NO340089B1

NO340089B1 - Fremgangsmåte for å diagnostisere et orofaryngealt plateepitelkarsinom (OSCC) hos et individ ved påvisning av en biomarkør valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSPl, H3F3A, OAZ1, S100P og SAT i cellefritt spytt

Info

Publication number: NO340089B1
Application number: NO20064226A
Authority: NO
Inventors: David T W Wong; Maie A R Stjohns; Yang Li
Original assignee: Univ California
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2006-09-19
Publication date: 2017-03-06
Also published as: EP1730304B1; NO20064226L; JP4880484B2; JP5367760B2; KR20130018438A; US20140249236A1; CN1977051B; JP2011229532A; HK1095163A1; US20080280772A1; US10072297B2; KR20070004725A; EP1730304A4; AU2005216095B2; CA2558666A1; WO2005081867A2; IL177579A0; US20190040471A1; CN1977051A; CA2558666C

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører å lage profiler av biomarkører og fremgangsmåte som anvender nevnte biomarkører. Spesielt er foreliggende oppfinnelse vedrører biomarkører for påvisning av munnhule- og orofaryngealt plateepitelkarsinom (OSCC).

Bakgrunn for oppfinnelsen

Biomarkører er molekylære indikatorer på en spesifikk, biologisk egenskap, en biokjemisk funksjon eller en fasett som kan benyttes til å måle progresjonen av sykdom eller effekten av behandling.

Proteiner og nukleinsyrer er eksempler på biomarkører. Spesielt har det blitt bredt akseptert at genomiske budbringere som er påvist ekstracellulært kan virke som bio-markører for sykdommer [6]. Spesielt har nukleinsyrer blitt identifisert i de fleste kropps-væsker, inkludert blod, urin og cerebrospinalvæske, og har med suksess blitt adoptert for å bli anvendt som diagnostiske biomarkører for sykdommer [28, 42, 49].

Spytt er ikke et passivt "ultrafiltrat" av serum [41], men inneholder en særegen sammensetning av enzymer, hormoner, antistoffer og andre molekyler. I de siste ti år har anvendelsen av spytt som en diagnostisk væske vellykket blitt benyttet i diagnostikk og for å forutse populasjoner med risiko for en rekke tilstander [47].

Spesifikke og informative biomarkører i spytt er ønskelige for å tjene til diagnostisering av sykdom og monitorering av human helse [30, 47, 6]. Foreksempel har biomarkører blitt identifisert i spytt for monitorering av karies, periodontitt, oral kreft, spyttkjertelsykdommer og systemiske forstyrrelser, f.eks. hepatitt og HIV [35]. Tidligere studier viser også at humane DNA-biomarkører kan bli identifisert i spytt og benyttet til deteksjon av oral kreft [30, 36]. RNA er mer labilt enn DNA og er antatt å være svært utsatt for degradering ved RNaser. Dessuten er RNase-aktivitet rapportert å være forhøyet i spytt, som utgjør et billig, ikke-invasivt og tilgjengelig kroppsvæske som er egnet for å fungere som et ideelt diagnostisk medium. Spesielt er RNase-aktivitet rapportert å være forhøyet i spytt hos kreftpasienter [83]. Det har slik blitt allment antatt at humant mRNA ikke kan overleve ekstracellulært i spytt. OSCC er den sjette vanligste kreftformen i verden og rammer årlig 50000 amerikanere. På verdensbasis utgjør kreft i munnhulen og orofarynks et stort allment helseproblem. OSCC står for omtrent 50 % av alle nylig diagnostiserte kreftformer i India og er den største årsaken til dødsfall i Frankrike [1].

På tross av forbedringer i lokoregional kontroll har sykelighets- og dødelighetsrater blitt lite forbedret i de siste 30 år [2]. Derfor er tidlig påvisning eller forebygging av denne sykdommen sannsynligvis det mest effektive. Påvisning av OSCC på et tidlig stadium er antatt å være den mest effektive måten å redusere dødsfall og vansiring fra denne sykdommen. Fraværet av entydige tidlige varselstegn for de fleste hode- og nakke-kreftformer antyder at sensitive og spesifikke biomarkører sannsynligvis vil være viktige ved screening av høyrisikopasienter.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å diagnostisere et orofaryngealt plateepitelkarsinom (OSCC) hos et individ, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter å: påvise i en prøve av en kroppsvæske en ekstracellulær m-RNA profil av en biomarkør, hvor kroppsvæsken er cellefritt spytt, og hvor biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P og SAT; sammenligne profilen av bio-markøren i prøven med en forhåndsbestemt profil av biomarkøren, gjenkjenne i profilen av biomarkøren av karakteristika for den forhåndsbestemte profilen av biomarkøren som er diagnostisk for

OSCC.

En fremgangsmåte for å påvise en biomarkør i en kroppsvæske, inkludert en cellefase og en væskefase, hvor biomarkøren er et ekstracellulært mRNA og kroppsvæsken er spytt, fortrinnsvis ikke-stimulert spytt, er også beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en celle-fri væskefasedel av kroppsvæsken; og påvise det ekstracellulære mRNA i den cellefrie væskefasedelen av kroppsvæsken. Spesielt kan påvisningen av det ekstracellulære mRNA omfatte å: isolere det ekstracellulære mRNA fra den cellefrie væskefasedelen av kroppsvæsken, og amplifisere det ekstracellulære mRNA.

Transkriptomanalyse av en kroppsvæske, inkludert en cellefase og en væskefase, der kroppsvæsken er spytt, er beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en cellefri væskefasedel av kroppsvæsken og påvise et transkriptommønster i den cellefrie væskefasedelen av kroppsvæsken. Kroppsvæsken er fortrinnsvis ikke-stimulert spytt.

Spesielt blir påvisningen av transkriptommønster i spyttsupernatanten fortrinnsvis utført ved hjelp av mikroarray-analyse, mest foretrukket ved hjelp av høytetthetsoligo-nukleotidmikroarrayanalyse. Påvisning av transkriptommønster i spyttsupernatanten kan også bli utført ved hjelp av kvantitativ PCR-analyse eller RT-PCR-analyse.

En fremgangsmåte for å påvise genetiske endringer i et organ ved analysering av en kroppsvæskeuttømming fra organet og inkludering av en cellefase og en væskefase er beskrevet. Kroppsvæsken er spesielt spytt, fortrinnsvis ikke-stimulert spytt og fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe cellefri væskefasedel av kroppsvæsken, påvise et transkriptommønster i den cellefrie væskefasedelen av kroppsvæsken og sammenligne transkriptommønsteret med et forhåndsbestemt mønster, der det forhåndsbestemte mønsteret er indikativt på et vanlig transkriptommønster for en normal cellefri væskefasedel av kroppsvæsken.

En fremgangsmåte for å påvise genetiske endringer i et gen i et organ ved analysering av en kroppsvæske som tømmes fra organet og inkludering av en cellefase og en væskefase er beskrevet. Kroppsvæsken er spesielt spytt og fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en cellefri væskefasedel av kroppsvæsken, påvise en mRNA-profil for genet i den cellefrie væskefasedelen av kroppsvæsken og sammenligne av mRNA-profilen for genet med en forhåndsbestemt mRNA-profil for genet, der den forhåndsbestemte mRNA-profilen for genet er indikativt på mRNA-profilen for genet i en normal cellefri væskefasedel av kroppsvæsken.

En fremgangsmåte for å diagnostisere en oral eller systemisk patologisykdom eller forstyrrelse hos et individ er beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en cellefri væskefasedel av spyttet fra individet, påvise en mRNA-profil for et gen som er assosiert med patologien, sykdommen eller forstyrrelsen i den tilveiebrakte, cellefrie spyttvæskefasedelen og sammenligne RNA-profilen for genet med en forhåndsbestemt mRNA-profil for genet, der den forhåndsbestemte mRNA-profilen for genet er indikativ på tilstedeværelsen av patologien, sykdommen eller forstyrrelsen hos individet.

I ett tilfelle er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen en kreftform i munnhulen og/eller i orofarynks, kroppsvæsken er spytt og genet er valgt fra gruppen som består av genet som koder for IL8 (interleukin-8), IL1B (interleukin-1, beta), DUSP1 (dual spesifisitetsfosfatase-1), H3F3A (H3-histon, familie 3A), OAZ1 (ornitindekarboksylase-antizym-1), S100P (S100-kalsiumbindingsprotein-P) og SAT (spermidin/spermin-Nl-acetyl-transferase).

I et andre tilfelle er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen en kreftform i munnhulen og/eller i orofarynks, kroppsvæsken er blodserum og genet er valgt fra IL6 (interleukin-6), H3F3A, TPT1 (tumorproteintranslasjonelt kontrollert-1), FTHl (ferritintung-polypeptid-1), NCOA4 (nukleær reseptorkoaktivator-4) og ARCR (Ras-homolog genfamilie, medlem-A).

Sykdommer som kan bli diagnostisert inkluderer orofaryngealt plateepitelkarsinom og muligens andre systemiske sykdommer.

En fremgangsmåte for å diagnostisere en oral eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse hos et individ er beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en cellefri væskefasedel av spyttet fra individet, påvise et transkriptommønster som er assosiert med patologien, sykdommen eller forstyrrelsen i den tilveiebrakte, cellefrie væskefasedelen og sammenligne transkriptommønsteret med et forhåndsbestemt mønster, der gjenkjenning i transkriptommønsteret av karakteristika for det forhåndsbestemte mønsteret er diagnostisk for patologien, sykdommen eller forstyrrelsen hos individet.

I ett tilfelle er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen en kreftform i munnhulen og/eller i orofarynks, og transkriptom inkludert transkript er valgt fra gruppen bestående av transkripter for IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT f ra spytt.

En fremgangsmåte for å diagnostisere en oral eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse hos et individ er beskrevet, der fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe serum fra individet, påvise i det tilveiebrakte serumet et transkriptommønster som er assosiert med patologien, sykdommen eller forstyrrelsen og sammenligne transkriptommønsteret med et forhåndsbestemt mønster, der gjenkjenning i transkriptommønsteret av karakteristika for det forhåndsbestemte mønsteret er diagnostisk for patologien, sykdommen eller forstyrrelsen hos individet.

I ett tilfelle er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen en kreftform i munnhulen og/eller i orofarynks, og transkriptom inkludert transkript er valgt fra gruppen som består av transkripter for IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 og ARCR fra serum.

En fremgangsmåte for å diagnostisere en kreftform hos et individ er beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en kroppsvæske fra individet, påvise i kroppsvæsken en profil for en biomarkør, sammenligne profilen for biomarkøren med en forhåndsbestemt profil for biomarkøren, der gjenkjenning i profilen til biomarkøren av karakteristika for den forhåndsbestemte profilen for biomarkøren er diagnostisk for kreften.

Patologier, sykdommer eller forstyrrelser som kan bli diagnostisert inkluderer orofaryngealt plateepitelkarsinom og muligens andre systemiske sykdommer. Biomarkører inkluderer IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og

ARCR.

I oppfinnelsen er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen orofaryngealt plateepitelkarsinom, biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, kroppsvæsken er spytt og påvisningen av en profil eller en biomarkør blir utført ved å påvise mRNA-profilen for biomarkøren.

I ett tilfelle er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen orofaryngealt plateepitelkarsinom, biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR, kroppsvæsken er serum og påvisningen av en profil for en biomarkør ble utført ved å påvise mRNA-profilen til biomarkøren.

I et annet tilfelle er patologien, sykdommen eller forstyrrelsen orofaryngealt plateepitelkarsinom, biomarkøren er IL6, kroppsvæsken er blodserum og påvisningen av en profil for en biomarkør blir utført ved å påvise proteinprofilen til biomarkøren.

Et sett for diagnostiseringen av en oral og/eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse er beskrevet, der settet omfatter: en identifikator av minst én biomarkør i en kroppsvæske, der biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR, og en detektor for identifikatoren.

Patologier, sykdommer eller forstyrrelser som kan bli diagnostisert inkluderer orofaryngealt plateepitelkarsinom og muligens de andre systemiske sykdommene.

Identifikatoren og detektoren skal bli anvendt i påvisning av kroppsvæskeprofilen for biomarkøren ifølge fremgangsmåtene som er beskrevet her. Spesielt er identifikatoren assosiert med biomarkøren i kroppsvæsken, og detektoren blir benyttet for å påvise identifikatoren, identifikatoren og detektoren muliggjør derved påvisningen av kroppsvæskeprofilen til biomarkøren.

En fremgangsmåte for å diagnostisere en oral og/eller systemisk patologisykdom eller forstyrrelse er beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: benytte spytt- og/eller serum-mRNA som biomarkører for oral og/eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse.

I ett tilfelle koder mRNA for minst én av biomarkørene som er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR.

En fremgangsmåte for å diagnostisere en oral og/eller systemisk patologi er beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: benytte spytt- eller serumproteiner som bio-markører for oral og/eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse, spesielt IL6-protein i serum og IL8-protein i spytt.

Fremgangsmåtene og settene ifølge denne beskrivelsen vil bli eksemplifisert ved hjelp av de tilhørende figurene.

Beskrivelse av figurene

Fig. IA viser resultatene for en RT-PCR-typing for ACTB utført på RNA isolert fra cellefri spyttsupernatant fra mennesker etter lagring i 1 måned (spor 2), 3 måneder (spor 3) og 6 måneder (spor 4), med en 100 bp stige av molekylvektmarkør på (spor 1) og en negativ kontroll (uten templater) (spor 5). En molekylstørrelsesmarkør er indikert på venstre side av figuren ved hjelp av piler. Fig. IB viser resultatene av en RT-PCR utført på RNA isolert fra cellefri spyttsupernatant fra mennesker (spor 1) og typing av GAPDH (Bl), RPS9 (B2) og ACTB (B3), med positiv kontroll (humant total-RNA, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA) (spor 2) og negative kontroller (uten templater) (spor 3). En molekylstørrelsesmarkør er indikert på venstre side av figuren ved hjelp av piler. Fig. 2A viser resultatene fra en kapillær elektroforese utført for å monitorere RNA-amplifisering fra RNA isolert fra cellefri spyttsupernatant fra mennesker. Sporene 1-5 viser 1 kb DNA-stige (spor 1), 5^1 spytt etter RNA-isolering (udetekterbart) (spor 2), 1^1 torunders amplifisert cRNA (fra 200 bp til ca. 4 kb) (spor 3), 1^1 cRNA etter fragmentering (rundt 100 bp) (spor 4) og Ambion RNA Century Marker (spor 5). En molekylstørrelses-markør er indikert på venstre side og høyre side av figuren ved hjelp av piler. Fig. 2B viser resultatene fra en PCR utført på RNA isolert fra cellefri spyttsupernatant fra mennesker ved ulike stadier med amplifisering og typing for ACTB. Spor 1-8 viser DNA-stige på 100 bp (spor 1), total-RNA isolert fra cellefritt spytt (spor 2), første runde cDNA (spor 3), første runde cRNA etter RT (spor 4), andre runde cDNA (spor 5), andre runde cRNA etter RT (spor 6), positiv kontroll (humant total-RNA, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA) (spor 7) og negativ kontroll (uten templater) (spor 8). En molekyl-størrelsesmarkør er indikert på venstre side av figuren ved hjelp av piler. Fig. 2C viser et diagram som rapporterer resultater av analysen av mål-cRNA utført ved hjelp av Agilent 2100 bioanalysator før hybridisering på mikroarray. På x-aksen er molekyl-vekten (bp) for det fragmenterte cRNA med referanse til markør-RNA indikert. På y-aksen er mengden av det fragmenterte cRNA (^g/ml) som er målbart ved hjelp av en bioanalysator indikert. Fig. 3 viser resultatene av en RT-PCR utført på RNA isolert fra cellefri spyttsupernatant fra mennesker (spytt) sammen med en stige (Mrkr) av positive kontroller (Ctrl(+)) og negative kontroller (Ctrl(-)) og typing for IL6 (IL6), IL8 (IL8) og p-aktin (p-aktin). Fig. 4 viser resultatene av en PCR utført for husholdnings-p-aktinet på helt spytt, serumprøver og prøver som hadde blitt sentrifugert ved 0 xg (0 xg), lOOOxg (lOOOxg), 2600 xg (2600 xg), 5000 xg (5000 xg) og 10000xg (10000 xg) ved å benytte genomisk DNA som markør (Mrkr) for cellelysis og utslipp av intracellulære forbindelser. Fig. 5A viser et diagram som rapporterer de gjennomsnittlige konsentrasjonene av mRNA for IL8 påvist i replikatprøver ved hjelp av qRT-PCR i spytt fra pasienter med OSCC (kreft) og normale individer (kontroll). På x-aksen er prøvegruppene angitt. På y-aksen er antallet kopier som er påvist angitt. Fig. 5B viser et diagram som rapporterer de gjennomsnittlige konsentrasjonene av IL8 som er påvist i replikatprøver ved hjelp av ELISA i spytt fra pasienter med OSCC (kreft) og normale individer (kontroll). På x-aksen er prøvegruppene angitt. På y-aksen er konsentrasjonen uttrykt i pg/ml angitt. Fig. 6A viser et diagram som rapporterer de gjennomsnittlige konsentrasjonene av mRNA for IL6 som er påvist i replikatprøver ved hjelp av qRT-PCR i serum fra pasienter med OSCC (kreft) og normale individer (kontroll). På x-aksen er prøvegruppene angitt. På y-aksen er antallet kopier som er påvist angitt. Fig. 6B viser et diagram som rapporterer de gjennomsnittlige konsentrasjonene av IL6 som er påvist i replikatprøver ved hjelp av ELISA i serum fra pasienter med OSCC (kreft) og normale individer (kontroll). På x-aksen er prøvegruppene angitt. På y-aksen er konsentrasjonen uttrykt i pg/ml angitt. Fig. 7A viser et diagram som rapporterer Receiver Operating Characteristic (ROC)-kurven beregnet for IL8 i spytt. På x-aksen er 1-spesifisitet angitt. På y-aksen er sensitiviteten angitt. Fig. 7B viser et diagram som rapporterer ROC-kurven som er beregnet for IL6 i serum. På x-aksen er 1-spesifisitet angitt. På y-aksen er sensitiviteten angitt. Fig. 7C viser et diagram som rapporterer ROC-kurven beregnet for en kombinasjon av IL8 i spytt og IL6 i serum. På x-aksen er 1-spesifisitet angitt. På y-aksen er sensitiviteten angitt. Fig. 8 viser resultater av en PCR-reaksjon som er utført på humant serum mRNA for fenotyping av spytt-mRNA for RPS9 (spor 2, 3 og 4), GAPDH (spor 5, 6 og 7), B2M (spor 8, 9 og 10) og ACTB (spor 11, 12 og 13) sammen med DNA-stige som en kontroll (spor 1). Fig. 9 viser et diagram som rapporterer en ROC-kurve for den logistiske regresjons-modellen for sirkulerende mRNA i serum. På x-aksen er 1-spesifisitet angitt. På y-aksen er sensitiviteten angitt. Fig. 10 viser et diagram som rapporterer klassifiserings- og regresjonstre (CART)-modellen som undersøker serum-mRNA-prediktorene for OSCC. Fig. 11 viser et diagram som rapporterer en ROC-kurve for den logistiske regresjons-modellen forden prediktive styrken av kombinerte spytt-mRNA-biomarkører. På x-aksen er 1-spesifisitet gitt. På y-aksen er sensitiviteten angitt. Fig. 12 viser et diagram som rapporterer klassifiserings- og regresjonstre (CART)-modellen som undersøker spytt-mRNA-prediktorene for OSCC.

