NO338313B1 - Humanisert antistoff som binder human CD20, isolert nukleinsyre eller ekspresjonsvektor som koder for antistoffet, vertsceller, fremgangsmåte for dets fremstilling, anvendelse derav ved behandling av en autoimmun sykdom, av en CD20-positiv kreftform eller for å depletere B-celler in vivo, samt for fremstilling av et medikament. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører anti-CD20-antistoffer og deres anvendelse i behandlingen av B-cellerelaterte sykdommer.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Lymfocytter er én av flere populasjoner av hvite blodceller, de gjenkjenner og responderer spesifikt mot fremmed antigen. De tre hovedklassene av lymfocytter er B-lymfocytter (B-celler), T-lymfocytter (T-celler) og naturlige dreper-(NK)-celler. B-lymfocytter er cellene som er ansvarlige for antistoffproduksjon og tilveiebringer humoral immunitet. B-celler modner i benmargen og forlater margen mens de uttrykker et antigenbindende antistoff på sin celleoverflate. Når en naiv B-celle først treffer antigenet, for hvilket dens membranbundne antistoff er spesifikt, begynner cellen å dele seg raskt og de nye cellene differensierer til hukommelses-B-celler og effektorceller kalt plasmaceller. Hukommelses-B-celler har en lengre livslengde og fortsetter å uttrykke membranbundet antistoff med den samme spesifisitet som den opprinnelige morcellen. Plasmaceller produserer ikke membranbundet antistoff, men produserer i stedet en utskillbar form av antistoffet. Utskilte antistoffer er de viktigste effektormolekylene i humoral immunitet.

CD20-antigenet (også kalt humant B-lymfocyttbegrenset differensieringsantigen, Bp35) er et hydrofobt transmembranprotein med en molekylvekt på omtrent 35 kD lokalisert på pre-B- og modne B-lymfocytter (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287

(1989), og Einfeld eta/., EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). Antigenet blir også uttrykt på mer enn 90 % av B-celle-non-Hodgkins lymfomer (NHL) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), men er ikke funnet på hematopoetiske stamceller, pro-B-celler, normale plasmaceller eller andre normale vev (Tedder et al., J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD20 er antatt å regulere et tidlig trinn i aktiveringsprosessen for cellesyklusinitiering og differensiering (Tedder et al., ovenfor) og virker muligens som en kalsiumionkanal (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)). Gitt ekspresjonen av CD20 i B-cellelymfomer har dette antigenet vært et nyttig terapeutisk mål for å behandle slike lymfomer. I USA har mer enn 300 000 mennesker B-celle-NHL og mer enn 56 000 nye tilfeller blir diagnostisert hvert år. For eksempel blir rituximab (Rituxan)-antistoffet, som er et genetisk fremstilt kimært murint/humant monoklonalt antistoff som er rettet mot humant-CD20-antigen (kommersielt tilgjengelig fra Genentech, Inc., South San Francisco, California, US), benyttet i behandlingen av pasienter med tilbakefall eller refraktorisk lavere-grads eller follikulær, CD20-positiv, B-celle-non-Hodgkins lymfom. Rituximab er antistoffet referert til som C2B8 i US patentskrift nr. 5 736 137, utstedt 7. april 1998 (Anderson et al.) og i US patentskrift nr. 5 776 456. In wtro-virkningsmekanisme undersøkelser har vist at Rituxan binder humant komplement og lyserer lymfoide B-cellelinjer via komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) (Reff eta/., Blood 83(2):435-445 (1994)). I tillegg har det signifikant aktivitet i analyser for antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Prekliniske undersøkelser in vivo har vist at Rituxan fjerner B-cellerfra perifert blod, lymfeknuter og benmarg i cynomolgusaper, sannsynligvis via komplement- og cellemedierte prosesser (Reff eta/., Blood 83(2): 435-445 (1994)). Andre anti-CD20-antistoffer, som er indikert for behandlingen av NHL, inkluderer det murine antistoffet zevalin som er koplet til radioisotopen yttrium-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, (CA), Bexxar som er et annet fullt murint antistoff konjugert til 1-131 (Corixa, WA). US 5 576 195 A omhandler et murint monoklonalt antistoff 2H7 som gjenkjenner det humane B-celle overflateantigenet Bp35 (CD20) som spilleren rolle i B-celle aktivering. WO 00/09160 gjør kjent behandling av B-celle lymfoma ved administrering av anti-CD20 antistoffer til pasienter med non-Hodgkins lymfom. Anti-humane CD20 antigen-bindende antistoffer inneholdende humane IgG3 konstante domener er kjent fra US 2002-128448 En stor begrensning i anvendelsen av murine antistoffer i human terapi er den humane anti-museantistoff (HAMA)-responsen (se f. eks. Miller, R.A. et al. "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983; og Schroff, R.W., et al. "Human anti-murin immunglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res., 45:879-885, 1985). Selv kimære molekyler der variabel (V)-domener i gnagerantistoffer er fusjonert til humane konstant(C)-regioner, er fremdeles i stand til å utløse en signifikant immunrespons (HACA), humant antikimært antistoff) (Neuberger et al. Nature (Lond).) 314:268-270, 1985). En virkningsfull tilnærmelse for å unngå disse begrensningene i den kliniske anvendelsen av monoklonale antistoffer er humanisering av det murine antistoff eller antistoff fra en ikke-human art (Jones eta/., Nature (Lond), 321:522-525, 1986; Riechman eta/., Nature (Lond), 332:323-327, 1988). Dermed er det fordelaktig å produsere terapeutiske antistoffer mot CD20-antigenet som danner minimalt eller ingen antigenisitet når det blir administrert til pasienter, spesielt ved kronisk behandling. Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller dette og andre behov. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anti-CD20-antistoffer som overvinner begrensningene til nåværende terapeutiske preparater, i tillegg til at den tilveiebringer ytterligere fordeler som vil være åpenbare fra den detaljerte beskrivelsen nedenunder.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer CD20-bindende antistoffer eller funksjonelle fragmenter derav, og deres anvendelse ved behandlingen av B-celleassosierte sykdommer. Disse antistoffene er monoklonale antistoffer.

Foreliggende oppfinnelse gjelder et humanisert antistoff som binder human CD20 eller et antigenbindende fragment derav, kjennetegnet ved at antistoffet er effektivt til å depletere primat-B-celler in vivo, hvor eventuelt primat B-cellene er fra menneske, hvor antistoffet omfatter a) en tung kjede variabel region (VH) som omfatter CDRl-sekvens ifølge SEQ ID NO. 10 ; CDR2-sekvensen ifølge SEQ ID NO. llog CDR3-sekvens ifølge SEQ ID NO. 12, og i all vesentlighet de humane konsensusrammeverks(FR)-restene fra human tung kjede undergruppe-III (VHIII), hvor de tung kjede variable regionen videre omfatter aminosyre substitusjonene R71V; N73K og A49G, og

b) en lett kjede variabel region (VL) som omfatter CDRl-sekvens ifølge SEQ ID NO. 4, CDR2-sekvens ifølge SEQ ID NO. 5, CDR3-sekvens ifølge SEQ ID NO. 6 og i all

vesentlighet de humane konsensusrammeverks(FR)-restene til human lettkjede-K-undergruppe I (VkI), hvor den lett kjede variable regionen videre omfatter aminosyre substitusjonen L46P.

De humaniserte 2H7-variantene inkluderer de som har aminosyresubstitusjoner i FR og affinitetsmodningsvarianter med endringer i de transplanterte CDR-ene. De substituerte aminosyrene i CDR eller FR er ikke begrenset til dem som foreligger i donor- eller mottakerantistoffet. I andre utførelsesformer omfatter anti-CD20-antistoffene ifølge oppfinnelsen ytterligere endringer i aminosyrerester i FC-regionen som fører til forbedret effektorfunksjon, inkludert forbedret CDC- og/eller ADCC-funksjon og B-celle-dreping (også referert til her som B-celledeplesjon). Andre anti-CD20-antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer de som har spesifikke endringer som forbedrer stabilitet. I en spesifikk utførelsesform er de humaniserte 2H7-variantene med økt stabilitet som beskrevet i eksempel 6 nedenfor. Fukosemanglende varianter som har forbedret ADCC-funksjon in vivo, er også tilveiebrakt. I én utførelsesform har det kimære anti-CD20-antistoffet murine V-regioner og human C-region. Ett slikt spesifikt kimært anti-CD20-antistoff er Rituxan (Rituximab, Genentech, Inc.).

I en foretrukket utførelsesform av alle antistoff preparatene og fremgangsmåtene for anvendelse av denne oppfinnelsen er det humaniserte CD20-antistoffet 2H7.vl6 som har lettkjede- og tungkjedeaminosyresekvensen i henholdsvis SEQ ID NO:21 og 22, som vist i fig. 6 og fig. 7. Når det refereres til polypeptidsekvensene i figurene 6, 7 og 8, skal det bli forstått at de første 19 eller så, aminosyrer som danner den sekretoriske signalsekvensen, ikke foreligger i det modne polypeptidet. V-regionen til alle andre varianter basert på versjon 16 vil ha aminosyresekvensen til vl6, bortsett fra på posisjonene for aminosyresubstitusjoner som er indikert i det som blir fremlagt her. Hvis ikke annet er indikert, vil 2H7-variantene ha den samme L-kjeden som den forvl6.

Oppfinnelsen tilveiebringer et humanisert antistoff som binder human CD20, eller et antigenbindende fragment derav, der antistoffet er effektivt i forhold til å depletere primat-B-celler in vivo, der antistoffet i H-kjedevariabelregionen (VH) omfatter minst en CDR3- sekvens ifølge SEQ ID NO: 12 fra et antihumant CD20-antistoff og vesentlig de humane konsensusrammeverks (FR)-restene i human tungkjedeundergruppe III (VHIII). I én utførelsesform er primat-B-cellene fra menneske og cynomolgusape. I en utførelsesform omfatter antistoffet ytterligere H-kjede-CDRl-sekvensen ifølge SEQ ID NO: 10 og CDR2-sekvensen i SEQ ID NO: 11. I en annen utførelsesform omfatter det foregående antistoffet L-kjede-CDRl-sekvensen i SEQ ID NO: 4, CDR2-sekvensen i SEQ ID NO: 5, CDR3-sekvensen i SEQ ID NO: 6 med vesentlig de humane konsensusrammeverks(FR)-restene i human lettkjede-K-undergruppe I (VkI). I en foretrukket utførelsesform har FR-regionen i VLen donorantistoffrest på posisjon 46, i en spesifikk utførelsesform har FR2 i VLen aminosyresubstitusjon av leuL46pro (Leu i den humane Kl-konsensussekvensen endret til pro som er til stede i den tilsvarende posisjon i m2H7).

VH-regionen omfatter ytterligere en donorantistoffrest på minst aminosyre-posisjoner 49, 71 og 73 i rammeverket. I én utførelsesform er de følgende FR-posisjoner i den humane tungkjedeundergruppen III i VH substituert: AlaH49Gly i FR2, ArgH71Val og AsnH73Lys i FR3. I andre utførelsesform er omfatter CDR-regionene i det humaniserte antistoffet ytterligere aminosyresubstitusjoner der restene verken er fra donor- eller mottakerantistoff.

Antistoffet i de foregående utførelsesformer kan omfatte VH-sekvensen i SEQ ID NO: 8 for vl6, som vist i fig. IB. I en ytterligere utførelsesform av det foregående omfatter antistoffet ytterligere VL-sekvensen i SEQ ID NO: 2 i vl6, som vist i fig. IA.

I andre utførelsesformer er det humaniserte antistoffet 2H7.v31 som har lettkjede-og tungkjedeaminosyresekvensen i hhv. SEQ ID NO: 21 og 23, som vist i fig. 6 og fig. 8, 2H7.v31 som har tungkjedeaminosyresekvensen i SEQ ID NO: 23 som vist i fig. 8, 2H7.v96 med aminosyresubstitusjoner av D65A og N100A i H-kjeden og S92A i L-kjeden til vl6.

I separate utførelsesformer omfatter antistoffet ifølge enhver av de foregående utførelsesformene ytterligere minst én aminosyresubstitusjon i Fc-regionen som forbedrer ADCC- og/eller CDC-aktivitet i forhold til det opprinnelige eller mor-antistoffet fra hvilket det er avledet, der v. 16 er mor-antistoffet som det blir sammenlignet med i de fleste tilfeller, og Rituxan i andre tilfeller. Ett slikt antistoff med forbedret aktivitet omfatter trippel-Alaninsubstitusjonen med S298A/E333A/K334A i Fc-regionen. Ett antistoff som har S298A/E333A/K334A-substitusjon er 2H7.v31 som har tungkjedeaminosyresekvensen til SEQ ID NO: 23. Antistoff 2H7.vll4 og 2H7.vll5 viser minst 10 ganger forbedret ADCC-aktivitet sammenlignet med Rituxan.

I en annen utførelsesform omfatter antistoffet ytterligere minst én aminosyre-substitusjon i Fc-regionen som minsker CDC-aktivitet sammenlignet med mor-antistoffet fra hvilket det ble avledet, som er vl6 i de fleste tilfeller. Ett slikt antistoff med minsket CDC-aktivitet sammenlignet med vl6 omfatter minst substitusjon K322A i H-kjeden. Sammenligningen av ADCC- og CDC-aktivitet kan bli analysert som beskrevet i eksemplene.

I en foretrukket utførelsesform er antistoffene ifølge oppfinnelsen fullengde-antistoffer der VH-regionen er bundet til en human IgG-tungkjedekonstantregion. I foretrukne utførelsesformer er IgG humant IgGl eller IgG3.

I en utførelsesform er det CD20-bindende antistoffet konjugert til et cytotoksisk middel. I foretrukne utførelsesformer er det cytotoksiske midlet et toksin eller en radioaktiv isotop.

I en utførelsesform blir antistoffene ifølge oppfinnelsen til anvendelse til terapeutiske eller diagnostiske formål fremstilt i CHO-celler.

Også beskrevet er et preparat som omfatter et antistoff ifølge enhver av de foregående utførelsesformene og en bærer. I en form er bæreren en farmasøytisk akseptabel bærer. Disse preparatene kan bli tilveiebrakt i en fremstilt artikkel eller et sett.

Beskrivelsen omtaler også en flytende formulering som omfatter et humanisert 2H7-antistoff ved 20 mg/ml antistoff, 10 mM histidinsulfat pH 5,8, 60 mg/ml sukrose (6 %), 0,2 mg/ml polysorbat-20 (0,02 %).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert nukleinsyre som koder for ethvert av antistoffene som blir beskrevet her, inkludert en ekspresjonsvektor for å uttrykke antistoffet.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er vertsceller som omfatter de forutgående nukleinsyrene og vertscelle som produserer antistoffet. I en foretrukket utførelsesform av den siste er vertscellen en CHO-celle. En fremgangsmåte for å fremstille disse antistoffene blir tilveiebrakt, der fremgangsmåten omfatter å dyrke vertscellen som produserer antistoffet og gjenvinne antistoffet fra cellekulturen.

Beskrivelsen omtaler også en fremstilt artikkel som omfatter en beholder og et preparat, der preparatet omfatter et antistoff ifølge enhver av de forutgående utførelses-formene. For anvendelse ved behandling av NHL omfatter den fremstilte artikkelen ytterligere skrevne instruksjoner som indikerer at preparatet blir benyttet til å behandle non-Hodgkins lymfom.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er å indusere apoptose i B-celler in vivo, ved å kontakte B-celler med antistoffet ifølge enhver av utførelsesformene ovenfor, for derved å drepe B-cellene.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse ved behandling av sykdommene som er beskrevet her; et CD20-antistoff eller funksjonelt fragment derav, er formulert for administrering til et pattedyr slik som en human pasient som lider av sykdommen. I enhver av behandlingene av en autoimmun sykdom eller en CD20-positiv kreftform er antistoffet i en utførelsesform 2H7.vl6 som har lettkjede- og tungkjedeaminosyresekvensene i henholdsvis SEQ ID NO: 21 og 22, som vist i fig. 6 og fig. 7. Dermed er en utførelsesform anvendelse ved behandling av en CD20-positiv kreftform, hvor behandlingen omfatter å administrere til en pasient som lider av kreftformen, en terapeutisk effektiv mengde av et humanisert CD20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen. I foretrukne utførelsesformer er den CD20-positive kreftformen et B-celle-lymfom eller leukemi inkludert non-Hodgkins lymfom (NHL) eller lymfocyttpredominant Hodgkins sykdom (LPHD), kronisk lymfocyttleukemi (CLL) eller SLL. I én form for behandling av et B-cellelymfom eller leukemi blir antistoffet formulert for administrering i et doseringsområde på omtrent 275-375 mg/m<2>. I ytterligere former omfatter behandlingen ytterligere administrering til pasienten av minst ett kjemoterapeutisk middel, der det kjemoterapeutiske midlet for non-Hodgkins lymfom blir valgt fra gruppen som består av doxorubicin, syklofosfamid, vinkristin og prednisolon.

Også tilveiebrakt er anvendelse ved behandling av en autoimmun sykdom, hvor behandlingen omfatter å administrere til en pasient som lider av den autoimmune sykdommen en terapeutisk effektiv mengde av det humaniserte CD20-bindende antistoffet ifølge ethvert av de foregående krav. Den autoimmune sykdommen er valgt fra gruppen som består av reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt, systemisk lupus erytematosus (SLE), Wegeners sykdom, inflammatorisk tarmsykdom, ideopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), autoimmun trombocytopeni, multippel sklerose, psoriasis, IgA-neuropati, IgM-polyneuropatier, myastenia gravis, vaskulitt, diabetes mellitus, Reynauds syndrom, Sjøgrens syndrom og glomerulonefritt. Der den autoimmune sykdommen er reumatoid artritt, kan antistoffet anvendes i kombinasjon med et andre terapeutisk middel som foretrukket er metotreksat.

I disse behandlingene kan de CD20-bindende antistoffene anvendes alene eller sammen med et andre terapeutisk middel, slik som et andre antistoff, eller et kjemoterapeutisk middel eller et immundempende middel. Det andre antistoffet kan være et som binder CD20 eller et forskjellig B-celleantigen eller et NK- eller T-celleantigen. I en utførelsesform er det andre antistoffet et radiomerket anti-CD20-antistoff. I andre utførelsesformer er det CD20-bindende antistoffet konjugert med et cytotoksisk middel, inkludert et toksin eller en radioaktiv isotop.

