactg 1620 cagtcatttc cttcggggcc aggagtgtgt ggaggagtgc cgagtatgga aggggctccc 1680 ccgggagtat gtgagtgaca agcgctgtct gccgtgtcac cccgagtgtc agcctcaaaa 1740 cagctcagag acctgctttg gatcggaggc tgatcagtgt gcagcctgcg cccactacaa 1800 ggactcgtcc tcctgtgtgg ctcgctgccc cagtggtgtg aaaccggacc tctcctacat 1860 gcccatctgg aagtacccgg atgaggaggg catatgccag ccgtgcccca tcaactgcac 1920 ccactcctgt gtggatctgg atgaacgagg ctgcccagca gagcagagag ccagcccggt 1980 gacattcatc attgcaactg tagagggcgt cctgctgttc ctgatcttag tggtggtcgt 2040 tggaatccta atcaaacgaa ggagacagaa gatccggaag tatacgatgt aa 2092 <210> 11 <211> 2092 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> homo sapiens/rattus norvegicus chimera <400> 11 cggagccgca gtgagcacca tggagctggc ggccttgtgc cgctgggggc tcctcctcgc 60 cctcttgccc cccggagccg cgagcaccca agtgtgcacc ggcacagaca tgaagctgcg 120 gctccctgcc agtcccgaga cccacctgga catgctccgc cacctctacc agggctgcca 180 ggtggtgcag ggaaacctgg aactcaccta cctgcccacc aatgccagcc tgtccttcct 240 gcaggatatc caggaggtgc agggctacgt gctcatcgct cacaaccaag tgaggcaggt 300 cccactgcag aggctgcgga ttgtgcgagg cacccagctc tttgaggaca actatgccct 360 ggccgtgcta gacaatggag acccgctgaa caataccacc cctgtcacag gggcctcccc 420 aggaggcctg cgggagctgc agcttcgaag cctcacagag atcttgaaag gaggggtctt 480 gatccagcgg aacccccagc tctgctacca ggacacgatt ttgtggaagg acatcttcca 540 caagaacaac cagctggctc tcacactgat agacaccaac cgctctcggg cctgccaccc 600 ctgttctccg atgtgtaagg gctcccgctg ctggggagag agttctgagg attgtcagag 660 cctgacgcgc actgtctgtg ccggtggctg tgcccgctgc aaggggccac tgcccactga 720 ctgctgccat gagcagtgtg ctgccggctg cacgggcccc aagcactctg actgcctggc 780 ctgcctccac ttcaaccaca gtggcatctg tgagctgcac tgcccagccc tggtcaccta 840 caacacagac acgtttgagt ccatgcccaa tcccgagggc cggtatacat tcggcgccag 900 ctgtgtgact gcctgtccct acaactacct ttctacggac gtgggatcct gcaccctcgt 960 ctgccccctg cacaaccaag aggtgacagc agaggatgga acacagcggt gtgagaagtg 1020 cagcaagccc tgtgcccgag tgtgctatgg tctgggcatg gagcacttgc gagaggtgag 1080 ggcagttacc agtgccaata tccaggagtt tgctggctgc aagaagatct ttgggagcct 1140 ggcatttctg ccggagagct ttgatgggga cccagcctcc aacactgccc cgctccagcc 1200 agagcagctc caagtgtttg agactctgga agagatcaca ggttacctat acatctcagc 1260 atggccggac agcctgcctg acctcagcgt cttccagaac ctgcaagtaa tccggggacg 1320 aattctgcac aatggcgcct actcgctgac cctgcaaggg ctgggcatca gctggctggg 1380 gctgcgctca ctgagggaac tgggcagtgg actggccctc atccaccatg ctagccgcaa 1440 cgcccatctc tgctttgtac acactgtacc ttgggaccag ctcttccgga acccacatca 1500 ggccctgctc cacagtggga accggccgga agaggattgt ggtctcgagg gcttggtctg 1560 taactcactg tgtgcccacg ggcactgctg ggggccaggg cccacccagt gtgtcaactg 1620 cagtcatttc cttcggggcc aggagtgtgt ggaggagtgc cgagtatgga aggggctccc 1680 ccgggagtat gtgagtgaca agcgctgtct gccgtgtcac cccgagtgtc agcctcaaaa 1740 cagctcagag acctgctttg gatcggaggc tgatcagtgt gcagcctgcg cccactacaa 1800 ggactcgtcc tcctgtgtgg ctcgctgccc cagtggtgtg aaaccggacc tctcctacat 1860 gcccatctgg aagtacccgg atgaggaggg catatgccag ccgtgcccca tcaactgcac 1920 ccactcctgt gtggatctgg