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

En fremgangsmåte for å påvise et ekstracellulært mRNA i en kroppsvæske blir her beskrevet der kroppsvæsken er spytt og det ekstracellulære mRNA er påvist i en cellefri væskefasedel av spyttet. Tilstedeværelse av RNA i den cellefrie væskefasedelen i spytt ble bekreftet av prosedyrene som utførlig er beskrevet i eksemplene, der kvaliteten av det påviste mRNA tilfredsstiller kravet for teknikker slik som PCR, qPCR og mikroarrayanalyser.

I fremgangsmåten blir påvisning av ekstracellulære mRNA her også informativ mRNA, utført i en kroppsvæske, spytt, som tilfredsstiller kravene for en rimelig, ikke-invasiv og tilgjengelig kroppsvæske for å virke som et ideelt medium for undersøkende analyse.

Påvisning av informative mRNA blir spesielt utført i en del av spytt (cellefri væskefase) der tilstedeværelsen av mikroorganismer og fremmede stoffer slik som matavfall er minimalisert, noe som tillater analysering av molekylene på en enkel og nøyaktig måte. Fortrinnsvis er den cellefrie væskefasedelen avledet fra ikke-stimulert spytt.

I fremgangsmåten kan spyttet bli samlet opp ifølge prosedyrer som er kjent på fagområdet og deretter prosessert for å oppnå den cellefrie væskefasen derav, for eksempel ved sentrifugering av det innsamlede spytt, som resulterer i pelletert spyttcellefase og en cellefri spyttvæskefase supernatant (se prosedyrer som utførlig er beskrevet i eksemplene 1, 5 og 13).

Ifølge foreliggende beskrivelse er betingelsene for å separere cellefasen og væskefasen for spytt optimalisert for å unngå mekanisk ødeleggelse av cellulære elementer som vil bidra til RNA som blir påvist i den cellefrie væskefasen.

I utførelsesformer der separasjonen blir utført ved hjelp av sentrifugering kan optimalisering bli utført ved å teste husholdningsgener på prøver som er sentrifugert ved forskjellige hastigheter og på hele spyttprøver ved å anvende DNA som en markør for cellelysis og utslipp, for å utlede den optimaliserte sentrifugeringshastigheten (se prosedyre beskrevet i eksempel 5).

Påvisning av det ekstracellulære mRNA i den cellefrie spyttvæskefasedelen (spytt-mRNA) kan deretter bli utført ved hjelp av teknikker som er kjent på fagområdet for å tillate kvalitativ og/eller kvantitativ mRNA-analyse, slik som RT-PCR, q-PCR og mikroarray. Påvisningen kan spesielt bli utført ifølge prosedyrer som kan inkludere isolering og amplifisering av spytt-mRNA og som er eksemplifisert i eksemplene.

Påvisning av spytt-mRNA i fremgangsmåten kan utføres med det formålet å lage en profil av spytt-mRNA.

I en første serie av utførelsesformer kan det lages en profil av ekspresjonen av forhåndsbestemte gener i en cellefri væskefasedel av spytt. I disse utførelsesformene kan påvisning av mRNA-profilen bli utført ved hjelp av RT-PCR eller en hvilken som helst teknikk som tillater identifisering av et forhåndsbestemt mål-mRNA. Kvantitative analyser kan deretter bli utført med teknikker så som kvantitativ PCR (qPCR) for å bekrefte tilstedeværelsen av mRNA som er identifisert ved hjelp av RT-PCR. En referansedatabase kan deretter bli generert basert på mRNA-profilene som er fremskaffet på denne måten. Eksempelprosedyrer for å utføre slike kvalitative og kvantitative analyser av spytt-mRNA er beskrevet i detaljer i eksemplene 1, 4 og 9.

Transkriptomanalyse av spytt kan utføres ved å påvise et transkriptommønster i den cellefrie væskefasedelen av spytt. Påvisning av transkriptommønsteret kan utføres ved å isolere og lineært amplifisere spytt-mRNA, som det deretter kan lages profiler av med teknikker slik som høytetthetsoligonukleotidmikroarray. Kvantitativ analyse kan deretter utføres med teknikker slik som Q-PCR for å bekrefte tilstedeværelsen av mRNA i mønsteret som er identifisert ved mikroarrayen. En referansedatabase kan deretter bli generert basert på mRNA-profilene som er fremskaffet på denne måten. Eksempelmessige prosedyrer for å utføre slike kvalitative og kvantitative analyser av spytt-mRNA er beskrevet i detalj i eksemplene 2-3, 9-10 og 14-15.

Å lage profiler av spytt-RNA kan utføres for å påvise og/eller monitorere menneskets helsetilstand og sykdom, eller for å undersøke biologiske spørsmål, slik som for eksempel, opprinnelsen, frigjøringen og uttømmingen av mRNA i spytt. Spytt-mRNA tilveiebringer faktiske eller potensielle biomarkører for å identifisere populasjoner og pasienter med risiko for orale og systemiske patologier, sykdommer eller forstyrrelser.

Endringer i spytt-mRNA-profilene og transkriptommønstrene som karakteriserer den cellefrie væskefasedelen av spytt hos normale individer kan være indikativ for patologier, sykdommer eller forstyrrelser av forskjellig opprinnelse. Eksempler på disse patologiene, sykdommene eller forstyrrelsene er tilveiebrakt ved de inflammatoriske tilstandene i munnhulen, OSCC eller andre tilstander slik som diabetes, brystkreft og HIV.

Sammenligning mellom mRNA-profilene og transkriptommønstrene for et individ som er rammet av en bestemt patologi, sykdom eller forstyrrelse kan også føre til identifiseringen av informative biomarkører for den bestemte patologien, sykdommen eller forstyrrelsen. Spesielt kan spytt-mRNA anvendes som diagnostiske biomarkører for orale og systemiske patologier, sykdommer eller forstyrrelser som kan være manifesterte i munnhulen.

Spesielt kan spytt-mRNA bli benyttet som diagnostiske biomarkører for kreft som kan være manifestert og/eller som rammer munnhulen. Spyttbaserte mRNA-analyser har den nødvendige spesifisiteten og sensitiviteten for pålitelige diagnostiske midler.

I tilfelle med forskjellige former for kreft kan endringer i de normale spytt-mRNA-og transkriptommønstrene også reflektere de genetiske endringene i én eller flere deler av munnhulen som er assosiert med tilstedeværelse av tumoren. For munnhulekreftpasienter stammer den påviste kreftassosierte RNA-signaturen sannsynligvis fra den samsvarende tumoren og/eller en systemisk respons (lokal eller distal) som ytterligere reflekterer seg selv i det totale spyttet som kommer fra hver av de tre hovedkildene (spyttkjertler, gingival crevikulær væske, og orale slimhinneceller). Det er tenkelig at det sykdomsassosierte RNA kan finne veien inn i munnhulen via spyttkjertlene eller sirkulering gjennom den gingivale crevikulære væsken. Et godt eksempel er den forhøyede tilstedeværelsen av HER2-proteinet i spytt hos brystkreftpasienter [87].

Et vanlig transkriptom i normalt cellefritt spytt, inkludert omtrent 185 forskjellige humane mRNA, også definert som «Normal Salivary Core Transcriptome» (NSCT) ble identifisert i resultatet av en transkriptomanalyse utført på cellefri væskefase av spytt fra normale individer (se eksempel 2, tabell 2).

I og med at NSCT ble identifisert ved å anvende probesettene på HG U133A-mikroarray som kun representerer ca. 19000 humane gener, og det humane genomet er sammensatt av mer enn 30000 gener [48], er det forventet at flere humane mRNAer vil bli identifisert i spytt ved andre metodikker og ytterligere spyttmønstre er identifiserbare ved fremgangsmåten som er beskrevet her.

NSCT og/eller andre spyttranskriptommønstre i cellefritt spytt fra normale populasjoner kan fungere i en spyttranskriptomdiagnostikk (SIvTD), for potensielle applikasjoner i sykdomsdiagnostikk i tillegg til som normal helseovervåkning.

I et første tilfelle av SIvTD er en fremgangsmåte for å diagnostisere en oral eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse hos et individ følgelig beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en cellefri væskefasedel av spyttet til individet, påvise i den tilveiebrakte, cellefrie spyttvæskefasedelen en mRNA-profil for et gen som er assosiert med sykdommen, og sammenligne RNA-profilen for genet med en forhåndsbestemt mRNA-profil for genet, der den forhåndsbestemte mRNA-profilen til genet er indikativ på tilstedeværelsen av sykdommen hos individet.

I et andre tilfelle av SIvTD er en fremgangsmåte for å diagnostisere en oral eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse hos et individ beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe cellefri spyttsupernatant fra individet, påvise i den cellefrie spyttsupernatanten et transkriptommønster som er assosiert med patologisykdom eller forstyrrelsen og sammenligne transkriptommønsteret med et forhåndsbestemt mønster, der gjenkjenning i transkriptommønsteret av karakteristika for det forhåndsbestemte mønsteret er diagnostisk for patologisykdommen eller forstyrrelsen hos individet.

I et tredje tilfelle av SIvTD er en fremgangsmåte for å identifisere en biomarkør som er assosiert med en forhåndsbestemt patologi, sykdom eller forstyrrelse beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: påvise en første mRNA-profil av et forhåndsbestemt gen i en cellefri væskefasedel av spytt fra et individ som er rammet av patologien, sykdommen eller forstyrrelsen, påvise en andre mRNA-profil for det forhåndsbestemte genet i den cellefrie væskefasedelen av spyttet fra et normalt individ, sammenligne den første mRNA-profilen med den andre mRNA-profilen, gjenkjenne forskjeller mellom den første mRNA-profilen og den andre mRNA-profilen, forskjellene er validert ved hjelp av statistisk analyse, være indikative på identifiseringen av det forhåndsbestemte genet som en biomarkør for den forhåndsbestemte patologien, sykdommen eller forstyrrelsen.

Spesielt blir forskjellen mellom RNA-profilen fra én sykdomskategori og én frisk kategori analysert ved hjelp av mikroarray statistiske metodikker. Algoritmene som blir benyttet inkluderer MAS 5.0, DNA-chipanalyser 1.3 og RMA 3.0. Fortrinnsvis blir analysene utført ved hjelp av en kombinasjon av disse fremgangsmåtene for å tilveiebringe kraftigere og mer nøyaktige markører og tester. Markørene som blir identifisert ved mikroarray vil deretter bli testet ved hjelp av konvensjonelle teknikker slik som Q-PCR.

I et fjerde tilfelle av SIvTD kan en diagnostisk fremgangsmåte bli utført der det cellefrie spyttet blir kontaktet med en identifikator for tilstedeværelsen eller ekspresjon av biomarkøren, og tilstedeværelsen av identifikatoren som er assosiert med tilstedeværelse eller ekspresjon av biomarkøren blir påvist, fortrinnsvis ved hjelp av en detektor.

SIvTD tillater påvisning av sykdommer slik som tumorer på et stadium som er tidlig nok til at behandling sannsynligvis vil være vellykket, med screen i ngsverktøy som viser de kombinerte egenskapene av høy sensitivitet og høy spesifisitet. Videre er screeningsverktøyene tilstrekkelig ikke-invasiv og billige til å tillate utbredt anvendelse.

Resultatene av fremgangsmåtene ovenfor av SIvTD kan integreres med en tilsvarende analyse utført på et mRNA- og/eller proteinnivå og/eller i annen kroppsvæske, slik som blodserum.

Biomarkører, slik som protein- eller transkriptommønstre påvist i serum, kan også fungere i serumtranskriptomdiagnostikk (SrmTD) for potensielle anvendelser i sykdomsdiagnostikk så vel som ved normal helseovervåkning. Tilfeller av SrmTD inkluderer fremgangsmåter som tilsvarer de som er rapportert ovenfor for SIvTD, der kroppsvæsken som ble analysert er serum istedenfor cellefritt spytt.

Spesielt kan resultatene som er oppnådd ved å følge SIvTD kombineres med resultater som er oppnådd med SrmTD i en kombinert spytt- og serumtranskriptom-tilnærming (SSTD).

Ifølge SSTD kan en diagnostisk fremgangsmåte bli utført, der kroppsvæsken, serumet og/eller spyttet blir kontaktet med en identifikator for tilstedeværelsen eller ekspresjonen av biomarkøren, der biomarkøren kan være et protein eller et mRNA og der tilstedeværelsen av identifikatoren som er assosiert med tilstedeværelsen eller ekspresjonen av biomarkøren blir påvist, fortrinnsvis ved hjelp av en detektor.

Eksempler på SIvTD, SrmTD og SSTD blir her tilveiebrakt med referanse til OSCC. Fagfolk på området kan utlede de passende modifikasjonene av STD som her er eksemplifisert for sykdommer som er forskjellig fra OSCC ved å lese foreliggende beskrivelse.

Profiler av to spesifikke cytokiner, IL6 og IL8, ble målt i den cellefrie væskefasedelen av spytt og serum fra pasienter med OSCC ifølge prosedyrer som utførlig er beskrevet i eksemplene 4-8. IL8 ble påvist ved høyere konsentrasjoner i spyttet hos pasienter med OSCC (P < 0,01) og IL6 ble påvist ved høyere konsentrasjoner i serumet fra pasienter med OSCC (P < 0,01). Disse resultatene ble bekreftet på både mRNA- og proteinnivå, og resultatene var overensstemmende. Konsentrasjonen av IL8 i spytt og IL6 i serum så ikke ut til å være assosiert med kjønn, alder eller bruk av alkohol eller tobakk (P > 0,75). Dataene ble underkastet statistisk analyse, spesielt til ROC-analyse, og var i stand til å bestemme grenseverdien, sensitiviteten og spesifisiteten for hver biomarkør for påvisning av OSCC (se eksempel 8, tabell 3). Dessuten var oppfinnerne i stand til å måle mRNA i spyttprøver.

En transkriptomanalyse av ikke-stimulert spytt samlet fra pasienter med OSCC og normale individer ble utført som beskrevet i eksemplene 9-12 og i eksemplene 13-16.

RNA-isolering ble utført fra spyttsupernatanten, etterfulgt av to runder lineær amplifisering med T7-RNA-polymerase. Human Genome U133A-mikroarrays ble benyttet for å profilere humant s pytt rans kri ptom. De ulike genekspresjonsmønstrene ble analysert ved å kombinere en t-testsammenligning og en fold-endringsanalyse på 10 matchede kreftpasienter og kontroller. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) ble benyttet for å validere de valgte genene som viste signifikante forskjeller (P < 0,01) ved hjelp av mikroarray. Den beregnede styrken til disse spytt-mRNA-biomarkørene ble analysert ved hjelp av mottakervirkende karakteristisk kurvemodell og klassifiseringsmodell.

Resultatene av et første sett med mikroarrayanalyse viste at det er 1679 gener som oppviste signifikante forskjellige ekspresjonsnivåer i spytt mellom kreftpasienter og kontroller (P < 0,05). Sju kreftrelaterte mRNA-biomarkører som oppviste minst en 3,5-gangers forhøyning i OSCC-spytt (P < 0,01) ble konsekvent validert ved qPCR på spyttprøver fra OSCC-pasienter (n = 32) og kontroller (n = 32). Disse spytt-RNA-biomarkørene er transkripter av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P og SAT. Kombinasjonene av disse biomarkørene ga sensitivitet (91 %) og spesifisitet (91 %) for å skille OSCC fra kontrollene. (Se eksemplene 13-16).

