NO341710B1 - Sensor for påvisning av karbohydrater - Google Patents

Abstract

En sensor for å måle analyttkonsentrasjonen innbefatter minst to forskjellige varianter av et egnet konkurransebindingsassay, idet sensoren har evnen til å måle nøyaktig et nødvendig område av analyttkonsentrasjoner ved hjelp av variantene av assayet, som hver har evnen til å måle nøyaktig kun en del av det nødvendige område av analyttkonsentrasjoner, og idet variantene av assayet er valgt slik at de måler overlappende eller hosliggende konsentrasjonsområder som dekker hele det nødvendige område.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en sensor.

Sensoren kan brukes for å måle nærværet eller konsentrasjonen av en karbohydratanalytt, som kan være en bestanddel av interstitiell væske, for eksempel glukose.

Sensoren er spesielt godt egnet for bruk i situasjoner hvor glukosenivået må overvåkes nøye og/eller hvor glukosemålinger må utføres gjentatte ganger, så som i styring av diabetes.

Ved styring av diabetes, er en regelmessig måling av glukose i blodet vesentlig for å sikre riktig insulindosering. Videre er det blitt demonstrert at i langtidspleien av diabetespasienten, kan en bedre regulering av blodglukosenivået sinke, hvis ikke forhindre, inntreden av retinopati, blodomløpsproblemer og andre degenerative sykdommer som ofte forbindes med diabetes. Dermed finnes det et behov for pålitelig og nøyaktig egenovervåking av blodglukosenivået hos diabetespasienter.

Det er ønskelig å måle blodglukosen over konsentrasjonsområdene som kan forekomme i en diabetespasient, dvs. fra 0 til 35 mM eller enda høyere. Selv om glukose ofte nevnes heri som et relevant eksempel, vil det være underforstått at prinsippene av oppfinnelsen er bredt anvendbare på et stort antall analytter.

For tiden overvåkes blodglukosen hos diabetespasienter ved bruk av handelstilgjengelige kolorimetriske teststrimler eller elektrokjemiske biosensorer (f.eks. enzymelektroder), som begge krever en regelmessig anvendelse av et instrument av lansetttype for å trekke ut en passende mengde blod hver gang en måling utføres. Gjennomsnittlig ville hovedparten av diabetespasientene bruke slike instrumenter to ganger daglig for å utføre en måling av blodglukosen. Imidlertid har US National Institutes of Health anbefalt at blodglukosetestingen utføres minst fire ganger daglig, en anbefaling som er blitt støttet av American Diabetes Association. Denne økte hyppighet av blodglukosetestingen utgjør en betraktelig belastning for diabetespasienten, både økonomisk og hva angår smerte og ubehag, spesielt i langtidsdiabetikeren som regelmessig må benytte seg av en lansett for å trekke ut blod fra fingertuppene. Dermed finnes det et klart behov for et bedre langtids glukoseovervåkingssystem som ikke innbefatter å trekke ut blod fra pasienten.

Det har funnets mange forslag til glukosemålingsteknikker som ikke krever at det trekkes ut blod fra pasienten.

Man har observert at konsentrasjonen av analytter i subkutan væske korrelerer med konsentrasjonen av disse analytter i blodet, og derfor er det flere ganger blitt rapportert bruk av glukoseovervåkingsanordninger som er plassert i en subkutan plassering. Bruk av konkurransebindingsassayer for glukose som kan fjernavspørres, er spesielt interessante.

En fremgangsmåte for å teste en konkurrerende binding er å bruke et nærhetsbasert signalgenererende/modulerende enhetspar (diskutert i US 6232 120), som typisk er et energioverførings-donor/mottaker-par (innbefattende en energidonorenhet og en energimottakerenhet). Energidonorenheten er fotoluminescerende (vanligvis fluorescerende).

I slike metoder bringes et energioverførings-donor/mottaker-par i berøring med prøven (så som subkutan væske) som skal analyseres. Prøven belyses deretter og den dannede emisjon påvises. Enten energidonorenheten eller energimottakerenheten av donor/mottaker-paret er bundet til en reseptorbærer, mens den andre del av donor/mottaker-paret (bundet til en ligandbærer) og enhver analytt som foreligger, konkurrerer om bindingsseter på reseptorbæreren. Energioverføring finner sted mellom donorene og mottakerne når de bringes sammen, hvilket resulterer i en påvisbar endring av livstiden (reduksjon) av fluorescensen av energidonorenheten. Dessuten slukkes en andel av det fluorescerende signal som utstråles av energidonorenheten.

Endringen av livstiden reduseres eller elimineres helt av analyttens kompetitive binding. Ved å måle den tilsynelatende luminescenslivstid, for eksempel ved fasemodulasjonsfluorometri eller tidsoppløst fluorometra (se Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, 1983, kapittel 3), kan man bestemme mengden analytt i prøven.

Det bør bemerkes at effekten av energioverføringen avhenger av kvantumutbyttet av donoren, overlappingen av emisjonsspektret av donoren absorpsjonsspektret av mottakeren, og den relative avstand og orientering mellom donoren og mottakeren.

I EP 0561 653 beskrives en fremgangsmåte for å avspørre en reseptor og en ligand slik som det ble beskrevet ovenfor.

Et eksempel på donor/mottaker-energioverføring er fluorescensresonansenergioverføring (Förster-resonansenergioverføring, FRET), som er en ikke-strålende overføring av eksitasjonstilstandsenergien fra den i utgangspunktet eksiterte donor (D) til en mottaker (A). Donoren emitterer typisk ved kortere bølgelengder, og dens emisjonsspektrum overlapper absorpsjonsspektret av mottakeren. Energioverføring finner sted uten opptreden av et foton og er resultatet av langdistanse dipol/dipolvekselvirkninger mellom donoren og mottakeren.

Begrepet resonansenergioverføring (RET) er riktigere ettersom FRET-prosessen ikke innbefatter opptreden av et foton. Imidlertid brukes FRET og RET ofte om hverandre.

Et viktig kjennetegn av FRET er at det finner sted over avstander som er sammenlignbare med størrelsen av biologiske makromolekyler. Avstanden hvor FRET er 50% effektiv, benevnt Förster-avstanden, er typisk i området fra 20-60 Å. Förster-avstander varierende fra 20 til 90 Å er passende for konkurransebindingsstudier.

Merking av en analyttbindende enhet med en donor (D) og en analyttanalog med en mottaker (A), eller omvendt, ville danne et assay som har evnen til å generere en målbar respons basert på avstanden mellom donoren og mottakeren. Dermed fører en binding av D: "analyttbindende enhet" til A: "analyttanalog" til en nedsatt donorintensitet eller -livstid. Analytten i prøven konkurrerer om de analyttbindende enheter på D: "analyttbindende enhet" og frigir D: "analyttbindende enhet" fra mottakeren (A). Intensitetsnedbrytningstiden og fasevinklene av donoren forventes dermed å øke med økende glukosekonsentrasjon.

Disse prinsipper er blitt brukt i glukosepåvisning ved energioverføring.

WO 91/09312 beskriver en subkutan metode og anordning som benytter seg av et affinitetsassay basert på glukose (som innlemmer et energioverførings-donor/mottaker-par) som fjernavspørres med optiske midler. Eksempelvis WO 97/19188, WO 00/02048, WO 03/006992 og WO 02/30275 beskriver hver glukosepåvisning ved energioverføring, som produserer et optisk signal som kan fjernavleses.

En person med kunnskaper innen faget vil forstå at mottakeren kunne være et fluorofor. Ethvert fluorescerende signal som emitteres av energimottakerenheten, etter eksitasjon med en stråle av innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energimottakerenheten, er upåvirket av FRET-prosessen. Det er derfor mulig å bruke intensiteten av det fluorescerende signal som emitteres av energimottakerenheten, som et internt referansesignal, for eksempel ved kontinuerlig kalibrering av sensoren eller for å overvåke i hvilket omfang sensoren er oppbrukt og dermed angi behovet for å implantere eller injisere en fersk sensor. Når dette signal faller under et akseptabelt basisnivå, vil dette tyde på at det er nødvendig å implantere eller injisere en fersk sensor.

Energimottakerenheten kan imidlertid være et ikke-fluorescerende fargestoff. I dette tilfelle brukes en forbindelse med fluorescensslukkende evne istedenfor den spesifikke energimottakerenhet. Et eksempel på en kraftig og ikke-spesifikk fluorescensslukker gis av Tyagi et al. Nature Biotechnology (1998) 18: s. 49.

En begrensning av de ikke-invasive assayer for glukosenivåene i kroppsvæsker som er kjent i dag, er området av glukosekonsentrasjoner som assayet kan måle nøyaktig. Det subkutane implantat ifølge WO 91/09312 sies å ha evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i området 0,5-18 mgml<-1>(2,6-94 mM), som dekker alt unntatt den nederste ende av målområdet som er nødvendig for målinger av glukosekonsentrasjonen i intracellulær væske. Nøyaktig måling ved meget lave glukosekonsentrasjoner er spesielt viktig ved styring av diabetes idet det tilsvarer hypoglykemi.

En lignende anordning beskrives i WO 98/05589, og sies å ha evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i området 0,05-5 mgml<-1>(0,26-26 mM), hvilket dekker den nederste ende området som er nødvendig for måling av den intracellulære glukosekonsentrasjon.

En tredje anordning beskrives i WO 00/16099.

Ballerstadt R. et al., «Competitive-binding assay method based on fluorescence quenching of ligands held in close proximity by a multivalent receptor», Analytica Chimica Acta, 1997, vol. 345, nr. 1-3, side 203 beskriver en konkurransebindingsassaysensor basert på fluorescenceslukkende ligander som holdes i nærheten av en multivalent reseptor for å påvise glukose i 0-30 mM området.

De ovennevnte anordninger benytter seg av konkurranseassayer som innbefatter en analyttanalog og et bindingsmiddel som har evnen til å konkurrerende binde den aktuelle analytt og analyttanalogen.

Evnen av analytten til å forskyve analytten fra bindingsmidlet er avhengig av identiteten av analytten, liganden og bindingsmidlet. Den målbare respons som produseres av assayet, korrelerer med andelen av analytt som er bundet til bindingsmidlet.

For et bestemt assay vil det derfor finnes et konsentrasjonsområdet av analytt som kan måles. Dette område vil defineres ved en minste konsentrasjon av analytt som er nødvendig for å forskyve analyttanalogen fra bindingsmidlet, og en største konsentrasjon av analytt på det punkt hvor all analyttanalog er blitt forskjøvet fra bindingsmidlet.

Skreddersying av ett assay for å fremkalle en målbar respons over hele det aktuelle konsentrasjonsområde av analytten, spesielt når det finnes andre egenskaper av assayet (f.eks. holdbarhet, kostnad, toksisitet) som må tas i betraktning, er en vanskelig og potensielt dyr prosess.

Oppfinnerne har funnet en måte å overvinne begrensningen av konsentrasjonsområdet ved hvilket assayet er nøyaktig.

I et første trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgelig en sensor for å måle karbohydratanalyttkonsentrasjonen, som innbefatter minst to forskjellige varianter av et egnet konkurransebindingsassay, hvert assay innbefattende:

et karbohydratanalyttbindingsmiddel som er et lektin; og

en karbohydratanalyttanalog innbefattende minst én karbohydratanalyttanalogenhet;

hvor karboydratanalyttbindingsmidlet binder den minst ene karbohydratanalyttanalogenhet av karbohydratanalyttanalogen for å danne et kompleks fra hvilket karbohydratanalyttanalogen forskyves av karbohydratanalytten;

hvor de forskjellige assayer kjennetegnes ved antallet eller naturen av analyttanalogenhetene som innbefattes av analyttanalogen;

idet sensoren har evnen til å måle nøyaktig et nødvendig område av karbohydratanalyttkonsentrasjoner ved hjelp av variantene av assayet som hver har evnen til å måle nøyaktig kun en del av det nødvendige området av karbohydratanalyttkonsentrasjoner og idet variantene av assayet er valgt slik at de måler overlappende eller hosliggende konsentrasjonsområder som dekker hele det nødvendige område.

Med fordel har variantene av assayet en optimal følsomhet innen området av analyttkonsentrasjoner som de har evnen til å måle nøyaktig.

Fortrinnsvis har sensoren evnen til å måle analyttkonsentrasjonen over et bredere konsentrasjonsområde enn området over hvilket en hvilken som helst enkelt assayvariant har evnen til å måle konsentrasjonen.

Assayvariantene kan ha evnen til å måle analyttkonsentrasjonen over konsentrasjonsområder som har lignende eller forskjellig bredde, og lignende eller forskjellig IC50-verdi. Bruk av en kombinasjon av assayvarianter som har evnen til å måle analyttkonsentrasjonen over konsentrasjonsområder som er forskjellig brede, er spesielt nyttig idet det muliggjør at visse deler av et samlet konsentrasjonsområde kan overvåkes mer nøyaktig (se nedenfor).