atgaacgagg ctgcccagca gagcagagag ccagcccggt 1980 gacattcatc attgcaactg tagagggcgt cctgctgttc ctgatcttag tggtggtcgt 2040 tggaatccta atcaaacgaa ggagacagaa gatccggaag tatacgatgt aa 2092 <210> 12 <211> 2092 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> homo sapiens/rattus norvegicus chimera <400> 12 cggagccgca gtgagcacca tggagctggc ggccttgtgc cgctgggggc tcctcctcgc 60 cctcttgccc cccggagccg cgagcaccca agtgtgcacc ggcacagaca tgaagctgcg 120 gctccctgcc agtcccgaga cccacctgga catgctccgc cacctctacc agggctgcca 180 ggtggtgcag ggaaacctgg aactcaccta cctgcccacc aatgccagcc tgtccttcct 240 gcaggatatc caggaggtgc agggctacgt gctcatcgct cacaaccaag tgaggcaggt 300 cccactgcag aggctgcgga ttgtgcgagg cacccagctc tttgaggaca actatgccct 360 ggccgtgcta gacaatggag acccgctgaa caataccacc cctgtcacag gggcctcccc 420 aggaggcctg cgggagctgc agcttcgaag cctcacagag atcttgaaag gaggggtctt 480 gatccagcgg aacccccagc tctgctacca ggacacgatt ttgtggaagg acatcttcca 540 caagaacaac cagctggctc tcacactgat agacaccaac cgctctcggg cctgccaccc 600 ctgttctccg atgtgtaagg gctcccgctg ctggggagag agttctgagg attgtcagag 660 cctgacgcgc actgtctgtg ccggtggctg tgcccgctgc aaggggccac tgcccactga 720 ctgctgccat gagcagtgtg ctgccggctg cacgggcccc aagcactctg actgcctggc 780 ctgcctccac ttcaaccaca gtggcatctg tgagctgcac tgcccagccc tggtcaccta 840 caacacagac acgtttgagt ccatgcccaa tcccgagggc cggtatacat tcggcgccag 900 ctgtgtgact gcctgtccct acaactacct ttctacggac gtgggatcct gcaccctcgt 960 ctgccccctg cacaaccaag aggtgacagc agaggatgga acacagcggt gtgagaagtg 1020 cagcaagccc tgtgcccgag tgtgctatgg tctgggcatg gagcacttgc gagaggtgag 1080 ggcagttacc agtgccaata tccaggagtt tgctggctgc aagaagatct ttgggagcct 1140 ggcatttctg ccggagagct ttgatgggga cccagcctcc aacactgccc cgctccagcc 1200 agagcagctc caagtgtttg agactctgga agagatcaca ggttacctat acatctcagc 1260 atggccggac agcctgcctg acctcagcgt cttccagaac ctgcaagtaa tccggggacg 1320 aattctgcac aatggcgcct actcgctgac cctgcaaggg ctgggcatca gctggctggg 1380 gctgcgctca ctgagggaac tgggcagtgg actggccctc atccaccata acacccacct 1440 ctgcttcgtg cacacggtgc cctgggacca gctctttcgg aacccgcacc aagctctgct 1500 ccacactgcc aaccggccag aggacgagtg tgtgggcgag ggcctggcct gccaccagct 1560 gtgcgcccga gggcactgct ggggtccagg gcccacccag tgtgtcaact gcagccagtt 1620 ccttcggggc caggagtgcg tggaggaatg ccgagtactg caggggctcg ctagcctccc 1680 ccgggagtat gtgagtgaca agcgctgtct gccgtgtcac cccgagtgtc agcctcaaaa 1740 cagctcagag acctgctttg gatcggaggc tgatcagtgt gcagcctgcg cccactacaa 1800 ggactcgtcc tcctgtgtgg ctcgctgccc cagtggtgtg aaaccggacc tctcctacat 1860 gcccatctgg aagtacccgg atgaggaggg catatgccag ccgtgcccca tcaactgcac 1920 ccactcctgt gtggatctgg atgaacgagg ctgcccagca gagcagagag ccagcccggt 1980 gacattcatc attgcaactg tagagggcgt cctgctgttc ctgatcttag tggtggtcgt 2040 tggaatccta atcaaacgaa ggagacagaa gatccggaag tatacgatgt aa 2092 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 taatacgact cactataggg 20 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 catggaattc cgcgattccg gggggcagga 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 