Resultatene fra et andre sett med mikroarrayanalyse viste at fem av ti oppregulerte gener som var valgt basert på deres rapporterte kreftassosiering viste signifikant for høyede transkripter i serum fra OSCC-pasienter. Disse RNA-biomarkørene er transkripter av H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR. Resultatene som ble validert ved qPCR bekreftet at transkripter av disse fem genene var signifikant forhøyet i serumet fra OSCC-pasienter (Wilcoxon Signed Rank-test, P < 0,05). (Se eksemplene 9-12).

Ved å benytte den beskrevne samlingen og prosesseringsprotokollene ble tilstedeværelsen av ACTB-, B2W-, GAPDH- og RPS9-mRNA (kontroll-mRNA) bekreftet i alle sera (pasienter og kontroller) ved RT-PCR.

Følgelig er en fremgangsmåte for å diagnostisere en kreft, spesielt OSCC hos et

individ, beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: tilveiebringe en kroppsvæske fra individet, påvise i kroppsvæsken en profil for en biomarkør, der biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR, og sammenligne profilen for biomarkøren med en forhåndsbestemt profil for biomarkøren, der gjenkjenning i profilen for biomarkøren av karakteristika for den forhåndsbestemte profilen for biomarkøren er diagnostisk for kreften.

En fremgangsmåte for å diagnostisere oral og/eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse, spesielt OSCC, er også beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å anvende spytt-mRNA som biomarkører for orale og/eller systemiske sykdommer, spesielt spytt-mRNA som er valgt fra gruppen bestående av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ2, S100P og SAT.

I tillegg er en fremgangsmåte for å diagnostisere oral og/eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse, spesielt OSCC, beskrevet. Fremgangsmåten omfatter å: benytte serum-mRNA og/eller protein som biomarkører for orale og/eller systemiske sykdommer, spesielt serum-mRNA som er valgt fra gruppen som består av IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR, og serum-IL6-protein.

Gitt den multifaktorielle naturen til onkogenese og heterogeniteten i onkogene reaksjonsveier så er anvendelsen av kombinasjoner av spytt- og/eller serumbiomarkører for å sikre høyere spesifisitet og sensitivitet for å påvise sykdommen, foretrukket. Flere statistiske strategier som er rapportert og risikomodeller som er beskrevet i eksemplene kan benyttes for å identifisere kombinasjoner av biomarkører som kan identifisere OSCC-pasientprøver og forenkle utvelgelsen av den egnede serumtranskriptombaserte diagnosen for pasientenes spesifikke kreftrisiko.

Monitoreringen av profil for spytt-mRNA i cellefri væskefasedel av spytt og/eller i annen kroppsvæske slik som blodserum, kan benyttes i den postoperative behandlingen av OSCC-pasienter. Den kan potensielt bli benyttet for monitorering av virkningen av behandling, eller sykdomstilbakefall etter at terapi er avsluttet. Spytt-mRNA og spesielt IL8 kan også fungere som prognostiske indikatorer for å styre behandlingen av pasienter med kreft i munnhulen. I perspektiv kan høyrisikopasienter bli styrt mot mer aggressive regimer eller adjuvansbehandlingsregimer.

Anvendelsen av disse biomarkørene kan også forbedre stadium-bestemmeisen av tumoren. Med tradisjonelle teknikker blir ofte tilstedeværelsen av mikroskopisk fjernsykdom underoppdaget. I de senere år har det vært et skifte fra lokoregional svikt til fjernsvikt for pasienter behandlet for antatt lokoregional sykdom [18]. Dette er delvis en refleksjon av subklinisk fjernsykdom som er til stede før oppstarten på terapi. Testing for tilstedeværelsen av biomarkører kan tillate påvisningen av små mengder tumorceller i en bakgrunn av normalt vev. Spytt-mRNA som biomarkører spesifikke for hode- og nakketumorer eller et panel av slike biomarkører kan tillate påvisningen av fjern mikroskopisk sykdom. For oral kreft er én av de viktigste applikasjonene av STD-tilnærmingen i så henseende å påvise kreftkonverteringen av orale premaligne lesjoner.

Å lage profiler av spytt-mRNA kan også bli anvendt for å undersøke rollen til gener i utviklingen av kreft, spesielt hvorvidt den avvikende ekspresjonen av disse genene funksjonelt bidrar til utviklingen av human OSCC. Den biologiske betydningen av differensiert ekspresjon av disse genene i hode- og nakke/ora I kreft bør bli bestemt. Identifisering av kreftassosierte gener som konsistent blir endret hos kreftpasienter vil tilveiebringe oss ikke bare med diagnostiske markører, men også med innsikt i molekylære profiler som er involvert i hode- og nakkekreftutvikling. Forståelse av profilen for molekylære endringer i en hvilken som helst spesiell kreftform vil være ekstremt nyttig fordi det vil bli mulig å korrelere den resulterende fenotypen for denne kreftformen med molekylære hendelser.

Sett av deler som er assosiert med fremgangsmåtene som er beskrevet her er også beskrevet. I en eksempelmessig tilfelle omfatter et sett: en identifikator for en biomarkør i en kroppsvæske, slik som et spytt-mRNA eller protein, og serum-mRNA eller protein, der biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR, og en detektor for identifikatoren, der identifikatoren og detektoren skal anvendes for å påvise kroppsvæskeprofilen av biomarkøren ifølge én av fremgangsmåtene som er beskrevet her, der identifikatoren er assosiert med biomarkøren i kroppsvæsken, og der detektoren anvendes for å påvise identifikatoren, der identifikatoren og detektoren således muliggjør påvisningen av kroppsvæskeprofilen for biomarkøren.

Kroppsvæsken kan være spytt, der påvisningen blir utført i den cellefrie væskefasedelen derav, eller en annen kroppsvæske slik som blodserum.

Identifikatoren og detektoren som er i stand til å påvise identifikatoren er identifiserbare av en fagperson på området. Andre sammensetninger og/eller komponenter som kan være hensiktsmessig inkludert i settet er også identifiserbare av en fagperson på området.

Identifikatoren og reagenset kan bli inkludert i ett eller flere sammensetninger der identifikatoren og/eller reagenset er inkludert med en passende vehikkel, bærer eller tilleggsmiddel.

I de diagnostiske settene som er beskrevet her kan midlene og identifikator-reagensene bli tilveiebrakt i settene, med passende instruksjoner og andre nødvendige reagenser, for å kunne utføre fremgangsmåtene som er beskrevet her. Settet vil normalt inneholde sammensetningene i separate beholdere. Instruksjoner, for eksempel skrevne-eller audioinstruksjoner, på papir eller på elektronisk medier slik som tape eller CD-ROM, for å utføre analysen, vil vanligvis være inkludert i settet. Settet kan også inneholde, avhengig av den spesielle fremgangsmåten som blir benyttet, andre forpakkede reagenser og materialer (dvs. vaskebuffere og lignende).

Ytterligere detaljer som gjelder identifiseringen av det passende bæremidlet eller tilleggsmidlet i sammenstningene, og generell fremstilling og forpakning av settet, kan bli identifisert av fagfolk på området ved å lese foreliggende beskrivelse.

Settet av deler som er beskrevet her kan spesielt bli benyttet i diagnostisk hensikt. Som et resultat er en ikke-invasiv diagnostisk påvisning av patologier, sykdommer eller forstyrrelser, og spesielt munnhulekreft og orofarynkskreft hos pasienter, beskrevet.

Anvendelsen av væskefasen av spytt har unike fortrinn i forhold til anvendelsen av eksfolierte celler. Avhengig av lokalisering av tumoren er man kanskje ikke i stand til enkelt å få tilgang til og gni tumorstedet. Selv om ikke spyttbiomarkører er i stand til å identifisere stedet der tumoren hadde sitt opphav, så kan de identifisere pasienter med risiko. En slik spyttest kan administreres av ikke-spesialister på avsidesliggende steder som et screenings-redskap for å velge pasienter for henvisning til grundig evaluering av de øvre luftveier og fordøyelsessystem. Å finne tidlig stadium, tidligere ikke-påvist sykdom kan til sist redde liv. Dessuten kan anvendelsen av lett tilgjengelige biomarkører vise seg å være svært fordelaktig i store populasjoner eller ved kjemoprevensjonsstudier. Dette kan tenkes ved rutinemessige tannlegebesøk eller målrettet screening av individer som har høy risiko for utvikling av sykdommen. Et hjemmetest-sett kan også være tenkelig.

Anvendelsen av blodtest er også tenkelig, spesielt fortidlig kreftpåvisning. Gjenvinning av det cellefrie sirkulerende mRNA eller proteinbiomarkører i serum fra kreftpasienter som representerer karakteristika for tumorgenetisk endring, slik som IL6-mRNA og protein, H3F3A, mRNA TPTl-mRNA, FTHl-mRNA, NCOA4-mRNA og ARCR-mRNA som er diagnostisk for OSCC, kan bli tenkt som en screeningstest for tilstedeværelse av okkult OSCC ved rutinemessig legebesøk med blodarbeid eller målrettet screening av individer som er i risiko for å utvikle oral kreft. Et hjemmetest-sett kan så bli fremstilt.

Spesielt kan perifert blod bli fremskaffet fra individer ved å benytte rutinemessige kliniske prosedyrer, og mRNA og proteiner kan bli isolert, fortrinnsvis med en optimalisert prosedyre som er beskrevet her. Sanntids kvantitativ PCR og ELISA for de respektive cytokinene vil bli utført for én eller flere biomarkører, slik som IL6.

Et perspektivt tilfelle av fremgangsmåtene som er beskrevet her er rettet mot den eventuelle dannelsen av mikro-/nanoelektriske mekaniske systemer (MEMS/NEMS) forden ultrasensitive påvisningen av molekylære biomarkører i oral væske. RNA- og protein-ekspresjon for de validerte OSCC-biomarkørene vil bli valgt som mål for kreftpåvisning. Integreringen av disse påvisningssystemene for den samtidige påvisningen av mRNA og protein for multiple OSCC-biomarkører vil føre til et effektivt, automatisert, rimelig system for oral væskebasert kreftdiagnostikk.

Ytterligere detaljer som gjelder reagenser, betingelser, samensetninger, teknikker som skal bli anvendes i fremgangsmåten og settene ifølge beskrivelsen er identifiserbare av fagfolk på området ved å lese foreliggende beskrivelse.

I tillegg kan passende modifikasjoner av STD-fremgangsmåtene og settene som er beskrevet her og eksemplifisert som assosiert med OSCC og/eller HSCNCC, for mRNA-profilen og transkriptomanalyse som er assosiert med undersøkelse og diagnostisering av andre patologier, sykdommer og forstyrrelser utføres av en fagperson på området ved å lese foreliggende beskrivelse.

De følgende eksemplene er tilveiebrakt for å beskrive oppfinnelsen i ytterligere detalj. Disse eksemplene som fremlegger en foretrukket måte som pr. i dag er påtenkt for å utføre oppfinnelsen, er ment å skulle illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Eksempel 1: RNA-isolering, amplifisering og gen ekspresjon for å lage profiler fra cellefritt spytt fra normale donorer

Normale individer

Spyttprøver ble fremskaffet fra ti normale donorer fra the Division of Otolarygology, Head and Neck Surgery, på the Medical Center, University of California, Los Angeles (UCLA), CA, ifølge en protokoll som er godkjent av the UCLA Institutional Review Board. De følgende inkluderingskriteriene ble benyttet: alder 30 år, ingen historie med malignitet, immunsvikt, autoimmunforstyrrelser, hepatitt, HIV-infeksjon eller røyking. Studiepopulasjonen var satt sammen av 6 menn og 4 kvinner, med en gjennomsnittlig alder på 42 år (varierer fra 32-55 ar).

Spvttinnsamlina og prosessering for å oppnå den relevante væskefasen

Ikke-stimulert spytt ble samlet mellom 9 på morgenen og 10 på morgenen i

samsvar med publiserte protokoller [38]. Individer ble bedt om å avstå fra spising, drikking, røking eller munnhygieneprosedyrer i minst én time før innsamling av spytt. Spyttprøver ble sentrifugert ved 2600 x g i 15 min. ved 4 °C. Spyttsupernatant ble separert fra den cellulære fasen. RNase-inhibitor (Superase-In, Ambion Inc., Austin, TX, USA) og proteaseinhibitorer (Aprotinin, Sigma, St. Louis, MO, USA) ble deretter tilsatt til den cellefrie spyttsupernatanten.

RNA- isolering fra cellefritt spytt

RNA ble isolert fra cellefri spyttsupernatant ved å benytte den modifiserte proto-kollen fra produsenten (QIAamp Viral RNA kit, Qiagen, Valencia, CA, USA). Spytt (560^1), blandet godt med AVL-buffer (2240^1), ble inkubert ved romtemperatur i 10 min. Absolutt etanol (2240^1) ble tilsatt og løsningen ble passert gjennom silikakolonner ved sentrifugering ved 6000 x g i 1 min. Kolonnene ble deretter vasket to ganger, sentrifugert ved 20000 x g i 2 min. og eluert med 30^1 RNasefritt vann ved 9000 x g i 2 min. Volumer av RNA ble behandlet med RNase-fri DNase (DNase I-DNA-fri, Ambion Inc., Austin, TX, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.

Stabiliteten til det isolerte RNA ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR-typing for aktin-p (ACTB) etter lagring i 1, 3 og 6 måneder. Resultatene som er rapportert i figur IA viser at mRNA som ble isolert kunne bli oppbevart uten signifikant degradering i mer enn 6 måneder ved -80 °C.

Kvaliteten til isolert RNA ble undersøkt ved RT-PCR for tre husholdningsgentranskripter: glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH), aktin-p (ACTB) og ribosomprotein-S9 (RPS9). Primere ble designet ved å benytte PRIMER3-programvare ( http:// www. qenome. wi. mit. edu) og ble syntetisert kommersielt (Fisher Scientific, Tustin, CA, USA) på følgende måte: primerne som hadde sekvensen som er rapportert i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 1 og SEKV. ID nr. 2 for GAPDH, primerne som hadde sekvensen rapportert i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 3 og SEKV. ID nr. 4 for ACTB, primerne som hadde sekvensen som er rapportert i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 5 og SEKV. ID nr.6 for RPS9. Mengden av RNA ble estimert ved å benytte Ribogreen<®>RNA Quantitation Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Resultatene er vist i figur IB, der GAPDH (Bl), RPS9 (B2) og ACTB (B3) ble konsekvent påvist i alle ti tilfeller som ble testet, noe som viser at alle ti spyttprøvene inneholdt mRNA'er som koder for husholdningsgenene: GAPDH, ACTB og RPS9.

mRNA for disse genene kunne bli lagret uten signifikant degradering i mer enn 6 måneder ved -80 °C (se resultater for ACTB rapportert i figur IA).

Mål- cRNA- fremstillina

Isolert RNA ble deretter underkastet lineær amplifisering ifølge publisert fremgangsmåte fra vårt laboratorium (Ohyama et al., 2000). Kort beskrevet ble revers transkripsjon ved å benytte T7-oligo-(dT)24som primeren utført for å syntetisere den første tråden av cDNA. Den første runden med in wtro-transkripsjon (IVT) ble utført ved å benytte T7-RNA-polymerase (Ambion Inc., Austin, TX, USA). BioArray™ High Yield RNA Transcript Labeling System (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) ble benyttet til den andre runden av IVT for å biotinylere cRNA-produktet, det merkede cRNA ble renset ved å benytte GeneChip<®>Sample Cleanup Module (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).

Mengden og kvaliteten av cRNA ble bestemt ved hjelp av spektrofotometri og gelelektroforese. Eksempelmessige resultater av agarosegelelektroforesetest som er gitt i figur 2A viser forskjellige mengder av amplifisert cRNA på de forskjellige stadiene av RNA-amplifiseringen.

Små volumer fra hvert av isoleringstrinnene og amplifiseringstrinnene ble også benyttet for å undersøke kvaliteten ved hjelp av RT-PCR. Eksempelmessige resultater er repportert i figur 2B og viser PCR-typing av ACTB utført på forskjellige trinn av RNA-amplifisering, der det forventede, enkle båndet (153 bp) kan bli påvist i hvert hovedtrinn i spytt-RNA-amplifiseringsprosessen.

Kvaliteten på det fragmenterte cRNA (fremstilt som beskrevet av Kelly, 2002) ble også evaluert ved kapillærelektroforese ved å benytte 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Eksempelmessige resultater er rapportert i figur 2C og viser én enkelt topp i et smalt område (50-200 bp) som viser riktig fragmentering.

Genekspresion for å lage profiler i det målsøkte cRNA- preparatet

Gen-ekspresjonsprofiler ble utført i cellefritt spytt fremskaffet fra ti normale donorer, der gjennomsnittlig 60,5 +. 13,1 ng (n = 10) totalt RNA ble fremskaffet fra 560^1 cellefrie spyttprøver. Resultatene er rapportert i tabell 1.

Den totale RNA-mengden er RNAet i 560 pl cellefri spyttsupernatant; cRNA-mengden er etter to runder med T7-amplifisering. Antall prober som viser tilstedeværelsessignal på HG U133A-mikroarray (påvisning p<0,04). Tilstedeværende prosentandel (P%) = antall prober tilordnet tilstedeværelsessignal/antall total prober (22283 for HG U133A-mikroarray).

