CN101638440B - 一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原-Fc融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的融合蛋白。该融合蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗肿瘤相关的由1)衍生的蛋白质。以该融合蛋白为活性成分并加入佐剂GM-CSF和BCG或IFN-γ和BCG制成的疫苗对肿瘤生长有明显的抑制作用，肿瘤HE染色切片中可以观察到，肿瘤组织内和包膜周围有大量炎性细胞浸润，证明佐剂辅助融合蛋白可诱导有效的抗肿瘤免疫反应。

Description

一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原-Fc融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原—Fc融合蛋白及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤的18％，全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤的首位。亚洲是乳腺癌的低发区，但是近年来，我国乳腺癌的发病率正在呈逐年上升的趋势，从1999年的十万分之十七增加到2003年的十万分之五十二，上升三倍。手术、化疗和放疗是乳腺癌的常规治疗手段，随着医疗水平的不断进步，原发性肿瘤的治疗技术，尤其是早期诊断患者的外科治疗效果得到了明显提高。但对晚期患者则难以奏效，且大多数肿瘤患者就诊时已处于晚期，其疗效大大受限，特别是当肿瘤发生远处器官转移或多发转移时，常规治疗不能达到肿瘤局部及全身的控制。肿瘤的主动免疫治疗以激发或增强机体的免疫功能为手段，选择性地针对肿瘤细胞，特异性地发挥杀伤作用而不影响正常细胞的生存，进而达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的。

原癌基因Her2(又称ErbB2或Her2/neu)是表皮生长因子受体家族成员之一，位于人染色体17q21，是由1255个氨基酸组成的蛋白质，分子量为185kDa。前653个氨基酸为胞外区，富含半胱氨酸和2个配体结合域；第654～675位氨基酸为穿膜区，起锚定作用；第676～1255位氨基酸为胞内区，具有内在酪氨酸激酶活性，含有自身酪氨酸磷酸化位点。Her2在25％～30％的乳腺癌中过表达，在正常组织中低表达，是与乳腺癌侵袭、转移及预后密切相关的肿瘤相关抗原之一(Swiatoniowski G，Dabrowska M，Klaniewski T，et al.Erb-2overexpression in breastcancer.Ginekol Pol，2003，74(4)：332-338.)，已成为良好的肿瘤免疫生物治疗的靶分子。临床前期研究发现，Her2高表达可促进乳腺癌细胞的转移潜能(Petit T，Borel C，Ghnassia JP，et al Chemotherapy response of breast cancer depends on HER-2status andanthracycline dose intensity in the neoadjuvant setting[J].Clin Cancer Res，2001，7(6)：1577-1581.)，且与肿瘤细胞的化疗及激素治疗的耐药有关。Salmon等报道，Her2基因过表达的乳腺癌患者平均生存时间为3年，而Her2阴性患者为6～7年(Slamon DJ，Clark GM，Wong SG，et al.Human breast cancer correlation of relapseand survival with amplication of the HER-2/neu oncogene[J].Science，1987，235(4785)：177-182.)。目前已有大量证据显示，Her2过表达是预测乳腺癌预后的重要指标。免疫组化染色发现，乳腺癌细胞的Her2蛋白水平比正常乳腺上皮高10～100倍。Her2高表达可抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞存活及肿瘤新生血管的生成等，Her2过度表达的肿瘤细胞对化疗不敏感。有报告显示乳腺癌患者唾液中Her2含量较正常人高10倍以上，有望用于早期乳腺癌的筛选性诊断。Tutsi等对698例原发性乳腺癌患者进行了持续54个月的追踪随访发现，无论是淋巴结阴性还是阳性组，单因素或多因素分析均显示Her2基因的过表达是主要的预后指标(Tsutsui S，OhnoS，Murakami S，et al.Prognostic value of c-erbB-2 expression in breast and ovariancancer[J].J Surq Oncol，2002，79(4)：216-23.)。

Her2属自身蛋白，机体免疫系统对于过表达的自身蛋白往往处于耐受状态。因此，如何打破机体对肿瘤抗原的免疫耐受、诱发有效的抗肿瘤免疫反应，是肿瘤免疫治疗取得突破的关键。研究表明，同源异种抗原可诱发增强对相应自身抗原的免疫应答。Disis等证实，用全长大鼠neu蛋白免疫大鼠时，不能诱导抗大鼠neu蛋白的免疫应答，但是，用与neu蛋白有高度同源的Her2胞内段蛋白免疫大鼠，则可导致大鼠产生较强的抗Her2及neu的细胞及体液免疫应答(Disis ML，Shiota FM，Cheever MA.Human HER-2/neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu：a vaccine strategy for self tumor antigens[J].Immunology，1998，93(2)：192-199.)。因此，利用异种抗原大鼠neu蛋白亦有可能打破机体对Her2的免疫耐受，产生抗Her2的免疫应答。