I et annet aspekt anvendes oppfinnelsen ved behandling av en autoimmun sykdom som er valgt fra gruppen som består av dermatomyositt, Wegeners granulomatose, ANCA, aplastisk anemi, autoimmun hemolytisk anemi (AIHA), faktor- Vlll-mangel, hemofili-A, autoimmun nøytropeni, Castlemans syndrom, Goodpastures syndrom, organ-transplantasjonsfrastøtning, transplantat versus vertssykdom (GVHD), IgM-mediert trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), Hashimotos tyroiditt, autoimmun hepatitt, lymfoid interstitiell pneumonitt (HIV), bronkiolitis obliterans (ikke-transplantat), vs. NSIP, Guillain-Barre-syndrom, vaskulitt i store kar, kjempecelle (Takayasus) artritt, vaskulitt i mellomstore kar, Kawasakis sykdom, polyartritt nodosa. Behandlingen omfatter å administrere til en pasient som lider av sykdommen en terapeutisk effektiv mengde av et CD20-bindende-antistoff. I en utførelsesform er det CD20-bindende-antistoffet rituxan.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensen i SEQ ID NO:24 i Cynomolgusape-CD20-antigen (vist i fig. 19), eller en degenerert variant av denne sekvensen. Én utførelsesform er en isolert nukleinsyre som omfatter en sekvens som koder for et polypeptid med aminosyresekvensen i SEQ ID NO:25 (vist i fig. 20) eller i SEQ ID NO:25 (fig. 20) med konservative aminosyresubstitusjoner. En annen utførelsesform er en vektor som omfatter nukleinsyren ovenfor, inkludert en ekspresjonsvektor for uttrykking i en vertscelle. Også inkludert er en vertscelle som omfatter en vektor. Også tilveiebrakt blir et isolert polypeptid som omfatter aminosyresekvensen [SEQ ID NO: 25, fig. 20] til Cynomolgusape-CD20.

Kort beskrivelse av figurene

FIG. IA er en sekvenssammenligning som sammenligner aminosyresekvensene for lettkjedevariabeldomene (VL) for hvert murine 2H7 (SEQ ID NO: 1), humanisert 2H7.vl6-variant (SEQ ID NO: 2) og human kappa-lettkjedeundergruppe I (SEQ ID NO: 3). CDR-ene i VLi 2H7 og hu2H7.vl6 er som følger: CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 5) og CDR3

(SEQ ID NO: 6).

FIG. IB er en sekvenssammenligning som sammenligner VH-sekvensene for murin 2H7 (SEQ ID NO: 7), humanisert 2H7.vl6-variant (SEQ ID NO: 8) og den humane konsensussekvensen for tungkjedeundergruppe III (SEQ ID NO: 9). CDR-ene i VH i 2H7 og hu2H7.vl6 er som følger: CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 11) og CDR3 (SEQ ID NO: 12).

I FIG. IA og FIG. IB foreligger CDR1, CDR2 og CDR3 i hver kjede innenfor parenteser, flankert av rammeverksregionene FR1-FR4 som indikert. 2H7 refererer til det murine 2H7-antistoffet. Asteriskene mellom to rader av sekvenser indikerer posisjonene som er forskjellige mellom de to sekvensene. Restnummerering er i henhold til Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5. utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), med insersjon vist som a, b, c, d og e. FIG. 2 viser sekvensen for fagemid-pVX4 (SEQ ID NO: 13) benyttet til konstruksjon av 2H7-Fab-plasmider (se eksempel 1) i tillegg til aminosyresekvensene for L-kjeden (SEQ ID NO: 14) og H-kjeden (SEQ ID NO: 15) for Fab for det CDR-transplanterte anti-IFN-a-humaniserte antistoffet. FIG. 3 viser sekvensen til ekspresjonsplasmidet som koder for det kimære 2h7.v6.8 Fab (SEQ ID NO: 16). Aminosyresekvensen til L-kjeden (SEQ ID NO: 17) og H-kjeden (SEQ ID NO: 18) er vist. FIG. 4 viser sekvensen til plasmidet pDRl (SEQ ID NO: 19, 5391 bp) for uttrykking av immunglobulinlettkjeder som beskrevet i eksempel 1. pDRl inneholder sekvenser som koder for et irrelevant antistoff, lettkjeden for et humanisert anti-CD3-antistoff (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)), startstrek og stoppkodoner for disse er indikert med fet skrift og understreket. FIG. 5 viser sekvensen til plasmid pDR2 (SEQ ID NO:20, 6135 bp) for uttrykking av immunglobulintungkjeder som beskrevet i eksempel 1. pDR2 inneholder sekvenser som koder for et irrelevant antistoff, tungkjeden til et humanisert anti-CD3-antistoff (Shalaby et al., ovenfor), der startstrek og stoppkodoner for disse er indikert i fet skrift og understreket. FIG. 6 viser aminosyresekvensen for den fullstendige L-kjeden for 2H7.vl6 (SEQ ID NO:21). De første 19 aminosyrene før DIQ er den sekretoriske signalsekvensen som ikke foreligger i den modne polypeptidkjeden. FIG. 7 viser aminosyresekvensen for den fullstendige H-kjeden for 2H7.vl6 (SEQ ID NO:22). De første 19 aminosyrene før EVQ er den sekretoriske signalsekvensen som ikke foreligger i den modne polypeptidkjeden. Ved å sammenstille VH-sekvensen i fig. IB (SEQ ID NO:8) med den fullstendige H-sekvensen foreligger den humane yl-konstantregionen fra aminosyreposisjon 114-471 i (SEQ ID NO:22). FIG. 8 viser aminosyresekvensen for den komplette H-kjeden for 2H7.v31 (SEQ ID NO:23). De første 19 aminosyrene før EVQ er den sekretoriske signalsekvensen som ikke foreligger i den modne polypeptidkjeden. L-kjeden er den samme som for 2H7.vl6 (se fig. 6). FIG. 9 viser den relative stabiliteten til IgG-variantene 2H7.vl6 og 2H7.v73 som beskrevet i eksempel 6. Analyseresultater ble normalisert til verdiene før inkubering og rapportert som prosent gjenværende etter inkubering. FIG. 10 er et flytskjema som oppsummerer aminosyreendringene fra den murine 2H7 til en undergruppe av humaniserte versjoner opp til v75. FIG. 11 er en oppsummering av gjennomsnittlig absolutt B-celletelling [CD3-/CD40+] i alle grupper (2H7-undersøkelse og Rituxan-undersøkelse kombinert) som beskrevet i eksempel 10. FIG. 12 viser resultatene fra en representativ ADCC-analyse på fukosemanglende 2H7-varianter som beskrevet i eksempel 11. FIG. 13 viser resultatene fra annexin-V-fargingen plottet som en funksjon av antistoffkonsentrasjon. Ramos-celler ble behandlet med et irrelevant IgGl-kontroll-antistoff (Herceptin, sirkler), Rituximab (kvadrater) eller rhuMAb 2H7.vl6 (triangler) i nærvær av et kryssbindende sekundært antistoff og ble analysert ved hjelp av FACS. Figurene 13-15 er beskrevet i eksempel 13. FIG. 14 viser resultatene av annexin-V og propidiumjodid dobbelfarging, plottet som en funksjon antistoffkonsentrasjon. Ramos-celler ble behandlet med et irrelevant IgGl-kontrollantistoff (Herceptin, sirkler), Rituximab (kvadrater) eller rhuMAb 2H7.vl6 (triangler) i nærvær av et kryssbindende sekundært antistoff og ble analysert ved hjelp av FACS. FIG. 15 viser tellingene (per 10 s) av levende ufargede celler plottet som en funksjon av antistoffkonsentrasjonen. Ramos-celler ble behandlet med et irrelevant IgGl-

kontrollantistoff (Herceptin, sirkler), Rituximab (kvadrater) eller rhuMAb 2H7.vl6 (triangler)

i nærvær av et kryssbindende sekundært antistoff og ble analysert ved hjelp av FACS.

FIG. 16, 17, 18 viser inhibering av Raji-celletumorvekst i naken mus som beskrevet i eksempel 14. De ble behandlet ukentlig (som indikert ved vertikale piler, n = 8 mus per gruppe) i 6 uker med PBS (kontroll) eller med Rituxan eller rhuMAb 2H7.vl6 ved 5 mg/kg (fig. 16), 0,5 mg/kg (fig. 17) eller 0,05 mg/kg (fig. 18). FIG. 19 viser nukleotidsekvensen (SEQ ID NO:24) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO:25) for CD20 fra cynomolgusape som beskrevet i eksempel 15. FIG. 20 viser aminosyresekvensen for CD20 fra cynomolgusape (SEQ ID NO:25). Rester som er forskjellige fra human CD20 er understreket, og de humane restene (SEQ ID NO:26) er indikert rett under ape-residuen. Det antatte ekstracellulære domene til ape-CD20 er i fet skrift. FIG. 21 viser resultatene fra cynomolgusapeceller som uttrykker CD20 og som binder til hu2H7.vl6, .v31 og Rituxan, som beskrevet i eksempel 15. Antistoffene ble analysert for evnen til å binde og fortrenge FITC-konjugert murin 2H7-binding til cynomolgus-CD20.

FIG. 22 viser doseøkningsskjema for reumatoid artritt fase I/II klinisk prøve.

FIG. 23 viser vektoren for uttrykking av 2H7.vl6 i CHO-celler.

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

CD20-antigenet er et ikke-glykosylert transmembranfosfoprotein med en molekylvekt på omtrent 35 kD som er funnet på overflaten til mer enn 90 % av B-celler fra perifert blod eller lymfoide organer. CD20 blir uttrykt under tidlig pre-B-celleutvikling og forblir inntil plasmadifferensiering, det er ikke funnet på humane stamceller, lymfoide forløperceller eller normale plasmaceller. CD20 foreligger både på normale B-celler i tillegg til på maligne B-celler. Andre navn for CD20 i litteraturen inkluderer «B-lymfocytt begrenset differensieringsantigen» og Bp35. CD20-antigenet er beskrevet for eksempel i Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52-81-149 (1989) og Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287(1989).

Uttrykket "antistoff" blir benyttet i den bredeste betydning og dekker spesifikt monoklonale antistoffer (inkludert monoklonale fullengdeantistoffer), multispesifikke antistoffer (f. eks. bispesifikke antistoffer) og antistoff-fragmenter så lenge de oppviser den ønskede biologiske aktivitet eller funksjon.

Den biologiske aktiviteten til de CD20-bindende og humaniserte CD20-bindende antistoffene ifølge oppfinnelsen vil i det minste inkludere binding av antistoffet til human CD20, mer foretrukket binding til human og annen primat-CD20 (inkludert cynomolgusape, rhesusape, sjimpanser). Antistoffene vil binde CD20 med en Kd-verdi som ikke er høyere enn 1 x IO"<8>, foretrukket en Kd-verdi som ikke er høyere enn omtrent 1 x IO"<9>, og vil være i stand til å drepe eller depletere B-celler in vivo, foretrukket med minst 20 % når det sammenlignes med den hensiktsmessige, negative kontrollen som ikke er behandlet med et slikt antistoff. B-celle deplesjon kan være et resultat av én eller flere av ADCC, CDC, apoptose eller annen mekanisme. I noen former for sykdomsbehandling som beskrives her, kan spesifikke effektorfunksjoner eller mekanismer være ønkselig fremfor andre, og visse varianter av humanisert 2H7 er foretrukket for å oppnå disse biologiske funksjonene, slik som ADCC.

"Antistoff-fragmenter" omfatter en del av et fullengdeantistoff, vanligvis den antigenbindende regionen eller den variable regionen derav. Eksempler på antistoff-fragmenter inkluderer Fab-, Fab'-, F(ab')2- og Fv-fragmenter, dialegemer, lineære antistoffer, enkeltkjedeantistoffmolekyler og multispesifikke antistoffer som er dannet fra antistoff-fragmenter.

"Fv" er det minste antistoff-fragmentet som inneholder et komplett antigengjen-kjennings- og bindingssete. Dette fragmentet består av en dimer av et tungkjede- og et lettkjedevariabelregiondomene med tett, ikke-kovalent assosiering. Fra foldingen av disse to domenene utgår seks hypervariable løkker (3 løkker hver fra H- og L-kjeden) som bidrar med aminosyrerestene for antigenbinding og som overfører antigenbindingsspesifisitet til antistoffet. Likevel har selv et enkelt variabeldomene (eller halvparten av en Fv som omfatter kun tre CDRer som er spesifikke for et antigen) evnen til å gjenkjenne og binde antigen, skjønt med en lavere affinitet enn hele bindingssetet.

Uttrykket "monoklonalt antistoff", slik som det blir benyttet her, refererer til et antistoff som er fremskaffet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, det vil si de individuelle antistoffene som omfatter populasjonen er identiske bortsett fra for mulige, naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke og er rettet mot et enkelt antigent sete. Videre, i motsetning til konvensjonelle (polyklonale) antistoffpreparater som typisk inkluderer ulike antistoffer rettet mot ulike determinanter (epitoper), er hvert monoklonale antistoff rettet mot én enkel determinant på antigenet. Uttykket "monoklonal" betegner at antistoffet er fremskaffet fra en vesentlig homogen populasjon av antistoffer og skal ikke bli ansett som at det krever produksjon av antistoffet ved en spesiell fremgangsmåte. Foreksempel kan de monoklonale antistoffene som skal bli benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse blir fremstilt ved hjelp av hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler et al., Nature 256:495 (1975), eller bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter (se for eksempel U.S. patentskrift nr. 4 816 567). De "monoklonale antistoffene" kan også bli isolert fra fagantistoffbiblioteker ved å benytte teknikkene som er beskrevet i Clackson et al., Nature 352-624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol. 222-581-597 (1991), for eksempel.

"Funksjonelle fragmenter" av de CD20-bindende antistoffene ifølge oppfinnelsen er de fragmentene som opprettholder binding til CD20 med vesentlig den samme aktiviteten

som det intakte fullengdemolekylet fra hvilket de er avledet og viser biologisk aktivitet inkludert depletering av B-celler som målt ved hjelp av in vitro- eller in wVo-analyser slik som de som er beskrevet her.

Uttrykket "variabel" refererer til det faktum at visse segmenter av variabeldomenene er svært forskjellige i sekvens blant antistoffer. V-domenet medierer antigenbinding og definerer spesifisitet for et spesielt antistoff for dets spesielle antigen. Likevel er variabiliteten ikke jevnt fordelt over de 110 aminosyrene til variabeldomenene. Isteden består V-regionene av relativt ikke-varierende strekninger kalt rammeverksregioner (FR) på 15 - 30 aminosyrer, avbrutt av kortere regioner med ekstrem variabilitet kalt "hypervariabelregioner", som hver er 9-12 aminosyrer lange. De variable domenene til native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FR, som i stor grad inntar en p-sheet-konfigurasjon, sammenbundet med tre hypervariabelregioner som danner løkker som binder sammen, og i noen tilfeller, som danner en del av p-sheet-strukturen. De hypervariable regionene i hver kjede blir holdt tett sammen ved hjelp av FRene og bidrar sammen med hypevariabelregionene fra den andre kjeden til dannelsen av det antigenbindende setet til antistoffer (se Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). De konstante domenen er ikke direkte involvert i bindingen av et antistoff til et antigen, men oppviser ulike effektorfunksjoner slik som deltakelse av antistoffet i antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC).

Uttrykket "hypervariabelregion", når det blir benyttet her, refererer til aminosyrerestene til et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Hypervariabelregionen omfatter generelt aminosyrerester fra en "komplementaritetsbestemmende region" eller "CDR"

(omtrent ved restene 24 - 34 (LI), 50 - 56 (L2) og 89 - 97 (L3) i VL, og ved omtrent 31 - 35B (Hl), 50 - 65 (H2) og 95 - 102 (H3) i VH (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) og/eller restene fra en hypervariabel løkke (for eksempel restene 26 - 32 (LI), 50 - 52 (L2) og 91 - 96 (L3) i VLog 26 - 32 (Hl), 52A - 55 (H2) og 96 - 101 (H3) i VH (Chothia og Lesk J. Mol. Biol, 196 : 901 - 917 (1987)).

Som referert her er "konsensussekvensen" eller konsensus-V-domenesekvensen en kunstig sekvens som er avledet fra en sammenligning av aminosyresekvensene til kjente, humane immunglobulin-variabelregionsekvenser. Basert på disse sammenligningene ble rekombinante nukleinsyresekvenser som koder for V-domeneaminosyrer som er en konsensus av sekvensene som er avledet fra det humane k- og det humane H-kjedeundergruppe-III-V-domenet fremstilt. Konsensus-V-sekvensen har ingen kjent antistoffbindingsspesifisitet eller affinitet.

"Kimere" antistoffer (immunglobuliner) har en del av tungkjeden og/eller lettkjeden identisk med eller er homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer som er avledet fra en

spesiell art eller som tilhører en spesiell antistoffklasse eller underklasse, mens resten av kjeden/kjedene er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer som er avledet fra en annen art, eller som tilhører en annen antistoffklasse eller underklasse, i tillegg til fragmenter av slike antistoffer, så lenge de oppviser den ønskede biologiske aktivitet (U.S. patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851 - 6855 (1984)). Humaniserte antistoffer som benyttet her er en undergruppe av kimere antistoffer.

"Humaniserte" former av ikke-humane (for eksempel murine) antistoffer er kimere antistoffer som inneholder minimalt med sekvenser avledet fra ikke-humant immunglobulin. For det meste er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottaker eller akseptorantistoff) der hypervariabelregionrester i mottakeren blir erstattet med hyperva ria bel reg ion rester fra en ikke-human art (donorantistoff), slik som mus, rotte, kanin eller ikke-human primat som har den ønskede spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller blir Fv-rammeverksregion (FR)-rester i det humane immunglobulinet erstattet med tilsvarende ikke-humane rester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte rester som ikke er funnet i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene blir utført for å ytterligere forbedre antistoffytelse slik som bindingsaffinitet. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatter vesentlig hele av minst én, og typisk to, variabeldomener, der alle eller vesentlig alle av hypervariabelløkkene tilsvarer de i et ikke-humant immunglobulin og hele eller vesentlig hele av FR-regionene er de fra en human immunglobulinsekvens, selv om FR-regionene kan inkludere én eller flere aminosyre-substitusjoner som forbedrer bindingsaffinitet. Antallet av disse aminosyresubstitusjonene i FR er typisk ikke mer enn 6 i H-kjeden og i L-kjeden ikke mer enn 3. Det humaniserte antistoffet vil eventuelt også omfatter minst én del av en immunglobulin-konstantregion (Fc), typisk den fra et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer, se Jones et al., Nature 321:522 - 525 (1986), Reichmann et al., Nature 332:323 - 329 (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 - 596 (1992).