Etter to runder med lineær T7-RNA-amplifisering var det gjennomsnittlige utbyttet av biotinylert cRNA 42,2 + 3,9 ug med A260/280 = 2,067 + 0,082 (tabell 1). cRNA varierer fra 200 bp til 4 kb før fragmentering og ble konsentrert til tilnærmet 100 bp etter fragmentering. Kvaliteten av cRNA-probe ble bekreftet ved kapillærelektroforese før hybridiseringene. ACTB-mRNA kunne påvises ved å benytte PCR/RT-PCR på originalprøve og produkter fra hvert amplifiseringstrinn: første cDNA, første in vitro-transkripsjon (IVT), andre cDNA og andre IVT, med et resulterende agarosegelektroforesemønster som var sammenlignbart med det som er vist i figur 2B.

Eksempel 2: Mikroarray profiler av mRNA fra cellefritt spytt fra normale donorer

Spytt ble samlet, prosessert og RNA ble isolert som rapportert i eksempel 1. I tillegg ble stabilitet, kvalitet og kvantitet av RNA også evaluert som rapportert i eksempel 1.

HG- U1331A- mikroarravanalvse

Affymetrix Human Genome U133A Array, som inneholder 22215 humane gen-cDNA-probesett som representerer ca. 19000 gener (dvs. hvert gen kan være representert med mer enn ett probesett), ble benyttet til genekspresjonsprofiler. Array-dataene ble normalisert og analysert ved å benytte Mikroarray Suite (MAS)-programvare (Affymetrix). En påvisnings-p-verdi ble fremskaffet for hvert probesett. Et hvilket som helst probesett med p<0,04 ble betegnet "til stede", for å indikere at det matchende gentranskriptet er pålitelig påvist (Affymetrix, 2001). Det totale antallet tilstedeværende probesett på hver array ble fremskaffet og den tilstedeværende prosentandelen (P%) av foreliggende gener ble beregnet. Funksjonell klassifisering ble utført på utvalgte gener (tilstede på alle ti arrays, p < 0,01) ved å benytte Gene Ontology Mining Tool (www.netaffx.coml.

Spytt-mRNA-profiler fra ti normale individer ble fremskaffet ved å benytte HG U133A-array inneholdende 222873 cDNA-prober. Et gjennomsnitt på 3143 +, 665,0 probesett (p < 0,04) ble funnet på hver array (n = 10) med gitte tilstedeværende signaler. Disse probesettene representerer omtrent 3000 ulike mRNA. Den gjennomsnittlige tilstedeværende prosentandelen var 14,11 +, 2,98 % (n=10). En referansedatabase som inkluderer data fra de ti arrays ble generert. Probesettene som representerer GAPDH, ACTB og RPS9 ga tilstedeværelsessignaler på alle 10 arrays. Det var totalt 207 probesett som representerer 185 gener gitt tilstedeværelsessignaler på alle ti arrays med påvisning p < 0,01. Disse 10 genene ble kategorisert på basis av deres kjente roller i biologiske prosesser og molekylære funksjoner. Biologiske prosesser og molekylære funksjoner for 185 gener i cellefritt spytt fra ti normale donorer (data fremskaffet ved å benytte Gene Ontology Mining Tool) er repportert i tabell 2.

Ett gen kan ha flere molekylære funksjoner eller delta i forskjellige biologiske prosesser. Antallet gener som er klassifisert i en viss gruppe/undergruppe. Hovedvirkningene til de 185 genene er relatert til cellevekst/vedlikehold (119 gener), molekylær binding (118 gener) og cellulær struktursammensetning (95 gener). Vi betegnet disse 185 genene som "normal spyttkjernetranskriptom (NSCT)".

Eksempel 3: Q-PCR-validering og kvantiteringsanalyse av mikroarrayprofiler fra cellefritt spytt fra normale donorer

Mikroarray-analysen som er utført i eksempel 2 ble validert via en kvantitativ gen-ekspresjonsanalyse ved hjelp av Q-PCR.

Kvantitative qenekspresionsanalvser ved hjelp av Q- PCR

Sanntids-kvantitativ-PCR (Q-PCR) ble benyttet for å validere tilstedeværelsen av humant mRNA i spytt ved å kvantifisere valgte gener fra de 185 "normale spytt-kjerne-transkriptom"-genene som ble påvist ved hjelp av Mikroarray-profilen som er beskrevet i eksempel 2. Genene IL1B, SFN og K-ALFA-1, som ble gitt tilstedeværelsessignal på alle 10 arrays, ble tilfeldig valgt for validering.

Q-PCR ble utført ved å benytte iCyclerTM thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Et volum på 2^1 av det isolerte spytt-RNA (uten amplifisering) ble reverstranskribert til cDNA ved å benytte MuLV-reverstranskriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Det resulterende cDNA (3^1) ble benyttet til PCR-amplifisering ved å benytte iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Primerne ble syntetisert ved hjelp av Sigma-Genosys (Woodlands, TX, USA) på følgende måte: primerne som hadde sekvensen som er rapportert i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 7 og SEKV. ID nr. 8 for interleukin-1, beta (IL1B), primerne som har sekvensen som er gitt i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 9 og SEKV. ID nr. 10 for stratifin (SFN), primerne som har sekvensen som er gitt i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 11 og SEKV. ID nr. 12 fortubulin, alfa, ubikvitær (K-ALFA-1). Alle reaksjoner ble utført i triplikat med betingelser som er skredder-sydd for de spesifikke PCR-produktene. Utgangsmengden av cDNA for et spesielt templat ble ekstrapolert fra standardkurve ved å benytte LightCycler-programvare 3.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Den detaljerte prosedyren for kvantifisering ved hjelp av standardkurve har tidligere blitt beskrevet (Ginzinger, 2002).

Q-PCR-resultater viste at mRNA for IL1B, SFN og K-ALFA-1 var påvisbart i alle 10 opprinnelige, ikke-amplifiserte, cellefrie spytt. De relative mengdene (i kopiantall) fordisse transkriptene (n = 10) er: 8,68 x 103 + 4,15 x 103 for IL1B, 1,29 x 105 + 1,08 x 105 for SFN og 4,71 x 106 +. 8,37 x 105 for K-ALFA-1. De relative RNA-uttrykkingsnivåene for disse genene målt ved hjelp av Q-PCR var tilsvarende med de som ble målt med mikroarray (data ikke vist).

Eksempel 4: IL6 og IL8-mRNA-isolering, amplifisering og analyse av ekspresjonen i cellefritt spytt fra OSCC-pasienter

Pasientutvelaelse

Pasienter ble rekruttert fra the Divisional of Head and Neck Surgery fra the University of California, Los Angeles (UCLA) Medical Center, Los Angeles, CA, the University of Southern California (USC) Medical Center, Los Angeles, CA, og the University of California San Francisco (UCSF) Medical Center, San Francisco, CA, over en 6 måneders periode.

Trettito pasienter med dokumentert primær Tl- eller T2-plateepitelkarsinom i munnhulen (OC) eller orofarynks (OP) ble inkludert i denne studien. Alle pasienter hadde nylig blitt diagnostisert med primær sykdom og hadde ikke mottatt noe tidligere behandling i form av kjemoterapi, radioterapi, kirurgi eller alternativ behandling. Et likt antall med alders- og kjønnsmatchede individer med sammenlignbare røkevaner ble valgt som en kontrollsammenligningsgruppe.

Blant de to individgruppene var det ingen signifikante forskjeller når det gjelder gjennomsnittsalder (standardavvik, SD): OSCC-pasienter, 49,3 (7,5) år, normale individer, 48,8 (5,7) år (Students t-test P > 0,80), kjønn (Students t-test P > 0,90), eller røkevaner (Students t-test P > 0,75). Ingen individer hadde en historie med tidligere malignitet, immunsvikt, autoimmunforstyrrelser, hepatitt eller HIV-infeksjon. Hvert av individene i kontrollgruppen gjennomgikk en fysisk undersøkelse av en hode- og nakkekirurg, for å sikre at ingen mistenkelige slimhinnelesjoner forelå.

Spvttinnsamlinq og prosessering

Informert samtykke hadde blitt gitt av alle pasienter. Spytt- og serum-behandlings-prosedyrer har blitt godkjent av rette myndighet ved hver institusjon: the University of California, Los Angeles (UCLA), the University og Southern California (USC), og the University of California San Francisco (UCSF).

Spytt fra 32 pasienter med OC eller OP SCCA og 32 ikke-rammede alders- og kjønnsmatchede kontrollindivider ble fremskaffet for en prospektiv sammenligning av cytokin konsentrasjon.

Individene ble påkrevd å avstå fra spising, drikking, røyking eller benyttelse av orale hygieneprodukter i minst én time før spyttinnsamling. Spyttinnsamling ble utført ved å benytte fremgangsmåten til Navazesh og Christensen [7] for en total donering av 5 cc spytt. Spyttprøver ble underkastet sentrifugering ved 3500 rpm (2600xg) i 15 min. ved 4 °C ved hjelp av en Sorvall RT6000D-sentrifuge (DuPont, Wilmington, DE). Væskefasen ble deretter fjernet og RNAse (Superase-In, RNAse-inhibitor, Ambion Inc., Austin, TX) og protease (Aprotinin, Sigma, St. Louis, MO; fenylmetylsulfonylfluorid, Sigma, St. Louis, MO, natriumortovanadat, Sigma, St. Louis, MO) inhibitorer ble deretter tilsatt umiddelbart på is. Betingelsene for separasjonen av de cellulære fasene og væskefasen av spytt ble optimalisert for å sikre at det ikke forekom mekanisk ødeleggelse av cellulære elementer som ville kunne bidra til det mRNAet som ble påvist i væskefasen. Alle prøver ble deretter blandet med DNAse (DNAsel-DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX). Cellepelleten ble beholdt og lagret ved -80°C.

RNA- isolering fra cellefritt spytt

560^1 spyttsupernatant ble deretter prosessert ved å benytte QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) kit. RNA ble ekstrahert ifølge produsentens instruksjoner. Prøver ble lufttørket og resuspendert i vann, behandlet med dietylpyrokarbonat og ble holdt på is for umiddelbar anvendelse eller lagret ved -80 °C. Volumer av RNA ble behandlet med RNAse-fri DNAse (DNAsel-DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX) ifølge produsentens instruksjoner. Konsentrasjoner av RNA ble bestemt spektrofotometrisk og intaktheten ble undersøkt ved hjelp av elektroforese på agarosegeler inneholdende formaldehyd.

Revers transkriptase- polvmerasekiedereaksion

Tilstedeværelse av IL6- og IL8-mRNA-transkriptet i væskefasen i spytt ble testet ved å benytte revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR).

RNA fra hver prøve ble reverstranskribert i 40^1 reaksjonsblanding inneholdende 2,5 U med Moloney murin leukemivirusreverstranskriptase (Applied Biosystems Inc. (ABI, Foster City, CA) og 50 pmol med tilfeldig heksanukleotider (ABI, Foster City, CA) ved 42 °C i 45 min. Basert på de publiserte sekvensene ble oligonukleotidprimere syntetisert kommersielt ved Fisher Scientific (Tustin, CA) for PCR som følger: primerne som hadde sekvensen som er gitt i i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 13 og SEKV. ID nr. 14 for p-aktin, primerne som har sekvensen som er rapportert i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 15 og SEKV. ID nr. 16 for IL8 og primerne som har sekvensen som er gitt i den vedlagte sekvenslisten som SEKV. ID nr. 17 og SEKV. ID nr. 18 for IL6.

Amplifisering av det komplementære DNA (cDNA) ble utført ved å benytte 50 sykluser ved 95°C i 20 sek., 60°C i 30 sek. og 72°C i 30 sek., etterfulgt av en siste forlengningssyklus med 72°C i 7 min. Spesifisitet av PCR-produktene ble verifisert ved hjelp av den beregnede størrelsen og ved hjelp av restriksjonsfordøying. For å etablere spesifisiteten for responsene ble negative kontroller benyttet der tilført RNA ble utelatt eller der RNA ble benyttet, men der revers transkriptase ble utelatt. Som en positiv kontroll ble mRNA ekstrahert fra totalt RNA fra spyttkjertel (Human Salivary Gland Total RNA, Clontech, Palo Alto, CA). For å sikre RNA-kvalitet ble alle preparater underkastet analyse for ekspresjon.

RT-PCR-studiene som ble utført på denne måten viste at spytt og serum inneholdt mRNA som koder for IL6 og IL8. Eksempelmessige resultater som er gitt i figur 3 viser PCR-produkter av størrelsene (95 bp for IL6 og 88 bp for IL8) som var forventet fra de valgte primerne. Produkter av den samme størrelsen ble uttrykt i den positive kontrollen.

For å sikre at RNA og proteinet som ble analysert kun var fra væskefasen fra spytt og for å sikre mangel på kontaminering fra intracellulære komponenter ble sentrifugeringshastigheten for spyttprøvene optimalisert. PCR av husholdningsgenet p-aktin og ubikitin på helspyttprøver og prøver som hadde blitt sentrifugert ved ulike hastigheter ved å benytte DNA som en markør for cellelysis og lekkasje av intracellulære komponenter. Resultatene støtter en optimal sentrifugeringshastighet for spyttprøver på 2600 +, 52 xg, med en foretrukket hastighet på 2600 xg (se eksmpelresultater som er gitt i figur 4).

Eksempel 5: IL6- og IL8-mRNA-isolering, amplifisering og analyse av ekspresjon i serum fra OSCC-pasienter

Pasienter som var rekruttert som rapportert i eksempel 4 ble underkastet analyse av tilstedeværelse av IL6- og IL8-mRNA i blodserum.

Seruminnsamlina oa prosessering

Serum fra 19 pasienter med OC eller OP SCCA og 32 ikke-rammede alders- og kjønnsmatchede kontrollindivider ble fremskaffet for en prospektiv sammenligning av cytokinkonsentrasjon. I individgruppene var det ingen signifikante forskjeller når det gjelder alder, kjønn, alkoholinntak eller røykevaner (P > 0,75).

Blod ble tatt fra kontrollindivider og pasienter før behandling. Serum ble samlet ved sentrifugering av helblod ved 3000 rpm (lOOOxg) i 10 min. ved 15 °C ved hjelp av en Sorvall RT6000D-sentrifuge (DuPont, Wilmington, DE). Serum ble deretter separert og RNAse (Superase-In, RNAse-inhibitor, Ambion Inc., Austin, TX) og protease (Aprotinin, Sigma, St. Louis, MO, fenylmetylsulfonylfluorid, Sigma, St. Louis, MO, natriumortovanadat, Sigma, St. Louis, MO) inhibitorer ble deretter tilsatt umiddelbart på is. Alle prøver ble deretter behandlet med DNAse (DNAsel-DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX). Alikvotene ble lagret ved

-80°C inntil senere anvendelse.

Revers transkriptase- polvmerasekiedereaksion

Tilstedeværelse av IL6- og IL8-mRNA-transkriptet i serum ble testet ved å benytte revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) utført som beskrevet i eksempel 4 ovenfor.

RT-PCR-undersøkelsene som ble utført på denne måten viste at serum inneholdt mRNA som koder for IL6 og IL8, med elektroforesegelmønstre som er sammenlignbare med de som er vist i figur 3.

For å sikre at RNA og protein som ble analysert kun var fra væskefasen fra serum og for å sikre mangel på kontaminering fra intracellulære komponenter ble sentrifugeringshastigheten for serumprøvene optimalisert ved å følge den samme tilnærmingen som er beskrevet i eksempel 4 for spyttprøver. Resultatene støtter en optimal sentrifugeringshastighet for spyttprøver på 1000 +, 20 xg med en foretrukket hastighet på 1000 xg.

Eksempel 6: IL6- og IL8-cytokinnivåanalyse i spytt fra OSCC-pasienter

Ved påvisning av at IL6- og IL8-mRNA-transkripter var tilstede i væskefasen fra spytt undersøkte vi og sammenlignet nivåene av IL6 og IL8 i spytte fra ikke-rammede individer og pasienter med OSCC ved å benytte kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR) og

ELISA.

Spytt fra 32 pasienter med OSCC og 32 alders- og kjønnsmatchede kontrollindivider ble fremskaffet. I individgruppene var det ingen signifikante forskjeller når det gjelder alder, kjønn, alkoholinntak eller røkevaner (P > 0,75).

Sanntids- PCR til kvantifisering av IL6- oa IL8- mRNA- konsentrasioner i spytt fra pasienter oa normale individer

For kvantitativt å analysere resultatet fra RT-PCR ble kvantitativ sanntids-PCR (BioRad iCycler, Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) benyttet. Hver prøve ble testet i triplikat. Amplifiseringsreaksjoner ble utført i en 20^1 blanding ved å benytte iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Etter utgangsdenaturering ved 95 °C i 3 min. ble 50 PCR-sykluser utført ved 6 0°C i 20 sek., deretter 20 sek. ved 72 °C, deretter 20 sek. ved 83 °C, etterfulgt av 1 min. ved 95 °C, og deretter fulgt av en siste forlengning ved 1 min. ved 55 °C. Alikvoter ble tatt fra hver brønn og undersøkt ved hjelp av elektroforese på agarosegeler for å sikre spesifisiteten til produktene.

RT-PCR-resultatene er illustrert ved diagrammet som er vist i figur 5A. Slike resultater viser at IL8 på både mRNA- og proteinnivå ble påvist i høyere konsentrasjoner i spyttet fra pasienter med OSCC sammenlignet med kontrollindivider (t-test, P < 0,01). Det var en signifikant forskjell i mengden av IL8-mRNA-uttrykking mellom spytt fra OSCC-pasienter og sykdomsfrie kontrollindivider. Det gjennomsnittlige kopiantallet var 1,1 x IO<3>for OSCC-gruppen og 2,6 x 10<1>for kontrollgruppen. Forskjellen mellom de to gruppene var svært statistisk signifikant (P < 0,0008).