人IgG1Fc段可结合于FcγIII受体(FcγIIIR，CD16)，该受体存在于单核细胞、树突状细胞、NK细胞及巨噬细胞膜表面，IgG1Fc与FcγRIII结合后可介导抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)，诱导细胞因子、趋化因子及炎症因子的释放。Fc受体不但可有效地介导抗原抗体复合物内化，提高MHC-II类途径的抗原递呈效率，而且Fc受体介导的抗原摄取还可通过MHC-I类途径交叉递呈(Albert ML，Sauter B，Bhardwaj N.Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce classI-restricted CTLs.Nature1998；392：86-9.Ravetch JV.Fc receptors：rubor redux.Cell1994；78：553-60.Regnault A，Lankar D，Lacabanne V et al.Fcγ receptor-mediatedinduction of dendritic cell maturation and major histocompatibility complex classI-restricted antigen presentation after immune complex internalization.J Exp Med1999；189：371-80.)。研究表明，FcγR介导的抗原摄取效率比吞噬及吞饮强100～1000倍，可有效促进抗原的递呈(Akiyama K，Ebihara S，Yada A，et al. Targeting ApoptoticTumor Cells to FcR Provides Efficient and Versatile Vaccination Against Tumors b

佐剂可决定免疫反应的类型，增强抗原的刺激作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)可激活抗原提呈细胞、参与T细胞的活化、诱导特异性CTL的产生、提高抗原递呈细胞(antigen-presentingcell，APC)的递呈效率，是细胞免疫的重要增强因子(Lefrance F，Cool V，Velu T，et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor gene transfer to induce a protectiveantitumoral immune response against the 9L rat gliosarcoma model[J].Int J Oncol，2002，20(5)：1077-1085.)，其在基因疫苗、分子疫苗及肿瘤疫苗等各类疫苗中的免疫佐剂作用已被广泛研究(Disis ML，Bernhard H，Shiota FM，et al.Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor；an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines[J].Blood，1996，88(1)：202-210.)。GM-CSF可促进多种炎细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及浆细胞等参与抗肿瘤免疫反应。Dranoff将GM-CSF作为黑色素瘤疫苗的免疫佐剂，发现GM-CSF相对于其它细胞因子佐剂可产生更持久、更有效的免疫促进作用(Dranoff G.GM-CSF-secreting melanoma vaccines[J].Oncogene，2003，22(20)：3188-3192.)。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是最早应用于肿瘤生物治疗的制剂，也是最强的免疫佐剂之一。作为结核分支杆菌的减毒活疫苗，具有很强的非特异性免疫刺激作用，能活化巨噬细胞、T细胞等免疫细胞，诱导产生IFN-γ和IL-12等Th1型细胞因子，介导以细胞免疫为主的免疫应答(Lammd L，ThorDE，Harris SC，et al.Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy of superficial bladdercancer[J].J Urol，1980，124：38-40.)。BCG在临床上已成功地应用于表浅型膀胱癌的膀胱内注射治疗，在预防膀胱肿瘤复发和治疗残存癌、原位癌中已经取得了肯定疗效(O’Donnell MA，DeWolf DC.Bacillus Calmette-Guérin immunotherapy forsuperficial bladder cancer.New prospects for an old war horse.Surg Oncol Clin N Am，1995，4：189-202.)。γ-干扰素(IFN-γ)是重要的免疫调节因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ能促进多种细胞表面表达MHC-I类和II类分子，促进Th0细胞分化为Th1细胞，激活巨噬细胞、DC和NK细胞等，在诱导Th1类免疫反应中起着主导作用。IFN-γ参与控制肿瘤的生长及转移，在肿瘤免疫监视过程中发挥重要的作用(Doherty GM，Alexander HR，Merino MJ，Venzon DJ，Norton JA.Role of endogenousinterferon gamma in murine tumor growth and tumor necrosis factor alpha antitumorefficacy.Ann Surg Oncol1996；3：198-203.Street SE，Cretney E，Smyth MJ.Perforinand interferon-gamma activities independently control tumor initiation，growth andmetastasis.Blood2001；97：192-7.)。在肿瘤基因治疗研究中显示，IFN-γ可提高肿瘤的免疫原性(Kaplan DH，Shankaran V，Dighe AS et al.Demonstration of an interferongamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice.Proc Nat AcadSci1998；95：7556-61.)。