Antistoffets "effektorfunksjoner" refererer til de biologiske aktivitetene som kan knyttes til Fc-regionen (en nativsekvens-Fc-region eller aminosyresekvensvariant-Fc-region) til et antistoff og varierer med antistoff-isotype. Eksempler på antistoff-effektorfunksjoner inkluderer: Clq-binding og komplementavhengig cytotoksisitet, Fc-reseptorbinding, antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflatereseptorer (foreksempel B-cellereseptor) og B-celleaktivering.

"Antistoffavhengige cellemediert cytotoksisitet" eller "ADCC" referer til en form for cytotoksisitet der utskilt lg bundet på Fc-reseptorer (FcRs) til stede på visse cytotoksiske celler (for eksempel naturlige dreperceller (NK)-celler, nøytrofiler og makrofager) og som gjør disse cytotoksiske effektorcellene i stand til å binde spesifikt til en antigenbærende målcelle og deretter drepe målcellen med cytotoksiner. Antistoffenes "arm" og de

cytotoksiske cellene er absolutt nødvendige for slik dreping. De primære cellene for å mediere ADCC, NK-celler, uttrykker kun FcyRIII, mens monocytter uttrykker FcyRI, FcyRII og FcyRIII. FcR-uttrykking på hematopoietiske celler er oppsummert i tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457 - 92 (1991). For å undersøke ADCC-aktivitet for et molekyl av interesse kan en in vitro ADCC-analyse, slik som den som er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337 bli utført. Nyttige effektorceller for slike analyser inkluderer mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og naturlige dreper-(NK)-celler. Alternativt eller i tillegg kan ADCC-aktivitet for molekylet av interesse bli undersøkt in vivo, for eksempel i en dyremodell, slik som den som er beskrevet i Clynes et al. PNAS (USA) 95:652 - 656 (1998).

"Fc-reseptor" eller "FcR" beskriver en reseptor som binder til Fc-regionen til et antistoff. Den foretrukne FcR er en nativsekvens human FcR. Videre er en foretrukket FcR en som binder et IgG-antistoff (en gammareseptor) og inkluderer reseptorer av underklassene FcyRI, FcyRII og FcyRIII, inkludert allele varianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. FcyRII-reseptorer inkluderer FcyRIIA (en "aktiverende reseptor") og FcyRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har tilsvarende aminosyresekvenser som primært er forskjellige i de cytoplasmiske domenene derav. Aktiverende reseptor FcyRIIA inneholder et immunoreseptor-tyrosinbasert aktiveringsmotiv (ITAM) på sitt cytoplasmiske domene. Inhiberende reseptor FcyRIIB inneholder et immunoreseptor-tyrosinbasert inhiberingsmotiv (ITIM) i sitt cytoplasmiske domene. (Se gjennomgang i Daéron, Annu. Rev. Immunol 15:203

- 234 (1997)). FcRer er gjennomgått i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457 - 92

(1991), Capel et al. Immunomethods 4:25 - 34 (1994), og de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330 - 41 (1995). Andre FcRer er omfattet av uttrykket "FcR" her. Uttrykket inkluderer også den neonatale reseptoren FcRn, som er ansvarlig for overføringen av maternale IgG til fostere (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) og Kim et al. J. Immunol. 24:249

(1994)).

WO 00/42072 (Presta) beskriver antistoffvarianter med forbedret eller redusert binding til FcRer. Se også Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591 - 6604 (2001).

"Humane effektorceller" er leukocytter som uttrykker én eller flere FcRer og utfører effektorfunksjoner. Foretrukket uttrykker cellene minst Fcylll og utfører ADCC-funksjon. Eksempler på humane leukocytter som medierer ADCC, inkluderer mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), naturlige dreper-(NK)-celler, monocytter, cytotoksiske T-celler og nøytrofiler der PBMC- og NK-celler er foretrukket. Effektorcellene kan bli isolert fra en nativ kilde, for eksempel fra blod.

"Komplementavhengig cytotoksisitet" eller "CDC" refererer til lyseringen av en målcelle i nærvær av komplement. Aktivering av den klassiske komplementveien blir initiert ved bindingen av den første komponenten i komplementsystemet (Clq) til antistoffer (av hensiktsmessig underklasse) som er bundet til deres tilhørende antigen. For å undersøke

komplementaktivering kan en CDC-analyse, foreksempel som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202:163 (1996) utføres.

Polypeptidvarianter med endrede Fc-region aminosyresekvenser og økt eller redusert Clq-bindingsevne er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 6 194 551B1 og WO 99/51642. Se også Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178 - 4184 (2000).

N-glykosyleringssetet i IgG er på Asn297 i CH2-domenet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også preparater av et CD20-bindende, humanisert antistoff som har en Fc-region der omtrent 80 - 100 % (og foretrukket omtrent 90 - 99 %) av antistoffet i preparatet omfatter en moden kjerne karbohydratstruktur som mangler fukose, bundet til Fc-regionen av glykoproteinet. Slike preparater ble her vist å utvise en overraskende forbedring i binding til FcyRIIIA(F158) som ikke er så effektiv som FcyRIIIA(V158) i å reagere med human IgG. Dermed er preparatene her forventet å være overlegne i forhold til tidligere beskrevne anti-CD20-antistoffpreparater, spesielt for terapi av humane pasienter som uttrykker FcyRIIIA(F158). Fcy(RIIIA (F158) er mer vanlig enn Fcy(RIIIA (V158) hos normale, friske afroamerikanere og hos hvite. Se Lehrnbecher et al. Blood 94:4220 (1999). Foreliggende søknad viser videre den synergistiske økningen i FcyRIII-binding og/eller ADCC-funksjon som er et resultat av å kombinere glykosyleringsvariasjonene her med aminosyre-sekvensmodifikasjon(er) i Fc-regionen til glykoproteinet.

Et "isolert" antistoff er ett som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent i dets naturlige miljø. Kontaminerende komponenter i dets naturlige miljø er materialer som vil interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser for antistoffet, og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteininneholdende eller ikke-proteininneholdende, løste komponenter. I foretrukne utførelsesformer vil antistoffet bli renset (1) til mer enn 95 vekt% i forhold til antistoff som bestemt ved hjelp av Lowry-metoden, og mest foretrukket mer enn 99 vekt%, (2) til en grad som er tilstrekkelig til å oppnå minst 15 rester av N-terminal eller intern aminosyresekvens ved å benytte en spinning-cup sekvensator, eller (3) til homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE ved reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å benytte coomassieblått eller, fortrinnsvis, sølvfarging. Isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ i rekombinante celler siden minst én komponent i antistoffets naturlige miljø ikke vil være til stede. Likevel vil vanligvis isolert antistoff bli fremstilt ved hjelp av minst ett rensetrinn.

Et "isolert" nukleinsyremolekyl er et nukleinsyremolekyl som er identifisert og separert fra minst ett kontaminerende nukleinsyremolekyl, med hvilket det vanligvis er assosiert i den naturlige kilden til antistoffnukleinsyren. Et isolert nukleinsyremolekyl er forskjellig fra den formen eller settingen i hvilken det blir funnet i naturen. Isolerte nukleinsyremolekyler skiller seg derfor ut fra nukleinsyremolekylet som det foreligger i naturlige celler. Imidlertid inkluderer et isolert nukleinsyremolekyl et nukleinsyremolekyl som forekommer i celler som vanligvis uttrykker antistoffet hvor for eksempel nukleinsyremolekylet er i en kromosomal lokalisering forskjellig fra den i naturlige celler.

Uttrykket "kontrollsekvenser" referer til DNA-sekvenser som er nødvendige for uttrykkingen av en operabelt bundet, kodende sekvens i en spesiell vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er hensiktsmessige for prokaryoter, inkluderer for eksempel en promotor, eventuelt en operatorsekvens og et ribosombindingssete. Eukaryote celler er kjent for å benytte promotorer, polyadenyleringssignaler og enhancere.

En nukleinsyre er "operablet bundet" når den blir plassert i et funksjonelt avhengighetsforhold med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en pre-sekvens eller sekretorisk leder operabelt bundet til DNA for et polypeptid hvis det blir uttrykt som et pre-protein som deltar i utskillingen av polypeptidet; en promotor eller enhancer er operabelt bundet til en kodende sekvens hvis den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodende sekvens hvis den er posisjonert slik at den fremmer translasjon. Generelt betyr "operabelt bundet" at DNA-sekvensene som er bundet, er tilgrensende, og i tilfellet med en sekretorisk leder, tilgrensende og i lesefase. Likevel trenger ikke enhancere å være tilgrensende. Binding blir utført ved ligering på hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, blir syntetiske oligonukleotid-adaptere eller linkere benyttet i overensstemmelse med konvensjonell praksis.

"Vektor" inkluderer shuttle- og ekspresjonsvektorer. Typisk vil plasmid-konstruksjonen også inkludere et startsted for replikasjon (for eksempel ColEl-startstedet for replikasjon) og en selekterbar markør (for eksempel ampicillin eller tetrasyklinresistens), for henholdsvis replikasjon og seleksjon, av plasmidene i bakterier. En "ekspresjonsvektor" refererer til en vektor som inneholder de nødvendige kontrollsekvenser eller regulatoriske elementer for uttrykking av antistoffene inkludert antistoff-fragment ifølge oppfinnelsen i bakterieceller eller eukaryote celler. Passende vektorer er beskrevet nedenfor.

Cellen som produserer et humanisert CD20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen vil inkludere de bakterielle og eukaryote vertcellene i hvilke nukleinsyrer som koder for antistoffene har blitt introdusert. Passende vertceller er beskrevet nedenfor.

Ordet "markør", når det blir benyttet her, refererer til en påvisbar forbindelse eller et preparat som er konjugert direkte eller indirekte til antistoffet. Markøren kan selv være påvisbart i seg selv (for eksempel radioisotopmarkør eller fluorescerende markør) eller, i tilfellet med en enzymatisk markør, kan katalysere kjemisk endring av en substrat-forbindelse eller preparat som er påvisbart.

En "autoimmun sykdom" her er en ikke-malign sykdom eller forstyrrelse som oppstår fra og er rettet mot et individs egne (selv) antigener og/eller vev.

Som benyttet her refererer "B-celledeplesjon" til en reduksjon i B-cellenivåer i et dyr eller menneske etter legemiddel- eller antistoffbehandling, sammenlignet med B-cellenivået før behandling. B-cellenivåer er målbare ved å benytte velkjente analyser slik som de som er beskrevet i de eksperimentelle eksemplene. B-celledeplesjon kan være fullstendig eller partiell. I en utførelsesform er deplesjonen av CD20-uttrykkende B-celler minst 25 %. Uten å være begrenset av en enkelt mekanisme, inkluderer mulige mekanismer for B-celledeplesjon ADCC, CDC, apoptose, modulering av kalsium-fluks eller en kombinasjon av to eller flere av de forutgående.

Uttrykket "cytotoksisk middel", som benyttet her, refererer til en substans som inhiberer eller forhindrer funksjonen til celler og/eller forårsaker ødeleggelse av celler. Uttrykket er ment å skulle inkludere radioaktive isotoper (f. eks. I<13>1,I125, Y<90>og Re<186>), kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som enzymatisk aktive toksiner av bakterielt, sopp-, plante- eller dyreopphav, eller fragmenter derav.

Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse som er nyttig i behandlingen av kreft. Eksempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer alkaliserende eller alkylerende midler slik som tiotepa og syklofosfamid (CYTOXAN), alkylsulfonater slik som busulfan, improsulfan og piposulfan, aziridiner slik som benzodopa, karbokvon, meturedopa og uredopa, etyleneminer og metylamelaminer inkludert altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylentiofosforamid og trimetylolomelamin, nitrogensenneper slik som klorambusil, klornafazin, cholofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretaminoksidhydroklorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, urasilsennep, nitrosureaer slik som carmustin, klorzotosin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin, antibiotika slik som aklasinomyciner, aktinomycin, autramycin, azaserin, bleomyciner, kaktinomycin, kalicheamisin, karabisin, karminomycin, karsinofilin, krommyciner, daktinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleusin, doksorubicin (adriamycin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomyciner, mykofenolsyre, nogalamycin, olivomyciner, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin, anti-metabolitter slik som metotreksat og 5-fluorurasil (5-FU), folsyrea na loger slik som denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat, purinanaloger slik som fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin, pyrimidinanaloger slik som ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, carmofur, cytarabin, dideoksyuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU, androgener slik som calusteron, dromostanolonpropionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, antiadrenaler slik som aminoglutetimid, mitotan, trilostan, folsyre-erstattere slik som folinsyre, aceglaton, aldofosfamidglykosid, aminolevulininsyre, amsacrin, bestrabusil, bisantren, edatraksat, defofamin, demecolcin, diazikvon, elfornitin, elliptiniumacetat, etoglusid, galliumnitrat, hydroksyurea, lentinan, lonidamin, mitoguazon, mitoksantron, mopidamol, nitrakrin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, podofyllinsyre, 2-etylhydrasid, prokarbazin, PSK, razoksan, sizofiran, spirogermanium, tenuazonsyre, triazikon, 2,2',2"-triklortrietylamin, uretan, vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacytosin, arabinosid ("Ara-C"), tiotepa, taksoider for eksempel paklitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) og doxetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Frankrike), klorambucil, gemcitabin, 6-tioguanin, merkaptopurin, metotrexat, platiniumanaloger slik som cisplatin og karboplatin, platinum, etopsid (VP-16), ifosfamid, mitomycin C, mitoxantron, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, navelbin, novantron, teniposid, daunomycin, aminopterin, xeloda, ibandronat, CPT-11, topoisomeraseinhibitor RFS 2000, diflurmetyl-ornitin (DMFO), retinolsyre, esperamiciner, capecitabin og farmasøytisk akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de ovenstående. Også inkludert i denne definisjonen er antihormonmidler som virker for å regulere eller inhibere hormonvirkning på tumorer slik som antiøstrogener inkludert for eksempel tamoksifen, raloksifen, aromataseinhiberende 4(5)-imidazoler, 4-hydroksytamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston og toremifen (Fareston), antiandrogener slik som flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid og goserelin, andre kjemoterapeutiske midler slik som prednisolon. Farmasøytisk akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de ovenstående er inkludert.

"Behandle" eller "behandling" eller "lindring" refererer til både terapeutisk behandling og profylaktiske eller preventive utførelser, der målet er å forhindre eller bremse (minske) den gjeldende, patologiske tilstand eller forstyrrelser. Et individ er vellykket "behandlet" for en CD20-positiv kreftform eller en autoimmun sykdom hvis individet, etter å ha mottatt en terapeutisk mengde av et CD20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen i henhold til anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, viser observerbar og/eller målbar reduksjon i, eller fravær av, ett eller flere tegn og symptomer på den spesielle sykdommen. For eksempel for kreft, reduksjon i antallet av kreftceller eller fravær av kreftcellene, reduksjon i tumorstørrelsen, inhibering (dvs. i noen grad bremse omfanget og fortrinnsvis stoppe) av tumormetastaser, inhibering, i noen grad, av tumorvekst, økning i lengden av remisjon og/eller lindring i noen grad, ett eller flere av symptomene som er assosiert med den spesifikke formen, redusert sykelighet og dødelighet og forbedring i livskvalitet. Reduksjon av tegnene eller symptomene på en sykdom kan også bli følt av pasienten. Behandling kan oppnå en fullstendig respons, definert som forsvinning av alle tegn på kreft, eller en partiell respons, der størrelsen på tumoren blir minsket, foretrukket med mer enn 50 %, mer foretrukket med 75 %. En pasient er også ansett for å være behandlet hvis pasienten opplever en stabil sykdom. I en foretrukket utførelsesform er kreftpasientene fremdeles progresjonsfrie i forhold til kreften etter ett år, foretrukket etter 15 måneder. Disse parametrene for å vurdere vellykket behandling og forbedring i sykdommen er lett målbare ved hjelp av rutineprosedyrer som er kjente for en lege med hensiktsmessig erfaring på fagområdet.

En "terapeutisk effektiv mengde" refererer til en mengde av et antistoff eller et legemiddel som er effektivt i å "behandle" en sykdom eller forstyrrelse hos et individ. I tilfellet med kreft kan den terapeutisk effektive mengden av legemiddelet redusere antallet kreftceller, redusere tumorstørrelse, inhibere (dvs. bremse i noen utstrekning og fortrinnsvis stoppe) kreftcelleinfiltrering i perifere organer, inhibere (dvs. bremse i noen utstrekning og fortrinnsvis stoppe) tumormetastase, inhibere, i noen utstrekning, tumorvekst og/eller lindre i noen utstrekning ett eller flere av symptomene som er assosiert med kreftformen. Se tidligere definisjon av "behandling".

"Kronisk" administrering refererer til administrering av middelet/midlene på en kontinuerlig modus, i motsetning til en akutt modus, for derved å opprettholde den opprinnelige terapeutiske effekten (aktiviteten) for en lengre tidsperiode. "Diskontinuerlig" administrering er behandling som ikke blir gjort fortløpende uten avbrudd, men som heller er syklisk i natur.

Preparater og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer humaniserte antistoffer som binder humant CD20 og fortrinnsvis andre primat-CD20 i tillegg, som omfatter en H-kjede som har minst én, fortrinnsvis to eller alle H-kjede-CDRene til et antihumant CD20-antistoff fra en ikke-human art (donorantistoff) og vesentlig alle rammeverksrestene til et humant konsensusantistoff som mottakerantistoffet. Donorantistoffet kan være fra ulike ikke-humane arter inkludert mus, rotte, marsvin, geit, kanin, hest, primat, men oftest vil det være et murint antistoff. "Vesentlig hele" i denne konteksten betyr at mottaker-FR-regionene i det humaniserte antistoffet kan inkludere én eller flere aminosyresubstitusjoner som ikke opprinnelig foreligger i den humane konsensus-FR-sekvensen. Disse FR-endringene kan omfatte rester som ikke finnes i mottakeren eller i donorantistoffet.