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i spyttkonsentrasjonene av IL6 på mRNA-nivået. I prøvestørrelsesstudien var ikke oppfinnerne i stand til å påvise forskjeller mellom røkende og ikke-røkende individer.

ELISA for kvantifisering av IL6- og IL8- proteinkonsentrasioner i spytt fra pasienter og normale individer

ELISA-sett for IL6 og IL8 ble benyttet (Pierce Endogen, Rockford, IL) ifølge produsentens protokoll. Hver prøve ble testet i duplikat i hver av de to replikat-eksperimentene. Etter utvikling av den kolorimetriske reaksjonen ble absorbansene 450 nm kvantifisert med et åttekanals spektrofotometer (EL800 Universal Mikroplate Reader, BIO-TEK Instruments Inc., Winooski, VT), og absorbansavlesningene ble konvertert til pg/ml basert på standardkurver fremskaffet med rekombinant cytokin i hver analyse. Hvis absorbansavlesningene gikk utover det lineære området for standardkurvene, ble ELISA-analyser repetert etter seriefortynning av supernatantene. Hver prøve ble testet i minst to ELISA-eksperimenter og dataene ble beregnet fra gjennomsnittet av tester for hver prøve.

ELISA-funnene er illustrert ved diagrammet som er vist i figur 5B. Nivået av IL8 i spytt fra OSCC-pasienter var signifikant høyere (720 pg/dl) enn nivåene i spytt fra kontrollgruppen (250 pg/dl) (P < 0,0001). For å sikre at de forhøyede nivåene av IL8-protein i spytt ikke skyldtes en forhøyning av totale proteinnivåer i spyttet fra OSCC-pasienter sammenlignet vi de totale proteinkonsentrasjonene i spytt fra de to gruppene. Ingen signifikante forskjeller ble funnet (P > 0,05).

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i spyttkonsentrasjonen av IL6 på protein-nivået. I ELISA-analysen ble heller ingen forskjeller påvist innenfor prøvestørrelsesstudien mellom røykende og ikke-røykende individer.

Eksempel 7: IL6- og IL8-cytokinnivåanalyse i serum fra OSCC-pasienter

Vi undersøkte også og sammenlignet nivåene av IL6 og IL8 i serum fra ikke-rammede individer og pasienter med OSCC ved å benytte qRT-PCR og ELISA. Pasientene ble valgt som beskrevet i eksempel 4 og serum ble prosessert som beskrevet i eksempel 5.

Sanntids- PCR for kvantifisering av IL6- og IL8- mRNA- konsentrasioner i serum fra pasienter og normale individer

For å analysere kvantitativt resultatene fra RT-PCR ble kvantitativ sanntids-PCR utført som beskrevet i eksempel 6.

RT-PCR-resultatene er vist i diagrammet som er vist i figur 6A. Slike resultater viser at IL6 på mRNA-nivå ble påvist i høyere konsentrasjoner i serumet fra pasienter med OSCC sammenlignet med kontrollindivider (t-test, P < 0,001). Vi la merke til en signifikant forskjell i mengden av IL6-mRNA-uttrykking mellom serum fra OSCC-pasienter og sykdomsfrie kontroller. Gjennomsnittlig kopiantall var 5,2 x 10<4>for OSCC-gruppen og 3,3 x IO<3>for kontrollgruppen. Forskjellen mellom de to gruppene var svært statistisk signifikant (P < 0,0004).

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i serumkonsentrasjonen av IL8 på mRNA-nivået. Innenfor prøvestørrelsesstudiene var heller ikke oppfinnelsen i stand til å påvise forskjeller mellom røkende individer og ikke-røkende individer.

ELISA for kvantifisering av IL6- og IL8- proteinkonsentrasioner i serum fra pasienter og normale individer

ELISA-tester for kvantifisering av IL6- og IL8-proteinkonsentrasjoner i serum ble utført som beskrevet i eksempel 6.

De relevante ELISA-funnene er illustrert ved diagrammet som er vist i figur 6B. De gjennomsnittlige nivåene av IL6 i serum fra OSCC-pasienter var signifikant høyere (87 pg/dl) enn de som ble funnet i serum for kontrollgruppen (0 pg/dl) (P < 0,0001).

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i serumkonsentrasjonen av IL8 på protein-nivået. I ELISA-analysen ble heller ingen forskjeller påvist innenfor prøvestørrelsesstudiene mellom røkende individer og ikke-røkende individer.

Eksempel 8: ROC og sensitivitets/spesifisitetsanalyse

Statistisk analyse av dataene som var samlet som resultat av eksperimentene som er rapportert i eksemplene 1-7 ovenfor viser spesifisiteten og sensitiviteten fordisse biomarkørene for HNSCC, og deres prediktive verdi.

Statistisk analyse

Fordelingene av pasientdemografi ble beregnet totalt og separat for OSCC-tilfeller og kontroller, og ble sammenlignet mellom de to kurvene med enten Students t-test for kontinuerlige målinger eller to-ganger-to Chi-kvadrattabeller for kategoriske målinger. Fordelingene av IL6- og IL8-nivåer i spytt og serum ble beregnet og sammenlignet mellom OSCC-tilfellene og kontrollene ved å benytte to uavhengige gruppe-t-tester. Forskjeller ble ansett som signifikante for P-verdier som mindre enn 0,01. Pa grunn av områdene for IL6-og IL8-nivåene ble log-transformasjoner av disse målene også benyttet i analysene. Data ble uttrykt som gjennomsnittet +. SD. Alder, kjønn og røkevaner ble kontrollert på gruppenivået i eksperimentutformingen, disse pasientfaktorene ble også justert i analysene når IL6 og IL8 ble sammenlignet ved hjelp av regresjonsmodellering.

Ved å benytte det binære resultatet av sykdommen (OSCC-tilfeller) og ikke-sykdom (kontroller) som avhengige variabler ble logistiske regresjonsmodeller tilpasset for å estimere sannsynligheten for å utvikle OSCC som en funksjon av hver av de potensielle biomarkørene (IL6 eller IL8), ved å kontrollere for pasientalder, kjønn og røkevaner. Ved å benytte de tilpassede, logistiske modellene ble mottakeropererende karakteristika (ROC)-kurveanalyser utført for å evaluere den prediktive styrken til hver av biomarkørene [8, 9, 10]. Via ROC-analysene beregnet vi sensitiviteter og spesifisiteter ved å variere kriteriet for positivitet fra den minste (kutt ved sannsynlighet på 0) til den mest stringente (kutt ved sannsynlighet på 1). Den optimale sensitiviteten og spesifisiteten ble bestemt for hver av biomarkørene og den tilsvarende grenseverdi/terskelverdien for hver av biomarkørene ble identifisert. Biomarkøren som har det største arealet undre ROC-kurven ble identifisert som å ha den sterkeste prediktive styrken for å påvise OSCC.

Kliniske data

Den gjennomsnittlige (SD) alderen for pasientene med OSCC var 49,3 (7,5) år (spenn 42-67 år) mot 48,8 (5,7) år (spenn (40-65 år) i kontrollgruppen, (Students t-test P

> 0,80). I de to individgruppene var det ingen signifikante forskjeller når det gjelder alder (gjennomsnittlig alder): OSCC-pasienter, 49,3 år, normale individer, 48,8 år (Students t-test P > 0,80), kjønn (Students t-test P > 0,90) eller røkevaner (Students t-test P > 0,75).

ROC (mottakeropererende karakteristika)-kurver, plott av sensitiviteter mot 1-spesifisiteter ble generert for hver av de potensielle biomarkørene. Alder, kjønn og røkevaner ble kontrollert som beskrevet ovenfor. Arealene under ROC-kurvene ble beregnet som mål på anvendeligheten av hver biomarkør for å påvise OSCC.

Figur 7A og figur 7B viser ROC-kurvene for IL8 i spytt og IL6 i serum. De beregnede ROC-verdiene (for predikert OSCC) var 0,978 for IL8 i spytt og 0,824 for IL6 i serum. Basert på fordelingen av sensitiviteter og spesifisiteter ble terskelverdier for biomarkører valgt for å påvise OSCC. Basert på våre data, for IL8 i spytt, gir en terskelverdi på 600 pg/dl en

sensitivitet på 86 % og en spesifisitet på 97 %. For IL6 i serum gir tilsvarende en terskelverdi som er større enn 0 pg/dl en sensitivitet på 64 % og en spesifisitet på 81 %.

Kombinasjonen av biomarkører: IL-8 i spytt og IL-6 i serum har større potensial for OSCC-diagnostikk siden ROC-analyse gir en sensitivitet på 99 % og en spesifisitet på 90 % som vist i figur 7C.

Den detaljerte statistikken på arealet under ROC-kurvene, terskelverdiene og de tilsvarende sensitivitetene og spesifisitetene for hver av de potensielle biomarkørene i spytt og i serum er gitt i tabell 3.

Den detaljerte statistikken for arealet under ROC-kurvene, terskelverdiene og de tilsvarende sensitivitetene og spesifisitetene for hver av de potensielle biomarkørene i spytt og i serum er gitt i tabell 3 nedenfor.

Eksempel 9: RNA-isolering, amplifisering og gen-ekspresjonsprofiler fra serum for OSCC-pasienter

Individutvelaelse

Trettito OSCC-pasienter ble rekruttert fra medisinske sentre på University of California, Los Angeles (UCLA) og University of Southern California (USC), Los Angeles, CA. Alle pasienter hadde nylig blitt diagnostisert med primær T1/T2 OSCC og hadde ikke mottatt noen tidligere behandling i form av kjemoterapi, radioterapi, kirurgi eller alternativ behandling. Trettifem normale donorer ble rekruttert som kontroller fra den generelle populasjonen ved School of Dentistry, UCLA. Ingen individer hadde en historie med tidligere malignitet, immunsvikt, autoimmun forstyrrelse, hepatitt eller HIV-infeksjon. Alle individene undertegnet informert samtykkeformularet til the Institutional Review Board for å godta og delta som bloddonorer i denne studien.

Totalt sekstisyv individer ble rekruttert, inkludert 32 OSCC-pasienter og 35 normale individer. I de to individgruppene var det ingen signifikante forskjeller når det gjelder gjennomsnittlig alder (standardavvik, SD): OSCC-pasienter, 49,3 (7,5) år, normale individer 47,8 (6,4) år (Students t-test P = 0,84). Kjønnsfordelingen i OSCC-gruppen var 10:22 (antall kvinner/antall menn) og i kontrollgruppen varden 14:21 (Chi-kvadrattest P« 1). Vi matchet røkevanene til disse to gruppene ved å bestemme det følgende. Alle individer ble spurt: (1) Hvor mange år har de røkt? (2) Hvor mange pakker pr. dag har de røkt? (3) Hvor mange år har gått siden de har sluttet å røke (hvis de faktisk har sluttet)? (4) Røkte de kun sigaretter eller røkte de også sigarer, pipe, tyggetobakk eller marihuana? Deretter optimaliserte vi matchen mellom pasienter og kontroller på grunnlag av det ovenstående: (1) tilsvarende pakker/år historie (2) tilsvarende tid siden de hadde sluttet å røke (3) kun anvendelse av sigaretter. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de to gruppene når det gjaldt røkevaner (Students t-test P = 0,77).

Blodsamlinq og prosessering

Blodbehandlingsprosedyre ble godkjent av the institutional review board ved UCLA og USC. Blod ble tatt fra kontrollindivider og pasienter før behandling. Fullblodet gjennomgikk deretter en sentrifugering ved 1000 xg i 10 min. ved 15°C ved hjelp av en Sorvall RT6000D-sentrifuge (DuPont, Wilmington, DE). Serum ble deretter separert og 100 U/ml RNase-inhibitor (Superase-In, Ambion Inc., Austin, TX) ble straks tilsatt til serumet. Alikvotene ble lagret ved -80°C inntil anvendelse.

RNA- isolering fra serum

RNA ble isolert fra 560^1 serum ved å benytte QIAmp Viral RNA kit (Qiagen, Valencia, CA). Volumer av isolert RNA ble behandlet med RNase-fri DNase (DNasel-DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX) ifølge produsentens instruksjoner. Kvaliteten til isolert RNA blir undersøkt ved hjelp av RT-PCR ved fire husholdningsgentranskripter p-aktin (ACTB), p-2-mikroglobulin (B2M), glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH), og ribisomprotein-S9 (RPS9). Basert på de publiserte sekvensene ble oligonukleotidprimere designet og deretter syntetisert (Sigma Genosis, Woodlands, TX) for PCR. RT-PCR ble utført for å amplifisere mRNA'enes kodende region fenotypet i 3 segmenter ved å benytte en vanlig oppstrømsprimer og tre ulike nedstrømsprimere valgt fra de fire husholdningsgen-transkriptene for RT-PCR vist i tabell 4.

Spesielt ble fire humane serum mRNA valgt og kodende region ble fenotypet i 3 segmenter ved å benytte en vanlig oppstrømsprimer og tre ulike nedstrømsprimere som delte den kodende regionen tilnærmet i 3 deler. 10^1 av hver PCR-reaksjon ble elektroforesekjørt på en 2 % agarosegel og farget med EtBr.

Spesifisitet for alle PCR-produktene ble verifisert ved hjelp av den beregnede størrelsen og sammenlignet med den positive kontrollen (Human Salivary Gland Total RNA, Clontech, Palo Alto, CA). Negative kontroller ble benyttet der tilført DNA ble utelatt eller der RNA ble benyttet men revers transkriptase ble utelatt.

Serumfenotypen til mRNA-produkt fra menneske ble evaluert ved hjelp av RT-PCR og elektroforese. Eksempelmessige resultater som er gitt i figur 8 viser at transkriptet fra fire husholdningsgener (ACTB, B2M, GAPDH og RPS9) kunne bli påvist. Spesielt ble amplicons for RPS9 med størrelse på 188, 426 og 614 bp påvist (se figur 8 spor 2, 3 og 4), amplicon for GAPDH med størrelser på 140755 og 1184 bp ble påvist (se figur 8 spor 5, 6 og 7), amplicon for B2M med størrelser på 216591 og 848 bp ble påvist (se figur 8 spor 8, 9 og 10) og amplicon for ACTB med størrelser på 195705 og 1000 bp ble påvist (se figur 8 spor 11, 12 og 13). Kontroller ble utført selv om kontrolldata ikke er vist i figuren.

Det lengste PCR-produktet vi amplifiserte dekket 56,8 % (ACTB), 85,9 % (B2M), 93,4 % (GAPDH) og 88,9 % (RPS9) av fullengden av det tilsvarende mRNA, ifølge NCBI-GenBank-databasen. Dette resultatet tyder også på at det kan være intakt humant mRNA sirkulerende i blod i en cellefri form.

Eksempel 10: Mikroarrayprofiler av mRNA fra serum fra OSCC-pasienter

Serum fra ti OSCC-pasienter (8 menn, 2 kvinner, alder = 51 +. 9,0) og fra ti kjønns-og aldersmatchede normale donorer (alder = 49 +. 5,6) ble samlet og prosessert som gitt i eksempel 9 til anvendelse i mikroarrayanalyse.

M i kroa rra va n a lyse

Isolert RNA fra serum ble underkastet lineær amplifisering ved hjelp av RiboAmp™ RNA Amplification kit (Arcturus, Mountain View, CA). Ved å benytte tidligere rapporterte protokoller [55] ble Affymetrix Human Genome U133A Array, som inneholder 22215 humane gen-cDNA-probesett som representerer ca. 19000 gener (dvs. at hvert gen kan være representert av mer enn ett probesett), benyttet til å lage genekspresjonsprofiler.

Rådataene ble importert til DNA-Chip Analyzer 1.3 (dChip)-programvare for normalisering og modellbasert analyse [60]. dChip gir ekspresjonsindeksen som representerer mengden av mRNA/genekspresjon og en annen parameter, kalt den tilstedeværende verdi, om hvorvidt mRNA-transkriptet faktisk var til stede i prøven eller ikke (14). S-pluss 6.0 (Insightful, Seattle, WA) ble benyttet til alle statistiske tester.

Tre kriterier ble benyttet for å bestemme differensielt uttrykte gener mellom OSCC og kontroller. Først ble gener som ble tilordnet som "fraværende" ekskludert i alle prøver. For det andre ble en tohalet Students t-test benyttet til sammenligning av gjennomsnittlig genekspresjonsnivåer blant OSCC (n=10) og kontroller (n=10). Det kritiske alfa-nivået på 0,05 ble definert for statistisk signifikans. For det tredje ble forholdstall beregnet for de genene som viste statistisk signifikant forskjell (P < 0,05). Kun de genene som oppviste minst to ganger endring vil bli inkludert for ytterligere analyse.

HG U133A-mikroarrays ble benyttet for å identifisere forskjellen i spytt-RNA-profiler mellom kreftpasienter og matchede normale individer. Blant de 14268 genene som ble inkludert ved de tidligere beskrevne kriteriene identifiserte vi 335 gener med P-verdi på mindre enn 0,05 og et forholdstallsendring >. 2. Blant disse genene er det 223 oppregulerte gener og 112 nedregulerte gener i OSCC-gruppen. Ifølge Affymetrix indikerer et gen som ble tilordnet tilstedeværende at dette genet er på et pålitelig vis påvist i originalprøven. Antallet gener som ble tilordnet tilstedeværende og tilstedeværende prosentandel på hver array er vist i tabell 5 som viser den humane mRNA-ekspresjonsprofilen i serum.