单核细胞来源于骨髓起源的CD34⁺细胞。它们进入组织并最终分化为组织中的驻留型巨噬细胞，包括肝脏的Kupffer细胞、肺泡中的巨噬细胞和骨髓中的破骨细胞。免疫系统中，巨噬细胞可同时发挥正、负向的调节作用(Gordon S.Alternativeactivation of macrophages.Nat Rev Immunol2003；3：23-35.Stout RD，Suttles J.T cellsignaling of macrophage function in inflammatory disease.Front Biosci1997；2：d197-d206.)：一方面，它们可通过释放细胞毒性分子可对肿瘤细胞产生直接的杀伤(Olikowsky T，Wang ZQ，Dudhane A et al.Two distinct pathways of humanmacrophage differentiation are mediated by interferon-γ and interleukin-10.Immunol1997；91：96-112.Lopez M，Bony V，Martinache C et al.Tumoricidal potential of humanmacrophages grown in vitro from blood monocytes.J Exp Ther Oncol1996；1：143-54.)，或通过递呈抗原和产生白介素-12(IL-12)刺激淋巴细胞应答(VerreckFA，de Boer T，Langenberg DM.Human IL-23-producing type 1 macrophages promotebut IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to(myco)bacteria.Proc NatlAcad Sci USA2004；101：4560-5.)；另一方面，肿瘤细胞通过释放高水平的抑制因子来破坏免疫系统的平衡，导致巨噬细胞抗肿瘤功能的下调(Elgert KD，Alleva DG，Mullins DW.Tumor-induced immune dysfunction：the macrophage connection.J LeukocBiol1998；64：275-90.Mantovani A，Sica A，Sozzani S et al.The chemokine system indiverse forms of macrophage activation and polarization.Trends Immunol2004；25(12)：677-86.)。研究发现，肿瘤组织中的巨噬细胞可抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性(Kono K，Salazar-Onfray F，Petersson M et al.Hydrogen peroxidesecreted by tumor-derived macrophages down-modulates signal-transducing zetamolecules and inhibits tumor-specific T cell-and natural killer cell-mediated cytotoxicity.Eur J Immunol1996；26：1308-13.)。

免疫系统由相互作用的多种细胞组成。来源于免疫系统的激活信号和抑制信号以及周围细胞的代谢物之间复杂的相互作用调节局部免疫反应的范围和强度。不同类型细胞之间广泛的相互作用和调节决定免疫应答的结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原—Fc融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗肿瘤活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表中序列2自氨基末端第1-121位为neu的L2结构域，第122-241位为neu的S2结构域，第242-464位为人IgG1Fc区。

上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述融合蛋白编码基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。

含有上述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种治疗肿瘤的疫苗。

所述肿瘤具体可为高表达Her2的乳腺癌。

本发明所提供的疫苗的活性成分是上述融合蛋白。

所述疫苗中还可以含有如下1)或2)的佐剂：

1)GM-CSF和BCG；

2)IFN-γ和BCG。

实验证明，本发明的融合蛋白对乳腺癌细胞具有较好的抑制效果，加入上述1)或2)的佐剂后，抑制效果明显提高，所述融合蛋白和上述1)或2)的佐剂可以以任一配比混合。

当然，所述疫苗中也可以只含有所述融合蛋白、佐剂GM-CSF和BCG或只含有融合蛋白、佐剂IFN-γ和BCG。

具体的说，本发明是将大鼠neu L2-S2功能域的编码序列与人IgG Fc区编码序列融合，构建真核表达载体；在CHO细胞中获得稳定表达，应用rProtein A SepharoseFast Flow亲和层析纯化neu-Fc融合蛋白，应用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白；Ficoll密度梯度离心法分离人PBMC，MTT法检测融合蛋白对PBMC的促增殖作用；通过ELISA法检测PBMC产生的IL-12和IL-10水平的变化；应用流式细胞分析检测单核细胞表型的变化；LDH法检测PBMC在佐剂协同异种抗原刺激下对靶细胞的杀伤作用；pcDNA3.0/Her2转染小鼠乳腺癌细胞EMT6，获得一株高表达Her2的EMT6/Her2细胞株；利用该细胞株构建裸鼠移植瘤模型，观察佐剂和融合蛋白联合应用对肿瘤生长的影响；对肿瘤组织作HE染色及组织学分析。

结果表明，neu-Fc是分子量约为66kDa的蛋白；PBMC经MCF-7细胞上清诱导后，IL-12水平降低，IL-10水平显著升高；10nM neu-Fc对PBMC具有显著的促增殖作用；neu-Fc与佐剂联合作用可显著促进PBMC中IL-12的表达并下调IL-10的表达；佐剂协同融合蛋白作用下，单核细胞表面MHC II类分子表达上调；佐剂协同融合蛋白刺激可导致PBMC对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强；建立的EMT6/Her2细胞中，Her2的表达率为99.59％；动物实验中，佐剂协同融合蛋白对肿瘤生长有明显的抑制作用；肿瘤组织HE染色组织学分析观察到，佐剂协同融合蛋白治疗组的肿瘤组织内和包膜周围有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润，肿瘤细胞广泛坏死，而对照组肿瘤无明显包膜，肿瘤细胞生长活跃，无炎细胞浸润。结果表明，佐剂辅助融合蛋白可诱导有效的抗肿瘤免疫反应。