I en utførelsesform er donorantistoffet det murine 2H7-antistoffet, V-regionen inkludert CDR- og FR-sekvensene til hver av H- og L-kjedene som er vist i figur IA og IB. I en spesifikk utførelsesform tilsvarer restene for det humane Fab-rammeverket konsensussekvensen til human Vic-undergruppe I og VH-undergruppe III, der disse konsensussekvensene henholdsvis er vist i figur IA og figur IB. Det humaniserte 2H7-antistoffet ifølge oppfinnelsen vil ha minst én av CDRene i H-kjeden til det murine donorantistoffet. I en utførelsesform omfatter det humaniserte 2H7-antistoffet som binder human CD20 CDRene i både H- og L-kjedene til donorantistoffet.

I et fullengdeantistoff vil det humaniserte CD20-bindende antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatte et humanisert V-domene bundet til et C-domene fra et humant immunglobulin. I en foretrukket utførelsesform er H-kjede-C-regionen fra humant IgG, fortrinnsvis IgGl eller IgG3. L-kjede-C-domenet er fortrinnsvis fra human K-kjede.

Hvis ikke annet er indikert, vil en humanisert 2H7-antistoffversjon her ha V- og C-domenesekvensene til 2H7.vl6-L-kjede (figur 6, SEQ ID NO: 21) og -H-kjede (figur 7, SEQ

ID NO: 22) bortsett fra på posisjonene for aminosyresubstitusjoner eller endringer som er indikert i de eksperimentelle eksemplene nedenfor.

De humaniserte CD20-bindende antistoffene vil binde minst human CD20 og fortrinnsvis binde andre primat-CD20, slik som den for aper, inkludert cynomolgusaper og resusaper og sjimpanser. Sekvensen for cynomolgusape-CD20 er beskrevet i eksempel 15 og figur 19.

Den biologiske aktiviteten til de CD20-bindende antistoffene og humaniserte CD20-bindende antistoffene ifølge oppfinnelsen vil minst inkludere binding av antistoffet til human CD20, mer foretrukket binding til human CD20 og primat-CD20 (inkludert cynomolgusape, rhesusape, sjimpanser) med en Kd-verdi som ikke er høyere enn 1 x IO"<8>, fortrinnsvis en Kd-verdi som ikke er høyere enn omtrent 1 x IO"<9>, enda mer foretrukket en Kd-verdi som ikke er høyere en omtrent 1 x IO"<10>, og være i stand til å drepe eller depletere B-celler in vitro eller in vivo, fortrinnsvis med minst 20 % sammenlignet med baselinjenivåer eller hensiktsmessig negativ kontroll som ikke er behandlet med et slikt antistoff.

Det ønskede nivået av B-celledeplesjon vil være avhengig av sykdommen. For behandlingen av en CD20-positiv kreftform vil det være ønskelig å maksimere deplesjonen av B-cellene som er målet for anti-CD20-antistoffene ifølge oppfinnelsen. For behandlingen av en CD20-positiv B-celle-neoplasma er det dermed ønskelig at B-celledeplesjonen er tilstrekkelig til i det minste å forhindre progresjon av sykdommen som kan bli vurdert av den erfarne legen på fagområdet, f. eks. ved å overvåke tumorvekst (størrelse), proliferasjon av den kreftrammede celletypen, metastase, andre tegn og symptomer på den spesielle krefttypen. Fortrinnsvis er B-celledeplesjonen tilstrekkelig til å forhindre progresjon av sykdom i minst 2 måneder, mer foretrukket 3 måneder, enda mer foretrukket 4 måneder, mer foretrukket 5 måneder, enda mer foretrukket 6 eller flere måneder. I enda mer foretrukne utførelsesformer er B-celledeplesjonen tilstrekkelig til å øke tiden i remisjon med minst 6 måneder, mer foretrukket 9 måneder, mer foretrukket 1 år, mer foretrukket 2 år, mer foretrukket 3 år, enda mer foretrukket 5 eller flere år. I en mest foretrukket utførelsesform er B-celledeplesjonen tilstrekkelig til å kurere sykdommen. I foretrukne utførelsesformer er B-celledeplesjonen i en kreftpasient minst omtrent 75 % og mer foretrukket 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % og til og med 100 % av baselinjenivået før behandling.

For behandling av en autoimmun sykdom kan det være ønskelig å modulere omfanget av B-celledeplesjon avhengig av sykdommen og/eller alvorligheten av tilstanden hos den individuelle pasienten ved å justere doseringen av CD20-bindende antistoff. Dermed kan B-celledeplesjon være fullstendig, men behøver ikke være fullstendig. Eller, total B-celledeplesjon kan være ønskelig i en første behandling, men i påfølgende behandlinger kan doseringen bli justert for kun å oppnå partiell deplesjon. I en utførelsesform er B-celledeplesjonen minst 20 %, dvs. 80 % eller mindre CD20-positive B-celler er tilbake sammenlignet med baselinjenivået før behandling. I andre utførelsesformer er B-celledeplesjonen 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % eller større. Fortrinnsvis er B-celledeplesjonen tilstrekkelig til å stoppe progresjon av sykdommen, mer foretrukket til å lindre tegnene og symptomene på den spesielle sykdommen under behandling, enda mer foretrukket å kurere sykdommen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også bispesifikke CD20-bindende antistoffer der én arm av antistoffet har en humanisert H- og L-kjede i det humaniserte CD20-bindende antistoffet ifølge oppfinnelsen, og den andre armen har V-regionbindingsspesifisitet for et annet antigen. I spesifikke utførelsesformer er det andre antigenet valgt fra gruppen som består av CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D eller andre NK-aktiverende ligander.

Sammenlignet med Rituxan (rituximab), oppviser vl6 omtrent 2 til 5 ganger økt ADCC-styrke, ca 3-4 ganger minsket CDC enn Rituxan.

Antistoffproduksjon

Monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler et al. Nature, 256:495 (1975) eller kan bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter (U.S. patentskrift nr. 4 816 567).

I hybridomfremgangsmåten blir en mus eller et annet hensiktsmessig vertsdyr, slik som en hamster, immunisert som beskrevet ovenfor for å stimulere lymfocytter som produserer eller er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt vil binde til proteinet som blir benyttet til immunisering. Alternativt kan lymfocytter bli immunisert in vitro. Etter immunisering blir lymfocytter isolert og deretter fusjonert med en myelomcellelinje ved å benytte et hensiktsmessig fusjoneringsmiddel, slik som polyetylenglykol, for å danne en hybridomcelle (Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Hybridomcellene som blir fremstilt på denne måten blir sådd ut og dyrket i et passende kulturmedium der dette mediet fortrinnsvis inneholder ett eller flere substanser som inhiberer veksten eller overlevelsen av de ufusjonerte mor-myelomcellene (også referert til som fusjonspartner). For eksempel, hvis mor-myelomcellene mangler enzymet hypoksantin-guanin-fosforibosyl-transferase (HGPRT eller HPRT) vil det selektive kulturmediet for hybridomene typisk inkludere hypoksantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) der disse substansene forhindrer veksten av HGPRT-manglende celler.

Foretrukne fusjonspartner-myelomceller er de som fusjonerer effektivt, støtter stabil høynivåproduksjon av antistoff fra de selekterte antistoffproduserende cellene og er sensitive for et selektivt medium som selekterer mot de ufusjonerte morcellene. Foretrukne myelomcellelinjer er murine myelomcellelinjer, slik som de som er avledet fra MOPC-21- og MPC-ll-musetumorer som er tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA og SP-2 og derivater, for eksempel X63-Ag8-653-celler som er tilgjengelige fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humane myelomcellelinjer og muse-humane heteromyelomcellelinjer har også blitt beskrevet for produksjonen av humane monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984) og Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51 - 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Kulturmedium der hybridomceller blir dyrket, blir undersøkt for produksjon av monoklonale antistoffer direkte mot antigenet. Fortrinnsvis blir bindingsspesifisiteten til monoklonale antistoffer som blir produsert av hybridomceller bestemt ved hjelp av immunpresipitering eller ved hjelp av in wfro-bindingsanalyse, slik som radioimmunoanalyse (RIA) eller enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA).

Bindingsaffiniteten til det monoklonale antistoffet kan, for eksempel, bli bestemt ved hjelp av Scatchard-analysen som er beskrevet i Munson et al., Anal. Biochem., 107:220

(1980).

Straks hybridomceller som produserer antistoffer med den ønskede spesifisiteten, affiniteten og/eller aktiviteten er identifisert, kan klonene bli subklonet ved hjelp av fortynningsrekke prosedyrer og dyrket ved hjelp av standard fremgangsmåter (Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, s.59-103 (Academic Press, 1986)). Passende kulturmedium for dette formålet inkluderer for eksempel D-MEM- eller RPMI-1640-medium. I tillegg kan hybridomcellene bli dyrket in vivo som ascitestumorer i et dyr, for eksempel ved hjelp av i.p. injeksjon av cellene inn i mus.

De monoklonale antistoffene som blir utskilt av subklonen blir hensiktsmessig separert fra kulturmediet, ascitesfluidiumet eller serumet ved hjelp av konvensjonelle antistoffrenseprosedyrer slik som for eksempel affinitetskromatografi (f. eks. ved å anvende protein-A- eller protein-G-sefarose) eller ionebytterkromatografi, hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse osv.

DNA som koder for de monoklonale antistoffene blir enkelt isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer (f. eks. ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for tungkjeder og lettkjeder for murine antistoffer). Hybridomcellene tjener som en foretrukket kilde for slikt DNA. Straks det er isolert, kan DNA bli plassert i ekspresjonsvektorer som deretter blir transfektert inn i vertscellene, slik som i E. co//'-celler, simian COS-celler, kinesisk hamster ovarie-(CHO)-celler eller myelomceller som ikke ellers produserer antistoffprotein, for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Oversiktsartikler på rekombinant uttrykking i bakterier av DNA som koder for antistoffet inkluderer Skerra et al., Curr. Opinion in Immunolol., 5:256-262 (1993) og Pliickthun, Immunol. Revs., 130:151-188

(1992).

I en ytterligere utførelsesform kan monoklonale antistoffer eller antistoffragmenter bli isolert fra antistoff-fagbiblioteker som er generert ved å benytte teknikkene som er beskrevet i McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) beskriver hhv. isoleringen av murine og humane antistoffer ved å benytte fagbiblioteker. Senere publikasjoner beskriver produksjon av høyaffinitets-(nM-område) humane antistoffer ved hjelp av kjedeflytting (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), i tillegg til kombinatorisk infeksjon og in wVo-rekombinasjon som en strategi for å konstruere svært store fagbiblioteker (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Dermed er disse teknikkene gode alternativer til tradisjonelle monoklonale antistoff-hybridomteknikker for isolering av monoklonale antistoffer.

DNA som koder for antistoffer kan bli modifisert til å produsere kimære eller fusjonsantistoff-polypeptider, for eksempel ved å substituere humane tungkjede- og lettkjedekonstantdomenesekvenser (CH og CL) med de homologe murine sekvensene (U.S. patentskrift nr. 4 816 567; og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), eller ved å fusjonere den immunglobulinkodende sekvensen med hele eller deler av den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulinpolypeptid (heterologt polypeptid). Ikke-immunglobulin-polypeptidsekvensene kan bli substituert med konstantdomener til et antistoff, eller de blir substituert med variabeldomener til et antigenkombinerende sete til et antistoff for å danne et kimært bivalent antistoff som omfatter et antigenkombinerende sete som har spesifisitet for et antigen, og et annet antigenkombinerende sete som har spesifisitet for et annet antigen.

Humaniserte antistoffer

Fremgangsmåter for humanisering av ikke-humane antistoffer har blitt beskrevet på fagområdet. Foretrukket har et humanisert antistoff én eller flere aminosyrerester introdusert som stammer fra en kilde som er ikke-human. Disse ikke-humane aminosyrerestene blir ofte referert til som "importerte" rester som typisk er tatt fra et "importert" variabeldomene. Humanisering kan i hovedsak bli utført ved å følge fremgangsmåten til Winter og samarbeidspartnere (Jones et al., Nature, 321:522-525

(1986); (Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), ved å substituere hypervariabel regionssekvenser med de tilsvarende sekvensene for et humant antistoff. Slike "humaniserte" antistoffer er kimære antistoffer (U.S. patentskrift nr. 4 816 567) der vesentlig mindre enn et intakt humant variabeldomene har blitt substituert med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis er humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer der noen hypervariabelregion-rester og muligens noen FR-rester, er substituert med rester fra analoge seter i gnagerantistoffer.

Valget av humane variabeldomener, både lette og tunge, som skal benyttes i fremstillingen av de humaniserte antistoffene, er svært viktige for å redusere antigenisitet og HAMA-respons (humant anti-mus-antistoff) når antistoffet er ment å skulle benyttes til human terapeutisk anvendelse. I henhold til den såkalte "beste tilpasnings"-fremgangsmåten, blir sekvensen til variabeldomenet til et gnagerantistoff screenet mot hele biblioteket av kjente humane variabeldomene-sekvenser. Den humane V-domenesekvensen som ligger nærmest den tilsvarende fra en gnager, blir identifisert og den humane rammeverksregionen (FR) innenfor den blir akseptert for det humaniserte antistoffet (Sims et al., J. Immunol.,

151:2296 (1993), Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). En annen fremgangsmåte benytter en spesiell rammeverksregion som er avledet fra konsensussekvensen til alle humane antistoffer i en spesiell undergruppe av lettkjeder eller tungkjeder. Det samme rammeverket kan bli benyttet til flere ulike humaniserte antistoffer (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Det er videre viktig at antistoffene blir humanisert med bibeholdelse av høy bindingsaffinitet for antigenet og andre fordelaktige biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet blir humaniserte antistoffer i henhold til en foretrukket fremgangsmåte fremstilt ved hjelp av en prosess med analyse av mor-sekvensene og ulike konseptuelle humaniserte produkter ved å benytte tredimensjonale modeller av mor-sekvensene og de humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er allment tilgjengelige og er kjent for fagfolk på området. Dataprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og viser sannsynlige tredimensjonale konformasjonsstrukturer av valgte kandidat-immunglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse mulige analyser av den sannsynlige rollen for restene i funksjonen til kandidat-immunglobulinsekvens, dvs. analysen av resider som påvirker kandidat-immunglobulinets evne til å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-resten bli valgt og kombinert fra mottakersekvensene og de importerte sekvensene, slik at de ønskede antistoffkarakteristika, slik som økt affinitet for målantigenet/antigenet blir oppnådd. Generelt er hypervariabelregionrestene direkte og svært vesentlig involvert i påvirkning av antigenbinding.

Det humaniserte antistoffet kan være et antistoff-fragment slik som en Fab som eventuelt er konjugert med ett eller flere cytotoksiske midler for å generere et immunkonjugat. Alternativt kan det humaniserte antistoffet være et fullengdeantistoff, slik som et fullengde-IgGl-antistoff.

Humane antistoffer og fag- display- metodikk

Som et alternativ til humanisering kan humane antistoffer bli generert. For eksempel er det nå mulig å produsere transgene dyr (f.eks. mus) som ved immunisering er i stand til å produsere et fullt repertoar av humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon. For eksempel har det blitt beskrevet at den homozygote delesjonen av genet for antistofftungkjede-sammenbindingsregionen (JH) i kimære og kjønnslinjemutante mus fører til fullstendig inhibering av endogen antistoffproduksjon. Overføring av den humane kjønnslinje-immunglobulin-gensamlingen inn i en slik kjønnslinjemutant mus, vil føre til produksjon av humane antistoffer som følge av antigen utfordring. Se f.eks. Jakobovits et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggeman et al., Year in Immuno, 7:33

(1993); U.S. patentskrift nr. 5 545 806, 5 591 669 (alle fra GenPharm); 5 545 807 og WO 97/17852.

Alternativt kan fag-display-teknologi (McCafferty et al., Nature 348:552-553

[1990]) bli benyttet for å fremstille humane antistoffer og antistoff rag menter in vitro fra variabel-(V)-domen-genrepertoaret for immunglobuliner fra uimmuniserte donorer. I henhold til denne teknikken blir antistoff-V-domene-gener klonet i ramme inn i enten et større eller mindre kappeprotein-gen fra en filamentøs bakteriofag, slik som M13 eller fd, og fremvist som funksjonelle antistoff-fragmenter på overflaten til fagpartikkelen. Fordi den filamentøse partikkelen inneholder en enkelttrådet DNA-kopi av faggenomet, fører seleksjoner basert på de funksjonelle egenskapene til antistoffet også til seleksjon av genet som koder for antistoffet som utviser disse egenskapene. Dermed etterligner fagen også noen av egenskapene til B-cellen. Fag-display kan bli utført i en mengde ulike formater som er gjennomgått i f.eks. Johnson, Kevin S. og Chiswell, David J., Current in Structural Biology 3:564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan bli benyttet til fag-display. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolerte en uensartet samling av anti-oksazolon-antistoffer fra et lite, tilfeldig kombinatorisk bibliotek av V-gener som er avledet fra milten til immuniserte mus. Et repertoar av V-gener fra uimmuniserte humane donorer kan bli konstruert og antistoffer mot en uensartet samling av antigener (inkludert (selv-antigener) kan bli isolert ved essensielt å følge teknikkene som er beskrevet av Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) eller Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Se også U.S. patentskrift nr. 5 565 332 og 5 573 905.

Som diskutert ovenfor kan humane antistoffer også bli generert ved hjelp av in wtro-aktiverte B-celler (se U.S. patentskrift nr. 5 567 610 og 5 229 275).

Antistoff- fragmenter

I visse tilfeller er det fordelaktig å benytte antistoff-fragmenter i stedet for hele antistoffer. Den mindre størrelsen til fragmentene medfører rask fjerning og kan føre til forbedret tilgang til faste tumorer.