(a) Antallet prober som viser tilstedeværelse på HG U133A-mikroarray (påvisning P < 0,04). (b) Tilstedeværende prosentandel (P%) = antallet prober tilordnet tilstedeværelse delt på antall totale prober (22283 for HG U133A-mikroarray).

<*>Arrays for OSCC har signifikant flere prober tilordnet tilstedeværende enn de for kontrollgruppen (P <. 0,002, Wilcoxon-test).

Gjennomsnittlig er det 2623 +, 868 prober i OSCC-arrays og 1792 +. 165 prober i kontrollarrays som ble tilordnet tilstedeværelse. OSCC-gruppen har signifikant flere tilstedeværende prober enn kontrollgruppen (P <. 0,002, Wilcoxon-test).

Ved å benytte det mer stringente kriteriet av at for et visst gen så ble tilstedeværelsen tilordnet gjennomgående til alle arrays ved alle kreftformer (n = 10) eller alle kontroller (n=10), så identifiserte vi 62 gener i å være kandidatene for ytterligere analyser. Vi merket at disse 62 genene alle er oppregulert i OSCC-serum, mens det ikke er noen gener funnet nedregulert ved å benytte de samme filtreringskriteriene.

Eksempel 11: Q-PCR-validering og kvantiteringsanalyse av mikroarray profiler fra cellefritt spytt fra OSCC-pasienter

qPCR ble utført for å kvantifisere en undergruppe av differensielt uttrykte transkripter i spytt og for å validere mikroarray-funnene i eksempel 10 på en forstørret prøvestørrelse som inkluderer spytt fra 32 OSCC-pasienter og 35 kontroller.

Kvantitativ PCR ( qPCR)- analvse

Primersett ble designet ved å benytte PRIMER3-programvare (tabell 2). Ved å benytte MuLV-reverstranskriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA) og tilfeldige heksamerer som primer (ABI, Foster City, CA), så ble cDNA syntetisert fra det opprinnelige og ikke-amplifiserte serum-RNA. qPCR-reaksjonene ble utført i et iCycler™ iQ-real-time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved å benytte iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Alle reaksjoner ble utført i triplikat med tilpassede betingelser for spesifikke produkter. Den relative mengden av cDNA/RNA av et spesielt templat ble ekstrapolert fra standard kurven ved hjelp av LightCycler-programvare 3.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En tohalet Students t-test ble benyttet til statistisk analyse.

Ti signifikante oppregulerte gener: H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4, ARCR, THSMB (tymosin beta 10), PRKCB1 (proteinkinase C, beta 1), FTI1 (ferritinlettpolypeptid), COX4I1 (cytokrom-c-oksidasesubenhet-IV-isoform-1) og SERP1 (stressassosiert endoplasmatisk retikulumprotein-1, ribosomassosiert membranprotein-4) ble valgt basert på deres kreftassosiering som vist i tabell 6, som rapporterer ti gener valgt til qPCR-validering.

Tabell 6 gir deres kvantitative endringer i serum fra OSCC-pasienter, bestemt ved qPCR. Resultatene bekreftet at transkripter for H3F3A, TPT1, FTHl, NCOA4 og ARCR var signifikant forhøyet i spytt fra OSCC-pasienter (Wilcoxon Signed Rank-test, P < 0,05). Vi påviste ikke de statistisk signifikante forskjellene i mengden av de andre fem transkriptene ved hjelp av qPCR.

Eksempel 12: ROC- og sensitivitets/spesifisitetsanalyse

Statistisk analyse av de innsamlede dataene som var resultater fra eksperimentene rapportert i eksemplene 9-11 ovenfor demonstrerer spesifisiteten og sensitiviteten til disse biomarkørene for HNSCC, og deres prediktive verdi.

Receiver Operating Characteristic kurveanalyse oa prediksjonsmodeller

Ved å benytte qPCR-resultatene ble multivariatklassifiseringsmodeller konstruert for å bestemme den beste kombinasjonen av de valgte serumtranskriptene for kreftprediksjon. Ved å benytte det binære resultatet fra sykdommen (OSCC) og ikke-sykdom (normal) som avhengige variabler ble først en logistisk regresjonsmodell konstruert [61]. Alder, kjønn og røkevaner er kontrollert i datainnsamlingsprosedyren.

Utelat-én kryssvalidering ble benyttet for å validere den logistiske regresjons-modellen. Kryssvalideringsstrategien fjerner først én observasjon og tilpasser deretter en logistisk regresjonsmodell fra de gjenværende tilfellene ved å benytte alle markører. Trinnvis modellseleksjon blir benyttet for hver av disse modellene for å fjerne variabler som ikke forbedrer modellen. Deretter ble observasjonsverdiene for tilfellet som ble utelatt benyttet for å beregne en predikert klasse for den observasjonen. Kryssvalideringsfeilraten er dermed antallet prøver predikert ukorrekt dividert på antallet prøver.

Receiver operating characteristic (ROC)-kurveanalysen ble deretter beregnet for den beste endelige logistiske modellen (S-pluss 6.0), ved hjelp av de tilpassede sannsynlighetene fra modellen som mulige grenseverdier for beregning av sensitivitet og spesifisitet. Arealet under kurven ble beregnet via nummerisk integrasjon av ROC-kurven.

For å demonstrere nytten av sirkulerende mRNA i serum for OSCC-diskriminering ble to klassifiserings/prediksjonsmodeller observert. Ved å benytte qPCR-dataene ble en logistisk regresjonsmodell bygd sammensatt av seks serumtranskripter som tidligere var undersøkt, ARHA, FTHl, H3F3A, TPT1, COX4I1 og FTLl. Disse seks transkriptene i kombinasjon tilveiebrakte den beste prediksjonen, som deretter ble validert ved hjelp av utelat-én-valideringen. Av 67 utelat-én-forsøk ble 54 (81 %) av de beste logistiske modellene funnet til den samme modellen som den fra de hele data og valideringsfeilraten var 31,3 % (21/67).

Resultater er rapportert i figur 9 der ROC-kurven som er beregnet for denne logistiske regresjonsmodellen er vist.

Ved å benytte en grenseverdi-sannsynlighet på 44 % ble en sensitivitet på 84 % og en spesifisitet på 83 % oppnådd. Den endelige modellen predikerer korrekt for 56 (83,5 %) individer av 67 med 0,84 (27/32) sensitivitet og 0,83 (29/35) spesifisitet og den feil-klassifiserer 6 individer som kontroll og 5 som OSCC. Det beregnede arealet under ROC-kurven var 0,88 for denne logistiske regresjonsmodellen.

Tre- basert klassifiserinqsmodell, klassifisering og regresjonstre ( CART)

For det andre ble en annen prediksjonsmodell som benytter qPCR-resultatene bygd ved hjelp av en tre-basert klassifiseringsmetode. Klassifiserings- og regresjonstrærne (CART), ble konstruert ved hjelp av S-pluss 6.0 ved å benytte serumtranskriptene som predikatorer fra qPCR-resultat. CART passer til klassifiseringsmodellen ved binær rekursiv partisjonering, der hvert trinn involverer å søke etter predikatorvariabelen som fører til den beste splitten mellom kreft versus de normale gruppene [62]. CART benyttet entropi-funksjonen med splittende kriterier fastsatt ved standardinnstillingene for S-pluss. Ved denne tilnærmingen ble tilgangsgruppen inneholdende alle prøvene (n=67) deretter delt i kreftgrupper og normale grupper. Vårt innledende tre ble beskåret for å fjerne alle splitter som ikke førte til undergrener med forskjellige klassifiseringer.

En annen modell, "klassifiserings- og regresjonstremodellen (CART)", ble generert ifølge diagrammet som er gitt i figur 10.

Vår tilpassede CART-modell benyttet serum-mRNA-konsentrasjonene fra THSMB og FTHl som predikatorvariabel for OSCC. THSMB, valgt som den innledende splitten, med en terskelverdi på 4,59E-17 M, ga to undergrupper fra tilgangsgruppen inneholdende alle 67 prøver. 47 prøver med THSMB-konsentrasjonen mindre enn 4,59E-17 M ble tilordnet i "Normal-1", mens 20 med THSMB-konsentrasjon >_ 4,59E-17 M ble tilordnet i "Kreft-1". "Normal-l"-gruppen ble ytterligere delt ved FTHl med en terskelverdi på 8,44E-16 M. De resulterende undergruppene, "Normal-2" inneholdt 28 prøver med FTHl-konsentrasjon

< 8,44E-16 M, og "Kreft-2" inneholdt 19 prøver med FTHl-konsentrasjon >.8,44E-16 M. Dermed ble de 67 serumprøvene involvert i vår undersøkelse klassifisert i "Normal-gruppen" og "Kreft-gruppen" ved hjelp av CART-analyse.

"Normal-gruppen" var sammensatt av prøvene fra "Normal-2" som inkluderte totalt 28 prøver, 25 fra normale individer og 3 fra kreftpasienter. Ved å benytte kombinasjonen av THSMB og FTHl til OSCC-prediksjon er slik den totale spesifisiteten 78 % (25/35). "Kreft-gruppen" var sammensatt av prøvene fra "Kreft-1" og "Kreft-2". Det er totalt 39 prøver tilordnet i den endelige "Kreft-gruppen", 29 fra kreftpasienter og 10 fra normale individer. Ved å benytte kombinasjonen av disse to serum-mRNA for OSCC-prediksjon er derfor den totale sensitiviteten 91 % (29/32 i kreftgruppen) og spesifisiteten er 78 % (25/35 i normalgruppen).

Eksempel 13: RNA-isolering, amplifisering og genekspresjonsprofiler fra spytt fra OSCC-pasienter

Pasientutvelqelse

OSCC-pasienter ble rekruttert fra Medical Centers at University of California, Los Angeles (UCLA), University of Southern California (USC), Los Angeles, CA, og University of California, San Francisco, San Francisco, CA. 32 pasienter med dokumentert primær Tl- eller T2-OSCC ble inkludert. Alle pasientene hadde nylig fått diagnostisert primær sykdom og hadde ikke mottatt noen tidligere behandling i form av kjemoterapi, radioterapi, kirurgi eller alternativ behandling.

Et likt antall alders- og kjønnsmatchede individer med sammenlignbare røkevaner ble valgt som en kontrollgruppe. Blant de to individgruppene var det ingen signifikante forskjeller når det gjelder gjennomsnittlig alder: OSCC-pasienter, 49,8 +. 7,6 år, normale individer 49,1 + 5,9 år (Students t-test, P > 0,80), kjønn (P > 0,90) eller røkevaner (P > 0,75). Ingen individer hadde en historie med tidligere malignitet, immunsvikt, autoimmunforstyrrelser, hepatitt eller HIV-infeksjon. Alle individene undertegnet institusjonsnemdens samtykkelsesformular om at de gikk med på å fungere som spyttdonorer for forsøkene.

Spyttinnsamling oa RNA- isolerina

Ikke-stimulerte spyttprøver ble innsamlet mellom 9 om morgenen og 10 om morgenen ved hjelp av tidligere etablerte protokoller [38]. Individer ble spurt om å avstå fra spising, drikking, røking eller munnhygieneprosedyrer i minst 1 time før innsamlingen. Spyttprøver ble sentrifugert ved 2600 xg i 15 min. ved 4°C.

Supernatanten ble fjernet fra pelleten og behandlet med RNase-inhibitor (Superase-In, Ambion Inc., Austin, TX). RNA ble isolert fra 560^1 spyttsupernatant med QIAamp Viral RNA kit (Qiagen, Valencia, CA). Alikvoter med isolert RNA ble behandlet med RNase-fri DNase (DNasel-DNA-free, Ambion Inc.) ifølge produsentens instruksjoner. Kvaliteten av isolert RNA ble undersøkt ved RT-PCR for tre cellulære husholdningsgentranskripter: glyser-aldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH), aktin-p (ACTB) og ribosomprotein S9 (RPS9). Kun de prøvene som oppviste PCR-produkter for alle tre mRNA ble benyttet i den påfølgende analysen.

Gjennomsnittlig ble 54,2 +. 20,1 ng (n = 64) med totalt RNA fremskaffet fra 560^1 spyttsupernatant. Det var ingen signifikante forskjeller i total RNA-mengde mellom OSCC og matchede kontroller (t-test, P = 0,29, n = 64). RT-PCR-resultater viste at alle spyttprøvene (n = 64) inneholdt transkriptet fra tre gener (GAPDH, ACTB og RPS9), som ble benyttet som kvalitetskontroller for humane spytt-RNA [55]. En overensstemmende amplifiserende størrelse (658±47,2, n = 5) kunne bli oppnådd etter to runder med RNA-amplifisering. Gjennomsnittlig var utbyttet av biotinylert cRNA 39,3 +. 6,0^g (n = 20). Det var ingen signifikante forskjeller i cRNA-mengden mellom OSCC og kontrollene (t-test, P = 0,31, n = 20).

Eksempel 14: Mikroarray profiler av mRNA fra spytt fra OSCC-pasienter

Spytt fra 10 OSCC-pasienter (7 menn, 3 kvinner, alder 52 + 9,0 år) og fra 10 kjønns- og aldersmatchede normale donorer (alder 49 +. 5,6 år) ble benyttet i en mikroarray studie. Isolert RNA fra spytt ble underkastet lineær amplifisering ved hjelp av RiboAmp RNA Amplification kit (Arcturus, Mountain View, CA). RNA-amplifiseringseffektiviteten ble målt ved å benytte kontroll-RNA av kjent mengde (0,1^g) kjørt i parallell med de 20 prøvene i fem uavhengige kjøringer.

M i kroa rra va n a I vse

Ved å følge tidligere rapporterte protokoller [55] ble the Human Genome U133A Array (HG U133A, Affymetrix, Santa Clara, CA) benyttet til gen ekspresjonsanalyse. Arrays ble skannet og fluorescensintensiteten ble målt ved hjelp av Mikroarray Suite 5,00 programvare (Affymetrix, Santa Clara, CA), arrayene ble deretter importert inn i DNA-Chip Analyzer programvare (http:www.dchp.org) for normalisering og modellbasert analyse [60]. S-pluss 6.0 (Insightful, Seattle, WA) ble benyttet til å utføre alle statistiske tester.

Tre kriterier ble benyttet for å bestemme differensielt uttrykte gentranskripter. Først ble probesett på arrayet som var betegnet som "fraværende" i alle prøver ekskludert. For det andre ble en tohalet Students t-test benyttet til sammenligning av gjennomsnittlig gen ekspresjonssignalintensitet mellom OSCC (n = 10) og kontroller (n = 10). Det kritiske nivået på 0,05 ble definert for statistisk signifikans. For det tredje ble forholdstall beregnet for de gentranskriptene som viste statistisk signifikant forskjell (P < 0,05). Kun de gentranskriptene som oppviste minst to ganger endring ble inkludert for ytterligere analyse.

HG U133A-mikroarrays ble benyttet for å identifisere forskjellen i spytt-RNA-profiler mellom kreftpasienter og matchede normale individer.

Blant de 10316 transkriptene som var blitt inkludert i kraft av de tidligere beskrevne kriteriene identifiserte vi 1679 transkripter med P-verdi på mindre enn 0,05. Blant disse transkriptene var 836 oppregulert og 843 var nedregulert i OSCC-gruppen. Disse transkriptene som ble observert var usannsynlig å være knyttet alene til tilfeldighet (2 test, P < 0,0001), tatt i betraktning de falske positive med P < 0,05. Ved å benytte forhånds bestemte kriterier for en endring i regulering >3-fold i alle 10 OSCC-spyttprøver og en grenseverdi på P-verdi < 0,01 ble 17 mRNA identifisert som viste signifikant oppregulering i OSCC-spytt. 17 transkripter viste en endring i regulering >3-fold i alle 10 OSCC-spyttprøver og en mer stringent grenseverdi på P-verdi < 0,01. Det bør bli bemerket at disse 17 spytt-mRNA alle er oppregulert i OSCC-spytt, mens det ikke er funnet noen mRNA nedregulert med de samme filtreringskriteriene. De biologiske funksjonene til disse genene og deres produkter er presentert i tabell 7 som viser spytt-mRNA oppregulert (>3-fold, P < 0,01) i OSCC identifisert ved hjelp av mikroarray.

Humant genom U133A-mikroarrayene ble benyttet for å identifisere forskjellen i RNA-uttrykkingsmønster i spytt fra 10 kreftpasienter og 10 matchede, normale individer. Ved å benytte et kriterium på en endring i regulering >3-fold i alle 10 OSCC-spyttprøver og en grenseverdi med P-verdi < 0,01 identifiserte vi 17 mRNA som viste signifikant oppregulering i OSCC-spytt.

Eksempel 15: Q-PCR-validering og kvantiteringsanalyse av mikroarray profiler fra cellefritt spytt fra OSCC-pasienter

Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) ble utført for å validere en undergruppe av forskjellig uttrykte transkripter identifisert ved hjelp av mi kroa rraya na lysen i eksempel 14.

Kvantitativ polvmerasekiedereaksionsvaliderina

cDNA fra det opprinnelige og ikke-amplifiserte spytt-RNA ble syntetisert ved å benytte MuLV-reverstranskriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA) og tilfeldige heksamerer som primer (Applied Biosystems). qPCR-reaksjoner ble utført i et iCycler PCR-system med iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Primersett ble designet ved å benytte PRIMER3-programvare ( http:// www. aenome. wi. mit. edu).