附图说明

图1为neu-Fc蛋白的SDS-PAGE检测结果

图2为neu-Fc对PBMC具有明显的促增殖作用

图3为MCF-7细胞上清诱导后PBMC分泌IL-12和IL-10的变化

图4为neu-Fc、GM-CSF和BCG联合应用对PBMC分泌IL-12和IL-10表达的影响

图5为neu-Fc、IFN-γ和BCG联合应用对PBMC分泌IL-12和IL-10表达的影响

图6为FACS分析单核细胞表型

图7为neu-Fc，IFN-γ和BCG诱导的PBMC体外抗肿瘤活性

图8为构建的细胞株EMT6/Her2表达Her2的情况

图9为neu-Fc、IFN-γ和BCG联合应用裸鼠体内抑瘤活性观察

图10为neu-Fc、IFN-γ和BCG联合应用裸鼠体内抑瘤活性观察、肿瘤的组织学观察及体内毒性评价

具体实施方式

人淋巴细胞分离液(相对密度为1.077)购自天津TBD生物技术发展公司，特级胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所，无酚红RPMI-1640购于Hyclone公司，DMEM购于GIBCO公司，HRP-羊抗鼠抗体购自中杉公司，抗Her2抗体(Ab20)购于Neomarkers公司，重组人GM-CSF(hGM-CSF)及IFN-γ均购于ProSpec-TanyTechnoGene公司，BCG购于北京生物制品研究所，IL-12和IL-10ELISA检测试剂盒购于北京达克为生物技术有限公司，增强型ECL试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司。

实施例1、融合蛋白neu-Fc联合GM-CSF和BCG的免疫调节效应

1、neu-Fc的构建、表达及纯化

大鼠neu的胞外区包括L1、S1、L2和S2四个结构域。根据大鼠neu胞外区的L2和S2结构域设计引物5’-tgccatggtccgagtgtgctatggtctg-3’和5’-agtttagcggccgcgtgggtgcagttgatggg-3’，PCR扩增大鼠neu胞外区的L2和S2结构域的编码序列(上游引物位于大鼠neu胞外区的L2结构域，下游引物位于大鼠neu胞外区的S2结构域)。

提取健康人离体的外周血单个核细胞的总RNA，利用RT-PCR方法扩增出人IgG1Fc段的cDNA。将人IgG1Fc段的cDNA经NotI和XhoI双酶切后插入到经同样酶切的载体pCI-neo(购自Promega公司)中，得到重组表达载体pCI-neo/Fc。

将上述大鼠neu胞外区的L2和S2结构域的PCR扩增产物用EcoRI和NotI双酶切后与经同样酶切的重组表达载体pCI-neo/Fc相连接，使大鼠neu的L2和S2结构域融合于人IgG1Fc段的N端，将得到的重组表达载体命名为pCI/neu-Fc。将pCI/neu-Fc进行测序，结果表明，大鼠neu的L2和S2结构域的编码序列已经和人IgG1Fc段的编码序列正确相连接，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，将其编码的融合蛋白命名为neu-Fc，该融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

将重组表达载体pCI/neu-Fc转染二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞，转染48小时后，细胞在含有10％透析血清的DMEM培养基和甲氨喋呤中筛选，获得稳定高表达融合蛋白neu-Fc的克隆。培养该细胞克隆，收获上清，应用rProtein ASepharose Fast Flow亲和层析纯化表达上清，获得高纯度的融合蛋白neu-Fc。对融合蛋白neu-Fc进行N端序列测定，结果表明，neu-Fc N末端的15个氨基酸残基和序列表中序列4的自N末端的第1-15位氨基酸残基相同。

2、neu-Fc蛋白的鉴定

将上述步骤1获得的neu-Fc蛋白经SDS-PAGE测定其分子量，结果如图1所示。其中，M为蛋白质分子量标准，1为neu-Fc的SDS-PAGE电泳结果，2为neu-Fc的Western blot结果。结果表明，neu-Fc的分子量为约66kDa。由于neu与Her2的同源性较高，可利用抗人Her2抗体(Ab20)(购于Neomarkers公司)对上述步骤1获得的neu-Fc蛋白进行Western blot分析。结果表明，抗人Her2抗体可识别neu-Fc融合蛋白，阳性反应条带的位置与上述步骤1纯化得到的neu-Fc蛋白在SDS-PAGE中的位置一致。

3、MTT法测定neu-Fc促进外周血单个核细胞(PBMC)增殖的作用

1)PBMC的分离与培养

采用Ficoll法分离人PBMC，将分离自健康人的新鲜离体白膜层细胞约30ml分别加入到两个50ml的培养瓶中，再分别加入等体积的无酚红RPMI-1640培养液稀释。将稀释好的白膜层细胞沿管壁缓慢滴加在淋巴细胞分离液液面上，每管滴加5ml，使白膜层与淋巴细胞分离液的体积比为1:1，2000rpm离心30分钟。离心后可以看到试管内液面分为4层。自上而下依次为：黄色血浆层、白色薄膜层(PBMC层)、无色透明的分离液层和红细胞层。