Ulike teknikker har blitt utviklet for produksjon av antistoff-fragmenter. Tradisjonelt ble disse fragmentene avledet via proteolytisk fordøying av intakte antistoffer (se f.eks. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); og Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Likevel kan disse fragmentene nå bli fremstilt direkte ved hjelp av rekombinante vertsceller. Fab-, Fv- og ScFv-antistoff-fragmenter kan alle bli uttrykt i og utskilt fra E. coli for derved å tillate den lette produksjonen av store mengder av fragmentene. Antistoff-fragmenter kan bli isolert fra antistoff-fagbibliotekene som diskutert ovenfor. Alternativt kan Fab'-SH-fragmenter bli direkte gjenvunnet fra E. coli og kjemisk koplet for å danne F(ab')2-fragmenter (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167

(1992). I overensstemmelse med en annen tilnærming kan F(ab')2-fragmenter bli isolert direkte fra rekombinant vertscellekultur. Fab og F(ab')2-fragmenter med økt halveringstid in vivo som omfatter bergings-reseptor-bindingsepitop-rester, er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 869 046. Andre teknikker for fremstillingen antistoff-fragmenter vil være tilgjengelige for fagfolk på området. I andre utførelsesformer er antistoffet som ble valgt, et enkeltkjede-Fv-fragment (scFv). Se WO 93/16185; U.S. patentskrift nr. 5 571 894 og U.S. patentskrift nr. 5 587 458. Fv og sFv er de eneste enhetene med intakte kombinasjonsseter som er frie for konstante regioner, og dermed er de hensiktsmessige for redusert uspesifikk binding under anvendelse in vivo. sFv-fusjonsproteiner kan konstrueres for å gi fusjon av et effektorprotein enten på amino- eller karboksyterminalen til en sFv. Se Antibody Engineering, utgiver Borrebaeck, ovenfor. Antistoff-fragmenter kan også være et "lineært antistoff", foreksempel som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 641 870. Slike lineære antistoff-fragmenter kan være monospesifikke eller bispesifikke.

Bispesifikke antistoffer

Bispesifikke antistoffer er antistoffer som har bindingspesifisiteter for minst to ulike epitoper. Eksempelvise bispesifikke antistoffer kan binde til to ulike epitoper på CD20-proteinet. Andre slike antistoffer kan kombinere et CD20-bindende sete med et bindingssete for et annet protein. Alternativt kan en anti-CD20-arm bli kombinert med en arm som binder til et utløsende molekyl på en leukocytt, slik som et T-cellereseptor molekyl (f. eks. CD3) eller Fc-reseptorer for IgG (FcyR), slik som FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) og FcyRIII (CD16) eller NKG2D eller annen NK-celleaktiverende ligand, for å fokusere og lokalisere cellulære forsvarsmekanismer mot den CD20-uttrykkende cellen. Bispesifikke antistoffer kan også bli benyttet for å lokalisere cytotoksiske midler til celler som uttrykker CD20. Disse antistoffene innehar en CD20-bindende arm og en arm som binder det cytotoksiske midlet (f. eks. saporin, anti-interferon-a, vinca-alkaloid, ricin-A-kjede, metotreksat eller radioaktivt isotophapten). Bispesifikke antistoffer kan bli fremstilt som fullengde-antistoffer eller antistoff-fragmenter (f. eks. F(ab')2-bispesifikke antistoffer).

WO 96/16673 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-FcyRIII-antistoff og U.S. patentskrift nr. 5 837 234 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-FcyRI-antistoff. Et bispesifikt anti-ErbB2/Fca-antistoff er vist i WO 98/02463. U.S. patentskrift nr. 5 821 337 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-CD3-antistoff.

Fremgangsmåter for å fremstille bispesifikke antistoffer er kjent på fagområdet. Tradisjonell fremstilling av fullengde bispesifikke antistoffer er basert på ko-uttrykkingen av to immunglobulin-tungkjede-lettkjedepar der de to kjedene har ulike spesifisiteter (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). På grunn av det tilfeldige utvalg av immunglobulintungkjeder og -lettkjeder produserer disse hybridomene (kvadromer) en potensiell blanding av 10 ulike antistoffmolekyler der kun ett har den korrekte bispesifikke strukturen. Rensing av det korrekte molekylet, som vanligvis blir utført ved hjelp av affinitetskromatografi-trinn er ganske besværlig og produktutbyttet er lavt. Tilsvarende prosedyrer er beskrevet i WO 93/08829 og i Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

I henhold til en annen tilnærming blir antistoff-variabeldomener med de ønskede bindingsspesifisiteter (antistoff-antigenkombinerende seter) fusjonert til immunglobulin-konstantdomene-sekvenser. Foretrukket er fusjonen med et Ig-tungkjede-konstantdomene som omfatter minst én del av CH2- og CH3-hengsleregionene. Det er foretrukket at den første tungkjede-konstantregionen (CH1) inneholder setet som er nødvendig for lettkjede-binding til stede i minst én av fusjonene. DNA som koder for immunglobulin-tungkjede-fusjonene og, hvis ønskelig immunglobulinlettkjeden, blir innsatt i separate ekspresjonsvektorer og blir ko-transfektert inn i en passende vertcelle. Dette gir større fleksibilitet i justeringen av de gjensidige proporsjoner for de tre polypeptidfragmentene i utførelses-former når ulike forhold av de tre polypeptidkjedene som blir benyttet i konstruksjonen tilveiebringer det optimale utbyttet av det ønskede bispesifikke antistoffet. Det er likevel mulig å sette inn den kodende sekvensen for to eller alle tre polypeptidkjeder inn i en enkelt ekspresjonsvektor når uttrykkingen av minst to polypeptidkjeder i like forhold fører til høye utbytter eller når forholdene ikke har noen signifikant effekt på utbyttet av den ønskede kjedekombinasjonen.

I en foretrukket utførelsesform av denne tilnærmingen er de bispesifikke antistoffene sammensatt av en hybrid immunglobulin-tungkjede med en første bindingsspesifisitet i én arm og et hybrid immunglobulin-tungkjede - lettkjedepar (som tilveiebringer en andre bindingsspesifisitet) i den andre armen. Det ble funnet at denne asymmetriske strukturen fremmer separasjonen av den ønskede bispesifikke forbindelsen fra uønskede immunglobulinkjede-kombinasjoner siden tilstedeværelsen av en immunglobulin-lettkjede i kun halvparten av det bispesifikke molekylet tilveiebringer en lettvint separasjonsmåte. Denne tilnærmingen er beskrevet i WO 94/04690. For ytterligere detaljer når det gjelder generering av bispesifikke antistoffer, se for eksempel Suresh et al. Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

I henhold til en annen tilnærming som er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 731 168 kan grenseflaten mellom et par av antistoffmolekyler bli fremstilt for å maksimere prosentandelen av heterodimerer som blir gjenvunnet fra rekombinant cellekultur. Den foretrukne grenseflaten omfatter minst en del av CH3-domenet. I denne fremgangsmåten blir én eller flere små aminosyre-sidekjeder fra grenseflaten til det første antistoff-molekylet erstattet med større sidekjeder (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Kompensatoriske "hulrom" av identisk eller tilsvarende størrelse som de større sidekjedene blir dannet på grenseflaten til det andre antistoff-molekylet ved å erstatte store aminosyresidekjeder med mindre (for eksempel alanin eller treonin). Dette tilveiebringer en mekanisme for å øke utbyttet av heterodimeren i forhold til andre uønskede endeprodukter slik som homodimerer.

Bispesifikke antistoffer inkluderer kryssbundne eller "heterokonjugate" antistoffer. For eksempel kan ett av antistoffene i heterokonjugatet blir koblet til avidin og den andre til biotin. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått å målrette immunsystem-celler til uønskede celler (U.S. patentskrift nr. 4 676 980) og for behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360, WO 92/200373 og EP 03089). Heterokonjugat-antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte enhver hensiktsmessig kryssbindings-fremgangsmåte. Hensiktsmessige kryssbindende midler er velkjente på fagområdet og er beskrevet i U.S. patentskrift nr.

4 676 980 sammen med et antall kryssbindingsteknikker.

Teknikker for å fremstille bispesifikke antistoffer fra antistoff-fragmenter er også blitt beskrevet i litteraturen. For eksempel kan bispesifikke antistoffer bli fremstilt ved å benytte kjemisk kobling. Brennan et al. Science, 229: 81 (1985) beskriver en prosedyre der intakte antistoffer blir proteolytisk spaltet for å generere F(ab')2_fragmenter. Disse fragmentene blir redusert i nærvær av ditiol-komplekseringsmiddelet, natriumarsenitt, for å stabilisere nærliggende ditioler og forhindre intermolekylær disulfiddannelse. Fab'-fragmentene som blir fremstilt, blir deretter konvertert til tionitrobenzoat (TN B)-de ri vater. Et av Fab'-TNB-derivatene blir deretter rekonvertert til Fab'-tiolen ved reduksjon med merkaptoetylamin og blir blandet med en ekvimolar mengde av det andre Fab'-TNB-derivatet for å danne det bispesifikke antistoffet. De bispesifikke antistoffene som blir fremstilt kan bli benyttet som midler til den selektive immobiliseringen av enzymer.

Nyere fremskritt har lettet den direkte gjenvinningen av Fab'-SH-fragmentet fra E. Coli som kan kobles kjemisk for å danne bispesifikke antistoffer. Shalaby et al. J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) beskriver fremstillingen av et fullt humanisert bispesifikt antistoff-F(ab')2-molekyl. Hvert Fab'-fragment ble separat utskilt fra E. Coli og utsatt for rettet kjemisk kobling in vitro for å danne det bispesifikke antistoffet. Det bispesifikke antistoffet dannet på denne måten var i stand til å binde til celler som overuttrykte ErbB2-reseptoren og normale, humane T-celler, så vel som å utløse den lytiske aktiviteten til humane cytotoksiske lymfocytter mot humane bryst-tumor mål.

Ulike teknikker for å fremstille og isolere bispesifikke antistoff-fragmenter direkte fra rekombinant cellekultur har også blitt beskrevet. For eksempel har bispesifikke antistoffer blitt fremstilt ved å benytte leucinzippere. Kostelny et al. J. Immunol, 148(5): 1547-1553

(1992). Leucinzipperpeptidene fra Fos- og Jun-proteinene ble bundet til Fab'-delen av to ulike antistoffer ved hjelp av genfusjon. Antistoff-homodimerene ble redusert på hengsle- regionen for å danne monomerer og deretter reoksidert for å danne antistoff-heterodimerene. Denne fremgangsmåten kan også bli benyttet i fremstillingen av antistoff-homodimerer. "Dialegeme"-teknologien som er beskrevet av Hollinger et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993) har tilveiebrakt en alternativ mekanisme for å fremstille bispesifikke antistoff-fragmenter. Fragmentene omfatter en VH bundet til en VLved hjelp av en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på den samme kjeden. Dermed blir VH- og VL-domenene på et fragment tvunget til å pare med de komplementære VL- og VH-domenene på et annet fragment for derved å danne to antigen-bindingsseter. En annen strategi for å fremstille bispesifikke antistoff-fragmenter ved hjelp av enkeltkjede-Fv (sFv)-dimerer har også blitt rapportert. Se Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Antistoffer med mer enn to valenser er omfattet. For eksempel kan trispesifikke antistoffer bli fremstilt. Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).

Multivalente antistoffer

Et multivalent antistoff kan bli internalisert (og/eller katabolisert) raskere enn et bivalent antistoff av en celle som uttrykker et antigen til hvilket antistoffene binder. Antistoffene kan være multivalente antistoffer (som ikke er av IgM-klasse) med tre eller flere antigenbindende seter (for eksempel tetravalente antistoffer) som enkelt kan bli produsert ved hjelp av rekombinant uttrykking av nukleinsyrer som koder for polypeptidkjedene til antistoffet. Det multivalente antistoffet kan omfatte et dimeriseringsdomene og tre eller flere antigenbindende seter. Det foretrukne dimeriseringsdomenet omfatter (eller består av) en Fc-region eller en hengsleregion. I dette scenarioet vil antistoffet omfatte en Fc-region og tre eller flere antigenbindende seter aminoterminalt i forhold til Fc-regionen. Det foretrukne multivalente antistoffet her omfatter (eller består av) tre til omtrent åtte, men foretrukket fire, antigenbindende seter. Det multivalente antistoffet omfatter minst én polypeptidkjede (og fortrinnsvis to polypeptidkjeder) der polypeptidkjeden/kjedene omfatter to eller flere variabeldomener. For eksempel kan polypeptidkjeden/kjedene omfatte VD1-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc, der VD1 er et førstevariabeldomene, VD2 er et andrevariabeldomene, Fc er en polypeptidkjede av en Fc-region, XI og X2 representerer en aminosyre eller polypeptid, og n er 0 eller 1. For eksempel kan polypeptidkjeden/kjedene omfatte: VH-CH1-fleksibellinker-VH-CHl-Fc-regionkjede, eller VH-CHl-VH-CHl-Fc-regionkjede. Det multivalente antistoffet omfatter fortrinnsvis ytterligere minst to (og fortrinnsvis fire) lettkjede-variabeldomene-polypeptider. Det multivalente antistoffet kan for eksempel omfatte fra omtrent to til omtrent åtte lettkjede-variabeldomene-polypeptider. Lettkjede-variabeldomene-polypeptidene omfatter et lettkjede-variabeldomene og eventuelt ytterligere et CL-domene.

Andre aminosyresekvensmodifisennger

Aminosyresekvensmodifiseringer av de CD20-bindende antistoffene som er beskrevet her er forutsett. For eksempel kan det være ønskelig å forbedre bindingsaffiniteten og/eller andre biologiske egenskaper for antistoffet. Aminosyresekvens-varianter av anti-CD20-antistoffet blir fremstilt ved å introdusere hensiktsmessige nukleotidendringer i anti-CD20-antistoff-nukleinsyren eller ved hjelp av peptidsyntese. Slike modifikasjoner inkluderer for eksempel delesjoner fra, og/eller insersjoner i, og/eller substitusjoner av rester i aminosyresekvensen til anti-CD20-antistoffet. Enhver kombinasjon av delesjon, insersjon og substitusjon blir utført for å komme frem til sluttkonstruksjonen, gitt at sluttkonstruksjonen innehar de ønskede karakteristika. Aminosyre-endringene kan også endre postranslasjonelle prosesser av anti-CD20-antistoffet, slik som å endre antallet eller posisjonen til glykosyleringseter.

En nyttig fremgangsmåte for identifisering av visse rester eller regioner i anti-CD20-antistoffet som er foretrukne lokaliseringer for mutagenese blir kalt "alaninscanningsmutagenese" som beskrevet av Cunningham og Wells i Science, 244:1081-0185 (1989). Her blir en rest eller gruppe av målrester identifisert (for eksempel ladde rester slik som arg, asp, his, lys og glu) og erstattet med en nøytral eller negativt ladd aminosyre (mest foretrukket alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med CD20-antigen. Disse aminosyre-lokaliseringene som viser funksjonell sensitivitet overfor substitusjonene blir deretter forbedret ved å introdusere ytterligere eller andre varianter på, eller istedenfor, setene for substitusjon. Mens setet for introdusering av en aminosyre-sekvensvariasjon er forhåndsbestemt, trenger ikke karakteren til mutasjonen perse å være forhåndsbestemt. For eksempel, for å analysere virkningen av en mutasjon på et gitt sete, blir ala-scanning eller tilfeldig mutagenese utført på målkodonet eller målregionen, og de uttrykte anti-CD20-antistoffvariantene blir screenet for den ønskede aktiviteten.

Aminosyresekvens-insersjoner inkluderer amino- og/eller karboksylterminalfusjoner som varierer i lengde fra én rest til polypeptider som inneholder 100 eller flere rester, i tillegg til intrasekvens-insersjon av enkle eller multiple aminosyrerester. Eksempler på terminale insersjoner inkluderer et anti-CD20-antistoff med en N-terminal metionylrest eller antistoffet fusjonert til et cytotoksisk polypeptid. Andre insersjonsvarianter av anti-CD20-antistoffmolekylet inkluderer fusjonen til N- eller C-terminalen til anti-CD20-antistoffet til et enzym (for eksempel for ADEPT) eller et polypeptid som øker halveringstiden i serum for antistoffet.

En annen type variant er en aminosyre-substitusjonsvariant. Disse variantene har minst én aminosyrerest i anti-CD20-antistoffmolekylet erstattet med en annen rest. Setene av størst interesse for substitusjonsmutagenese inkluderer de hypervariable regionene, men FR-endringer er også omfattet. Konservative substitusjoner er vist i tabellen nedenfor under overskriften "foretrukne substitusjoner". Hvis slike substitusjoner fører til en endring i biologisk aktivitet, da kan mer omfattende endringer, kalt "eksemplariske substitusjoner" i tabellen, eller som videre beskrevet nedenfor med referanse til aminosyre-klasser, bli introdusert og produktene screenet.

Omfattende modifikasjoner i de biologiske egenskapene til antistoffet blir utført ved å velge substitusjoner som skiller seg vesenlig når det gjelder deres effekt i å opprettholde (a) strukturen til polypeptidryggraden i området for substitusjonen, for eksempel som en flatekonformasjon eller en helisk konformasjon (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet på målsetet eller (c) omfanget av sidekjeden. Naturlig forekommende rester blir delt i grupper basert på felles sidekjedeegenskaper:

(1) hydrofobe: norleucin, met, ala, val, leu, ile,

(2) nøytral hydrofil: cys, ser, thr,

(3) sure: asp, glu,

(4) basiske: asn, gin, his, lys, arg,

(5) rester som påvirker kjedeorientering: gly, pro og

(6) aromatiske, trp, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil innebære å bytte et medlem av en av disse klassene med en annen klasse.

Enhver cysteinrest som ikke er involvert i å opprettholde den riktige konformasjonen til anti-CD20-antistoffet kan også bli substituert, generelt med serin, for å forbedre den oksidative stabiliteten til molekylet og forhindre feilaktig kryssbinding. Motsatt kan cysteinbinding(er) bli innført i antistoffet for å forbedre dets stabilitet (spesielt der antistoffet er et antistoff-fragment slik som et Fv-fragment).