Fortrinnsvis er sensoren egnet for påvisning eller måling av analytt i kroppsvæske, for eksempel subkutan væske. Det er ønskelig at sensoren er egnet for bruk in vivo, og dette skal diskuteres i større detalj nedenfor.

Fortrinnsvis er analytten som skal påvises eller måles i assayet glukose.

Fortrinnsvis har sensoren evnen til å måle blodglukosen for konsentrasjoner over i det minste en del av området fra 0 til 35 mM glukose, for eksempel over området fra 0 til 25 mM glukose. For eksempel kan en assayvariant ha en IC50-verdi fra 7-8 mM og en annen assayvariant kan ha en IC50-verdi rundt ca. 18 mM. Mer foretrukket har sensoren evnen til å måle glukosekonsentrasjoner over området fra 2 til 10 mM glukose. En doseresponskurve som er så nært som mulig lineær innen dette område, er ønskelig.

I en foretrukket utførelse innbefatter sensoren to varianter av et konkurransebindingsassay, idet én variant har evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i området 0-15 mM, og den andre variant har evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i området 10-35 mM, 10-25 mM eller 15-35 mM.

Bruk av overlappende områder foretrekkes idet hver assayvariant har en optimal følsomhet rundt IC50-verdien. For eksempel har oppfinnerne fremstilt et enkelt assay med en respons for glukose i området 0-100 mM på 7,5 fasegrader som tilsvarer 0,08° pr. mM Glc. Hvis to varianter av det passende konkurransebindingsassay ble brukt optimalt, ville 7,5 fasegrader være tilgjengelig i området 0-15 mM Glc, som tilsvarer 0,5° pr. mM Glc, og i det andre assay ville 7,5 fasegrader være tilgjengelig i området 10-25 mM Glc, som tilsvarer 0,5° pr. mM Glc.

En kombinasjon av en assayvariant som har evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i området 0-35 mM glukose, med en assayvariant som har evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i det smalere område 0-10 mM glukose, er spesielt å foretrekke, ettersom et mer følsomt assay i området 0-10 mM glukose ville redusere antallet falske hypoglykemialarmer, som ofte forbindes med andre kontinuerlige glukoseovervåkingsanordninger.

Fortrinnsvis innbefatter sensoren ytterligere en tredje variant av konkurransebindingsassayet, som har evnen til å måle glukosekonsentrasjoner i området 25-50 mM.

I en foretrukket utførelse benytter seg foreliggende oppfinnelse av et konkurranseassay hvor en analyttanalog kan bindes ikke-kovalent til analyttbindingsmidlet som er et lektin på et antall seter. Bindingene dannes typisk ved analyttanalogenheter av analyttanalogen. Konsentrasjonen av analytt som er nødvendig for å forskyve analyttanalogen, vil avhenge av grådigheten (den samlede bindingsevne) av analyttanalogen etter analyttbindingsmidlet.

Parametrene som påvirker grådigheten av en analyttanalog etter et gitt analyttbindingsmiddel, innbefatter:

- antallet analyttanalogenheter;

- affinitet (individuell bindingsevne) av de analoge analyttenheter med lektinet; - kalsiumkonsentrasjonen; og

- fleksibiliteten av analyttanalogen.

Den fysiologiske kalsiumkonsentrasjon kan ikke reguleres. Imidlertid kan de øvrige parametere velges.

Jo større antallet av analyttanalogenheter er som har en gitt affinitet, desto større er grådigheten av liganden etter analyttbindingsmidlet, og desto større er konsentrasjonen av analytten som er nødvendig for å forskyve den.

På lignende måte, jo større affiniteten av et gitt antall analyttanalogenheter er, desto større er grådigheten av liganden etter analyttbindingsmidlet, og desto større er konsentrasjonen av analytten som er nødvendig for å forskyve den.

Derfor kan konsentrasjonsområdet som kan måles av en assayvariant, forandres mellom høyere og lavere analyttkonsentrasjoner ved å variere antallet analyttanalogenheter, naturen av enkelte eller alle analyttanalogenheter og fleksibiliteten av analyttanalogen.

En kombinasjon av assayvarianter, som hver inneholder en analyttanalog som har forskjellig grådighet for analyttbindingsmidlet, kan derfor brukes, idet assayvariantene er valgt slik at områdene av de enkelte assayvarianter overlapper eller er hosliggende hverandre og, satt sammen, dekker hele det aktuelle område av analyttkonsentrasjoner.

Konkurransebindingsassayene innbefatter dermed hver:

et analyttbindingsmiddel som er et lektin; og

en analyttanalog innbefattende minst én analyttanalogenhet;

hvor analyttbindingsmidlet binder den minst ene analyttanalogenhet av analyttanalogen for å danne et kompleks fra hvilket analyttanalogen kan forskyves av analytten, og hvor de forskjellige assayer kjennetegnes ved antallet eller naturen av analyttanalogenhetene som innbefattes av analyttanalogen.

Påvisning

Fortrinnsvis produserer assayvarianter et målbart optisk signal som kan korreleres med analyttkonsentrasjonen, f.eks. etter stimulering med optisk energi som produserer fluorescens.

Egnede påvisningsteknikker innbefatter FRET, fluorescensenergioverføring, fluorescenspolarisasjon, fluorescensslukking, fosforescens, luminescensforsterkning, luminescensslukking, diffraksjon eller plasmonresonans.

Bindingsassayet som genererer det optiske signal, bør fortrinnsvis være reversibelt slik at det kan oppnås en kontinuerlig overvåking av fluktuerende nivåer av analytt. Denne reversibilitet en spesiell fordel ved bruk av et bindingsassayformat hvor bestanddelene av assayet ikke brukes opp.

Fortrinnsvis genereres det påvisbare eller målbare optiske signal ved bruk av et nærhetsbasert signalgenererende/modulerende enhetspar. Et signal genereres eller moduleres når et første medlem av paret bringes i tett nærhet med et andre medlem av paret.

I en foretrukket utførelse, merkes analyttbindingsmidlet som er et lektin med ett medlem av et nærhetsbasert signalgenererende/modulerende enhetspar, og analyttanalogen merkes med det andre medlem av det nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhetspar, og det finnes en påvisbar forskjell i signalet mellom når analyttanalogen og analyttbindingsmidlet danner komplekset, og når analyttanalogen forskyves fra komplekset av analytten.

Fortrinnsvis er det nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhetspar et energidonorenhets- og energimottakerenhetspar. Energidonorenheter og energimottakerenheter benevnes også henholdsvis donor- og mottakerkromoforer (eller lysabsorberende materialer). En energimottaker som ikke emitterer fluorescens, benevnes en slukkende enhet.

I dette tilfelle, merkes lektinet med ett medlem av et energidonor- og energimottakerenhetspar, og analyttanalogen merkes med det andre medlem av energidonor- og energimottakerenhetsparet. Den påvisbare forskjell i signalet tilsvarer en påvisbar forskjell i energioverføringen fra energidonorenheten til energimottakerenheten.

Mer foretrukket, bærer analyttanalogen energimottakerenheten, og analyttbindingsmidlet som er et lektin bærer energidonorenheten.

Med fordel innlemmer sensoren ifølge oppfinnelsen et assay som genererer en optisk avlesning ved bruk av FRET-teknikken.

I en foretrukket utførelse, innbefatter variantene av konkurransebindingsassayet hver:

et analyttbindingsmiddel som er et lektin merket med et første lysabsorberende materiale;

et makromolekyl merket med et andre lysabsorberende materiale og innbefattende minst én analyttanalogenhet;

hvor analyttbindingsmidlet binder den minst ene analyttanalogenhet av makromolekylet for å danne et kompleks fra hvilket makromolekylet kan forskyves av analytten, og hvor komplekset har evnen til å absorbere lysenergi og den absorberte lysenergi har evnen til å overføres ikke-strålende mellom ett av de lysabsorberende materialer og det andre av de lysabsorberende materialer med en derav følgende målbar endring av en fluorescensegenskap av de lysabsorberende materialer når de foreligger i komplekset, sammenlignet med deres fluorescensegenskap når makromolekylet forskyves fra komplekset av analytten, og hvor de forskjellige varianter av assayet kjennetegnes ved antallet analyttanalogenheter som foreligger i makromolekylet.

Fluorescenslivstids- eller fluorescensintensitetsmålinger kan utføres. Fluorescenslivstid kan måles ved bruk av fasemodulasjonsteknikker.

Når assayet skal brukes in vivo, er det ønskelig at donorer fluorescerer ved 550 til rundt 700 nm og at mottakere absorberer lys ved rundt 650 nm. Dette unngår overlapping mellom donorfluorescensen og in vivo-autofluorescens ved kortere bølgelengder.

Alexa Fluor 594 (f.eks. som suksinimidylester) er en energidonorenhet med et egnet emisjonsspektrum for bruk in vivo. Dette fargestoff absorberer ved 594 nm og fluorescerer ved 620 nm.

HMCV-fargestoffene som beskrives i WO 05/059037, er egnede energimottakerenheter for bruk ifølge oppfinnelsen. Disse fargestoffer er stabiliserte karbeniumioner. Et eksempel er Hexa-Methoksy-Crystal Violet-suksinimidylester (HMCV-1).

Alternativt kan QSY21 brukes som energimottakerenhet med Alexa Fluor 594 som energidonorenhet.

Fluorescenslivstids- eller fluorescensintensitetsmålinger kan utføres. Fluorescenslivstid kan måles ved bruk av fasemodulasjonsteknikker (diskutert nedenfor).

I en foretrukket utførelse, merkes analyttbindingsmidlet med Alexa Fluor 594 som energidonorenhet, analyttanalogen merkes med HMCV-1 som energimottakerenhet, og fluorescenslivstiden måles ved bruk av fasemodulasjonsteknikker.

I assayer av denne type, tilveiebringer de materialbevarende assaybestanddeler fortrinnsvis tilstrekkelig rom til at energidonor- og energimottakerenhetenene kan atskilles når de ikke er bundet til hverandre, slik at energioverføringen kan opphøre.

Analyttbindingsmiddel

Analyttbindingsmidlet er et lektin. Begrepet "lektin" innbefatter ethvert karbohydratbindende protein som ikke åpenbart er involvert i karbohydratmetabolismen og som ikke tilhører noen av hovedklassene av immunoglobuliner. Lektiner oppviser selektiv binding til karbohydrater via karbohydratgjenkjenningsdomener (CRD'er). Lektiner forekommer naturlig i både monomere og multimere former, idet sistnevnte ofte innbefatter et antall delenheter som hver bærer flere CRD'er. Bruk av et lektin som analyttbindingsmiddel er derfor spesielt godt egnet når analytten er et karbohydrat.

De FRET-baserte systemer som ble diskutert ovenfor, avhenger av Concanavalin A (Con A) som glukosebindingsmiddel. Concanavalin A er et planteavledet lektin.

Concanavalin A er ikke stabilt over lengre tidsrom under assaybetingelser (se den samtidig innleverte søknad WO 06/061207).

Dessuten er Concanavalin A toksisk og potensielt immunogent (imidlertid brukes det i glukoseassayer i små mengder som antas å være sikre i menneskets kropp).

Vår søknad (WO 06/061207) som ble nevnt ovenfor, baserer seg på innsikten at det finnes et behov for å finne glukosebindende enheter som ikke har ulempene forbundet med Con A. Bruk av alternative glukosebindende enheter er blitt undersøkt, og man har overraskende funnet at dyrelektiner, spesielt humane lektiner, kan brukes som glukosebindende enheter.

Fortrinnsvis er lektinet derfor et dyrelektin, selv om bruk av plantelektiner så som Con A ikke utelukkes.

Fortrinnsvis er lektinet et lektin av C-type (kalsiumavhengig).

Fortrinnsvis er dyrelektinet et virveldyrlektin, for eksempel et pattedyrlektin, mer foretrukket et humant eller humanisert lektin. Imidlertid kan det alternativt være et fuglelektin, fiskelektin eller et lektin fra et virvelløst dyr så som et insektlektin.

Med fordel er lektinet et humant lektin avledet fra menneskets kropp. Alternativt kan lektinet være et rekombinant fremstilt lektin.

Som ytterligere alternativ kan lektinet være et humanisert dyrelektin, for eksempel et humanisert bovint lektin. Dette gjelder når det finnes et tilsvarende humant lektin. Lektinet kan humaniseres på analog måte som antistoffer.

Med fordel er lektinet i multimer form. Multimere lektiner kan avledes fra et menneskes eller dyrs kropp. Alternativt kan lektinet foreligge i monomer form. Monomere lektiner kan dannes ved bruk av rekombinante metoder, eller ved å sprenge bindingen mellom delenheter i et naturlig multimert lektin avledet fra et menneskes eller dyrs kropp.