将上述PBMC层吸至另一50ml培养瓶中，加入等体积的无酚红RPMI-1640培养液稀释，800rpm离心10分钟。离心后试管底部有乳白色沉淀出现，用手指将沉淀轻轻弹散开，加入无酚红RPMI-1640培养液吹悬细胞，800rpm离心10分钟洗涤细胞3次，离心后的上清液透亮，停止洗涤。将细胞沉淀用含20％胎牛血清的无酚红RPMI-1640培养液重悬并计数。

2)MTT法测定neu-Fc促增殖作用

调整上述步骤1)获得的PBMC的密度为2×10⁶/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。用含20％血清的无酚红RPMI-1640培养液将上述步骤1获得的neu-Fc蛋白稀释为2nM、10nM和50nM，并加入到培养有PBMC的细胞培养板中，每孔100μl。同时以不加neu-Fc蛋白作为对照。每个浓度设3个重复孔。37℃培养箱中孵育96小时后，每孔吸出110μl培养液，然后加入10μl5mg/ml的MTT溶液。继续培养4～6小时，2000rpm离心10分钟，弃上清。每孔中加入100μl酸化SDS，充分混匀，37℃培养过夜，酶联仪上测定A₅₇₀值，结果如图2所示。结果表明，2nM和10nM的neu-Fc均具有显著的促细胞增殖作用(P<0.05)，10nM neu-Fc的促增殖作用最强。

4、MCF-7细胞培养上清抑制PBMC分泌IL-12及刺激IL-10的分泌

用含20％血清的无酚红RPMI-1640培养液将PBMC的密度调为2×10⁶/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，然后加入MCF-7细胞培养上清100μl。对照孔中不加MCF-7细胞培养上清，补充RPMI-1640100μl，每个处理设3个重复孔。培养48-72小时后，进行细胞因子检测，结果如图3所示。图中，“^*”表示P<0.05，“^**”表示P<0.01。结果表明，PBMC与MCF-7细胞培养上清共孵育后，Th1型细胞因子IL-12水平明显降低(P<0.05)，Th2型细胞因子IL-10水平显著升高(P<0.01)，表明MCF-7细胞培养上清中存在可导致PBMC处于免疫抑制状态的物质。

5、neu-Fc、GM-CSF和BCG联合作用对细胞因子分泌的影响

用含20％血清的无酚红RPMI-1640培养液将PBMC的密度调为2×10⁶/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。实验组加入MCF-7细胞培养上清100μl，培养48-72小时后，吸去培养液，并分为如下四个处理：1、补充RPMI-1640100μl(对照组)；2、加入含终浓度为10nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100μl；3、加入含终浓度为20ng/ml GM-CSF、300μg/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基100μl；4、加入含终浓度为20ng/ml GM-CSF、300μg/ml BCG和10nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100μl。

每个处理设3个重复孔。72小时后2000rpm离心10分钟，吸出上清，按照ELISA检测试剂盒的要求检测上清中的细胞因子，统计学分析采用SPSS10.0统计软件，所有数据采用X±SD表示，组间比较采用one sample-ANOVA法分析，以P<0.05表示有统计学意义，结果如图4所示。其中，黑色柱子表示加入融合蛋白neu-Fc，白色柱子表示未加融合蛋白neu-Fc。

结果表明，neu-Fc单独作用于PBMC时，IL-12分泌水平略有升高，而IL-10分泌水平明显受到抑制(P<0.01)；当同时用GM-CSF、BCG和neu-Fc处理PBMC时，IL-12的水平升高则更为显著(P<0.01)，而IL-10水平进一步降低(P<0.05)。表明，neu-Fc促增殖的细胞群体主要为Th1型细胞，GM-CSF、BCG和neu-Fc的联合应用能强有力地诱导PBMC向Th1型应答转换。

实施例2、异种蛋白neu-Fc联合IFN-γ和BCG的免疫调节效应

1、neu-Fc、IFN-γ和BCG联合作用对细胞因子分泌的影响

用含20％血清的无酚红RPMI-1640培养液将PBMC的密度调为2×10⁶/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。实验组加入MCF-7细胞培养上清100μl，培养48-72小时后，吸去培养液，并分为如下几个处理：1、补充RPMI-1640100μl；2、加入含终浓度为10nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100μl；3、加入含终浓度为40U/ml IFN-γ的无酚红RPMI-1640培养基100μl；4、加入含终浓度为40U/mlIFN-γ和10nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100μl；5、加入含终浓度为300μg/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基100μl；6、加入含终浓度为300μg/ml BCG和10nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100μl；7、加入含终浓度为40U/ml IFN-γ、300μg/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基100μl；8、加入含终浓度为40U/mlIFN-γ、300μg/ml BCG和10nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100μl。对照组不加MCF-7细胞培养上清，分别补充RPMI-1640100μl或含10nM neu-Fc的RPMI-1640培养基100μl。每个处理设3个重复孔。72小时后2000rpm离心10分钟，吸出上清，按照ELISA检测试剂盒的要求检测上清中的细胞因子，统计学分析采用SPSS10.0统计软件，所有数据采用X±SD表示，组间比较采用onesample-ANOVA法分析，以P<0.05表示有统计学意义，结果如图5所示。其中，黑色柱子表示加入融合蛋白neu-Fc，白色柱子表示未加融合蛋白neu-Fc。