En spesielt foretrukket type av en substitusjonsvariant involverer å substituere én eller flere hypervariabelregion-rester i et mor-antistoff (f. eks. et humanisert eller humant antistoff). Vanligvis vil den resulterende varianten(ene) som er valgt for ytterligere utvikling, ha forbedrede biologiske egenskaper i forhold til mor-antistoffet fra hvilket de er generert. En passende måte å generere slike substitusjonsvarianter involverer affinitets-modning ved å benytte fag-display. Kort fortalt blir flere hypervariabelregion-seter (f. eks. 6-7 seter) mutert for å generere alle mulige aminosyresubstitusjoner på hvert sete. Antistoffvariantene som dermed blir generert, blir fremvist på en monovalent måte fra filamentøse fagpartikler som fusjoner med produktet av gen-III i M13 pakket inne i hver partikkel. Fag-display-variantene blir deretter screenet for deres biologiske aktivitet (f. eks. bindingsaffinitet) som beskrevet her. For å kunne identifisere hypervariabelregion-kandidatseter for modifisering, kan alaninscanningsmutagenese bli utført for å identifisere hypervariabelregion-rester som bidrar vesentlig til antigenbinding. Alternativt, eller i tillegg, kan det være fordelaktig å analysere en krystallstruktur av antigen-antistoffkomplekset for å identifisere kontakt-punkter mellom antistoffet og human CD20. Slike kontaktrester og naborester er kandidater for substitusjon ifølge teknikkene som blir benyttet her. Straks slike varianter har blitt generert blir panelet av varianter utsatt for screening som beskrevet her, og antistoffer med overlegne egenskaper i én eller flere relevante analyser kan bli valgt for ytterligere utvikling.

En annen type av aminosyrevariant av antistoffet endrer det opprinnelige glykosyleringsmønsteret til antistoffet. Med endring er det ment fjerning av én eller flere karbohydratenheter som er funnet på antistoffet og/eller innføring av ett eller flere glykosyleringsseter som ikke foreligger i antistoffet.

Glykosylering av antistoffer er typisk enten N-bundet eller O-bundet. N-bundet refererer til koblingen av karbohydratenheten på sidekjeden til en asparaginrest. Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, der X er enhver aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjenningssekvensene for enzymatisk påkobling av karbohydratenheten til asparaginsidekjeden. Dermed danner tilstedeværelsen av enhver av disse tripeptidsekvensene i et polypeptid et potensielt glykosyleringssete. O-bundet glykosylering refererer til påkoblingen av ett av sukkerenhetene N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, vanligst serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksy-lysin også kan bli benyttet.

Innføring av glykosyleringsseter på antistoffet blir passende utført ved å endre aminosyresekvensen slik at den inneholder én eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptidsekvensene (for N-bundne glykosyleringsseter). Endringen kan også bli utført ved tilsetningen av, eller substitusjonen med, én eller flere serin- eller treoninrester i sekvensen til det opprinnelige antistoffet (for O-bundne glykosyleringsseter).

Nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvens-varianter av anti-CD20-antistoffet blir fremstilt ved hjelp av en mengde ulike fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Disse fremgangsmåtene inkluderer isolering fra en naturlig kilde (i tilfellet med naturlig forekommende aminosyresekvens-varianter) eller fremstilling ved hjelp av oligo-nukleotidmediert (eller seterettet) mutagenese, PCR-mutagenese og kassettmutagenese av en tidligere fremstilt variant eller en ikke-variantversjon av anti-CD20-antistoffet.

Det kan være ønskelig å modifisere antistoffet ifølge oppfinnelsen med hensyn til effektorfunksjon, for eksempel for å forbedre antigenavhengig, cellemediert cytotoksisitet (ADCC) og/eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) for antistoffet. Dette kan bli oppnådd ved å introdusere én eller flere aminosyre-substitusjoner i en Fc-region i antistoffet. Alternativt eller i tillegg kan cysteinrester bli introdusert i Fc-regionen for derved å tillate interkjede-disulfidbindingsdannelse i denne regionen. Det homo-dimere antistoffet som på denne måten blir generert, kan ha forbedret internaliserings-kapasitet og/eller økt komplement-mediert celledreping og antistoff-avhengig celluær cytotoksisitet (ADCC). Se Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) og Shopes, B.J. Immunol. 148: 2918-2922

(1992). Homodimere antistoffer med forbedret antitumoraktivitet kan også bli fremstilt ved å benytte hetero-bifunksjonelle krysslinkere som beskrevet i Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativt kan et antistoff som har to Fc-regioner bli utviklet og som derved kan ha forbedret komplement-mediert lysering og ADCC-kapasiteter. Se Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

For å øke halveringstid av antistoffet i serum, kan man inkorporere en rednings-reseptorbindingsepitop i antistoffet (spesielt et antistoff-fragment) som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 739 277 for eksempel. Som benyttet her, refererer uttrykket "rednings-reseptorbindingsepitop" til en epitop i Fc-regionen til et IgG-molekyl (for eksempel IgGi, IgG2, IgG3eller IgG4) som er ansvarlig for å øke halveringstiden for IgG-molekylet in vivo i serum.

Andre antistoff- modifikasjoner

Andre modifikasjoner av antistoffet er omfattet her. For eksempel kan antistoffet bli koblet til én av en mengde ulike ikke-proteinpolymerer, for eksempel polyetylenglykol, poly- propylenglykol, polyoksyalkylener eller kopolymerer av polyetylenglykol og polypropylen-glykol. Antistoffet kan også bli innfanget i mikrokapsler, fremstilt for eksempel ved hjelp av koaservasjonsteknikker eller ved hjelp av interfasepolymerisering (for eksempel hydroksy-metyllcellulose- eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetacylat) mikrokapsler) i kolloidale legemiddel-leveringssystemer (for eksempel liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A., utg. (1980).

Screening for antistoffer med de ønskede egenskaper

Antistoffer med visse biologiske karakteristika kan bli valgt som beskrevet i de eksperimentelle eksemplene.

De vekstinhibitoriske effektene av et anti-CD20-antistoff ifølge oppfinnelsen kan bli undersøkt ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, f. eks. ved å benytte celler som uttrykker CD20 enten endogent eller etter transfeksjon med CD20-genet. For eksempel kan tumorcellelinjer og CD20-transfekterte celler bli behandlet med et monoklonalt anti-CD20-antistoff ifølge oppfinnelsen ved ulike konsentrasjoner i noen få dager (f. eks. 2-7 dager) og farget med krystallfiolett eller MTT eller analysert ved hjelp av en annen kolorimetrisk analyse. En annen fremgangsmåte for å måle proliferasjon vil være å sammenligne<3>H-tymidinopptak for cellene som er behandlet i nærvær eller fravær av et anti-CD20-antistoff ifølge oppfinnelsen. Etter antistoffbehandling blir cellene høstet og mengden av radioaktivitet som er inkorporert i DNA blir kvantitert i en scintillasjonsteller. Hensiktsmessige, positive kontroller inkluderer behandling av en valgt cellelinje med et vekstinhibitorisk antistoff som er kjent for å inhibere vekst av denne cellelinjen.

For å selektere for antistoffer som induserer celledød kan tap av membran integritet, som indikert ved for eksempel propidiumjodid (PI), trypanblått eller 7AAD-opptak, bli undersøkt i forhold til kontroll. En PI-opptaksanalyse kan bli utført i fravær av komplement og immuneffektorceller. CD20-uttrykkende tumorceller blir inkubert med medium alene eller medium inneholdende det hensiktsmessige, monoklonale antistoff ved for eksempel omtrent 10 \ ig/ m\. Cellene blir inkubert i en 3-dagers tidsperiode. Etter hver behandling blir celler vasket og fordelt i 35 mm filterkorkede 12 x 75 rør (1 ml per rør, 3 rør per behandlingsgruppe) for fjerning av celleklumper. Rørene mottar deretter PI (10 \ ig/ m\). Prøver kan bli analysert ved å benytte et FACSCAN-flowcytometer og FACSCONVERT-CellQuest-programvare (Becton Dickinson). De antistoffene som induserer statistisk signifikante nivåer av celledød som bestemt ved PI-opptak, kan bli valgt som celledød-induserende antistoffer.

For å screene for antistoffer som binder til en epitop på CD20 bundet av et antistoff av interesse, kan en rutinemessig kryssblokkeringsanalyse slik som den som er beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, utg. Harlow og David Lane

(1988) bli utført. Denne analysen kan bli benyttet for å bestemme hvorvidt et test-antistoff binder på det samme setet eller epitop som et anti-CD20-antistoff ifølge oppfinnelsen. Alternativt, eller i tillegg, kan epitop-kartlegging bli utført ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. For eksempel kan antistoff-sekvensen bli mutert, slik som ved alaninscanning, for å identifisere kontaktrester. Det muterte antistoffet blir i utgangspunktet testet for binding med polyklonalt antistoff for å sikre riktig folding. I en annen fremgangsmåte kan peptider som tilsvarer ulike regioner på CD20 bli benyttet i konkurrerende analyser med test-antistoffene eller med et test-antistoff og et antistoff med enkarakteriserteller kjent epitop.

Vektorer, vertceller og rekombinante fremgangsmåter

Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert nukleinsyre som koder for et humanisert CD20-bindende antistoff, vektorer og vertceller som omfatter nukleinsyren og rekombinante teknikker for fremstillingen av antistoffet.

For rekombinant produksjon av antistoffet, blir nukleinsyren som koder for det isolert og innsatt i en replikerbar vektor for videre kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. DNA som koder for det monoklonale antistoffet kan med letthet bli isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer (f. eks. ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjedene til antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelige. Vektorkomponentene inkluderer vanligvis én eller flere av de følgende: en signalsekvens, et startsted for replikasjon, ett eller flere markørgener, et enhancerelement, en promotor og en transkripsjonstermineringssekvens.

( i) Signalsekvenskomponent

Det CD20-bindende antistoffet ifølge oppfinnelsen kan bli produsert rekombinant, ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid som fortrinnsvis er en signalsekvens eller annet polypeptid som har et spesifikt kløyvingssete på N-terminalen til det modne proteinet eller polypeptidet. Den heterologe signalsekvensen som ble valgt er fortrinnsvis én som blir gjenkjent og prosessert (dvs. kløyvd ved hjelp av en signalpeptidase) av vertcellen. For prokaryote vertceller som ikke gjenkjenner og prosesserer den native CD20-bindende antistoff-signalsekvensen, blir signalsekvensen substituert med en prokaryot signalsekvens som for eksempel er valgt fra gruppen av alkalisk fosfatase, penicillinase, Ipp eller varmestabile enterotoksin-II-ledere. For utskilling i gjær kan den native signalsekvensen bli substituert med for eksempel gjærinvertaselederen, a-faktoHederen (inkludert Saccharomyces og Kluyveromyces a-faktorlederne) eller syrefosfataselederen, C. a/b/cans-glukoamylaselederen eller signalet som er beskrevet i WO 90/13646. I pattedyrcelle-ekspresjon er pattedyr-signalsekvenser så vel som virus-sekretoriske ledere, for eksempel herpes simplex gD-signalet tilgjengelige.

DNA for en slik forløperregion blir ligert i leseramme til DNA som koder for det CD20-bindende antistoffet.

( ii) Startsted for replikasjon

Både ekspresjonsvektorer og kloningsvektorer inneholderen nukleinsyresekvens som gjør vektoren i stand til å replikere i én eller flere valgte vertceller. I kloningsvektorer er denne sekvensen generelt én som gjør vektoren i stand til å replikere uavhengig av vertens kromosomale DNA og inkluderer startstedet for replikasjon eller autonomt replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjente for en mengde bakterier, gjær og virus. Startstedet for replikasjon fra plasmidet pBR322 er egnet for de fleste gram-negative bakterier, startstedet i 2^-plasmidet er egnet for gjær, og ulike startseder i virus (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er nyttige for kloningsvektorer i pattedyrceller. Vanligvis er ikke startstedet for replikasjonskomponenten nødvendig for pattedyr-ekspresjonsvektorer (startstedet i SV40 kan typisk bli benyttet kun fordi det inneholder den tidlige promotoren).

( iii) Seleksjonsgenkomponent

Ekspresjonsvektorer og kloningsvektorer kan inneholde et seleksjonsgen som også blir kalt en selekterbar markør. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) overfører resistens for antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampicillin, neomycin, metotreksat ellet tetrasyklin, (b) kompletterer auksotrofiske mangler eller (c) tilfører nødvendige næringsemner som ikke er tilgjengelige fra komplekse medier, f. eks genet som koder for D-alaninracemase for Bacilli.

Ett eksempel på et seleksjonsskjema benytter et legemiddel for å stoppe veksten av en vertscelle. De cellene som er vellykket transformert med et heterologt gen produserer et protein som overfører legemiddelresistens og dermed overlever seleksjonsregimet. Eksempler på en slik dominant seleksjon benytter legemidlet neomycin, mykofenolsyre og hygromycin.

Et annet eksempel på passende selekterbare markører for pattedyrceller er de som muliggjør identifiseringen av celler som er kompetente til å ta opp nukleinsyren for det CD20-bindende antistoffet, slik som DHFR, tymidinkinase, metallotionein-I og -II, fortrinnsvis metallotioneingener fra primater, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase osv.

For eksempel blir celler som er transformert med DHFR-seleksjonsgenet først identifisert ved å dyrke alle transformantene i et kulturmedium som inneholder metotreksat (Mtx), som er en konkurrerende antagonist av DHFR. En hensiktsmessig vertscelle når villtype-DHFR blir benyttet, er kinesisk hamster ovarie-(CHO)-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet (f. eks ATCC CRL-9096).

Alternativt kan vertsceller (spesielt villtypeverter som inneholder endogent DHFR) transformert eller ko-transformert med DNA-sekvenser som koder for CD20-bindende antistoff, villtype-DHFR-protein og en annen selekterbar markør, slik som aminoglykosid-3'-fosfotransferase (APH) bli selektert ved cellevekst i medium som inneholder et seleksjons- middel for den selekterbare markøren slik som et aminoglykosidantibiotikum, f. eks. kanamycin, neomycin eller G418. Se U.S. patentskrift nr. 4 965 199.

Et nyttig seleksjonsgen for anvendelse i gjær er f/pl-genet som foreligger i gjærplasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Trpl-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1. Jones, Genetics 85:12 (1977). Tilstedeværelsen av t/pl-lesjonen i gjærvertcellegenomet tilveiebringer dermed et effektivt miljø for å påvise transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan. Tilsvarende er Leu2-manglende gjærstammer (ATCC 20 622 eller 38 626) omfattet av kjente plasmider som bærer Z.ei/2-genet.

I tillegg kan vektorer som er avledet fra det sirkulære plasmidet pKDl på 1,6^m bli benyttet for transformasjon av Kluyveromyces- gjær. Alternativt ble et ekspresjonssystem for storskalaproduksjon av rekombinant kalvechymosin rapportert for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Stabile mulitkopi-ekspresjonsvektorer for utskilling av modent rekombinant humant serumalbumin ved hjelp av industrielle stammer av Kluyveromyces har også blitt beskrevet. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

( iv) Promotorkomponent

Ekspresjonvektorer og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promotor som blir gjenkjent av vertsorganismen og som er operabelt bundet til nukleinsyren som koder for det CD20-bindende antistoffet. Promotorer som er egnet for anvendelse med prokaryote verter, inkluderer pfroA-promotoren, p-laktamase og laktosepromotorsystemer, alkalisk fosfatasepromotor, et tryptofan (trp)-promotorsystem og hybridpromotorer, slik som tac-promotoren. Likevel er andre bakterielle promotorer egnede. Promotorer til anvendelse i bakterielle systemer vil også inneholde en Shine-Dalgarno (S.D.)-sekvens som er operabelt bundet til DNA som koder for det CD20-bindende antistoffet.

Promotersekvenser er kjent for eukaryoter. Nesten alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert omtrent 25 til 30 baser oppstrøms fra setet der transkripsjon blir startet. En annen sekvens som kan bli funnet 70 til 80 baser oppstrøms fra starten av transkripsjon fra mange gener er en CNCAAT-region der N kan være ethvert nukleotid. Ved den 3' enden til de fleste eukaryote gener finnes en AATAAA- sekvens som kan være signalet for påsetningen av poly-A-halen på den 3' enden av den kodende sekvensen. Alle disse sekvensene kan hensiktsmessig bli innsatt i eukaryote ekspresjonsvektorer.

Eksempler på egnede promotorsekvenser til anvendelse med gjærverter inkluderer promotorene for 3-fosfoglyseratkinase eller andre glykolytiske enzymer slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofrukto-kinase, glykose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase.

Andre gjærpromotorer som er induserbare promotorer som har den ytterligere fordelen av at transkripsjon er kontrollert av vekstbetingelser, er promotorregionene for alkoholdehydrogenase-2, isocytokrom-C, sur fosfatase, degraderende enzymer assosiert med nitrogenmetabolisme, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galaktoseutnyttelse. Egnede vektorer og promotorer til anvendelse ved gjæruttrykking er videre beskrevet i EP 73 657. Gjærenhancere er også med fordel benyttet sammen med gjærpromotorer.

CD20-bindende antistoff-transkripsjon fra vektorer i pattedyrvertceller er for eksempel kontrollert av promotorer som er fremskaffet fra genomene til virus slik som polyomavirus, fuglekoppevirus, adenovirus (slik som adenovirus-2), bovint papillomavirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og mest foretrukket Simian Virus 40 (SV40), fra heterologe pattedyrpromotorer, f. eks. aktinpromotoren eller en immunglobulin promotor, fra varmesjokkpromotorer, gitt at slike promotorer er kompatible med vertcelle-systemene.

Den tidlige og sene promotoren fra SV40-viruset blir hensiktsmessig fremskaffet som et SV40-restriksjonsfragment som også inneholder virusstartstedet for replikasjon fra SV40. Den umiddelbare, tidlige promotoren fra humant cytomegalovirus blir hensiktsmessig fremskaffet som et HindIII-E-restriksjonsfragment. Et system for uttrykking av DNA i pattedyrverter ved å benytte det bovine papillomaviruset som en vektor er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 419 446. En modifisering av dette systemet er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 601 978. Se også Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) om uttrykking av humant p-interferon-cDNA i museceller under kontrollen av en tymidinkinase-promotor fra herpes simpleksvirus. Alternativt kan den lange, terminale repetisjonen fra Rous Sarcomavirus bli benyttet som promotoren.

( v) Enhancerelement- komponent

Transkripsjon av et DNA som koder for det CD20-bindende antistoffet ifølge oppfinnelsen i høyere eukaryoter blir ofte økt ved å sette inn en enhancersekvens inn i vektoren. Mange enhancersekvenser er nå kjent fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, a-fetoprotein og insulin). Likevel vil man typisk benytte en enhancer fra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40-enhanseren på den sene siden av startstedet for replikasjon (bp 100-270), den tidlige promotorenhanceren i cytomegalovirus, polyoma-enhanceren på den sene siden av startstedet for replikasjon og adenovirusenhancere. Se også Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) om enhancerelementer for aktivering av eukaryote promotorer. Enhanceren kan bli spleiset inn i vektoren på en posisjon 5' eller 3' i forhold til den CD20-bindende antistoffkodende sekvensen, men blir fortrinnsvis lokalisert på et sete 5' fra promotoren.