Eksempler på dette er slik som det beskrives i US 6232 130.

Fortrinnsvis har lektinet tre eller flere CRD'er. Mer foretrukket har lektinet 6, 9, 12, 15 eller flere CRD'er.

Fortrinnsvis er lektinet et kollektin (kollagenlignende lektin). Dette er dyrelektiner av C-type som har kollagenlignende sekvenser (Gly-Xaa-Yaa-triplett). MBL er et kollektin av C-type, mens Concanavalin A er et lektin av C-type. Monomere kollektin-CRD'er kan fremstilles ved innvirkning av kollagenase.

Fortrinnsvis er lektinet mannosebindende lektin, konglutinin eller kollektin-43 (f.eks. bovint CL-43) (alle disse er serumkollektiner) eller et pulmonæroverflateprotein ("pulmonary surfactant protein") (lungekollektiner).

Mannosebindende lektin (også benevnt mannanbindende lektin eller mannanbindende protein, MBL, MBP), for eksempel humant MBL, har vist seg å være spesielt interessant. MBL er et kollagenlignende forsvarsmolekyl som innbefatter flere (typisk 3 til 4 (MALDI-MS), selv om fordelinger av 1 til 6 også gjerne kan forekomme (SDS-PAGE)) delenheter i en "bukett"-anordning som hver består av tre identiske polypeptider. Hver delenhet har en molekylvekt rundt 75 kDa, og kan valgfritt være kompleksert med ett eller flere MBL-assosierte serinproteaser (MASP'er). Hvert polypeptid inneholder en CRD. Dermed presenterer hver delenhet tre karbohydratbindingsseter. Trimere MBL og tetramere MBL (som er hovedformene som foreligger i humant serum, Teillet et al., Journal of Immunology, 2005, side 2870-2877) presenterer henholdsvis ni og tolv karbohydratbindingsseter.

MBL forekommer naturlig i kroppen som en del av det iboende immunsystem hvor det binder mannoseenheter som dekker overflaten av bakterier. Humant MBL er ikke tok sisk og er ikke-immunogent for mennesker. MBL fra andre arter forventes å være immunogent, men ikke toksisk for mennesker.

Humant MBL er handelstilgjengelig både i en form avledet fra menneskets kropp og i en rekombinant fremstilt form. Det brukes som erstatningsterapi ved behandling av MBL-manglende pasienter som antas å ha en hevet mottakelighet for smittesykdommer.

Med fordel er lektinet MBL i det vesentlig i trimer og/eller tetramer form. Slik som det ble beskrevet ovenfor, antas trimere MBL og tetramere MBL å være de overveiende naturlig forekommende multimere former i humant serum.

Alternativt kan lektinet være et pulmonæroverflateprotein valgt fra SP-A og SP-D. Disse proteiner ligner på MBL. De er vannløselige kollektiner som fungerer som kalsiumavhengige karbohydratbindende proteiner i iboende vertsforsvarsfunksjoner. SP-D binder også lipider. SP-A har en "bukett"-struktur som ligner strukturen av MBL (Kilpatrick, D.C. (2000) Handbook of Animal Lectins, s. 37, J Appl Physiol 51, 1-8, Am J Respir Cell Nol Biol 4, 88-94). SP-D har en tetramer "X"-struktur med CRD'er i hver ende av "X"-et.

Andre egnede dyrelektiner er de som er oppført i den følgende opplisting:

- PC-lektin (US 20030216300, US 20040265898)

- CTL-1 (US 179528/10)

- Keratinocyttmembranlektiner (Parfuemerie und Kosmetik 74, 164-80)

- CD94 (Eur J Immunol 25, 2433-7)

- P35 (synonym: humant L-ficolin, en gruppe lektiner) (Immunol Lett 67, 109-12) - ERGIC-53 (synonym: MR60) (Mol Biol Cell, 7, 483-93)

- HIP/PAP (Eur J Biochem 267, 1665-71)

- CLECSF8 (Eur J Immunol 34, 210-20)

- DCL (gruppe av lektiner) (søknad nr. 00231996/US)

- protein fra GLUT-familien, spesielt GLUT1, GLUT4 og GLUT11 (PNAS 97, 1125-30)

Andre egnede dyrelektiner nevnes i Appendix A, B og C av "Handbook of Animal Lectins: Properties and Biomedical Applications", David C. Kilpatrick, Wiley 2000.

Slik som det ble diskutert ovenfor, kan forskjellige analyttbindingsmidler brukes i forskjellige assayvarianter.

Teillet et al. (J. Immunol., 2005, s. 2870-2877) demonstrerer at trimert MBL (9 CRD'er) bindes mindre sterkt til karbohydrater enn tetramere MBL (12 CRD'er). Ved bruk av et assay med forskjellige lektiner eller, slik som tilfellet er her, forskjellige MBL-multimerer, kan brukes til å endre følsomheten også.

Derfor kan de forskjellige assayvarianter skjelnes ved at de har forskjellige lektiner som analyttbindingsmidler. Fortrinnsvis er de forskjellige lektiner som analyttbindingsmidler forskjellige MBL-arter, for eksempel MBL-arter som har forskjellige antall CRD'er (for eksempel 9 CRD'er og 12 CRD'er slik som det ble diskutert ovenfor).

Analyttbindingsmidlet er fortrinnsvis merket slik som det ble diskutert ovenfor.

Analyttanalog

Fortrinnsvis er analyttanalogen en glukoseanalog.

Fortrinnsvis innbefatter analyttanalogen et flertall karbohydrat- eller karbohydratmimetiske analyttanalogenheter som bindes til bindingsseter av analyttbindingsmidlet. Begrepet "karbohydrat" innbefatter sukkere.

Egnede karbohydratmimetiske enheter innbefatter peptider så som keratinpeptid (SFGSGFGGGY), som etterligner N-acetylglukosamin. Det er blitt vist at keratinpeptid kan inhibere MBL (Mantacto et al. 2001 J. Immunol. 166, 4148-4153).

Med fordel er karbohydrat-analyttanalogenhetene monosakkarider eller oligosakkarider (oligomerer). Analyttanalogen i og for seg kan være et oligosakkarid (se nedenfor).

Egnede monosakkarider er valgfritt derivatiserte tetroser, pentoser, heksoser, heptoser eller høyere aldose- eller ketosehomologer, for eksempel valgfritt derivatisert D-glukose, D-mannose, N-acetyl-D-glukosamin, L-fukose, D-fruktose, D-tagatose eller D-sorbitol.

Egnede oligomerer kan være rettkjedede eller forgrenede homooligomerer eller blandede oligomerer, for eksempel inneholdende fra 2 til 50 karbohydratenheter.

'HQIRUHWUXNQHJO\NRV\ODVMRQHUĺHOOHUĺHWWHUVRPĺRJĺJO\NRV\ODVMRQ IRUYHQWHVnIRUVW\UUH0%/ELQGLQJHQ)RUHNVHPSHOIRUYHQWHVQRQDĺĮJOXNRVH GHNVWUDQ'DnKDVWHUNHUHJUnGLJKHWIRU0%/HQQȕ'JOXNRVHUIHNVODPL nanariheksaose). Egnede oligosakkarider innbefatter pannose, maltose, maltotriose, isomaltotriose, D-leukrose, erlose, D-palatinose, D-turanose eller 1 til 250 kDa dekstran (fortrinnsvis 1 til 40 kDa dekstran, for eksempel 1 kda, 1,5 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 25 kDa eller 40 kDa dekstran).

Fortrinnsvis er analyttanalogenhetene av minst én assayvariant valgt fra D-fruktose, D-leukrose, N-acetylglukosamin, D-mannose, L-fukose, N-acetylmannosamin, D-arabinose, myo-inositol, D-tagatose, erlose, D-glukose, D-palatinose, D-turanose, D-ribose, D-sorbitol.

Eksempler på et syntetisk forgrenet sakkarid er dendrimer-"kiler" som brukes til å konstruere dendrimerer (f.eks. TRIS-avledet trisakkarid med et aminbindeledd, vist nedenfor). Slike "kiler" kunne konjugeres på et protein så som HSA (humant serumalbumin), for eksempel via et bifunksjonelt aminbindeledd.

Oppfinnerne har funnet at affiniteten av vanlige karbohydratenheter for MBL er som følger:

D-Mannose, N-acetyl-D-mannosamin, D-fruktose, D-leukrose, erlose, N-acetyl-D-glukosamin, L-Fukose > myo-inositol, D-glukose, D-arabinose, D-palatinose, D-turanose, D-sorbitol, D-ribose, D-tagatose > D-lyksose > laktose, L-arabinose, D-galaktose.

En fagperson vil forstå at ved bruk av denne liste, kunne man velge ut variantassayer hvor analyttanalogene innbefatter analyttanalogenheter med forskjellig affinitet for analyttbindingsmidlet. For eksempel ville en analyttanalog med mannoseanalyttanalogenheter ha høyere grådighet for MBL som analyttbindingsmiddel enn en analyttanalog med samme antall glukose-analyttanalogenheter. Derfor ville den mannoseholdige analyttanalog kreve at mer glukoseanalytt ble forskjøvet fra MBL, og dette assay ville ha en optimal følsomhet over et større glukosekonsentrasjonsområde enn assayet som benyttet seg av de glukoseholdige analyttanaloger.

En fagperson vil også forstå at en analyttanalog innbefattende flere enn én type analyttanalogenhet kunne fremstilles. Dette muliggjør en bedre regulering over de optimale glukosefølsomhetsområder.

Fortrinnsvis innbefatter analyttanalogenhetene av minst én assayvariant minst én glukoseenhet og/eller minst én N-acetylglukosaminenhet og/eller minst én mannoseenhet, ettersom disse har en høy affinitet for MBL og andre dyrelektiner. Mest foretrukket er analyttanalogenhetene av minst én assayvariant D-glukose.

Fortrinnsvis innbefatter analyttanalogen et makromolekyl.

Fortrinnsvis er makromolekylet en naturlig polymer. Mer foretrukket er makromolekylet rettkjedet.

Tre forskjellige typer struktur for analyttanalogen er av spesiell interesse.

For det første kan analyttanalogen være et karbohydrat/protein-konjugat eller et karbohydrat/dendrimer-konjugat, slik at makromolekylet er et protein eller en dendrimer. I hvert av disse tilfeller kan karbohydratmimetiske enheter brukes istedenfor eller i tillegg til karbohydratenheter som analyttanalogenheter.

Foretrukne proteiner for bruk i konjugatet er humane proteiner som har en molekylvekt på minst 10 kDa, fortrinnsvis minst 20 kDa. Fortrinnsvis har proteinet en ikke-globulær samlet tertiær struktur. Man tror at dette fremmer bindingen på flere enn ett bindingssete, hvilket fører til stor grådighet. Monoklonale antistoffer så som herceptin og Remicade (et immunoglobulin som har flere globulære domener med en ikke-globulær "Y"-formet samlet tertiær struktur) er egnet. Andre alternative egnede proteiner er humant trombin, humant laktoferrin og Faktor XIII.

Som et annet eksempel på et karbohydrat/protein-konjugat kan proteinet være et lektinavledet protein, for eksempel et lektin hvor CRD'ene er fjernet.

Med fordel kan konjugatet være et karbohydrat/albumin-konjugat. For eksempel kan konjugatet være et mannose/HSA-konjugat eller et mannose/BSA (bovint serumalbumin)-konjugat. Imidlertid er konjugater av denne type ikke foretrukne ettersom, slik som det ble nevnt ovenfor, binding til MBL har vist seg å være avhengig av kalsiumkonsentrasjonen. Ved fysiologisk kalsiumkonsentrasjon viste det seg at et 70 kD mannose/HSA-konjugat med 20 mannoseresiduer ikke bandt seg til MBL. Avhengigheten av kalsiumkonsentrasjonen synker med økende mannosylasjon.

En fagperson vil være kjent med syntetiske ruter til konjugater av denne type. Som HNVHPSHONDQ1LVRWLRF\DQDWDPLQRIHQ\O2Į'PDQQRS\UDQRVLG0DQ,7&NRQMX geres på HSA.

I en foretrukket utførelse er makromolekylet i hver konkurransebindingsassayvariant HSA og analyttanalogenheten er glukose eller mannose, og hver variant av konkurransebindingsassayet inneholder et HSA/glukose- eller mannose-konjugat innbefattende et forskjellig antall glukose- eller mannoseenheter. Med fordel er analyttbindingsmidlet i denne utførelse MBL.