catggaattc ctctcattcc tgcaggacat 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 catggaattc aagggaggag ttttgatccg 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 catggaattc cggctgccca ctgactgctg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 catggaattc tcctgcactc tggtgtgtcc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 catggaattc gctccgctga ggcctgagca 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 catggaattc cgcaacgccc atctctgctt 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 catggaattc gggctccccc gggagtatgt 30 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 tagaaggcac cagtcgaggc t 21 <210> 23 <211> 69 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 aattgcatca tcatcatcat cataatggtc ataccggtga acaaaaactc atctcagaag 60 aggatctgg 69 <210> 24 <211> 69 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 aattccagat cctcttctga gatgagtttt tgttcaccgg tatgaccatt atgatgatga 60 tgatgatgc 69 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 ccgggaattc gctggcattg gtgggcaggt 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 ccgggaattc tttcaagatc tctgtgaggc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 ccgggaattc tggccccttg cagcgggcac 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 ccgggaattc ggatcccacg tccgtagaaa 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 ccgggaattc ggcagtgttg gaggctgggt 30 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 ctaggaagct tgtttaactt gctagct 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 agctagctag caagttaaac aagcttc 27 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 catggctagc cgcaacgccc atctctgctt 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 catggctagc ctcccccggg agtatgtgag 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 catggctagc atggtggata gggccagtcc 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 catggctagc agacccctgc agtactcggc 30

Claims (10)

1. _p185^neu 단백질 단편을 암호화하는 SEQ ID N. 1,2,3,4,5에서 선택된 서열 또는 키메릭(chimeric) _p185^neu 단백질을 암호화하는 SEQ ID N. 6,7,8,9,10,11,12에서 선택된 서열을 포함하는 플라스미드(plasmids)인, DNA 전사를 위한 플라스미드 벡터(plasmid vector).
2. 청구항 1에 있어서, 추가로 전사 프로모터(transcription promoter)를 포함하는 플라스미드 벡터(plasmid vector).
3. 청구항 2에 있어서, 언급된 프로모터(promoter)가 CMV 프로모터(promoter)인 플라스미드 벡터(plasmid vector).
4. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 포유류, 특히 인간에게 사용하기에 적합한 플라스미드 벡터(plasmid vector).
5. 청구항 1 - 3에 따른 플라스미드 벡터(plasmid vector)와 함께 약제학적으로 허용가능한 매개제(vehicles)와 부형제(excipients)를 함유하는 약제학적 조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 비경구 투여에 적합한 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 주사가능한 용액 형태의 조성물.
8. 청구항 5에 있어서, DNA 백신(vaccine) 형태의 조성물.
9. 청구항 1 - 4에 따른 플라스미드 벡터(plasmid vector)의 _p185^neu-양성 종양 발생의 위험있는 피검자(subject) 또는 최초의 종양, 전이 또는 _p185^neu-양성 종양 재발을 지닌 환자들의 예방 또는 치료에 사용되는 치료제의 제조를 위한 청구항 1 - 4에 따른 플라스미드 벡터(plasmid vector)의 용도.
10. 청구항 9에 있어서, DNA 백신(vaccine)의 제조를 위한 용도.

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