( vi) Transkripsjonsterminerings- komponent

Ekspresjonsvektorer som blir benyttet i eukaryote vertceller (gjærceller, soppceller, insektceller, planteceller, dyreceller, menneskeceller eller celler med kjerne fra andre flercellede organismer), vil også inneholde sekvenser som er nødvendige for termineringen av transkripsjon og for å stabilisere mRNA. Slike sekvenser er vanlig tilgjengelige fra de 5' og noen ganger 3' utranslaterte regionene til eukaryote eller virale DNAer eller cDNAer. Disse regionene inneholder nukleotidsegmenter som blir transkribert som polyadenylerte fragmenter i den utranslaterte delen av mRNA som koder for CD20-bindende antistoff. En nyttig transkripsjonstermineringskomponent er den bovine veksthormon-polyadenylerings-regionen, se WO 94/11026 og ekspresjonsvektoren som blir beskrevet der.

( vii) Seleksjon og transformering av vertceller

Passende vertceller for kloning eller uttrykking av DNA i vektorene her er de prokaryote cellene, gjærcellene eller de høyere eukaryote cellene som er beskrevet ovenfor. Hensiktsmessige prokaryoter for dette formålet inkluderer eubakterier, slik som gram-negative eller gram-positive organismer, for eksempel Enterobacteriaceae slik som Escherichia, for eksempel E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans og Shigella i tillegg til Bacilli slik som B. subtilis og B. licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41P beskrevet i DD 266 710 publisert 12. april 1989), Pseudomonas slik som P. aeruginosa og Streptomyces. En foretrukket E.Co//'-kloningsvert er E. Coli 294 (ATCC 31 446), selv om andre stammer slik som E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC 31 537) og E. Coli W3110 (ATCC

27 325) er passende.

Fullengde-antistoff, antistoff-fragmenter og antistoff-fusjonsproteiner kan bli produsert i bakterier, spesielt når glykosylerings- og Fc-effektorfunksjon ikke er nødvendig, slik som når det terapeutiske antistoffet er konjungert til et cytotoksisk middel (f. eks. et toksin) og immunkonjugatet i seg selv viser effektivitet i tumorcelleødelegging. Fullengde-antistoffer har lengre halveringstid i sirkulasjon. Produksjon i E. Coli er raskere og mer kostnadseffektivt. For uttrykking av antistoff-fragmentet og polypeptidet i bakterier, se f. eks. U.S. 5 648 237 (Carter et al.), U.S. 5 789 199 (Joly et al.) og U.S. 5 840 523 (Simmons et al.) som beskriver translasjons-initieringsregion (TIR) og signalsekvenser for å optimalisere ekspresjon og utskilling. Etter ekspresjon blir antistoffet isolert fra E. coli-cellemasse i en løselig fraksjon og kan bli renset via for eksempel en protein-A- eller -G-kolonne avhengig av isotypen. Endelig rensing kan bli utført på samme måte som prosessen for å rense antistoff uttrykt i for eksempel CHO-celler.

I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober slik som filamentøse sopper eller gjær egnede klonings- eller uttrykkingsverter for CD20-bindende-antistoffkodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig bakegjær er den mest vanlig benyttede blant lavere eukaryote vertsmikroorganismer. Likevel er et antall andre familier, arter og stammer lett tilgjengelige og nyttige her, slik som Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces- verter slik som for eksempel K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans og K. marxianus, yarrowia (EP 402 226), Pichia pastoris (EP 183 070), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Neurospora crassa, Schwanniomyces slik som Schwanniomyces occidentalis og filamentøse sopper slik som for eksempel Neurospora, Penicillium, Tolypocladium og Aspergillus- verter slik som A. nidulans og A. niger.

Passende vertceller for uttrykkingen av glykosylerte CD20-bindende antistoffer er avledet fra multicellulære organismer. Eksempler på invertebratceller inkluderer planteceller og insektceller. Utallige baculovirusstammer og varianter og tilsvarende valgfrie insektsvert-celler fra verter slik som Spodoptera frugiperda (sommerfugllarve), Åedes aegypti (mygg), Åedes albopictus (mygg), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori har blitt identifisert. En mengde virusstammer for transfeksjon er allment tilgjengelige, for eksempel L-l-varianten av Autographa califomica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV, og slike virus kan bli benyttet som viruset her i henhold til foreliggende oppfinnelse, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frigiperda- ceWer.

Plantecellekulturer av bomull, mais, potet, soyabønne, petunia, tomat og tobakk kan også bli benyttet som verter.

Likevel har interessen vært størst for vertebratceller og propagering av vertebratceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig prosedyre. Eksempler på passende pattedyrvertcellelinjer er apenyre-CVl-linjen transformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), human embryonyrelinje (293 eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), babyhamsternyreceller (BHK, ATCC CCL 10), kinesiske hamsterovarieceller/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216

(1980)), musesertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980), apenyreceller (CV1 ATCC CCL 70), nyreceller fra afrikansk grønnape (VERO-76, ATCC CRL-1587), humane livmorhalskarsinomceller (HELA, ATCC CCL 2), hundenyreceller (MDCK, ATCC CCL 34), bøffelrotteleverceller (BRL3A, AATCC CRL 1442), humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G2, HB 8065), musebrysttumor (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad, Sei. 383:44-68 (1982)), MRC 5-celler, FS4-celler og en human hepatomlinje (Hep G2).

Vertceller blir transformert med de ovenfor beskrevne ekspresjon- eller kloningsvektorer for CD20-bindende antistoff produksjon og dyrket i konvensjonelle næringsmedier, modifisert hensiktsmessig for å indusere promotorer, selektere transformanter eller amplifisere genene som koder for de ønskede sekvensene.

( viii) Dyrking av vertcellene

Vertcellene som blir benyttet til å produsere det CD20-bindende antistoffet ifølge denne oppfinnelsen kan bli dyrket i en mengde ulike medier. Kommersielt tilgjengelige medier slik som Ham's F10 (Sigma), Minimalt Essensielt Medium ((MEM), (Sigma), RPMI- 1640 (Sigma) og Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) er egnede for å dyrke vertcellene. I tillegg kan ethvert av mediene som er beskrevet i Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. patentskrift nr. 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 eller 5 122 469, WO 90/03430, WO 87/00195 eller U.S. patent Re. 30 985 blir benyttet som kulturmedier for vertcellene. Ethvert av disse mediene kan bli supplert som nødvendig med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (slik som insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleotider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (slik som GENTAMYCIN-legemiddel), sporstoffer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis foreligger ved sluttkonsentrasjoner i mikromolarområdet) og glukose eller en tilsvarende energikilde. Alle andre nødvendige tilsetninger kan også bli inkludert i hensiktsmessige konsentrasjoner som vil være kjent for fagfolk på området. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH og lignende, er de som tidligere er benyttet for vertcellen som er valgt for uttrykking og vil være åpenbare for fagfolk på området.

( ix) Rensing av antistoff

Når rekombinante teknikker blir benyttet, kan antistoffet bli produsert intracellulært i det periplasmiske rommet eller blir direkte utskilt i mediet. Hvis antistoffet blir produsert intracellulært, blir som et første trinn det partikulære avfallet, enten vertceller eller lyserte fragmenter, fjernet, for eksempel ved sentrifugering eller ultrafiltrering. Carter et al. Bio/Technology 10:163-167 (1992) beskriver en prosedyre for å isolere antistoffer som er utskilt i det periplasmiske rommet i E. Coli. Kort fortalt blir celleblanding tint i nærvær av natriumacetat (pH 3,5), EDTA og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i løpet av omtrent 30 minutter. Celleavfall kan bli fjernet ved hjelp av sentrifugering. Der antistoffet blir utskilt i mediet, blir vanligvis supernatanter fra et slikt ekspresjonssystem først konsentrert ved å benytte et allment tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, for eksempel en Amicon- eller Millipore-Pellicon-ultrafiltreringsenhet. En proteaseinhibitor slik som PMSF kan bli inkludert i ethvert av de tidligere trinnene for å inhibere proteolyse, og antibiotika kan bli inkludert for å forhindre veksten av skadelige forurensninger.

Antistoff preparatet som er fremstilt fra cellene, kan bli renset ved for eksempel å benytte hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse og affinitetskromatografi, der affinitetskromatografi er den foretrukne renseteknikken. Hensiktsmessigheten for protein-A som en affinitetsligand avhenger av typen og isotypen av ethvert immunglobulin-Fc-domene som foreligger i antistoffet. Protein-A kan bli benyttet til å rense antistoffer som er basert på humane yl-, y2- eller y4-tungkjeder (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein-G er anbefalt for alle museisotyper og for human y3 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Matriksen som affinitetsliganden blir koblet på er oftest agarose, men andre matrikser er tilgjengelige. Mekanisk stabile matrikser slik som kontrollert poreglass eller poly(styrendivinyl)benzen tillater raskere strømningshastigheter og kortere prosesseringstider enn som kan bli oppnådd med agarose. Der hvor antistoffet omfatter et CH3-domene, er Bakerbond ABX-resinet (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) nyttig for rensing. Andre teknikker for proteinrensing, slik som fraksjonering på en ionebytterkolonne, etanolpresipitering, reversfase-HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparin-SEPHAROSE, kromatografi på et anion- eller kationbytterresin (slik som en polyaspartatsyrekolonne), kromatofokusering, SDS-PAGE og ammoniumsulfatpresipitering er også tilgjengelig avhengig av antistoffet som skal bli gjenvunnet.

Etter ethvert forutgående rensetrinn kan blandingen som omfatter antistoffet av interesse og forurensninger bli utsatt for lav-pH-hydrofobkromatografi ved å benytte en elueringsbuffer ved en pH mellom omtrent 2,5-4,5, foretrukket utført ved lave saltkonsen-trasjoner (for eksempel fra omtrent 0-0,25 M salt).

Antistoffkonjugater

Antistoffet kan bli konjugert til et cytotoksisk middel slik som et toksin eller en radioaktiv isotop. I visse utførelsesformer er toksiner calicheamicin, et maytansinoid, en dolastatin, auristatin-E og analoger eller derivater derav foretrukket.

Foretrukne legemidler/toksiner inkluderer DNA-skadende midler, inhibitorer av mikrotubulipolymerisering eller depolymerisering og antimetabolitter. Foretrukne klasser av cytoksiske midler inkluderer for eksempel enzyminhibitorene slik som dihydrofolatreduktase-inhibitorer og tymidylatsyntaseinhibitorer, DNA-interkaleringsmidler, DNA-kløyvere, topoisomeraseinhibitorer, antrasyklinfamilien av legemidler, vincalegemidlene, mitomycinene, bleomycinene, de cytotoksiske nukleosidene, pteridinfamilien av legemidler, diynenene, podofyllotoksinene og differensieringsinduserere. Spesielt nyttige medlemmer av disse klassene inkluderer for eksempel metotreksat, metopterin, diklormetotreksat, 5-fluoruracil, 6-merkaptopurin, cytosinarabinosid, melfalan, leurosin, leurosidein, aktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, N-(5,5-diacetoksypentyl)doksorubicin, morfolino-doksorubicin, l-(2-kloretyl), 1,2-dimetansulfonylhydrazid, N<8->acetylspermidin, aminopterinmetopterin, esperamicin, mitomycin-C, mitomycin-A, aktinomycin, bleomycin, karminomycin, aminopterin, tallysomycin, podofyllotoksin og podofyllotoksinderivater slik som etopsid eller etopsidfosfat, vinblastin, vinkristin, vindesin, taksol, taksotere, retinolsyre, smørsyre, N<8->acetylspermidin, kamptotecin, calicheamicin, bryostatiner, cefalostatiner, ansamitocin, actosin, maytansinoider slik som DM-1, maytansin, maytansinol, N-desmetyl-4,5-desepoksymaytansinol, C-19-deklormaytansinol, C-20-hydroksymaytansinol, C-20-demetoksymaytansinol, C-9-SH-maytansinol, C-14-alkoksymetylmaytansinol, C-14-hydroksy- eller acetyloksymetylmaytansinol, C-15-hydroksy/acetyloksymaytansinol, C-15-metoksymaytansinol, C-18-N-demetylmaytansinol og 4,5-deoksymaitansinol, auristatiner slik som auristatin E, M, PHE og PE, dolostatiner slik som dolostatin-A, dolostatin-B, dolostatin-C, dolostatin-D, dolostatin-E (20-epi og 11-epi), dolostatin-G, dolostatin-H, dolostatin-I, dolostatin-1, dolostatin-2, dolostatin-3, dolostatin-4, dolostatin-5, dolostatin-6, dolostatin-7, dolostatin-8, dolostatin-9, dolostatin-10, deo-dolostatin-10, dolostatin-11, dolostatin-12, dolostatin-13, dolostatin-14, dolostatin-15, dolostatin-16, dolostatin-17 og dolostatin-18, cefalostatiner slik som cefalostatin-1, cefalostatin-2, cefalostatin-3, cefalostatin-4, cefalostatin-5, cefalostatin-6, cefalostatin-7, 25'-epi-cefalostatin-7, 20-epi-cefalostatin-7, cefalostatin-8, cefalostatin-9, cefalostatin-10, cefalostatin-11, cefalostatin-12, cefalostatin-13, cefalostatin-14, cefalostatin-15, cefalostatin-16, cefalostatin-17, cefalostatin-18 og cefalostatin-19.

Maytansinoider er mitotiske inhibitorer som virker ved å inhibere tubulinpoly-merisering. Maytansin ble først isolert fra den øst-afrikanske busken Maytenus serrata (U.S.

Patentskrift nr. 3 896 111). Etter hvert ble det oppdaget at visse mikrober også produserer maytansinoider, slik som maytansinol og C-3-maytansinolestere (U.S. patentskrift nr. 4 151 042). Syntetisk maytansinol og derivater og analoger derav er for eksempel beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 137 230, 4 248 870, 4 256 746, 4 260 608, 4 265 814, 4 294 757, 4 307 016, 4 308 268, 4 308 269, 4 309 428, 4 313 946, 4 315 929, 4 317 821, 4 322 348, 4 331 598, 4 361 650, 4 364 866, 4 424 219, 4 450 254, 4 362 663 og 4 371 533.

Maytansin og maytansinoider har blitt konjugert til antistoffer som spesifikt binder til tumorcelleantigener. Immunkonjugater som inneholder maytansinoider og deres terapeutiske anvendelse er for eksempel beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 208 020, 5 416 064 og i europeisk patent EP 0 425 235 Bl. Liu et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) beskriver immunkonjugater som omfatter et maytansinoid betegnet DM1 bundet til det monoklonale antistoffet C242 som er rettet mot human tykktarmskreft. Konjugatet ble funnet å være svært cytotoksisk mot dyrkede tykktarm kreftceller og viste antitumoraktivitet i en in wVo-tumorvekstanalyse. Chari et al. Cancer Research 52:127-131

(1992) beskriver immunkonjugater der et maytansinoid ble konjugert via en disulfidlinker til det murine antistoffet A7 som binder til et antigen på humane tykktarmkreftcellelinjer eller til et annet murint monoklonalt antistoff TA. 1 som binder HER-2//7eu-onkogenet.

Det eksisterer mange koblingsgrupper som er kjent på fagområdet for å fremstille antistoff-maytansinoidkonjugater, inkludert for eksempel de som er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 208 020 eller EP-patent 0 425 235 Bl og Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992). Koblingsgruppene inkluderer disulfidgrupper, tioetergrupper, syrelabile grupper, fotolabile grupper, peptidaselabile grupper eller esteraselabile grupper, som beskrevet i de ovenfor gitte patentene, disulfid- og tioetergrupper er foretrukket.

Konjugater av antistoffet og maytansinoidet kan bli fremstilt ved å benytte en mengde bifunksjonelle proteinkoblende midler, slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bis- azidoforbindelser (slik som bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bis-diazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som toluen 2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Spesielt foretrukne koblingsmidler inkluderer N-suksinimidyl-3-(2-pyridyltio)propionat (SPDP) (Carlsson et al. Biochem. J. 173:723-737 (1978)) og N-suksinimidyl-4-(2-pyridyltio)pentanoat (SPP) for å tilveiebringe en disulfidkobling.

Linkeren kan bli koblet til maytansinoidmolekylet på ulike posisjoner, avhengig av typen av kobling. For eksempel kan en esterkobling bli dannet ved reaksjon med en hydroksylgruppe ved å benytte konvensjonelle koblingsteknikker. Reaksjonen kan forekomme på C-3-posisjonen som har en hydroksylgruppe, C-14-posisjonen modifisert med hydroksymetyl, C-15-posisjonen modifisert med en hydroksylgruppe og C-20-posisjonen som har en hydroksylgruppe. I en foretrukket utførelsesform blir koblingen dannet på C-3-posisjonen av maytansinol eller en maytansinolanalog.

Calicheamicin

Et annet immunkonjugat av interesse omfatter et CD-20-bindende antistoff konjugert til ett eller flere calicheamicinmolekyler. Calicheamicinfamillien av antibiotika er i stand til å produsere dobbelttrådede DNA-brudd ved subpikomolare konsentrasjoner. For fremstilling av konjugater av calicheamicinfamilien, se U.S. patentskrift nr. 5 712 374, 5 714 586, 5 739 116, 5 767 285, 5 770 701, 5 770 710, 5 773 001, 5 877 296 (alle tilhørende American Cyanamid Company). Strukturelle analoger av calicheamicin som kan bli benyttet, inkluderer, men er ikke begrenset til, yi<1>, a2\ a3', N-acetyl-yi<1>, PSAG og Ø<1>!(Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998) og de tidligere nevnte U.S. patentskriftene tilhørende American Cyanamid). Et annet antitumorlegemiddel som antistoffet kan bli konjugert med, er QFA som er et antifolat. Både calicheamicin og QFA har intracellulære seter der de virker og krysser ikke plasma-membranen lett. Det cellulære opptaket av disse midlene via antistoffmediert internalisering øker derfor sterkt deres cytotoksiske effekter.