结果表明，neu-Fc单独作用可导致细胞分泌IL-12水平显著增高，IL-10的分泌受抑制；IFN-γ单独作用不能逆转MCF-7细胞上清对Th1细胞的抑制作用；但是，当与neu-Fc共同作用时，IL-12的水平升高及IL-10的水平明显降低，与neu-Fc单独作用相比具有统计学意义(P<0.01)。BCG与IFN-γ联合作用能显著上调IL-12的水平，与两者单独作用相比作用明显增强；而当BCG、IFN-γ和neu-Fc共同作用时，IL-12的分泌水平进一步提高；BCG单独作用可显著抑制IL-10的分泌，而与IFN-γ联合应用并未能进一步下调IL-10的水平。

2、neu-Fc和BCG、IFN-γ联合诱导逆转单核细胞表型

单核细胞是体外诱导DC的来源，单核细胞在体外通过内皮细胞迁移或在体内吞噬抗原后亦可分化为DC。按照文献报道的方法(Tang CB，Inman MD，Rooijen NVet al.Th Type1-Stimulating Activity of Lung Macrophages Inhibits Th2-MediatedAllergic Airway Inflammation by an IFN-γ-Dependent Mechanism.J Immunol2001；166：1471-81.)，利用单核细胞的黏附特性分离单核细胞，具体方法如下：

按照上述实施例1步骤3的方法，将分离的PBMC培养于50ml细胞培养瓶中，在含20％胎牛血清的无酚红RPMI1640培养液中培养。2小时后，在倒置显微镜下观察，可见部分细胞已贴壁，此时将上清吸去，并用无酚红的RPMI1640培养液清洗贴壁细胞，此贴壁细胞即为单核细胞。

将单核细胞培养于含20％血清的无酚红RPMI-1640培养液中，加入MCF-7细胞培养上清100μl。培养24-48小时后，加入含终浓度为40U/ml IFN-γ、10nMneu-Fc和300μg/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基，同时以未用MCF-7细胞培养上清作用及未加刺激物的细胞分别作为对照。培养48-72小时后，6000rpm离心30秒收集细胞，用FACS洗液(PBS+2％BSA或2％胎牛血清+0.1％NaN₃)洗涤3次。然后分别加入抗-CD11b-PE抗体、抗-CD14-FITC抗体、抗-CD80-FITC抗体、抗-CD86-PE抗体和抗-MHC-DR-PE抗体(以上抗体均购于Ebioscience公司)，冰浴、避光轻摇20-40分钟。6000rpm离心30秒后，弃上清，再洗涤3次。最后一次离心后，弃上清，用1％的多聚甲醛固定，流式细胞仪分析单核细胞表型。

单核细胞膜表面CD14和CD11b的表达如图6所示。其中，A为单核细胞CD14的表达，B为单核细胞CD11b的表达。从图中可以看出，单核细胞的CD11b阳性率约为96％，CD14的阳性率约为90％。

在MCF-7细胞上清的诱导下，单核细胞表面HLA-DR、CD80和CD86分子的表达显著下调。BCG、IFN-γ和neu-Fc联合作用刺激48小时后，单核细胞表面HLA—DR的表达由50％提高至75％，CD80的表达由39％提高至47％，CD86的表达由44％提高至64％，具体结果如表1所示。结果表明，单核细胞在BCG、IFN-γ和neu-Fc联合作用下被活化。

表1单核细胞共刺激分子和MHC II类分子的表达

杀伤实验(LDH法)

为了观察neu-Fc、IFN-γ和BCG是否可促进效应细胞(PBMC)对Her2过表达肿瘤细胞的抑制活性，构建了MCF-7/Her2细胞，并分析了4种不同的乳腺癌细胞(T47D、MCF-7、MCF-7/Her2和SKBR3细胞)表面MHC-II类分子的表达水平，具体的实验过程如下：

1)MCF-7/Her2细胞的构建

提取人乳腺癌细胞SKBR3的总RNA，利用RT-PCR方法扩增出Her2的cDNA。将扩增得到的Her2的cDNA插入到真核表达载体pcDNA3(购自Invitrogen公司)的HindIII和XhoI位点间，将得到的重组质粒命名为pcDNA3/Her2。