Alle reaksjoner ble utført i triplikat med tilpassede betingelser for spesifikke produkter. Utgangsmengden av cDNA/RNA av et spesielt templat ble ekstrapolert fra standardkurven som beskrevet tidligere [32]. Denne valideringen ble fullført ved å teste alle prøvene (n = 64) inkludert de 20 som tidigere ble benyttet i mikroarray studien. Wilcoxon-Signed-Rank-test ble benyttet til statistisk analyse.

Kvantitativ PCR ble utført for å validere mikroarray funnene på en forstørret prøvestørrelse som inkluderte spytt fra 32 OSCC-pasienter og 32 matchede kontroller. Ni kandidater for spytt-mRNA-biomarkører: DUSP1, GADD45B, H3F3A, IL1B, IL8, OAZ1, RGS2, S100P og SAT ble valgt basert på deres rapporterte kreftassosiering raportert i tabell 7. Tabell 8 gir kvantitative endringer av de ni kandidatene ovenfor i spytt fra OSCC-pasienter, bestemt ved hjelp av qPCR.

Resultatene bekreftet at transkripter av 7 av de 9 kandidat-mRNA (78 %), DUSP1, H3F3A, IL1B, IL8, OAZ1, S100P og SAT var signifikant forhøyede i spyttet til OSCC-pasienter

(Wilcoxon Signed-Rank-test, P < 0,05). Vi påviste ikke de statistisk signifikante forskjellene i mengden av RGS2 (P = 0,149) og GADD45B (P = 0,116) ved hjelp av qPCR. De validerte syv genene kunne bli klassifisert i tre grupper ved størrelsen på økning: høyt oppregulert mRNA inkludert IL8 (24,3-fold), moderat oppregulert mRNA inkludert H3F3A (5,61-fold), IL1B (5,48-fold) og S100P (4,88-fold) og lavt oppregulert mRNA inkludert DUSP1 (2,60-fold), OAZ1 (2,82-fold) og SAT (2,98-fold).

Eksempel 16: ROC- og sensitivitets/spesifisitetsanalyser

Ved å benytte qPCR-resultatene ble Receiver operating characteristic (ROC)-kurve-analyser utført [82] ved hjelp av S-pluss 6.0 for å evaluere den prediktive styrken til hver av biomarkørene som ble identifisert i eksempel 15.

Receiver operating characteristic kurveanalvse og prediksjonsmodeller

Det optimale grenseverdier ble bestemt for hver biomarkør ved å søke etter de som ga den maksimale korresponderende sensitiviteten og spesifisiteten. ROC-kurver ble deretter plottet på basis av settet av optimale sensitivitets- og spesifisitetsverdier. Arealet under kurven ble beregnet via nummerisk integrasjon av ROC-kurvene. Biomarkøren som hadde det største arealet under ROC-kurven ble identifisert som å ha den sterkeste prediktive styrken for å påvise OSCC.

Deretter ble multivariant klassifiseringsmodeller konstruert for å bestemme den beste kombinasjonen av spyttmarkører for kreftprediksjon. Ved å benytte det binære resultatet av sykdom (OSCC) og ikke-sykdom (normal) som avhengige variabler konstruerte vi først en logistisk regresjonsmodell som kontrollerer for pasientalder, kjønn og røkevaner. Trinnvis bakover regresjon [61] ble benyttet for å finne den beste endelige modellen.

Utelatt-én kryssvalidering ble benyttet for å validere den logistiske regresjons-modellen. Kryssvalideringsstrategien fjerner først en observasjon og tilpasser deretter en logistisk regresjonsmodell fra de gjenværende tilfellene med alle markørene. Trinnvis modellseleksjon ble benyttet for hver av disse modellene for å fjerne variabler som ikke forbedrer modellen. Deretter ble markørverdiene benyttet i det tilfellet som ble utelatt for å beregne en predikert klasse for denne observasjonen. Kryssvalideringsfeilraten er dermed antallet prøver som er predikert ukorrekt dividert på antallet av prøver.

ROC-kurven, som er illustrert i figur 11, ble deretter beregnet for den logistiske modellen ved en tilsvarende prosedyre, med de tilpassede sannsynlighetene fra modellen som muliggjør grenseverdier for beregning av sensitivitet og spesifisitet.

Den detaljerte statistikken for arealet under Receiver operating characteristic (ROC)-kurver, terskelverdiene og de tilsvarende sensitivitetene og spesifisitetene for hver av de syv potensielle spytt-mRNA-biomarkørene for OSCC er gitt i tabell 9 som viser ROC-kurveanalyse av OSCC-assosierte spytt-mRNA-biomarkører.

Ved å benytte qPCR-resultatene utførte vi en ROC-kurveanalyse for å evaluere den prediktive styrken til hver av biomarkørene. Den optimale grenseverdien ble bestemt for å gi den maksimale tilsvarende sensitiviteten og spesifisiteten. Biomarkøren som har det største arealet under ROC-kurven ble identifisert som å ha den sterkeste prediktive styrken for å påvise OSCC.

Dataene viste at IL8-mRNA virket best blant de syv potensielle biomarkørene for å predikere tilstedeværelsen av OSCC. Det beregnede arealet under ROC-kurven for IL8 var 0,85. Med en terskelverdi på 3,19E-18 mol/l gir IL8-mRNA i spytt en sensitivitet på 88 % og en spesifisitet på 81 % for å skille OSCC fra det normale.

For å påvise anvendbarheten av spytt-mRNA for å skille mellom sykdom ble to klassifiserings/prediksjonsmodeller undersøkt. En logistisk regresjonsmodell ble bygget basert på fire av de syv validerte biomarkørene, IL1B, OAZ1, SAT og IL8, som i kombinasjon tilveiebrakte den beste prediksjonen (tabell 10). Tabell 10 viser spyttbiomarkører for OSCC valgt ved hjelp av logistisk regresjonsmodell.

Den logistiske regresjonsmodellen ble bygget basert på fire av de syv validerte biomarkørene (IL1B, OAZ1, SAT og IL8) som, i kombinasjon, tilveiebrakte den beste prediksjonen. Koeffisientverdiene er positive for disse fire markørene, noe som indikerer at den synkroniserte økningen i deres konsentrasjoner i spytt økte sannsynligheten for at prøven var fremskaffet fra et OSCC-individ.

Koeffisientverdiene er positive for disse fire markørene, noe som indikerer at den synkroniserte økningen i deres konsentrasjon i spytt økte sannsynligheten for at prøven var fremskaffet fra et OSCC-individ. Utelat-én-kryssvalideringsfeilraten basert på logistiske regresjonsmodeller var 19 % (12 av 64). Alle bortsett fra én (av de 64) av modellene som er generert i utelat-én-analysen benyttet det samme settet av fire markører funnet å være signifikante i fu I Idata modellen som er spesifisert i tabell 10.

ROC-kurven ble beregnet for den logistiske regresjonsmodellen. Ved å benytte en grenseverdi-sannsynlighet på 50 % oppnådde vi en sensitivitet på 91 % og en spesifisitet på 91 %. Det beregnede arealet under ROC-kurven var 0,95 for den logistiske regresjons-modellen (fig. 11).

Trebasert klassifiserinqsmodell, klassifiserings- og regresjonstre ( CART)

En annen modell, en trebasert klassifiseringsmodell, klassifiserings- og regresjonstre (CART)-modell, ble generert. CART-modellen som ble konstruert med S-pluss 6.0 med de validerte mRNA-biomarkørene som predikatorer. CART passer til klassifiseringsmodellen ved binær rekursiv partisjonering, der hvert trinn involverer å søke for predikatorvariabelen som fører til den beste splitten av kreften i forhold til normalgruppene [62]. CART benyttet entropi-funksjonen med splittende kriterier fastsatt ved standardinnstillingene for S-pluss Ved denne tilnærmingen ble tilgangsgruppen som inneholder alle prøvene (n = 64) deretter delt i kreftgrupper og normale grupper. Vårt innledende tre ble beskåret for å fjerne alle splitter som ikke førte til undergrener med forskjellige klassifiseringer

Resultater er vist i diagrammet i figur 12. Vår tilpassede CART-modell benyttet spytt-mRNA-konsentrasjonene for IL8, H3F3A og SAT som predikatorvariabler for OSCC. IL8, som ble valgt som den innledende splitten, med en terskelverdi på 3,14E_18 mol/l, ga to undergrupper fra tilgangsgruppen inneholdende alle 64 prøvene. 30 prøver med IL8-konsentrasjonen <3,14E-18 mol/l ble tilordnet i "Normal-1" mens 34 med IL8-konsentrasjon <3,14E-18 ble tilordnet i "Kreft-1". "Normal-l-gruppen" ble ytterligere delt ved hjelp av SAT med en terskelverdi på 1,13E-14 mol/l.

De resulterende undergruppene, "Normal-2" inneholdt 25 prøver med SAT-konsentrasjon <1,13E-14 mol/l og "Kreft-2" inneholdt 5 prøver med SAT-konsentrasjon >. 1,13E-14 mol/l. Tilsvarende ble "Kreft-l-gruppen" ytterligere delt med H3F3A med en terskelverdi på 2,07E-16 mol/l. De resulterende undergruppene, "Kreft-3" inneholdt 27 prøver med H3F3A-konsentrasjon >. 2,07E-16 mol/l og "Normal-3-gruppen" inneholdt 7 prøver med H3F3A-konsentrasjon < 2,07E-16 mol/l.

Dermed ble de 64 spyttprøvene som var involvert i vår studie klassifisert i "kreftgruppen" og i "normalgruppen" ved hjelp av CART-analyse. "Normalgruppen" var sammensatt av prøver fra "Normal-2" og de fra "Normal-3". Det er totalt 32 prøver tilordnet til "Normalgruppen", 29 fra normale individer og 3 fra kreftpasienter.

Ved å benytte kombinasjonen av IL8, SAT og H3F3A for OSCC-prediksjon så er den totale sensitiviteten 90,6 % (29 av 32). "Kreftgruppen" var sammensatt av prøvene fra "Kreft-2" og "Kreft-3". Det er totalt 32 prøver tilordnet til den endelige "Kreftgruppen", 29 fra kreftpasienter og 3 fra normale individer. Ved å benytte kombinasjonen av disse tre spytt-mRNA-biomarkørene for OSCC-prediksjon er derfor den totale spesifisiteten 90,6 %

(29 av 32).

Oppsummert refererer foreliggende beskrivelse til en fremgangsmåte for å påvise en biomarkør i spytt der biomarkøren er et ekstracellulært mRNA, som omfatter å påvise det ekstracellulære mRNA i det cellefrie spyttet, transkriptomanalyse av spytt omfatter å påvise et transkriptommønster i det cellefrie spyttet, en fremgangsmåte for å påvise genetiske endringer i et organ eller i et gen i organet ved å analysere spytt, omfatter å påvise et transkriptommønster og/eller mRNA-profiler av genet i cellefritt spytt, en fremgangsmåte for å diagnostisere en oral eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse hos et individ, som omfatter å: påvise en profil for en biomarkør som er assosiert med patologien, sykdommen eller forstyrrelsen, spesielt mRNA og/eller protein, i cellefritt spytt og/eller serum, sett som omfatter identifikator for minst én biomarkør for å utføre minst én av fremgangsmåtene og anvendelse av spyttbiomarkører og/eller serum-mRNA'er som biomarkører for oral og/eller systemisk patologi, sykdom eller forstyrrelse.

REFERANSER

[1] Parkin M, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer. 1999, 80:827-841.

[2] Goepfert H. squamous cell carrinoma of the head and necte past progress and futurepromise. CA Cancer J CM. 1998;48:195-198.

13] SEdransky D. Emerging moteaiar markers of cancer. Nat Raviews. 2002; 3:210-219.

[4] Alevizos I, Mahadevappa M, Zhang Xtet al. Oral cancer in wvo gene expression profidng assisted by laser-capture miatxSssection and rniicroarray analysis. Oncogene. 2001; 20:6196-6204.

[5] Chen Z, Malhotra PS, Thomas GR, et ai Expression of proinflammatory and; proangiogenic cytokines bi patierrts wfm head and; nede cancer. CUn Cancer Res. 1999;5:1369-1379.

[6] SkJransky D. Nucteic aedd-based mefhods for the detecfion of cancer. Science. 1997;278:1054-1058.

[7] Navazesh M, Christensen CA. A comparison of whole mouth resting and stimulated salivary measuremerrts. J. Dent Res. 1982; 61:1158-1162.

[8] HanEey JA, McNeH BJ. the meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (HOC) curve. Radioktgy. 1982; 143:29-36.

09] Hanley JA, McNeil BJ. A rnethod of comparing the areas under receiver operating characteristic curves derived from the same cases. Radiofogy. 1983; 148:839-843.

[10] Liu HH, Wu TT. EstJmatmg the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve for repeated rneasures design. JoumeJ of Statisticai Software. 2003;8:1-18.

{11] Norton JA, Peacock JL, Morrisen SD. Cancer cachexia. Cnr Rev O/røof Hematot. 1987;7:289-327.

[12] Smith DR, Poiverini PJ, Kunket SL, et al. Inhibition of interieukin 8 atienuates angbgenesls in bronchogenic carcinoma. J Exp Med. 1994;179:1409-1415.

[13] Dong G, Loukinova E, Smith CW, Chen Z, and Van Waes C. Genes differentially expressed with malEgnant transformation and mefastatic tumor progression of munne squamous celt carcinoma. J Ce// Biochem Supp/. 1997;28/29:90-100.

[14] Pak AS, Wright MA, Matthews JP, et ai. Mechanisms of immune suppression in patients with head and neck cancer presence of CD34+ cells which suppress immune functions within cancers that secrete granulocyte-macropnage colony-stimulating factor. Clin Cancer Res. 1995;1:95-103.

[15] Ueda T, Shimada E, Urakawa T. Serum (evels of cytokines in patients with colorectai cancer, possible involvement of interieuktn-6 and interieukin-8 in hematogenous metastasis. J GastroenterxA. 1994;29:423-429.

[16] Oka M, Yamamoto K, Takahashi M, et al. Relationship between serum ievels of interieukin 6, various disease parameters, and malnutrition in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res. 1996;56:2776-2780.

[17] Wang PL, Ohura K, Fujii T, Oido-Mori M, Kowashi Y, Kikuchi M, Suetsugu Y, Tanaka J. DNA microarray anaiysis of human gingivat fibrobiasts from healthy and inftammatory gingival tissues. Biochem Blophys ResCommun. 2003;305:970-973.

[18] Giannopoulou C, Kamma JJ, Mombelli A. Effect of inflammation, smoking and stress on gingivat crevicuiar fluid cytøkme levei. J Clin Periodontoi. 2003; 30:145-153.

[191 Sullivan Pepe M, Etzioni R, Feng Z, et al. Phases of biomarker development for early detection of cancer. J National Can Inst 2001;93:1054-1061.

[20] Van Houten VM, Tabor MP, van den Breke! MW, et al. Molecular asssys for the diagnosis of minimal residua! head-and-neck cancer: methods, rellabiltty, pltfalls, and solutlons. Clin Cancer Ras. 2000;6:3803-3816.

[21] Thompson ML, Zucchlnl W. On the statjstJeal anaiysis of ROC curves. Stat Med. 1980;8:1277-1290.

[22] Hoffman HT, Kamell LH, Funk GF, Roblnson RA, Menck HR. The national cancer data base report on cancer of the head and neck. Aren OtolaryngoiHeadNeckSurg. 1998;124:951-962.

[23] Khuri FR, Shin DM, Glissen BS, Uppman SM, Hong WK. Treatment of patients with recurrent or metastatic squamous celt carcinoma of the head and neck: current status and futura dlrections. Semin Qncol. 2000;27:25-33.

[24] Spafford MF, Koch WM, Reed AL, et al. Detection of head and neck squamous ceil carcinoma among exfoiiated oral cetls by mlcrosatellite anaiysis. Clin Cancer Ree. 2001;7:607-612.

[25] Bradford GR, Genetic markers of head and neck cancer idantifyfng new molecular targets. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003;129:366-367.

[26] Koch WM. Genetic markers in the cllnlcal care of head and neck cancer slow in coming. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003;129:367-368.

[27] Affymetrix, (2001). Affymetrix Technical Note: New Statlstlcai Algorithms for Monltoring Gene Expression on GsnsChip® Probe Arrays, Santa Clara, CA: Affymetrix.

[28] Anker P, Mulcahy H, Chen XQ, Stroun M (1999). Detection of circulatlng tumor DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. Cancer Metastasia Rev 18( 1) ;66- 7&

[29] Anker P, Mulcahy H. Stroun M (2003). Circulatlng nucleic edds in plasma and serum as a noninvasive Invesflgation for cancer time for large-scale cllnlcal studies? Int J Cancer 103(2): 149-152.

[30] Bonassl 5, Neri M, Puntonl R (2001). Valtdation of biomarkers as early predictors of disease. Mutet Raa 480-481: 340-350.

[30] El-Naggar AK, Mao L, Staerkei G, Coombes MM, TuckerSL, Luna MA, et al (2001). Genetic Hetsrogenetty in saiiva from patients with oral squamous carcinomas: ImpllcatJons in molecular diagnosts and screening. J Mol Dtagn 3(4): 164-170.

[31] Relschnacker M, Beinert T, Ermttsch M, Sefeit D, Possinger K, Engelmann C, er a/ (2001). Detection of amplifiebte messenger RNA in the serum of patients with lung cancer. Ann NYAcad Sol 945:179—188.