Dendrimerer for bruk ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis amin-funksjonaliserte, karboksylsyre-funksjonaliserte eller hydroksyl-funksjonaliserte overflater. Fortrinnsvis er dendrimerene av type polyamidoamin (PAMAM) eller polypropylenimin (DAB). Fortrinnsvis er molekylvekten mindre enn 60 kDa, for eksempel rundt 2 til 10 kDa. Slike dendrimerer kan klarnes av nyrene (Kobayashi et al., 2004, J. Mag. Reson.

Imaging 20 (3) 512-518).

For det andre kan analyttanalogen være en valgfritt derivatisert polymer av karbohydratog/eller karbohydratmimetiske enheter (begge innbefattet i begrepet "polysakkarid" som EUXNHVKHUL'HNVWUDQHQJOXNRVHSRO\PHUSRO\ĺĮJOXNRVHELQGHVVWHUNWWLO MBL og lignende lektiner. Oppfinnerne tror at dette er et resultat av det store antallet glukoseresiduer (ca. 430 residuer i 70 kDa dekstran) og fleksibiliteten av dekstran. Konsentrasjonen av glukose som er nødvendig for å forskyve dekstran fra MBL, er derfor stor.

En glukoseassayvariant basert på dekstran og MBL kan optimalt måle glukosekonsentrasjoner rundt 30 mM. Dette er mye mer enn den normale 5 mM glukosekonsentrasjon i blod. En slik assayvariant kan måle glukosekonsentrasjoner fra 0 til 10 mM med en følsomhet på kun ca. en tredjedel av den samlede faserespons.

Foreliggende oppfinnere lette derfor etter alternative analyttanaloger som ville binde MBL og lignende lektiner mindre sterkt, slik at man kunne oppnå en assayvariant hvor mer enn en tredjedel av den samlede faserespons ville være tilgjengelig i glukoseområdet fra 0 til 10 mM.

Oppfinnerne oppdaget at behandling av dekstran med perjodat (som oksidativt spalter glukosepyranoseringen mellom karbonene 2 og 3 eller 3 og 4 for å danne et dialdehyd) kan brukes for å redusere grådigheten av dekstran for MBL og lignende lektiner. Dette virker å skyldes at MBL bindes til de 3 og 4 ekvatoriale hydroksyler av glukose slik som det ble beskrevet ovenfor. De 3 og 4 hydroksylgrupper kunne inaktiveres på andre måter (for eksempel ved oksidasjon, reduksjon, alkylering, substitusjon, glykosylasjon eller forestring).

Meget overraskende fant oppfinnerne at perjodatbehandlet dekstran/MBL-binding ikke forhindres av fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner. Dette stod i motsetning til mannose/HSA-konjugat-MBL-binding slik som det ble diskutert ovenfor. Det ville ha vært å forvente at perjodat-behandlet dekstran/MBL-binding ble forhindret av fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner, spesielt ettersom glukoseenhetene av dekstran har lavere affinitet for MBL enn mannoseenheter har.

Teoretisk kunne det inntas to ekvivalenter perjodat per glukoseenhet (én per diol). Imidlertid har man funnet at 1 til 100 ekvivalenter perjodat er egnet for 70 kDa dekstran.

Behandling av dialdehydet med ammoniakk eller et amin fulgt av reduksjon (f.eks. med natriumcyanoborhydrid) kan brukes for å gi et aminert dekstran. Det kan også brukes en fremgangsmåte hvor dialdehydet amineres, fulgt av valgfri katalytisk hydrogenering for å gi det frie amin. Benzylamin er et nyttig amin i denne sammenheng. Et benzylaminavledet aminert dekstran kan brukes til å bedømme graden av perjodatspaltning, ved bruk av spektrofotometriske teknikker. Hvis benzylgruppen fjernes ved katalytisk hydrogenering, kan energidonor- eller energimottakerenheter kobles til det gjenværende amin.

Alternativt, slik som det ble diskutert ovenfor kan det syntetiseres polysakkarid-baserte analyttanaloger som bærer forskjellige karbohydrat- eller karbohydratmimetiske analyttanalogenheter med forskjellig affinitet for MBL og lignende lektiner. Derivatisering av dekstran med mannoseenheter for å justere glukosepåvisningsområdet i et Concanavalin A-FRET-assay beskrives i Ballerstadt et al., Diabetes Technology & Therapeutics, vol. 6, nr. 2, 2004.

Galaktose bindes til MBL med meget lav affinitet. Derfor har en analyttanalog som inneholder galaktoseenheter (for eksempel galaktose-derivatisert dekstran) lavere grådighet for MBL enn den uderivatiserte analyttanalog.

N-acetylglukosamin har høy affinitet for MBL. Derfor ville en analyttanalog som inneholder N-acetylglukosaminenheter (for eksempel GlcNAc-derivatisert amylose) ha høyere grådighet for MBL enn den uderivatiserte analyttanalog.

I denne utførelse er fortrinnsvis analyttanalogen valgt fra valgfritt derivatisert dekstran, mannan, amylose, amylopektin, glykogen, hyaluronat, kondroitin, heparin, dekstrin, inulin, xylan, fruktan og kitin. Ettersom galaktose har meget lav affinitet for MBL, er en ikke-derivatisert polymer av galaktose så som agarose ikke foretrukket som analyttanalog.

En fagperson vil være kjent med måter som et polysakkarid kan derivatiseres på med karbohydratenheter. Som eksempel kan amin-funksjonaliserte polysakkarider (for eksempel aminodekstran, som er handelstilgjengelig fra KarboMer, San Diego, California, USA, katalognr. 5-00060 eller Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA, katalognr. D1862) eller de aminerte dekstraner som ble nevnt ovenfor, bekvemt derivatiseres. Alternativt kan alkoholgrupper i polysakkarid- og amingruppene i karbohydrat- eller de karbohydratmimetiske enheter kobles ved bruk av divinylsulfon. Metoder for å derivatisere dekstran beskrives i EP 594772.

Eksempler på egnede karbohydrat-analyttanalogenheter for derivatisering av polysakkarider er de som er oppført i sammenheng med karbohydrat/protein- og karbohydrat/dendrimer-konjugatene ovenfor.

I en foretrukket utførelse er analytten glukose, og i hver variant av konkurransebindingsassayet danner makromolekylet og analyttanalogenheten sammen et derivatisert dekstran, og hver variant av konkurransebindingsassayet inneholder et dekstran derivatisert slik at antallet analyttanalogenheter innlemmet i dekstranet er forskjellig. Med fordel er analyttbindingsmidlet i denne utførelse MBL.

I en spesielt foretrukket utførelse er det derivatiserte dekstran i hvert tilfelle valgfritt perjodat-behandlet dekstran.

For det tredje kan analyttanalogen være en syntetisk polymer.

Syntese av en kunstig polymer heller enn derivatisering av et protein eller polysakkarid gjør det mulig å lett styre parametrene av polymeren (for eksempel molekylfleksibilitet, vannløselighet, molekylvekt, naturen av karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter, antallet karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter, antallet nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter) for å forbedre assayytelsen og å tilveiebringe egnede assayvarianter. Sammenlignet med et polysakkarid, har en syntetisk polymer den fordel at antallet karbohydrat-analyttanalogenheter kan styres uavhengig av lengden av polymeren. Videre gir bruk av ikke-ringholdige monomerer så som 2-hydroksyetylakrylat (HEA) i polymeren en økt molekylær rotasjonell fleksibilitet sammenlignet med dekstran.

Uten at de ønsker å binde seg til denne teori, tror oppfinnerne at det er viktig at nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter er nær bindingsenheten for å generere et sterkt signal. Globulære ligander konsentrerer bindingsenheter og nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter på en sfærisk flate slik at de er nære hverandre. I dekstran, som er rettkjedet, består grunnstrukturen av bindingsenheter, og det er derfor ikke mulig å styre om bindingen er nær eller fjernt fra en nærhetsbasert signalgenererende/-modulerende enhet. Dette kan styres i den syntetiske polymer ved å plassere bindingsenhetene nære de nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter.

I denne utførelse er fortrinnsvis analyttanalogen en ikke-sakkarid, fleksibel vannløselig polymer som bærer påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske analyttanalogenheter.

Begrepet "fleksibel" innbefatter polymerer som har evnen til betraktelig intermonomer rotasjon. Fortrinnsvis inneholder polymerene ikke store grupper (for eksempel ringstrukturer, tert-butylgrupper eller andre sterisk store grupper) i tillegg til de påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske analyttanalogenheter og nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter (diskutert nedenfor). Fortrinnsvis har slike polymerer meget få dobbeltbindinger i grunnstrukturen (for eksempel færre enn 10%). Med fordel har slike polymerer ikke noen globulær tertiær struktur, selv om de kan ha en slik struktur.

Fortrinnsvis er polymeren uforgrenet (til forskjell fra dendrimerene som ble diskutert ovenfor). Dette forbedrer polymerene fleksibilitet. Imidlertid kan polymeren være forgrenet eller fornettet i noen grad, forutsatt at dette ikke fører til dannelse av en hydrogel. For eksempel er 1 til 5 forgreninger i en polymer med en samlet molekylvekt på 100 kDa akseptabelt.

Begrepet "vannløselig" innbefatter polymerer som har en vannløselighet ved romtemperatur på minst 4 mg/ml, fortrinnsvis minst 25 mg/ml, mer foretrukket minst 50 mg/ml, for eksempel minst 100 mg/ml. Løseligheten vil være høyere ved kroppstemperatur. Det er viktig at polymeren er vannløselig slik at den vil løse seg opp i interstitiell væske når den brukes i en sensor i kroppen slik som det skal diskuteres i det følgende. Polymeren bør være vannløselig selv når den er bundet til et karbohydratbindende molekyl så som MBL.

Fortrinnsvis innbefatter polymeren ikke flere enn 1 til 5 typer monomerenheter, mer foretrukket ikke flere enn 3 monomerenheter.

Med fordel er polymeren en kopolymer innbefattende første monomerenhetsresiduer som bærer påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter og andre monomerenhetsresiduer som bærer påhengende nærhetsbaserte signalgenererende/-modulerende enheter. Alternativt eller i tillegg kan det brukes én enkelt type monomerenhetsresiduum som bærer både påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter og påhengende nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter. Bruk av første og andre monomerenheter er å foretrekke, ettersom mengden karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enheter og nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter da kan reguleres uavhengig.

Fortrinnsvis er kopolymeren en tilfeldig kopolymer. Imidlertid kan den også være en alternerende kopolymer. Bruk av en blokkopolymer med store blokker er ikke å foretrekke. Imidlertid kan det brukes en blokkopolymer med blokker med lav molekylvekt (for eksempel 1 til 3 kDa).

Når den brukes i et assay med MBL som karbohydratbindende molekyl, bindes polymeren fortrinnsvis til MBL ved 0 mM glukose minst 50% så sterkt som aminodekstran, mer foretrukket minst så sterkt som aminodekstran, men er lettere å inhibere. Det er spesielt viktig at polymeren lett inhiberes over området fra 0 til 35 mM glukose, og spesielt over området fra 2 til 15 mM. Dette gir et assay over glukosekonsentrasjoner som fysiologisk sett er spesielt interessante som er mer følsomt enn et lignende assay ved bruk av aminodekstran som glukoseanalog.

Flere enn én type monomerenhetsresiduum som bærer karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter, kan foreligge. De karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kan være forskjellige, med forskjellige affiniteter for MBL og lignende lektiner.

Med fordel er hver av de første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) et dobbeltbinding-holdig derivat av en karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enhet. Imidlertid kan hver av de første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) være et dobbeltbinding-holdig molekyl som inneholder en funksjonell gruppe som de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kan kobles til, med fordel etter polymerisasjon.

Fortrinnsvis er det dobbeltbinding-holdige derivat av de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter et allyl- eller vinylholdig derivat av en karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enhet. Andre egnede dobbeltbinding-holdige derivater av karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter innbefatter homologer av allylderivater, for eksempel 3-butenyl- eller 4-pentenylderivater, eller styrenderivater med den karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enhet i 4-posisjon. Ytterligere egnede dobbeltbinding-holdige derivater av karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter innbefatter HEA-, 2-hydroksyetylmetakrylat (HEMA)- eller vinylalkohol (VA)-baserte derivater.

De karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kan kobles til amin-, syre-, alkohol- og/eller sulfonfunksjonelle grupper av den første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter). For eksempel kan alkoholgrupper i monomerenhetene og amingrupper i de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kobles ved bruk av divinylsulfon. Når karbohydratet er mannose, bør koblingen ikke skje via C3-OH- eller C4-OH-gruppene, ettersom disse er viktige ved binding til MBL. I dette tilfelle kan divinylsulfonkobling være uegnet.

Aminoderivatiserte karbohydratenheter kan fremstilles ved reduktiv aminering av disakkarider. Dette gjør det mulig for karbohydratenheten å kobles i sin anomere posisjon (C1).

De karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kunne kobles til alkoholgrupper (f.eks. i HEA) ved Fischer-glykosidasjon.

Det er ikke nødvendig at de første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) inneholder dobbeltbindinger.

Eksempler på egnede karbohydrater for bruk i kopolymerene er de som ble diskutert i sammenheng med karbohydrat/protein-konjugatene ovenfor.

Med fordel er hver av de andre monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) et dobbeltbinding-inneholdende molekyl som inneholder en funksjonell gruppe som den nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhet kan kobles til, med fordel etter polymerisasjon. Egnede funksjonelle grupper innbefatter syre, alkohol og/eller sulfon. Kobling etter polymerisering hjelper å minimere tapet av de dyre energidonor- og energimottakerenheter.

Imidlertid kan de andre monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) inneholde de nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter. I dette tilfelle gjelder diskusjonen ovenfor av egnede polymeriserbare grupper og koblinger.

I en foretrukket utførelse er hver av de andre monomerenheter N-(3-aminopropyl)metakrylamid eller et derivat derav.

I en foretrukket utførelse er hver av de enkle monomerenheter et dobbeltbinding-inneholdende, karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enhet-inneholdende derivat av lysin. Et eksempel er vist nedenfor (flertrinns reaksjonsskjema):

Utgangsmaterialet i dette reaksjonsskjema er metakryloyl-L-lysin, tilgjengelig via PolysSciences Europe (Eppelheim, Tyskland). Etter polymerisering kunne alfaamingruppen kobles til den nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhet.

Fortrinnsvis inneholder polymeren dessuten tredje monomerenhetsresiduer som ikke bærer påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske eller nærhetsbaserte signalgenererende/-modulerende enheter. Dette hjelper med å heve fleksibiliteten.

Fleksibiliteten heves ved bruk av tredje monomerenheter som er sterisk uhindret, så som HEA. Fleksibiliteten heves også ved bruk av tredje monomerenheter som er uladede. En polymer som ikke inneholder noen tredje monomerenheter, ville ha et stort antall positivt ladede ammoniumgrupper, som ville måtte inaktiveres for å minimere en redusert fleksibilitet ved elektrostatisk avstøtning.

Flere enn én type tredje monomer kan innlemmes i polymeren.

Fortrinnsvis er hver av de tredje monomerenheter et dobbeltbinding-inneholdende molekyl inneholdende en hydrofil gruppe, for eksempel en hydroksylgruppe. Det er ikke foretrukket at de tredje monomerenheter er et lipofilt dobbeltbinding-inneholdende molekyl, for eksempel styren.

I en foretrukket utførelse er hver av de tredje monomerenheter HEA, vinylpyrrolidon, MMA, HEMA, vinylalkohol og/eller etylenglykol. Imidlertid vil en fagperson forstå at det finnes mange andre dobbeltbinding-inneholdende molekyler inneholdende hydrofile grupper som kunne brukes.

Med fordel omsettes monomerenhetene ved tilsetningspolymerisering. Tilsetningspolymeriseringen kan initieres av frie radikaler, for eksempel ved bruk av kaliumperoksodisulfat (PPS) eller en annen peroksidforbindelse.

Andre muligheter er kondensasjonspolymerisering (for eksempel ionisk kondensasjonspolymerisering), ringåpningspolymerisering og atomoverføringsradikalpolymerisering (ATRP). En fagperson vil forstå at naturen av monomerenhetene vil avhenge av den ønskede polymeriseringsmetode (for eksempel er dobbeltbinding-inneholdende monomerenheter ikke nødvendig for kondensasjonspolymerisering).

Med fordel blandes monomerenhetene før initiatoren tilsettes.

Fortrinnsvis tar polymerisasjonsreaksjonen mindre enn to dager. Varigheten av polymerisasjonen kan brukes til å regulere molekylvekten av kopolymerproduktet.

Med fordel finner polymerisasjonsreaksjonen sted under oksygenfrie betingelser.

Med fordel utføres polymerisasjonsreaksjonen ved romtemperatur.

Når det ikke brukes én enkelt monomerenhet, foreligger den første monomerenhet fortrinnsvis i reaksjonsblandingen i en mengde fra 20 til 70 vekt%, mer foretrukket i en mengde fra 30 til 50 vekt%.

Når det brukes tredje monomerenheter, foreligger de fortrinnsvis i reaksjonsblandingen i en mengde fra 5 til 15 vekt%.

Det vil være underforstått at sammensetningen av polymeren ikke nøyaktig gjenspeiler mengden av monomerenheter som foreligger i reaksjonsblandingen. Dette skyldes innvirkningen av andre faktorer (for eksempel sterisk hindring og løselighet).

I en foretrukket utførelse er analytten glukose, og i hver variant av konkurransebindingsassayet danner makromolekylet og analyttanalogenhetene sammen en polymer som beskrevet ovenfor, og de forskjellige assayvarianter kjennetegnes ved antallet eller naturen av analyttanalogenheter i polymeren. Foretrukne polymerer innbefatter man-QRVHE UHQGHSRO\PHUHUIRUHNVHPSHOVOLNHIUHPVWLOWDYDOO\OĮ'PDQQRS\UDQRVLGVRP DQGUHPRQRPHUHQKHWPHGIRUVNMHOOLJHPHQJGHUDOO\OĮ'PDQQRS\UDQRVLGIRUGHIRU skjellige polymervarianter). Fortrinnsvis er analyttbindingsmidlet i denne utførelse MBL.

Det bør også noteres at analyttanalogen kan bestå av to eller flere atskilte helheter som sammen virker som analyttanalog. Spesielt kan analyttanalogen bestå av en første helhet med minst to analyttanalogenheter og en andre helhet som er et analyttbindingsmiddel så som et lektin. For eksempel kan merket mottaker-MBL og merket donor-MBL brukes sammen med umerket dekstran eller umerket syntetisk polymer som sjablong for å bringe det merkede donor-MBL og det merkede mottaker-MBL i nærheten av hverandre slik at det finner sted FRET (et eksempel som benytter seg av Con A, gis av Gestwicki et al. (2002) Chemistry and Biology 9, s. 163).

Fortrinnsvis merkes analyttanalogen slik som det ble diskutert ovenfor.

De nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter kan festes på analyttanalogen slik som det ble diskutert i sammenheng med de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske analyttanalogenheter ovenfor. For eksempel kan merking av dekstran oppnås ved direkte divinylsulfonkobling eller ved aminering (slik som det ble beskrevet ovenfor) fulgt av kobling. Når det brukes et aminderivatisert dekstran som analyttanalog, må man være nøye med å unngå fornetning under påfestingen av energidonoreller energimottakerenhetene, ettersom dette kunne føre til uønsket felling. Metoder for å derivatisere dekstran med DVS for å minimere fornetning beskrives i EP 594772.

Analyttanalogen bør ha en tilstrekkelig høy molekylvekt til å forhindre at den slipper ut fra sensoren, men tilstrekkelig lav til at det ikke finner sted felling når analyttanalogen bindes til analyttbindingsmidlet. Analyttanaloger som har en vekt i området 25 til 250 kDa, mer foretrukket 40 til 250 kDa, enda mer foretrukket 70 til 150 kDa, sterkt foretrukket 100 til 120 kDa, for eksempel 110 kDa, er å foretrekke. Analyttanaloger basert på 110 kDa dekstran er spesielt foretrukne.

Valgfritt forankres analyttanalogen og analyttbindingsmidlet sammen.

Sensorkonstruksjon

Fortrinnsvis holdes bestanddelene av assayet fast av et materiale som har en porestørrelse som tillater diffusjon av analytt, men ikke av assaybestanddelene. Imidlertid kan denne selektivitet oppnås på andre måter, for eksempel ved bruk av et materiale som tillater diffusjon av uladede materialer.

Fortrinnsvis innesluttes de forskjellige assayvarianter av sensoren i atskilte rom av sensoren. Rommene kan være makroskopiske eller mikroskopiske og er fortrinnsvis plassert tilstrekkelig nær hverandre til å kunne avspørres simultant av én enkelt måleanordning. Imidlertid kan assayvarianter innesluttes i ett enkelt rom, selv om dette ikke foretrekkes.

Fortrinnsvis holdes bestanddelene av assayet fast av et skall- eller matrisemateriale. Analyttanalogen og/eller analyttbindingsmidlet kan podes på dette materiale. Mer foretrukket er materialet biologisk nedbrytbart, slik som det beskrives i WO 00/02048. Valgfritt kan sensoren innbefatte små partikler (f.eks. en blanding av to eller flere typer partikler eller to eller flere masser av matriseholdigeassayvarianter) som holdes fast i et skall av biologisk nedbrytbart materiale, slik som det beskrives i WO 03/006992.

I en foretrukket utførelse holdes bestanddelene av assayet fast av et skall av biologisk nedbrytbart materiale som innkapsler assaybestanddelene mens det lar glukose komme i berøring med assaybestanddelene, og det biologisk nedbrytbare materiale innbefatter en kopolymer som har hydrofobe og hydrofile enheter, slik som det beskrives i WO2005/110207.

Fortrinnsvis er kopolymeren en tilfeldig kopolymer.

Fortrinnsvis har kopolymeren en permeabilitet på minst 5,0 x 10<-10>cm<2>/s.

Ordet "permeabilitet" brukes for å vise til den samlede permeabilitet av analytt (glukose) gjennom hydrert kopolymer som kan måles eksperimentelt.

Fortrinnsvis degraderes kopolymeren når den vel er blitt implantert i kroppen, i løpet av et tidsrom på én uke til ett år, for eksempel 30 dager. For en typisk polymertykkelse på 5 μm tilsvarer dette en degraderingsrate på 0,17 μm/dag.

Fortrinnsvis, for mobiliteten av glukose, har det biologisk nedbrytbare materiale en avskjæringsgrense for molekylvekten på ikke mer enn 25.000 Da. Mer foretrukket har det biologisk nedbrytbare materiale en avskjæringsgrense for molekylvekten på ikke mer enn 10.000 Da.

Fortrinnsvis er vektandelen av de hydrofobe enheter fra 10 til 90% av kopolymeren, mer foretrukket fra 10 til 50% av kopolymeren.

Fortrinnsvis er molekylvekten av hver hydrofile enhet fra 200 til 10.000 Da, mer foretrukket fra 400 til 4.000 Da.

Fortrinnsvis innbefatter hver av de hydrofile enheter av kopolymeren en ester av polyetylenglykol og en disyre. Som et alternativ til polyetylenglykol kan det brukes en blandet polymer av etylenglykol og propylenglykol, og/eller polyetergrunnstrukturen kan være substituert med hydrofobe og/eller hydrofile grupper. Som ytterligere alternativ til polyetylenglykol kan poly-tetrahydrofuran (poly-THF) brukes.

Fortrinnsvis innbefatter de hydrofile enheter tereftalsyre og/eller ravsyre som disyrer. Andre egnede disyrer er oksalsyre, vinsyre, ftalsyre, asparaginsyre, malonsyre og oligomere eller polymere disyrer, for eksempel poly(dimersyre-"sebacic acid"). I en foretrukket utførelse er disyren kun tereftalsyre. I en alternativ foretrukket utførelse er det molare forhold mellom tereftalsyre og ravsyre 1:2 til 2:1, med fordel 1:1.

Alternativt kan de hydrofile enheter av kopolymeren innbefatte oligomerer. Egnede oligomerer er oligomerer av hydroksyetylmetakrylat (HEMA), vinylpyrrolidon, vinylalkohol, karbohydrater, etylenoksid og/eller 2-akrylamido-2-metylpropansulfonsyre. Når de hydrofile enheter innbefatter HEMA, tilveiebringes det biologisk nedbrytbare koblinger (for eksempel esterkoblinger så som tereftalatkoblinger) i polymeren for å forbedre den biologiske nedbrytbarhet.

Fortrinnsvis er molekylvekten av hver hydrofobe enhet fra 400 til 5.000 Da.

Fortrinnsvis innbefatter de hydrofobe enheter av kopolymeren en ester av butan-1,4-diol og en disyre. Som et alternativ til butan-1,4-diol kan pentan-1,5-diol eller heksan-1,6-diol brukes.

Fortrinnsvis innbefatter de hydrofobe enheter tereftalsyre og/eller ravsyre som disyrer. I en foretrukket utførelse er det molare forhold mellom tereftalsyre og ravsyre 1:2 til 2:1, med fordel 1:1. Alternativt innbefatter de hydrofobe enheter kun tereftalsyre som disyre. Andre egnede disyrer ble angitt ovenfor.