用pcDNA3/Her2质粒转染MCF-7细胞，800μg/ml G418(Sigma)加压筛选10天后，获得稳定表达Her2的MCF-7细胞。经过有限稀释法获得高表达Her2的细胞克隆，将其命名为MCF-7/Her2。MCF-7/Her2细胞在含200μg/ml G418的培养液中维持。

MCF-7/Her2细胞、MCF-7细胞和T47D细胞表达Her2的情况如图7A所示。其中，虚线表示T47D细胞表达Her2的情况，细的实线表示MCF-7细胞表达Her2的情况，粗的实线表示MCF-7/Her2细胞表达Her2的情况。

2)效应细胞的处理

用含20％胎牛血清的无酚红RPMI1640培养液将上述实施例1分离的PBMC细胞浓度调整至1×10⁶/ml，分为4组：1、阴性对照；2、加入neu-Fc；3、加入IFN-γ和BCG；4、加入neu-Fc、IFN-γ和BCG。neu-Fc的终浓度为10nM，IFN-γ的终浓度为40U/ml，BCG的终浓度为300μg/ml，作用96小时。

3)靶细胞的处理

T47D、MCF-7、MCF-7/Her2和SKBR3是4种表达不同水平Her2和低水平MHC-II的人类乳腺癌细胞系(T47D、MCF-7和SKBR3均购自美国ADCC)。4种细胞经过2000U/ml的IFN-γ作用96小时后，应用FACS检测细胞表面MHC-DR的表达。结果如图7B和图7C所示。其中，图7B为IFN-γ作用前T47D、MCF-7、MCF-7/Her2和SKBR3细胞表面MHC-DR的表达情况，图7C为IFN-γ作用后T47D、MCF-7、MCF-7/Her2和SKBR3细胞表面MHC-DR的表达情况。

结果表明，IFN-γ处理可使T47D、MCF-7、MCF-7/Her2三种细胞表面MHC-DR的表达明显上调，而SKBR3无明显变化，因此选择T47D、MCF-7和MCF-7/Her2作为杀伤实验中的靶细胞。

用2000U/ml的IFN-γ分别作用于T47D、MCF-7和MCF-7/Her2细胞96小时后，将细胞分别用胰酶消化成单细胞悬液，800rpm离心5分钟，细胞洗涤两次后计数，调整细胞密度为4×10⁴/ml，铺于96孔板中，每孔100μl。

4)效靶作用

收集上述步骤2)的效应细胞，用无酚红RPMI1640洗两次并计数，调整细胞密度为8×10⁵/ml，每孔100μl。当上述步骤3)的靶细胞贴壁后，用无酚红的RPMI1640培养液将靶细胞洗两次，然后将效应细胞加入培养有靶细胞的培养板中，使效应细胞和靶细胞的数量比分别为20：1和10：1。同时以仅含效应细胞和仅含靶细胞的孔作为对照，每种处理设三个重复孔。37℃培养3-4小时后，250g离心3分钟，从每孔中吸出50μl上清液至另一96孔板中。采用细胞毒性检测试剂盒，按说明书中的步骤首先配制反应试剂，然后将其加入到上述96孔板中，每孔50μl，室温避光反应10～30分钟，测OD₄₉₂值。结果如图7D和图7E所示。其中，图7D为效应细胞和靶细胞的数量比为20：1时的测定结果，图7E为效应细胞和靶细胞的数量比为10：1时的测定结果。在仅含靶细胞的3个孔中加入1％(体积百分含量)的Triton(曲拉通，用PBS稀释)10μl，作为最大靶细胞释放孔。

结果表明，neu-Fc、IFN-γ和BCG联合作用刺激效应细胞对高表达Her2的细胞可产生最有效的杀伤，与neu-Fc或BCG+IFN-γ刺激的效果相比，具有明显的差异(P<0.01)。且效应细胞对MCF-7/Her2细胞的杀伤率较T47D细胞和MCF-7细胞更高，提示效应细胞对肿瘤细胞的杀伤依赖于细胞表面Her分子的密度。

实施例3、动物实验

1、EMT6/Her2细胞的构建

用pcDNA3/Her2质粒转染来源于Balb/C鼠的小鼠乳腺癌细胞EMT6(购自美国ADCC)，在800μg/ml G418压力下筛选表达Her2的EMT6细胞，经两次有限稀释法及加压筛选，获得稳定表达Her2的EMT6细胞克隆，将其命名为EMT6/Her2。同时以未转染pcDNA3/Her2质粒的EMT6细胞作为对照。采用抗Her2抗体(Ab20)购于Neomarkers公司及FACS检测EMT6/Her2细胞表达Her2的情况，FACS检测结果如图8所示。其中，图8A为对照组EMT6细胞的FACS检测结果，图8B为EMT6/Her2细胞的FACS检测结果。结果表明，近100％的EMT6/Her2细胞表达Her2分子。