[32]GlnzJnger D (2002). Gene quantiflcatlon using real-time quantttative PCR: an emerging technology hits the malnstream. Exp Hemato 30:503—512.

[33] Kelly JJ, Chemov BK, Tovstanovsky I, Mirzabekov AD, Bavykin SG

(2002). Radlcal-generatlng coordlnatlon complexes as toois for rapid and effectfve fragmentation and fiuorescent labeling of nucieic aclds for mlcrochip hybridlzaiton. Anal Biochem 311 (2): 103-118.

[34] Kopreski MS, Banko FA, Kwak LW, Gocke CD (1999). Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma. Clin Cancer Raa 5:1961—1965.

[35] Lawrence HP (2002). Sallvary markers of systemlc dlsease: nonlnvaslve diagnosts of dlsease and monitortng of general health. J Can Dent Aasoc 68(3):170-174.

[36] Uao PH, Chang YC, Huang MF, Tal KW, Chou MY (2000). Mutation of p53 gene codon 63 In saiiva as a molecular marker for oral squamous celtcarcinomas. Oral Onco/36(3):272-276.

[37] Mercer DK, Scott KP, Motville CM, Glover LA, Rint HJ (2001). Transformatlon of an oral bacterium via chromosomal fntsgration of fres DNA In the presence of human saiiva. FEMS Mlcroblof Lett 200(2): 163-167.

[38] Navszesh M (1993). Methods for coJIectfng saiiva. Ann N YAoad Sel 694:72-77.

[39] Ohyama H, Zhang X, Kohno Y, Alavizos I, Posner M, Wong DT, et at

(2000). Laser capture micfodissection-generated target sample for hlgh-density oilgonudeotide array hybrtdlzation. Btoteehnlques 29(3): 530-536.

[40] Pusen W, Ftocco MT. Leung SM, Thlele H, Kostrzewa M (2003). Mase spectrometry-based cllnlcal protsomics. Pharmacoganomhs 4(4) :463-476.

[41] Rehak NN, Cecco SA, Csako G (2000). Bfochemical compositlon and eiectrolyte balance of "unstimulated" whole human saiiva. Clin Chem Lab Med 3 8(4):335-343.

[42] Rleger-Christ KM, Mourtzlnos A, Lee PJ, Zagha RM, Cain J, Silverman M, er al (2003). Identification of fibroblast growth factor receptor 3 mutations in urine sediment DNA samples complements cytology In bladder tumor detection. Cancer9S(4):737-744.

[43] Sakki T, Knuuttlia M (1996). Controlled study of the association of smoking with iactobacllll, mutans streptococci and yeasts in saiiva. EurJ Oral 5e/104(5-6):619-622.

[44] Horer, O.L. and G. Palicari, RNase actlvrty in the caplllary blood of chlldren. vlrologie, 1986.37(2): p. 111-114

[45] Sidransky D (2002). Emerglng molecular markers of cancer. Nat Revfews 3:210-219.

[46] Stamey FR, DeLeon-Cames M, Petel MM, Pellett PE, Dollard SC (2003). Comparison of a microtiter plate system to Southern blot for detection of human herpesvirus 8 DNA amplified from blood and saiiva. J Viml Methods 108(2):189-193.

[47] Streckfus CF, Sigler LR (2002). Saiiva as a dlagnostJc fluid. Oral Dis 8(2):69-76.

[48] Venter JC, Adams MD, Myers EW, U PW, Mura) U, Sutten G6 er a/

(2001). The sequence of the human genome (published erratum appears ln Science 292(5 523): 1838). Science 291(5507): 1304-1351.

[49] Wong U, Lueth M, U XN, Lau CC, Vogel H (2003). Detection of mitochondrial DNA mutations in the tumor and carebrospinal fluid of medulloblastoma patients. Cancer Res 63(14):3B66-3871.

[50] Xiang CC, Chen M, Ma L, Phan QN, Inman JM, Kozhich OA, er al (2003). A new strategy to amplify degraded RNA from smalt tissue samples for microarray studies. Nudeh Aclds Res 31 (9):e53

[51] Upshutz, R.J., et al., High density synihetic oligonucieotide arrays. Nat Genet, 1999.21(1 Suppi): p. 20-4.

[52] Lipshutz, R.J., AppBcations of hkjh- density otigonucleotide arrays. Novartis Found Symp, 2000.229: p. 84-90; discussfon 90-3.

[53] Barker, P.E., Cancer bfomaiker validation: standards and process: roles for the National Institute of Standards and Technology ( NIST). Ann N Y Acad Sei, 2003.983: p. 142-50.

[54] Juusola, J. and J. Ballantyne, Messenger RNA proflling: a prototype method to suppiant conventional methods for body fluid idenHficatbn. Forensic Sel Int 2003.135(2): p. 85-96.

[55] Li, Y., et al., RNA proflling ofcelNtee saiiva using microarray technology. J Dent Res, 2004.83(3): p. 199-203.

[56] Kopreski, M.S., FA. Benko, and CD. Gocke, Clrculating RNA as a tumor marker, detection of5T4 mRNA In breast and tung cancer paflent serum. Ann NY Acad Sei, 2001.945: p. 172-178.

[57] Bunn, P.J., Jr., Eariy detection oflung cancer using serum RNA or DNA mankers: ready for " prime time" or for validation? J Clin Oncof, 2003.21(21): p. 3891-3893.

[58] Wong, S.C., et al., Quantification of plasma beta- catenin mRNA in colorectal cancer and adenoma patients. Clin Cancer Res, 2004.10(5): p. - 1613-1617.

[59] Fugazzola, L, et al., Highfy sensitive serum thyrogjobulin and drculaUng thyrogjobuiin mRNA evaluaHons in the management of patients with cWarenBated thyroid cancer ln apparent remisslon. J Ciin Endocrinol Metab, 2002.87(7): p. 3201-8.

[60] U, C. and W.H. Wong, Modef- based anaiysis of oligonucieotide arrays: expr& ssion Index computatton and ouffior detection. Proe Nati Acad Sei U S A, 2001.98(1): p. 31-36.

[61] Renger, R. and LM. Meadows, Use ofstepwise regression ln medicai educatton tesearch. Acad Med, 1994.69(9): p. 738.

[62] Lemon, S.C., et al., ClassHication and regression tree anaiysis in public health: methodologlcal review and comperison with logistic regression. Ann Behav Med, 2003.26(3): p. 172-181.

[63] Cancer facts and Sgures 2004. Atlanta: American Cancer Society, 2004.

[64] Wildt, J-, T. Bundgaard, and S.M. Bentzen, Deiayfn the dlagnosis of oral squamous cell carcinoma. Clin Otolaryngol, 1995.20(1): p. 21-25

[65] Fong, K.M., et al., Molecular genetic basis for earty cancer detection and

cancer susceptibility., in Molecular Pathology of Earty Cancer, S.S. HD and G. AF, Editors. 1999, IOS Press. p. 13-26.

[66] Epstein, J.B., L Znang, and M. Rosin, Advanees in the dlagnosis of oral premalignant and malignant lesions. J Can Dent Assoc, 2002.68(10): p. 617-621.

[67] Mao, L, W.K. Hong, and VA Papadimftrakopoulou, Focus on head and neck cancer. Cancer Cell, 2004.5(4): p. 311-316

[68] LI, Y., et al., Safivary transcfiptomo diagnostics ifor oral cancer detection. din Cancer Res, 2004.10(24): p. 8442-8450.

[69] Ng, E.K., et al., Pæsence offHterable and nonfiltenable mRNA in the plasma cf cancer patients andhaaithyindividuais. Clin Chem. 2002.48(8): p . 1212-1217

[70] Jung, K., et al., Increased cett- froe DNA in plasma of patients with metastatic spread in prostata cancer. Cancer Lett, 2004.205(2): p. 173-180

[71] Wang, B.G., et al., Increased plasma DNA imegrityin cancer patients. Cancer Res, 2003.63(14): p. 3966-3968.

[72] Lo, YM, et al., Qua^ in plasma of patients with rwsopharyngeeJ carcinoma. Cancer Res, 1999. 59(6): p. 1188-1191

[73] Chen, X.Q., et al., Tefomemse RNA as a detection marker in the serum ofbreast cancer patents. Clin Cancer Res, 2000.6(10): p. 3823-3826.

[74] Slira, J.M..etaL, Deta*fø ofbreast cancer patients is associated with poorprognosis tumor characteristics. Clin Cancer Res, 2001.7(9): p. 2821-2825.

[75] Dasl, F., et al., Reai- tfme quantification in plasma of human teiomerase reverse transcriptase ( hTERT) mRNA: a simple blood test to monitor disæse in cancer patients. Lab Invest 2001.81(5): p. 767-769

[76] Bernard, P.S. and C.T. Wittwer, ReaPSma PCR technology for cancer diagnostics. Clin Chem, 2002.48(8}: p. 1178-1185.

[77] Jahr, S., et al., DNA fragments in the biood plasma of cancer patients: quantitations and evidence fartheirorigln from apoptotic and necrotic cetls. Cancer Res. 2001.61(4): p. 1659-1665

[78] Stroun, M., et ai., Neopiastic characteristics of the DNA found In the plasma of cancer patients. Oncology, 1989.48(5): p. 318-322

[79] Hoilstein M, Sidranaky D, Vogeistein B, Harris CC. p53 mutattons ln human cancer*. Science (Waeh DC) 1991;253:49 -53.

[89] Du T, Wahlberg S, Burek É, Lindblom P, Rubio C, Lindblom ÆMIcrosateflite Instabilfty as a predlctor of a mutation in a DNA mismatch repair gene In famlllat colorectaJ cancer. Oanes Ctiromosomes Cancer 2000;27:17-25.

[81] Graden J, ThlEveris A, Samowftz W, et al. Identification and charactertzation of the famillal adenomatous polyposis coil gene. CeD 1991; 68:589-600.

[82] GnjnkemeJar GL, Jin R. Receiver operating characteristic curve anaiysis of cllnlcal risk rnodels. Ann Thorac Surg 2001;72:323- 326.

[83]. Kharchenko SV, Shpakov AA [Regulation of the RNase activity of the saiiva ln healthy subjects and in stomach cancer], Izv Akad Nauk SSSR Biol 1989:58-63.

[84]. Myers LL, Wax MK. Positron emisston tomography In the evaluatfon of the negative neck in patients with oral cavlty cancer. J Otolaryngol 1998;27:342-347.

[85] Mashberg A, Samit A. Early dlagnosis of asymptomatic oral and oropharyngeaJ squamous cancers. CA Cancer J Clin 1995;45:328 -51.

[86] Rosin MP, Epsteln JB, Berean K, et al. The use of exfoHative cell samples to map clonal genetic alteratlons In the orai epitheJium of high-risk patients. Cancer Res 1997;57:5258-5260.

[87] Streckfus C, Blgler L, Delllnger T, Dai X, Kingman A, Thlgpen JT. The presence of solubte c-erb8-2 in saiiva and serum among women with breast cardnoma: a prelimlnary study. Clin Cancer Res 2000;6: 2363-2370.

[88] Unoki M, Nakamura Y. Growth-suppresslve etrects of BPOZ and EGR2, two genes fnvoJved in the PTEN signaling palhway. Ofwogene 2001;20:4457-4465.

[89] Suzuki C, Unett M, Nakamura Y. Identification and allele rrequendes of nowei single-nudeorJde porymorphisms in the DUSP1 and BTG1 genes. J Hum Genet 2001;46:155-157.

[90] Bettuzzl S, Davafli P, Astancolle S. et al. Tumor progression is accompanied by sJgnfficant changes inmelevdsof expresskmof potyamine metaboiism reguJatory genes and dusterin (sutfated gt<y>co<p>rotein 2} ln human prostate cancer spetimens. Cancer Res 2Q00;60:28-34.

[91] Tbrelli G, VenturellT D, Coto A, et al. Expiession of o-myb piotooncogene and other cell cycle-related genes fri normal and neoptastic human cotonlc mucosa. Cancer Res 1987;47:5266 -5269.

[92] Tsuji T, Usur S, Akte T, et al. Inductkm of epitheliai diftereftfation and DNA dernethyfation in hamster mafignant oral keratinoevte by ornithine decarboxylase antizyme. Oncogene 2001:20:24 -33.

[93] Gribenko A, Lopez MM, Richardson JM 111, Makhafadze Gl. Cloning, overexpression, puriffication, and spectroscopte catractenzatfon of human S100P. Protein Sei 1998;7:211-215.

[94] Guerreiro Da Sllva ID, Hu YF, Russo IH, et aL S100P calciumbinding protein overexpression is associated wilh immortalizatkin of human breast eplthefiai cells in vitre and eariy stages of breast cancer development bi vim. tnt J Oncol 2000:16231-240.

|95] Mousses S, Bubendorf L, Wagner U, et al. COnical valktanon of candfdate genes associated with prostate cancer progression in the CWR22 medel system using tissue microarrays. Cancer Res 2002:62:1256-1260.

[96] Mackay A, Jones C, Dexter T, et al. cDNA microarray anaiysis of genes associated wim ERBS2 (HER2/neu) overexpression in human mammary luminal epitheliaJ celis. Cftcogene 2043:222680-2688.

[97] Logsdon CD, Simeone DM, Bmfdey C, et al. Molecular proflling of

pancreatic aderrøcarrinorrta and chronic pancreatitis idénfifies multipie genes differentially reguiated in pancreatic cancer. Cancer Res 2003;63:2649-2657.

[98] OmogoracKluicevic T, Mtssiagfla E, BEaveri E, et al. Molecular aiteraoons in pancreatic carcinoma: expression profling shows that dysregutated expresslon of S100 genes is Nghly prevalent. J PathoJ 2003201:63-74.

{99] Jabionska E, Piotrowski L, Grabowska Z. Serum Levete of IL-1b, IL6, TNF-a, sTNF-RI and CRPin patients with oral cavity cancer. Pathol Oncol Res 1997;3:126-129.

[100] Chen CK, Wu MY, Chao KH, Ho HN, Sheu BC. Huang SC. T lymphocytes and cytokine producvon ln ascitic fluid of ovarian malignancies. J Formos Med Assoc 1999;98:24 -30.

[101] Hamajima N, YuasaH. [Genette polyrnorphisms related to interieukin-1 beta production and dlsease risk]. Nippon Koshu Etsel Zasshi 2003;50:194-207.

[102] El-Omar EM, Rabkin CS, Gammon MD, et al. Increased risk of noncardia gastne cancer associated with proinlfarnrnatory cytokine gene pdymorphisms. Gastroenterotogy 2003;124:1193-1201.

[103] Malamud D. Oral diagnosfic testing for detecting human ImmunodeficJency virus-1 antibodles: a technology whose time has come. Am J Med 1997;102:9-14.

[104] Guven Y, Satman l. Dinccag N, Alptekin S. Salivary peroxidase activity in whole saiiva of patients wim msulin-dependent (type-1) diabetes mellftus. J Clin Periodontol 1996;23:879-881.

[105] Lee JJ, Hong WK, Hittelman WN, et al. Predicting cancer development in oral Ieukoplakia: ten years of translarJonal research. Clin Cancer Res 2000;6:1702-1710.

[106] Silverman S Jr, Gorsky M. Proirferarjve verrucous ieukoplakia: a follow-up study of 54 cases. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radlol Endod 1997;84:154-157.

[107] Sudbo J, Kildal W, Risberg B, Koppang HS, Danielsen HE, Reith A. DNA content as a prognosSc marker in patients with oral Ieukoplakia. N Engi J Med 2001;344:1270-1278.

[108] Berta GN, Ghezzo F, DAvolio A, et al. Enhancement of caicyclin gene RNA expresslon in squamous cell carcinoma of the oral mucosa, but not in benign lesions. J Oral Pathol Med 1997;26:206 -210.

[109] Watanabe H, iwase M, OhashI M, Nagumo M. Rofe of interieukin-8 secreted from human oral squamous cell carcinoma cell lines. Oral Oncol 2002;38:670-679.

Claims

1. Fremgangsmåte for å diagnostisere et orofaryngealt plateepitelkarsinom (OSCC) hos et individ,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å: påvise i en prøve av en kroppsvæske en ekstracellulær m-RNA ekspresjon av en biomarkør, hvor kroppsvæsken er cellefritt spytt, og hvor biomarkøren er valgt fra gruppen som består av IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P og SAT; sammenligne ekspresjonen av biomarkøren i prøven med en forhåndsbestemt ekspresjon av biomarkøren, gjenkjenne i ekspresjonen av biomarkøren av karakteristika for den forhåndsbestemte ekspresjonen av biomarkøren, som er diagnostisk for OSCC,

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor påvisningen av m-RNA ekspresjonen blir utført ved hjelp av mikroarrayanalyse.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, hvor påvisningen av m-RNA ekspresjonen blir utført ved hjelp av høytetthetsoligonukleotid-mikroarrayanalyse.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor påvisningen av m-RNA ekspresjonen blir utført ved hjelp av kvantitativ PCR-analyse eller RT-PCR-analyse.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor fremgangsmåten omfatter påvisning av mer enn én biomarkør.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor biomarkøren er IL8.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor m-RNA ekspresjonen av IL1B, OAZ1, SAT og IL8 sammenlignes med en forhåndsbestemt ekspresjon av IL1B, OAZ1, SAT og IL8, gjenkjenning av ekspresjonen av biomarkøren av karakteristika for den forhåndsbestemte ekspresjon av biomarkøren, som er diagnostisk for OSCC,

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor spyttet er ikke-stimulert spytt.