Alternativt kan de hydrofobe enheter av kopolymeren innbefatte oligomerer av metylmetakrylat (MMA), polyuretan og/eller amider (for eksempel Nylon-6, oligo-N-tertiært butylakrylamid eller oligo-N-isopropylakrylamid). Når de hydrofobe enheter innbefatter MMA, tilveiebringes det biologisk nedbrytbare koblinger (for eksempel esterkoblinger så som tereftalatkoblinger) i polymeren for å forbedre den biologiske nedbrytbarhet.

Foretrukne polymerer har den generelle formel aPEG(T/S)bPB(T/S)c hvor "a" betyr molekylvekten av PEG-kjeden, "b" vektandelen av PEG(T/S) (polyetylenglykoltereftalat/suksinylat) i den dannede polymer og "c" vektandelen av PB(T/S) (polybutylentereftalat/suksinylat) i den dannede polymer. Eksempler på slike polymerer er 600PEGT80PBT20, 1000PEGT80PBT20, 2000PEGT80PBT20, 4.000PEGT80PBT20, 1000PEGT50PBT50 og 1000PEG(T/S)60PB(T/S)40(T/S 50%). Polymerene er biologisk nedbrytbare, har høy glukosepermeabilitet og har molekylvektavskjæringsegenskaper rundt 25.000 Da.

Enkelte av disse polymerer beskrives i US 6383 220 og EP 1247522.

Kopolymeromhyllingen har fortrinnsvis en tykkelse fra 1 til 50 μm.

Kjemiske metoder for fremstilling av polymermikrokapsler innbefatter faseseparasjon (koaservasjon), løsemiddelfordampning og/eller ekstraksjon.

Egnede fysikalske metoder for fremstilling av polymermikrokapsler innbefatter sprøytetørking, sprøytebelegning, sprøytekjøling, rotasjonsplateforstøvning, belegning i fluidisert sjikt, koekstrudering (for eksempel koekstrudering med stasjonær dyse, sentrifugalhodekoekstrudering eller koekstrudering med nedsenket dyse) og belegning i panne.

Sensoranvendelse

En fremgangsmåte for å påvise glukose ved bruk av en sensor slik som den beskrives heri, innbefattende implantasjon av sensoren inn i huden av et pattedyr og påvisning eller måling av glukose ved bruk av eksterne optiske anordninger er beskrevet.

En fremgangsmåte for å påvise glukose ved bruk av en sensor slik som den ble beskrevet ovenfor, innbefattende påvisning eller måling av glukose ved bruk av eksterne optiske anordninger ved belysning av en slik sensor som foreligger i eller under huden av et pattedyr er også beskrevet.

Fortrinnsvis innbefatter fremgangsmåten ytterligere spaltning av biologisk nedbrytbart materiale i sensoren.

Sensoren kan innføres i huden ved injeksjon, fortrinnsvis ved bruk av en sprøyte, eller ved bruk av andre metoder, spesielt ved bruk av en hvilken som helst metode som beskrives i WO 00/02048. Sensoren er fortrinnsvis av en størrelse som er egnet for injeksjon gjennom en nål med trangt gaugetall for å minimere ubehaget for pasienten. Fortrinnsvis har sensoren en maksimal størrelse fra 20 μm til 1 mm. Imidlertid kan det brukes en stavformet sensor som har en større maksimal dimensjon.

Sensoren kan innføres i tykkelsen av dermis eller subdermalt, eller kan innføres i epidermis, selv om den i sistnevnte tilfelle antakelig ville utstøtes fra huden ved utvekst av epidermalsjiktene, eventuelt før det biologisk nedbrytbare materiale er spaltet.

Ettersom sensoren er plassert i huden, påvises et optisk signal som genereres i sensoren, fortrinnsvis transkutant (dvs. gjennom det eller de ytre sjikt av huden), hvilket vil fjerne behovet for noen direkte forbindelse mellom sensoren og det eksterne miljø som kunne føre til infeksjon.

Imidlertid kan påvisning alternativt finne sted via en hul eller transparent anordning (for eksempel en nål eller optisk fiber) som tillater belysning av sensoren med eksterne optiske anordninger uten å føre lys gjennom huden.

Når sensoren er på plass på en kutan plassering, kan det utføres glukosemålinger så ofte som nødvendig uten ugunstige virkninger. Dette er en spesiell fordel i sammenheng med langtidspleien av diabetespasienter ettersom det hvis det utføres hyppigere glukosemålinger, kan holdes tettere styring av glukosenivået i blodet og faren for å utvikle tilstander forbundet med dårlig regulert blodglukose, så som retinopati, nefropati, nevropati, generell mikro- og makrovaskulær skade og dårlig sirkulasjon, vil reduseres.

Ettersom sensoren ifølge oppfinnelsen i og for seg ikke inneholder noen av de optiske bestanddeler som er nødvendige for å avspørre avlesningen av assayet (idet disse fortrinnsvis tilveiebringes atskilt og plassert utenfor kroppen), kan sensoren lett tilveiebringes i en form som er injiserbar med minimalt ubehag for pasienten.

Sensorer som innlemmer et assay som benytter seg av FRET-teknikken, kan avspørres ved å tilføre innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energidonorenheten, og måle intensiteten av den emitterte fluorescens eller livstiden av den eksiterte tilstand. Allment kjente metoder er:

1. Stabil tilstandsmåling

2. Tidsdomene-livstidsmåling

a. Enkeltfotontelling

b. Stripekamera

c. Portforsynt påvisning (pulsesampling)

d. Oppkonversjon

3. Frekvensdomene-livstidsmåling

a. Fasemodulasjonsfluorometri (heterodyn påvisning)

b. Fasefølsom påvisning (homodyn påvisning)

Nærmere beskrivelse av prinsippene finnes i Lakowicz, J. R. "Principles of Fluorescence Spectroscopy", 2. utgave, 1999.

Den foretrukne metode for å avspørre assayet er fasemodulasjonsfluorometri.

Et egnet optisk oppsett for å avspørre assayet (fig. 7) består av en lysemitterende diode (LED) 11, som emitterer lys innen emisjonsspektret av energidonorenheten. LED'en drives av en driverkrets 13, som modulerer LED'en ved en frekvens som gir en tilstrekkelig faseforskyvning, fortrinnsvis i området 45°. For et fluorofor med en livstid på 3 ns er den foretrukne frekvens 50 MHz. Lyset som emitteres av LED'en, filtreres av et eksitasjonsfilter 15 og rettes mot sensoren 16 av en dikroisk strålesplitter 17 og fokuseres på sensoren/huden over den injiserte sensor 16 av en linse 19. Fluorescensen som emitteres av sensoren, samles av linsen 19. Lyset passerer gjennom den dikroiske strålesplitter og filtreres gjennom et emisjonsfilter 21. Det filtrerte lys fokuseres av en linse 23 på detektoren 25, i dette tilfelle en lavinefotodiode (APD). ADP'en reversforspennes av en APD-forspenningstilførsel 27, som styres av en signalprosesserings- og styreenhet 29. Signalet fra ADP'en forsterkes av en transimpedansforsterker 31, filtreres av et båndpassfilter 33 og prøves ("is sampled") av en første analog-til-digital-konverterer (ADC) 35. På tilsvarende måte prøves det modulerte drivsignal til LED'en av en andre ADC 37. Signalet som prøves på den første ADC 35, er:

Y1(t)=A1*sin(2*S*f*t+Mfl+M1)

A1er amplituden av det påviste signal fra assayet, f er modulasjonsfrekvensen, Mfler faseforskyvningen som innføres av donorfluoroforet, og M1er en fast faseforskyvning som innføres av det elektroniske og optiske oppsett.

Signalet som prøves på den andre ADC 37, er:

Y2(t)=A2*sin(2*S*f*t+M2)

A2er amplituden av det modulerte drivsignal til LED'en og M2er en fast faseforskyvning som innføres av det elektroniske oppsett.

Signalprosesserings- og styringsenheten avleder faseforskyvningen Mflsom innføres av energidonorenheten, ved å sammenligne de to prøvde signaler og kompensere for de faste og kjente faseforskyvninger som innføres av elektronikken og optikken.

Det tas målinger ved å holde fluorometeret nær huden og linjestilt med sensoren. Faseforskyvningen omvandles til analyttkonsentrasjon ved bruk av en fase-til-analytt-kalibreringsfunksjon, så som

analyttkonsentrasjon = A+Bx/(k+x),

hvor A er fasen hvor det ikke forekommer analytt, B er fasen ved maksimal respons, x er den målte fase, og k er dissosiasjonskonstanten mellom reseptoren og analyttanalogen.

En alternativ målingsteknikk er måling av fluorescensintensiteten.

I dette tilfelle bør den optiske anordning tilføre en første stråle av innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energidonorenheten, og fortrinnsvis en andre stråle av innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energimottakerenheten (dette gjelder når energimottakerenheten også er et fluorofor). I tillegg bør den optiske anordning fortrinnsvis ha evnen til å måle optiske signaler som genereres i sensoren, ved to forskjellige bølgelengder; bølgelengde 1 innen emisjonsspektret av energidonorenheten (signalet som genereres i sammenheng med målingen av analytt) og bølgelengde 2 i emisjonsspektret av energimottakerenheten (som kunne være analyttsignalet eller det interne referanse- eller kalibreringssignal).

Fluorometeret måler de følgende parametere hver for seg:

Ved bølgelengde 1 (energidonorenhet)

Eksitasjonslysintensitet, I(1,0)

Omgivelseslysintensitet, I(1,1)

Kombinert intensitet av fluorescerende og omgivelseslys, I(1,2)

Ved bølgelengde 2 (energimottakerenhet)

Eksitasjonslysintensitet, I(2,0)

Omgivelseslysintensitet, I(2,1)

Kombinert intensitet av fluorescerende og omgivelseslys, I(2,2)

Det tas igjen målinger ved å holde fluorometeret nær huden og linjestilt med sensoren. Når det tas transkutane målinger av de fluorescerende signaler som genereres i sensoren, er det nødvendig å ta høyde for hudens absorpsjon av signal. Absorptiviteten av menneskehud har i eksperimenter vist seg å være lavest i området fra 400 nm til 900 nm. Det endelige resultat som tilveiebringes, er det normaliserte forhold mellom den fluorescerende intensitet fra de to fluoroforer, definert ved det følgende forhold (ligning 1):

Endelig resultat = (I(1,2)-I(1,1))*I(2,0)/(I(2,2)-I(2,1))*I(1,0) (1)

Det endelige resultat fra den optiske anordning (f.eks. fluorometeret) som gis av ligning 1 ovenfor, omvandles til analyttkonsentrasjon fortrinnsvis ved hjelp av en datamaskin ved bruk av kalibreringsdata som kan innhentes basert på prinsippene som beskrives i WO 00/02048.

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere under henvisning til eksempler, og til figurene hvor:

Fig. 1 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og HSA-mannose-ELLA-assaysystem (eksempel 1);

Fig. 2 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og perjodatbehandlet dekstran-ELLA-assaysystem (eksempel 2).

Fig. 3 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og syntetisk polymer-ELLA-assaysystem (eksempel 3).

Fig. 4 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og syntetisk mannose-kopolymer-ELLA-assaysystem (eksempel 3).

Fig. 5 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og syntetisk polymer-FRET-assaysystem (eksempel 9).

Fig. 6 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og 70 kDa dekstran-FRET-assaysystem (eksempel 10);

Fig. 7 viser et egnet optisk oppsett for å avspørre assayet.

Eksempler

Generelt

De følgende materialer ble brukt:

p-Aminofenyl-D-d-mannopyranosylisotiocyanat, bovint serumalbumin-D-d-mannopyranosylisotiocyanat (23 molare ekvivalenter mannose per BSA), humant serumalbumin, natriumperjodat (NaIO4), biotin-N-hydroksysuksinimid, o-fenylendihydroklorid, benzylamin, ammoniakk, natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN) (Sigma-Aldrich); Nunc F96 MaxiSorp-plate (Nunc, Danmark); PD-10-kolonner, Streptavidin-HRP (Amersham Bioscience); dekstran (Pharmacosmos, Danmark); mannanbindende lektin (tilgjengelig fra flere kilder); dialyserør Spectra/Por (Spectrum Laboratories, Inc., California, USA). Allyl-D-D-Glukopyranosid, allyl-2-acetamido-2-deoksy-D-D-Glukopyranosid (Glycon Biochemicals, Tyskland). Allyl-D-D-Galaktopyranosid (Sigma-Aldrich).

PBS er 20 mM Fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,4, og TBS er 20 mM TRIS, 150 mM NaCl, 1,25 mM CaCl2, pH 7,4 hvis intet annet er nevnt.

Forkortelser: MBL: mannanbindende lektin; PBS: fosfatbufret salin; TBS: TRIS-bufret salin; ELLA: "Enzyme Linked Lectine Assay".