2、动物实验

1)注射抗原剂量的确定

EMT6/Her2细胞用无抗生素和血清的RPMI-1640培养液稀释成4×10⁶/ml，于右侧腋下皮下注射4—6周龄的雌性Balb/C小鼠，每只小鼠注射0.1ml。注射后第6天，可见小鼠注射部位有肿瘤生长，随机将小鼠分为4组，分别为对照组、佐剂组、高剂量抗原加佐剂组和低剂量抗原加佐剂组，每组6只小鼠。其中，抗原为上述实施例1获得的neu-Fc融合蛋白，高剂量组抗原用量为每只小鼠20μg，低剂量组抗原用量为每只小鼠10μg；佐剂为IFN-γ(每只小鼠2000U)和BCG(每只小鼠0.5mg)。

将上述成瘤小鼠尾静脉注射抗原及肿瘤周围皮下注射佐剂，对照组尾静脉和肿瘤周围皮下均注射与实验组等体积的无抗生素和血清的RPMI-1640培养液；佐剂组尾静脉注射无抗生素和血清的RPMI-1640培养液，肿瘤周围皮下注射佐剂；高剂量和低剂量抗原加佐剂组尾静脉注射不同剂量的抗原，肿瘤周围皮下注射佐剂。每周给药一次，共给药两次。每3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径和短径，计算小鼠肿瘤的体积(体积＝长径×短径²×0.5)。注射EMT6/Her2细胞3周后，将小鼠断颈处死，称量小鼠体重，将肿瘤剥出，称量肿瘤的重量。结果如图9所示。

结果表明，neu-Fc、IFN-γ和BCG联合作用可抑制肿瘤的生长，高剂量的neu-Fc并未诱导更高的抗肿瘤活性，提示产生的保护性免疫应答不具有剂量依赖性特征。根据该实验结果，下面的实验中采用10μg的抗原剂量。

2)动物实验

EMT6/Her2细胞用无抗生素和血清的RPMI-1640培养液稀释成4×10⁶/ml，于右侧腋下皮下注射4—6周龄的雌性Balb/C小鼠，每只小鼠注射0.1ml。注射后的第6天，可见小鼠注射部位有肿瘤生长，随机将小鼠分为4组，分别为对照组、佐剂组、抗原组和抗原加佐剂组，每组6只小鼠。其中，抗原为上述实施例1获得的neu-Fc蛋白，抗原的剂量为每只小鼠10μg，佐剂用量同第一批动物实验。注射方法同上，每周给药一次，共给药四次。每3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径和短径，计算小鼠肿瘤的体积(体积＝长径×短径²×0.5)。注射EMT6/Her2细胞30天后，将小鼠断颈处死，称量小鼠体重，将肿瘤剥出，称量肿瘤的重量，并按组别排列照相。肿瘤组织随后固定于10％中性福尔马林(Na₂HPO₄·12H₂O，3.28g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.9g；甲醛，24ml；加水至200ml)中，石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察照相。结果如图10所示。其中，图10A为不同组别小鼠肿瘤体积的测定结果，图10B为不同组别小鼠肿瘤重量的测定结果，图10C为不同组别小鼠肿瘤的照片。

从图10A和10B可以看出，对照组肿瘤生长迅速，neu-Fc组和IFN-γ+BCG组均产生一定的抑瘤作用，而neu-Fc、IFN-γ和BCG联合应用则可更有效地抑制肿瘤生长。图10C中，肉眼观察可见，neu-Fc、IFN-γ和BCG联合应用组的肿瘤血管形成减少，肿瘤组织苍白，而其它各组肿瘤表面可见明显的血管形成。组织学观察发现，对照组小鼠肿瘤组织由大量低分化的细胞构成，肿瘤呈实性、无腺管样结构，镜下易见核分裂象。neu-Fc、IFN-γ和BCG联合治疗组肿瘤组织有纤维囊膜包裹，包膜下可见大量细胞坏死，瘤组织内外有大量的中性粒细胞及淋巴细胞浸润，如图10G所示；而对照组肿瘤则无炎细胞浸润现象，如图10D-图10F所示。对小鼠体重的观察结果可知，治疗未引起明显的毒副作用，结果如图10H和图10I所示。此外，小鼠的肝、肾和肺等脏器未见病理改变。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1395

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>464

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Claims (9)

1.一种融合蛋白是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。

4.含有权利要求2或3所述融合蛋白编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述融合蛋白编码基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述融合蛋白编码基因的重组菌。

7.一种预防和/或治疗肿瘤的疫苗，它的活性成分是权利要求1所述的融合蛋白；所述肿瘤为乳腺癌。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗中还含有佐剂，所述佐剂为GM-CSF和BCG。

9.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗中还含有佐剂，所述佐剂为IFN-γ和BCG。

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