Fremstilling av biotinylert MBL

Biotin-NHS (20 PL, 7 mgmL<-1>i DMSO, ca. 10-15 molare ekvivalenter per MBL-monomer) ble tilsatt til en oppløsning av MBL (0,530 mg) i PBS (3 mL). Oppløsningen ble forsiktig omrørt i 2 timer, og deretter overført til et dialyserør (MWCO 10-12k) og dialysert mot TBS (2 × 1 L) i løpet av 24 timer. Det dannede biotinylerte MBL (0,2 mgmL<-1>i TBS) ble brukt uten ytterligere rensing.

MBL-ELLA-assay

TBS-bufferen som ble brukt heri, var TRIS (20 mM), NaCl (150 mM), CaCl2(20 mM), pH 7,4.

En 96-brønners mikrotiterplate ble bestrøket over natten ved 5°C med to kolonner av hvert antigen (f.eks. HSA-mannose, aminodekstran osv.) (100 PL, 20 PgmL<-1>) i TBS. Gjenværende bindingsseter ble deretter blokkert ved tilsetning av 1% (vekt/vol) HSA i TBS (150 PL). Fortynninger av glukose (fra 100 mM til 0 mM) i biotinylert MBL (2 PgmL<-1>) ble tilsatt til det samlede volum 100 PL. Etter inkubasjon i 2 timer ble platen tømt og vasket (2 × 200 PL TBS). Brønnene ble deretter vasket (2 × 200 PL TBS). Streptavidin-HRP 0,1% (vol/vol) (100 PL) i TBS ble tilsatt. Etter 1 times inkubasjon ble platene tømt og vasket (3 × 200 PLTBS). Nærværet av HRP ble visualisert ved tilsetning av substratoppløsning (1 mg o-fenylendihydroklorid) og stanset etter 2 min med 1 N H2SO4. Fargeutviklingen ble bestemt ved å avlese absorbansen ved 490 nm, med subtraksjon av bakgrunn ved 630 nm.

Eksempel 1: Mannosylert HSA

Fire konjugater ble fremstilt på den følgende måte.

Til hvert av fire 2 mL Eppendorf-kolber tilsatte man HSA (10 mg) oppløst i en 20 mM karbonatbuffer (0,4 mL, pH 9,2).

p-Aminofenyl-D-d-mannopyranosylisotiocyanat (Man-ITC, 1,6 mL) ble tilsatt i 15×, 30×, 60× og 120× molart overskudd ved å fremstille fire oppløsninger.

Man-ITC (11,9 mg) ble løst opp i DMSO (0,1 mL) og 20 mM karbonatbuffer pH 9,2 (3,9 mL). En alikvot (1,6 mL) av denne oppløsning (som tilsvarer 120× molart overskudd) ble tilsatt til en Eppendorf-kolbe inneholdende HSA (0,4 mL). Resten av Man-ITC-oppløsningen ble fortynnet til dobbelt volum, og fra det fortynnede volum tilsatte man en alikvot (1,6 mL) til en annen Eppendorf -kolbe. Denne prosedyre ble gjentatt inntil de fire forskjellige HSA:Man-ITC-blandinger var blitt fremstilt. De fire reaksjonsblandinger ble inkubert i en rysteanordning over natten ved romtemperatur.

De dannede glykokonjugater ble renset på en PD-10-kolonne. Under rensingen ble bufferen byttet mot TBS.

Graden av konjugasjon ble bestemt ved bruk av MALDI-TOF-MS.

m/z (MALDI-TOF) Antall mannose per HSA HSA-Mannose 1:15 67500-70000 3 - 11

HSA-Mannose 1:30 67700-70600 4-13

HSA-Mannose 1:60 68100-72300 5-18

HSA-Mannose 1:120 68600-73400 7 - 22

Tabell 1: Bestemmelse av konjugasjonsgraden ved bruk av MALDI-TOF-MS. Toppbreddebedømmelse ble målt ved rundt halv høyde. Antallet mannoseenheter ble bestemt ved bruk av den følgende ligning: (Topp i MS-66500)/313.

Når de ble brukt i konkurransebindingsassayet, viste seg de forskjellige glykokonjugater å ha forskjellig aviditet for MBL, og derfor ble derfor bundet konkurrerende i nærvær av forskjellige konsentrasjonsområder av glukose. MBL-ELLA-assayet som ble beskrevet ovenfor, ble brukt til å bestemme mannosylasjonsgradens virkning på det dynamiske område for glukoseinhibering, og resultatene vises på fig. 1.

Glukosekonsentrasjonsområdet over hvilket doseringsresponskurven er rettkjedet for et bestemt glykokonjugat på fig. 1, tilsvarer glukosekonsentrasjonsområdet over hvilket konkurransebindingsassayvarianten som inneholder dette glykokonjugat, kan påvise glukose nøyaktig. Slik som det fremgår fra fig. 1, kan bruk av de tre glykokonjugater HSA-Man 15, HSA-Man 30 og HSA-Man 60 i tre konkurranseassayvarianter innen sensoren ifølge foreliggende oppfinnelse tillate en nøyaktig måling av glukosekonsentrasjon over området 0-50 mM glukose.

Eksempel 2: Perjodatoksidert dekstran for bruk i ELLA assay

Fremstilling av perjodatoksidert dekstran

Dekstran 70k (200 mg, 2,86 mmol) ble løst opp i vann (2,8 mL) og tilsatt til NaIO4(100 mM, 100× molart overskudd) i vann (2,8 mL). Blandingen ble omrørt i mørke i 1 time ved romtemperatur. De dannede blanding ble overført til et dialyserør (MWCO 10-12k) og dialysert over natten mot 5 L vann.

Etter dialyse ble volumet justert til 8 mL. Det perjodatoksiderte dekstran ble delt opp i to alikvoter (4 mL, 100 mg hver) og behandlet i 30 min med henholdsvis 28% vandig ammoniakk (200 PL) og benzylamin (300 PL). Imin- og iminiumderivatene ble deretter redusert med NaBH3CN (45 mg) over natten ved romtemperatur og pH rundt 10.

Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 2 × 1 L 20 mM TRIS den følgende dag.

Graden av amininnlemmelse i det perjodatoksiderte dekstran ble bestemt ved bruk av elementanalyse.

MBL-ELLA-assay

Assayet som ble beskrevet ovenfor, ble brukt, unntatt med en TRIS-buffer inneholdende 1,25 mM CaCl2(fysiologisk Ca-konsentrasjon).

Resultatene av ELLA-assayet som sammenlignet aminodekstran, dekstran oksidert i nærvær av 10× molart overskudd av perjodat og reduktivt aminert ved bruk av benzylamin, og dekstran oksidert i nærvær av 100× molart overskudd av perjodat og reduktivt aminert ved bruk av benzylamin, vises på fig. 2.

Fra fig. 2 fremgår det at området over hvilket glukosekonsentrasjonen kan måles nøyaktig, kan være 0-35 mM glukose ved bruk av tre konkurransebindingsassayer i kombinasjon, som hver inneholder én av de tre aminodekstraner. Bindingen av aminodekstranene til MBL viser seg å være i det vesentlige Ca<2+>-uavhengig, og dermed kan disse assayer brukes ved fysiologiske Ca<2+>-konsentrasjoner.

Eksempel 3: Syntetisk polymer for bruk i ELLA-assay

Allyl-D-D-mannopyranosid

I det vesentlige slik som det beskrives i Pekari et al. (2004) J. Org. Chem, 66(22), 7432-7442. D-Mannose (12,1 g, 67 mmol) ble tilbakeløpsbehandlet over natten i tørr allylalkohol (140 ml) i nærvær av BF3-OEt2(0,58 ml). Reaksjonsblandingen ble nøytralisert med Et3N (1,8 ml) den følgende dag, og løsningsmidlet ble inndampet. Tørrkolonnevakuumkromatografi (id 6 cm; 100 ml fraksjoner; 0-45% MeOH i DCM (vol/vol)-11 fraksjoner, 5% trinn 100%) gav produktet 9,38 g (63%) som en fargeløs sirup. TLC (DCM-MeOH, 9:1) Rf0,3;<1>H-NMR (300MHz, 128 skanninger, 4 mg i 700 Pl D2O) G 3,27 (s, 2H, allyl), 3,52-4,21 (m, 6H), 4,84 (bs, 1H, DH), 5,16-5,34 (m, 2H, allyl), 5,82-5,98 (m, 1H, allyl).

Kopolymerisering

Det følgende eksempel illustrerer hvordan mannose 50%-kopolymeren fremstilles. Se tabellene 2 og 3 for alle øvrige kopolymerfremstillinger. Stamoppløsninger (100 mg/ml) av allylsakkarider (AS) og N-(3-aminopropyl)metakrylamidhydroklorid (NAMH) ble fremstilt i PBS (50 mM, pH 7,4).

Kaliumperoksodisulfat (PPS) (150 mg) ble løst opp i PBS-buffer (50 mM, pH 7,4; 7,8 ml) i et skrueforseglet plastrør. Til denne oppløsning tilsatte man i den følgende rekkefølge allyl-D-D-mannopyranosid (allylsakkarid; AS)(2,20 ml; 220 mg), 2-hydroksyetylakrylat (HEA)(110 Pl), N-(3-aminopropyl)metakrylamidhydroklorid (NAMH)(89 Pl) og N,N,N’,N’-tetrametyletylendiamin (TMEDA)(100 Pl). Blandingen ble spylt med nitrogen i 5 min for å fjerne oppløst oksygen. Polymerisering ble utført over natten ved RT i en orbitalrysteanordning. Reaksjonsblandingen ble filtrert og felt i metanol (100 ml). Polymeren ble samlet ved sentrifugering (4.000 rpm, 3 min) og deretter vasket med metanol (3u10 ml). Den endelig dannede polymerpellet ble tørket over natten i en tørkeanordning.

Tabell 2

Tabell 3: De fire forskjellige monosakkarider som ble brukt for kopolymerisasjon

MBL-ELLA-assay

Assayet som ble beskrevet ovenfor, ble brukt, unntatt med en TRIS-buffer inneholdende

5 1,25 mM CaCl2(fysiologisk Ca-konsentrasjon).

Resultatene vises på fig. 3, som sammenligner 20 kopolymerer fremstilt av mannose, N-acetylglukosamin, glukose og galaktose. Høye absorpsjoner tilsvarer binding av MBL til liganden. Grunnabsorpsjonen tilsvarer ingen binding av MBL til liganden. AmDex er 150 kDa aminodekstran (eksempel 5).

10 Dette demonstrerer at den monomere sakkaridenhet som ble brukt i den syntetiske polymer, trenger å ha høyere affinitet for MBL enn glukose (IC50~18 mM), og er fortrinnsvis mannose (IC50~8 mM) eller N-acetylglukosamin (IC50~6 mM). Sakkaridmonomerenheter med lavere affinitet, så som galaktose (IC50~36 mM), gir ingen MBL-binding ved fysiologisk kalsiumkonsentrasjon (1,25 mM).

15 En serie av mannosekopolymerer ble fremstilt (tabell 4) og testet ved bruk av MBL-ELLA-assayet. Man fant at 35% mannosekopolymer var optimalt. Bindingen var like sterk til MBL ved 0 mM glukose, men ble lettere inhibert enn aminodekstran. Fra inhiberingskurvene (fig. 4) er det mulig å beregne en IC50-verdi for aminodekstran og den optimerte kopolymer (tabell 5). IC50-verdien er kun gyldig for dette bestemte assay.

Tabell 4

IC50Glukose (mM)

Aminodekstran 23

35% Man-kopolymer 13

Tabell 5

Eksempel 4: Flekking av MBL

Humant MBL ble bufferskiftet (ved dialyse) til en 10 mM NaHCO3-buffer inneholdende 150 mM NaCl og 1,25 mM Ca<2+>, pH 8,7. Fargen som ble brukt for flekking, var Alexa Fluor 594 suksimidylester (AF594-SE) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Fargen ble løst opp i tørt DMSO og tilsatt langsomt (10 min) til MBL'en i bikarbonatbuffer. Reaksjon fikk finne sted i 1 time. Flekkingen ble utført med 15 ganger molart overskudd (med hensyn til polypeptidenheten) av farge. Rensing ble utført ved dialyse mot 10 mM TRIS-buffer pH 7,4, 150 mM NaCl og 1,25 mM Ca<2+>. Den dannede merkingsgrad av det flekkede protein ble bestemt ved UV-spektroskopi å være 2,3 farger per delenhet MBL.

Eksempel 5: Fremstilling av aminodekstran

150 kDa dekstran (6,00 g, 0,4 Pmol) ble løst opp i 250 mM K2HPO4pH 11,5 (600 mL). Natriumborhydrid (3 g, 0,08 mol) ble tilsatt, fulgt av tilsetningen av divinylsulfon (15 ml, 0,15 mol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 min ved romtemperatur, før nøytralisering til pH 7,2 med konsentrert HCl. Etter 30 minutters omrøring, ble den dannede blanding dialysert (MWCO 10-12 kDa) i vann (3 u 25 L). Innholdet ble overført til en Erlenmeyer-kolbe, og 24% ammoniakk (200 mL) ble tilsatt. Etter 2 timer, ble pH justert til 10,5, og reaksjonsblandingen ble omrørt over natten. Overflødig ammoniakk ble fjernet ved dialyse (MWCO 10-12k) i vann (8u25 L), og hele innholdet ble lyofilisert for å gi aminodekstran 5,75 g (78%, basert på en aminodekstranmolekylvekt på 185 kDa) som en hvit fnuggete substans. Elementanalyse ble brukt til å gi et grovt overslag av molekylvekten, amininnlemmelsen og mengden innlemmet divinylsulfon. (funnet C 39,86; H 6,26; N 0,16; S 3,08% dekstran 150k, ~22 DVS-NH2, ~160 DVS-OH, og ~720 H2O krever C 39,55; H 6,60; N 0,16; S 3,07%).

Eksempel 6: Fremstilling av hexa-metoksy-"crystal Violet"-suksimidylester (HMCV-1)

Syntese av HMCV-1:

Skjema 1. I) 4-(N-metylamino)smørsyrehydroklorid (1 ekv.), diisopropyletylamin, i acetonitril, 20qC, 20 timer. II) Dimetylamin (overskudd). III) TSTU, diisopropyletylamin, i acetonitril, 20qC, 2 timer.

4a (BF4-): 4-(metylamino)smørsyrehydroklorid (1,36 g; 8,8 mmol), 1 (5,0 g; 8,3 mmol) og diisopropyletylamin (5 mL) ble løst opp i acetonitril (120 mL). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 30-35qC i en tørr nitrogenatmosfære i 22 timer. Vandig dimetylamin (40 mL 40% oppløsning) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i fire dager til. Løsningsmidlet og overflødig dimetylamin ble fjernet under vakuum, og resten av materialet ble løst opp i kloroform. Kloroformoppløsningen ble vasket to ganger med saltvann og tørket over MgSO4før inndamping av løsningsmidlet og felling av produktet fra CH2Cl2/eter. Utbytte: 4,4 g (70%) mørkeblått pulver.

MS (FAB+): m/z 624 (M+)

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): G 8,34 (1H, bs), 6,03 (2H, s), 5,83 (4H, s), 3,49 (2H, m), 3,46 (6H, s), 3,44 (12H, s), 3,12 (3H, s (maskert)), 3,08 (12H, s), 1,94 (2H, t), 1,70 (2H, m).

HMCV-1 (Cl-): TSTU (2-suksinimido-1,1,3,3-tetrametyluroniumtetrafluorborat, 0,8 g, 2,6 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av 4a (0,9 g, 1,26 mmol) og diisopropyletylamin (0,55 g, 4,5 mmol) i acetonitril (15 mL). Reaksjonsblandingen ble omrørt i en lukket kolbe i 2 timer, før den ble helt i en iskald nesten mettet NaCl-oppløsning (ca. 150 mL) surgjort med vandig HCl (4 mL, 2 M). Den vandige fase ble ekstrahert med kloroform (2 x 150 mL). De samlede kloroformfaser ble vasket med saltvann (2 x 50 mL) og tørket over MgSO4. Inndamping av løsningsmidlet og gjenfelling fra CH2Cl2/eter gav et mørkeblått pulver (0,80 g, 84%).

MS (FAB+): m/z 721 (M+)

<1>H-NMR<1>H-NMR br.(400 MHz, DMSO-d6): G 5,88 (2H,s), 5,85 (4H,s), 3,60 (2H, s), 3,46 (12H, s), 3,45 (6H, s), 3,15 (12H, s), 3,12 (3H, s), 2,85 (4H, s), 2,80 (2H, t), 1,95 (2H, m).

Eksempel 7: Flekking av aminodekstran

70 kDa aminodekstran (0,5 mmol NH2/g dekstran, dvs. 35 mol amin per mol dekstran) fremstilt ved en metode som var analog med metoden i eksempel 2, ble flekket i 10 mM NaHCO3pH 8,5, 150 mM NaCl med HMCV-1 (eksempel 5). Fargestoffet ble løst opp i tørt DMSO og tilsatt langsomt (10 min) til dekstranet i bikarbonatbuffer. Reaksjon fikk finne sted i 1 time. Flekkingen ble utført med 8 ganger molart overskudd av fargestoff. Rensing ble utført ved dialyse mot 10 mM TRIS-buffer pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,25 mM Ca<2+>, 2 mM NaN3. Den erholdte merkingsgrad av det flekkede protein ble bestemt ved UV-spektroskopi å være 7,0 fargestoffer per dekstran.

Eksempel 8: Glukosemåling for HMCV-1dekstran

AF594-flekket humant MBL (eksempel 1) og HMCV1-dekstran (fremstilt slik som det ble beskrevet i eksempel 7) ble blandet i TBS-buffer (samme som ovenfor) til konsentrasjoner med 10 μM av begge bestanddeler. Assaykjemiblandingen ble sugd inn i en hul fiber (regenerert cellulose, diameter 0,2 mm). Fluorescenslivstidmålinger (frekvensdomene) ble utført i et KOALA automatisert prøvetakingsrom (ISS, Champaign IL), og glukosekonsentrasjonen ble forandret ved å skifte buffer (TBS) rundt den hule fiber som inneholdt assaykjemien.

Tabell 6 Absolutte faseforskyvninger for AF594-MBL og HMCV1-Dex70. PMT-tellingene gjenspeiler intensitetsøkningen i systemet.

Eksempel 9: Glukosemåling for syntetisk polymer

Kopolymersyntese

Mannosekopolymerer (~40%) ble fremstilt ved emulsjonspolymerisasjon som følger.

Til en 250 ml tre-halset rundbunnet kolbe utstyrt med et mekanisk røreverk og et nitrogenrør tilsatte man Span80-surfaktant (5,7 g; HLB [hydrofil-lipofil-balanse] 4,3, 10% vekt/vekt basert på toluen), AIBN (30 mg) og toluen (57,3 g). Kolben ble forseglet, spylt med nitrogen og holdt under en nitrogenatmosfære under hele polymerisasjonen. Allyl-D-D-mannopyranosid (3,52 g), 2-hydroksyetylakrylat (2,552 g) og N-(3-aminopropyl)metakrylamidhydroklorid (0,178 g) ble løst opp i vann (12,7 g) og filtrert for å fjerne uløselig materiale. Denne blanding ble tilsatt til den kraftig omrørte blanding i den rundbunnede kolbe gjennom en gummiseptum.

Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil det dannedes en stabil emulsjon (30 min), deretter ved 60°C i 4 timer En oppløsning av VA-044 (1 ml, 60 mg/ml) ble injisert gjennom septum, og polymerisasjon fortsatte over natten (17 timer). Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, og emulsjonen ble sprengt ved tilsetning av aceton. Dette forårsaket felling av polymeren, som ble samlet, gjenoppløst i vann og felt ved tilsetning av aceton. Produktet ble tørket over natten under vakuum for å gi 3,2 g (50%) rå lysegul polymer. En del av råpolymeren (1,0 g) ble løst opp i vann (10 ml) og dialysert (MWCO [molekylvekt-avskjæringspunkt] 25.000) i vann for å fjerne materiale med lav molekylvekt. Frysetørking gav 0,46 g (46%) fnuggete hvit polymer.

45% mannosekopolymer ble fremstilt analogt.

Flekking av kopolymer

Generelt følger merkingen av kopolymeren beskrivelsen som gis av Molecular Probes (produktinformasjon MP00143, Rev. juni 2001).

Kopolymeren (88,6 mg) ble løst opp i 10 mM NaHCO3-oppløsning (3 ml; pH 8,5). Polymeroppløsningen ble delt likt i tre Eppendorf-kolber. HMCV-1 (eksempel 3) (19,6 mg; 26,1 Pmol) ble løst opp i tørt DMSO (600 Pl). Fargestoffet ble tilsatt til polymeroppløsningene i 10 Pl alikvoter hvert 30. sekund, på en slik måte at den første kolbe fikk til sammen 100 Pl, den andre kolbe fikk 200 Pl og den tredje kolbe fikk 300 Pl. Etter tilsetningen av den siste alikvot, ble kolbene forsiktig omrørt i én time før oppløsningene ble dialysert (MWCO 10-12.000) i 10 mM TRIS-buffer med flere bufferskifter og inntil ingen farge var synlig i dialysebufferen (vanligvis 6-8 bufferskifter på 500 ml og 72 timer).

FRET-assay

AF594-flekket humant MBL (eksempel 4) og HMCV1-kopolymer ble blandet i TBS-buffer (samme som ovenfor) til konsentrasjoner med 10 μM av begge bestanddeler (ved bruk av konsentrasjon av MBL-AF594 karbohydratgjenkjenningsdomener, CRD, hver med en molekylvekt rundt 25kDa). Assaykjemiblandingen ble sugd inn i en hul fiber (regenerert cellulose, diameter 0,2 mm).

Fluorescenslivstidmålinger (frekvensdomene) ble utført i et KOALA automatisert prøvetakingsrom (ISS, Champaign IL). Alle oppløsninger ble forhåndsoppvarmet til 34qC i et vannbad, og alle målinger i KOALA-instrumentet ble registrert ved 34qC. Fluorescenscellen som inneholdt fiberen og fiberholdesammenstillingen ble plassert i prøveholderen av KOALA, og fluorescenscellen ble fylt med buffer inneholdende glukose.

Den målte fase var et gjennomsnitt av minst førti fasevinkelregistreringer. Etter fullføring av en måling, ble fluorescenscellen tømt ved bruk av en pipette og fylt opp igjen med buffer inneholdende den neste konsentrasjon av glukose. En sinking på 20 minutter mellom målinger ble innført for å la assaykjemien nå likevekt.

For å generere en glukose-doseresponskurve ble fasen målt ved 0, 5, 10, 30, 100 og 500 mM glukose. Etter bestemmelse av fasevinkelen ved 500 mM glukose, ble fiberen vasket flere ganger med 10 mM TRIS-buffer over et tidsrom på 60 minutter. På dette tidspunkt oppnådde man den samme fasevinkel som for 0 mM glukose. Dette demonstrerer reversibiliteten av assayet.

Resultatene vises i tabell 7 og på fig. 5.

Tabell 7 Absolutte faseforskyvninger for AF594-MBL og HMCV1-kopolymer.

<mM Glc 'M ved 61 MHz 'M ved 61 MHz>mannose 40% kopolymer mannose 45% kopolymer

0 0,0 0,0

5 1,8 0,4

10 4,3 1,1

30 9,5 3,8

100 13,9 8,9

500 15,2 14,2

Det fremgår at stigningen for mannose 40%-kopolymeren er sterkere (mer respons) i området 0-5 mM, 5-10 mM, 10-30 mM Glc, enn for mannose 45%-kopolymeren.

Imidlertid er stigningen av mannose 45%-kopolymeren sterkere i området 30-100 mM og 100-500 mM Glc. Dette gjør en mannose 40%-kopolymer mer følsom i området 0-30 mM Glc, og mannose 45%-kopolymer mer følsom i området 30-500 mM Glc.

Eksempel 10: Sensorformulering og implantasjon

Fibre fremstilles ved å dyppe en glasstav med diameter 700 Pm i en 15% vekt/vekt oppløsning av polymer (1000PEGT80PBT20, søknad nr. P9738GB) i diklormetan og la den tørke ved romtemperatur. Dette gir en hul fiber med ytre dimensjon 900 Pm og lumendiameter 700 Pm. Fiberen fylles med den ønskede konsentrasjon av assay bestanddeler [f.eks. 5 PM Alexa Fluor 594<TM>-flekket MBL (konsentrasjon angitt med hensyn til karbohydratgjenkjenningsdomenene) og 20 PM HMCV1-flekket aminodekstran 150 kDa]. Oppvarming av polymeren for å smelte den, lukker enden av fiberen. Den sammensveisede fibre testes for lekkasje før testing og innføring.

Denne type fiber kan plasseres i toppsjiktet av huden ved bruk av en nål. En nål av egnet størrelse (tilstrekkelig stor til å omslutte den våte fiber) plasseres parallelt med hudens flate i en dybde på ca. 1 mm idet nålen holdes som en synlig skygge gjennom huden. Fiberen (fortsatt våt) plasseres i nålen, og nålen fjernes. Typisk observeres ingen blødning på innsetningsstedet etter fullført innsetningsprosedyre.

Når fiberen er på plass, plasseres avlesningsanordningen direkte ovenfor fiberen, og målingene kan begynne. Glukoseresponsen kan måles ved bruk av tidsoppløst fluorescensspektroskopi, som tilsvarer responsen vist på fig. 6.