Radioaktive isotoper

For selektiv ødeleggelse av tumoren kan antistoffet omfatte et svært radioaktivt atom. En mengde radioaktive isotoper er tilgjengelige for produksjonen av radiokonjugerte anti-CD-20-antistoffer. Eksempler inkluderer At211,I131, I125,Y90, Re<186>, Re188, Sm153,Bi<212>, P<32>, Pb<212>og radioaktive isotoper av Lu. Når konjugatet blir benyttet til diagnose, kan det omfatte et radioaktivt atom for seintegråfiske undersøkelser, for eksempel tc<99m>eller I123eller et spinnmerke for kjernemagnetisk resonans (NMR)-avbildning, (også kjent som magnetisk resonans avbildning, mri), slik som jod-123 igjen, jod-131, indium-111, fluor-19, karbon-13, nitrogen-15, oksygen-17, gadolinium, mangan eller jern.

Radiomerkene eller andre merker kan bli inkorporert i konjugatet på kjente måter. For eksempel kan peptidet bli biosyntetisert eller kan bli syntetisert ved hjelp av kjemisk aminosyresyntese ved å benytte passende aminosyre-forløpere som for eksempel involverer fluor-19 istedenfor hydrogen. Merker, slik som tc<99m>eller I123,Re186, Re188 og In<1>11 kan bli påkoblet via en cysteinrest i peptidet. Yttrium-90 kan bli påkoblet via en lysinrest. IODOGEN-fremgangsmåten (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 kan bli benyttet til å inkorporere jod-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"

(Chatal, CRC Press 1989) beskriver andre fremgangsmåter i detalj.

Konjugater av antistoffet og cytotoksiske midler kan bli fremstilt ved å benytte en mengde bifunksjonelle protein koblende midler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridyltio)-propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl) sykloheksan-l-karboksylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetladipimidat HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bis-azidoforbindelser (slik som bis (p-azidobenzoyl) heksandiamin), bis-diazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som tolyen 2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Foreksempel kan et ricinimmunotoksin bli fremstilt som beskrevet i Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Karbon-14-merket l-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylentriaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på et chelaterende middel for konjugering av radionukleotid til antistoffet. Se WO 94/11026. Linkeren kan være en "kløyvbar linker" som fremmer frigjøring av det cytotoksiske legemiddelet i cellen. For eksempel kan en syrelabil linker, peptidasesensitiv linker, fotolabil linker, dimetyllinker eller disulfidinneholdende linker (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992), U.S. patentskrift nr. 5 208 020 bli benyttet.

Terapeutiske anvendelser av de CD-20-bindende antistoffene

De CD-20-bindende antistoffene ifølge oppfinnelsen er nyttige ved behandling av et antall maligne og ikke-maligne sykdommer inkludert autoimmune sykdommer og relaterte tilstander og CD-20-positive kreftformer inkludert B-cellelymfomer og leukemien Stamceller (B-celleforløpere) i benmarg mangler CD-20-antigenet, noe som gjør at friske B-celler kan regenerere etter behandling og returnere til normale nivåer i løpet av flere måneder.

Autoimmune sykdommer eller autoimmunrelaterte tilstander inkluderer artritt (reumatoid artritt, j uven il reumatoid artritt, osteoartritt, psoriatrisk artritt), psoriasis, dermatitt inkludert atopisk dermatitt, kronisk autoimmun urtikaria, polymyositt/dermatomyositt, toksisk epidermal nekrolyse, systemisk skleroderma og sklerose, responser assosiert med inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (Crohns sykdom, ulcerøs kolitt), respiratorisk distress-syndrom, adult respiratorisk stress-syndrom (ARDS), meningitt, allergisk rhinitt, encefalitt, uveitt, kolitt, glomerulonefritt, allergiske tilstander, eksem, astma, tilstander som involverer infiltrering av T-celler og kroniske inflammatoriske responser, aterosklerose, autoimmun myokarditt, leukocyttadhesjonsmangel, systemisk lupus erytametosus (SLE), lupus (inkludert nefritt, ikke-renal, diskoid, alopesi), ba rn ed ia betes, multippel sklerose, allergisk encefalomyelitt, immunresponser assosiert med akutt og forsinket hypersensitivitet mediert av cytokiner og T-lymfocytter, tuberkulose, sarkoidose, granulomatose inkludert Wegeners granulomatose, agranulocytose, vaskulitt (inkludert ANCA), aplastisk anemi, Coombs positive anemi, Diamond Blackfan anemi, immunhemolytisk anemi, inkludert autoimmun hemolytisk anemi (AIHA), pernisiøs anemi, ren rødcelleaplasi (PRCA), faktor-VIII-mangel, hemofili-A, autoimmun nøytropeni, pancytopeni, leukopeni, sykdommer som involverer leukocyttdiapedese, CNS-inflammatoriske forstyrrelser, multippelt organskade syndrom, myastenia gravis, antigen-antistoffkompleksmedierte sykdommer, anti-glomerulær basemembransykdom, anti-fosfolipidantistoffsyndrom, allergisk neuritt, Bechets sykdom, Castlemans syndrom, Goodpastures syndrom, Lambert-Eaton Myastenisk syndrom, Reynauds syndrom, Sjøgrens syndrom, Stevens-Johnson syndrom, fast organ transplantasjonsavstøtning (inkludert forbehandling for høypanelreaktive antistofftitre, IgA-deponering i vev osv.), transplantat versus vertsykdom (GVHD), pemfigoid bullous, pemfigus (alle inkludert vulgaris, foliaceus), autoimmun polyendokrinopatier, Reiters sykdom, Stiffmans syndrom, kjempecellearteritt, immunkompleksnefritt, IgA-neuropati, IgM-polyneuropatier eller IgM-mediert neuropati, idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), autoimmun trombocytopeni, autoimmun sykdom i testiklene og ovariene inkludert autoimmun orchitis og ooforitt, primær hypotyroidoisme, autoimmune endokrinsykdommer inkludert autoimmun tyroidititt, kronisk tyroidititt (Hashimotos Tyroidititt), subakutt tyroidititt, idiopatisk hypotyroidisme, Addisons sykdom, Graves sykdom, autoimmune, polyglandulære syndromer (eller polyglandulære endokrinopatiske syndromer), type-I-diabetes, også referert til som insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) og Sheehans syndrom, autoimmun hepatitt, lymfoid interstitiell pneumonitt (HIV), bronkiolitt obliterans (ikke-transplantat) versus NSIP, Guillain-Barres syndrom, storkar vaskulitt (inkludert polymyalgi reumatika og storcelle (Takayasus) arteritt), mediumkar vaskulitt (inkludert Kawasakis sykdom og polyartritt nodosa), ankyloserende spondylitt, Bergers sykdom (IgA-neuropati), raskt utviklende glomerulonefritt, primær biliær cirrhose, cøliaki (gluten enteropati), cryoglobulinemi, ALS, koronar arteriesykdom.

CD-20-positive kreftformer er de formene som omfatter unormal proliferasjon av celler som uttrykker CD-20 på celleoverflaten. De CD-20-positive B-celle-neoplasmene inkluderer CD-20-positiv Hodgkins sykdom inkludert lymfocytt predominant Hodgkins sykdom (LPHD), non-Hodgkins lymfon (NHL), follikulær sentercelle (FCC)-lymfomer, akutt lymfocyttisk leukemi (ALL), kronisk lymfocyttleukemi (CLL), hårcelleleukemi. Non-Hodgkins-lymfomet inkluderer lavere grad/follikulært non-Hodgkins lymfom (NHL), smålymfocyttlymfom (SLL), mellomgrads/follikulær NHL, mellomgradsdiffus NHL, høygrads- immunoblastisk NHL, høygradslymfoblastisk NHL, høygrads liten ikke-kløyvd celle-NHL, "bulkydisease"-NHL, plasmacytoidlymfocyttisk lymfom, mantelcellelymfom, AIDS-relatert lymfom og Waldenstrøms makroglobulinemi. Behandling av tilbakefall av disse kreftformene er også forutsett. LPHD er en type av Hodgkins sykdom som har en tendens til å gjenoppstå ofte på tross av strålings- eller kjemoterapibehandling og erkarakterisert vedCD-20-positive, maligne celler. CLL er en av fire hovedtyper av leukemi. En kreftform i modne B-celler kalt lymfocytter, CLL, blir manifestert ved progressiv akkumulering av celler i blod, benmarg og lymfatisk vev.

I spesifikke utførelsesformer blir de humaniserte CD-20-bindende antistoffene og funksjonelle fragmenter derav benyttet til å behandle non-Hodgkins lymfon (NHL), lymfocyttpredominant Hodgkins sykdom (LPHD), smålymfocyttlymfom (SLL), kronisk lymfocyttleukemi, reumatoid artritt og barnereumatoid artritt, systemisk lupus erytematosus (SLE) inkludert lupusnefritt, Wegeners sykdom, inflammatorisk bowelsykdom, idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), autoimmun trombocytopeni, multippel sklerose, psoriasis, IgA-neuropati, IgM-polyneuropatier, myastenia gravis, vaskulitt, diabetes mellitus, Reynauds syndrom, Sjøgrens syndrom og glomrulonefritt.

De humaniserte CD-20-bindende antistoffene eller funksjonelle fragmenter derav er nyttige som en enkeltmiddelbehandling i for eksempel tilbakefalt eller refraktorisk laveregrad eller follikulær CD-20-positiv, B-celle-NHL, eller kan bli administrert til pasienter sammen med andre legemidler i et multilegemiddelregime.

Indolent lymfom er en sakteutviklende, ikke-kurerbar sykdom der den gjennom-snittlige pasient overlever mellom 6 og 10 år etter mange perioder med remisjon og tilbakefall. I en utførelsesform blir de humaniserte CD-20-bindende antistoffene, eller funksjonelle fragmenter derav, benyttet for å benytte indolent NHL.

Parametrene for å undersøke effektivitet eller vellykkethet av behandling av neoplasmen vil være kjent for en lege som er erfaren når det gjelder den aktuelle sykdom. Vanligvis vil den erfarne lege se etter reduksjon i tegn og symptomer for den spesifikke sykdommen. Parametere kan inkludere gjennomsnittlig tid til sykdomsprogresjon, remisjonstid, stabil sykdom.

De følgende referanser beskriver lymfomer og CLL, deres diagnoser, behandling og standard medisinske prosedyrer for å måle behandlingseffektivitet. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL, The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998, van Besien K og Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, s. 1293-1338, i: Hematology, Basic Principles and Practice, 3. utg. Hoffmann et al.

(utgivere). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000 og Rai, K og Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, kapittel 72, s. 1350-1362, i: Hematology, Basic Principles and Practice, 3. utg. Hoffman et al. (utgivere). Churchill Livingstone, Phildelphia, 2000.

Parameterne for å vurdere effektivitet eller vellykkethet av behandling av en autoimmun eller autoimmunrelatert sykdom vil være kjent for en erfaren lege for den aktuelle sykdom. Generelt vil den erfarne legen se etter reduksjon i tegn og symptomer for den spesifikke sykdommen. Det følgende blir gitt som eksempler.

Antistoffene kan være nyttige til å behandle reumatoid artritt. RA erkarakterisertved inflammasjon i mange ledd, brusktap og benerosjon som fører til ødeleggelse av ledd og til slutt redusert leddfunksjon. I tillegg, siden RA er en systemisk sykdom, kan den ha effekter på andre vev slik som lungene, øynene og benmargen. Færre enn 50 prosent av pasienter som har hatt RA i mer enn 10 år kan fortsette å arbeide eller funksjonere normalt på en dag til dag basis. Antistoffene kan bli benyttet som en første linjete ra pi hos pasienter med tidlig RA (dvs. metotreksat) (MTX) naiv) og som monoterapi eller i kombinasjon med foreksempel MTX eller syklofosfam id. Eller, antistoffene kan bli benyttet i behandling som andrelinjeterapi for pasienter som var DMARD og/eller MTX-refraktoriske og som monoterapi eller i kombinasjon med foreksempel MTX. De humaniserte CD-20-bindende antistoffene er nyttige for å forhindre og kontrollere leddskade, forsinke strukturell skade, minske smerte assosiert med inflammasjon i RA og generelt redusere tegnene og symptomene i moderat til alvorlig RA. RA-pasienten kan bli behandlet med det humaniserte CD-20-antistoffet før, etter eller sammen med behandling med andre legemidler benyttet til å behandle RA (se kombinasjonsterapi nedenfor). I en utførelsesform blir pasienter som tidligere mislykket var behandlet med sykdomsmodifiserende antireumatiske legemidler og/eller hadde en utilstrekkelig respons overfor metotreksat alene, behandlet med et humanisert CD-20-bindende antistoff. I en form av denne behandlingen blir pasientene i et 17-dagers behandlingsregime gitt humanisert CD-20-bindende antistoff alene (1 g iv-infusjoner på dag 1 og 15), CD-20-bindende antistoff pluss syklofosfamid (750 mg iv-infusjon på dag 3 og 17) eller CD-20-bindende antistoff pluss metotreksat.

En fremgangsmåte for å evaluere behandlingseffektivitet i RA er basert på kriterier fra American College of Rheumatology (ACR), som måler prosentandelen av forbedring i såre og oppsvulmede ledd, blant annet. RA-pasienten kan bli tilordnet en verdi på for eksempel ACR 20 (20 prosent forbedring) sammenlignet med ingen antistoffbehandling (for eksempel baselinje før behandling) eller behandling med placebo. Andre måter å evaluere effektiviteten av antistoffbehandling inkluderer røntgenverditilordning slik som "Sharp-X-ray"-verditilordning som ble benyttet til å verditilordne strukturell skade slik som benerosjon og innsnevring av leddhulrom. Pasienter kan også bli evaluert for forhindringen av eller forbedringen i uførhet basert på Health Assessment Questionnaire [HAQJ-verditilordning, AIMS-verditilordning, SF-36 ved tidsperioder under og etter behandling. ACR-20-kriteriene kan inkludere 20 % forbedring i både sår (smertefull) leddantall og oppsvulmet leddantall pluss 20 % forbedring i minst 3 av 5 ytterligere mål:

1. pasientens smertevurdering ved hjelp av visuell analog skala (VAS),

2. pasientens globale vurdering av sykdomsaktivitet (VAS),

3. legens globale vurdering av sykdomsaktivitet (VAS),

4. pasientens selvvurderte uførhet målt ved hjelp av Health Assessment Questionnaire,

og

5. akuttfasereaktanter, CRP eller ESR.

ACR-50 og -70 blir definert analogt. Fortrinnsvis blir pasienten administrert en mengde av et CD-20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen som er effektiv for å oppnå minst en verditilordning på ACR 20, fortrinnsvis minst ACR 30, mer foretrukket minst ACR50, enda mer foretrukket minst ACR70, mest foretrukket minst ACR75 og høyere.

Psoriasis artritt har unike og distinkte radiografiske egenskaper. For psoriasis artritt kan ledderosjon og innsnevring av leddåpning bli evaluert med Sharp-verditilordningen i tillegg. De humaniserte CD-20-bindende antistoffene kan bli benyttet for å forhindre leddskaden i tillegg til å redusere sykdomstegn og symptomer på forstyrrelsen.

Et aspekt av oppfinnelsen er en behandling av lupus eller SLE hvor pasienten som lider av SLE tilføres en terapeutisk effektiv mengde av et humanisert CD-20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen. SLEDAI-verditilordning tilveiebringer en numerisk kvantitering av sykdomsaktivitet. SLEDAI er en vektet indeks av 24 kliniske parametere og laboratorie-parametere som er kjent for å korrelere med sykdomsaktivitet, med et numerisk område på 0-103. Se Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521. Antistoffer mot dobbelttrådet DNA er antatt å forårsake nyere utposning og andre manifestasjoner av lupus. Pasienter som gjennomgår antistoffbehandling kan bli overvåket i forhold til tid frem til nyreutposning, som er definert som en signifikant, reproduserbar økning i serumkreatinin, urinprotein eller blod i urinen. Alternativt eller i tillegg kan pasienter bli overvåket for nivåer av antinukleære antistoffer og antistoffer mot dobbelttrådet DNA. Behandlinger for SLE inkluderer høydosekortikosteroider og/eller syklofosfamid (HDCC).

Spondyloartropatier er en gruppe av forstyrrelser i leddene, inkludert ankyloserende spondylitt, psoriasis artritt og Chrohns sykdom. Behandlingssuksess kan bli bestemt ved hjelp av globale validerte pasientundersøkelsesmålingsverktøy og legeundersøkelses-målingsverktøy.

Ulike medisineringer blir benyttet for å behandle psoriasis, og behandling er ulik i direkte relasjon til sykdomsalvorlighet. Pasienter med mildere form av psoriasis benytter typisk topiske behandlinger slik som topiske steroider, antralin, kalsipotrien, klobetasol og tazaroten, for å forvalte sykdommen, mens pasienter med moderat og alvorlig psoriasis oftere benytter systemisk (metotreksat, retionoider, syklosporin, PUVA og UVB) terapier. Tjærer blir også benyttet. Disse terapiene har en kombinasjon av sikkerhetsmessige hensyn, tidskrevende regimer eller uhensiktsmessige prosesser for behandling. Videre krever noen dyrt utstyr og klargjort plass i kontorsettingen. Systemiske medisiner kan gi alvorlige bivirkninger inkludert hypertensjon, hyperlipidemi, benmargsundertrykking, leversykdom, nyresykdom og tarmforstyrrelse. Anvendelsen av fototerapi kan også øke forekomsten av hud kreftformer. I tillegg til uhensiktsmessigheten og ubehaget som er assosiert med anvendelsen av topiske terapier, krever fototerapi og systemiske behandlinger at pasienter blir tatt av og på terapi og overvåkning av livstidseksponering på grunn av deres bivirkninger.

Behandlingseffektivitet for psoriasis blir undersøkt ved å overvåke endringer i kliniske tegn og symptomer på sykdommen inkludert Physician's Global Assessment (PGA)-endringer og Psoriasis Area og Severity Index (PASI)-verditilordninger, Psoriasis Symptom Assessment (PSA), sammenlignet med baselinjetilstaden. Pasienten kan bli målt periodisk under hele behandlingen på den visuelle analoge skalaen som blir benyttet for å indikere graden av kløe som ble opplevd ved spesifikke tidspunkter.

Pasienter kan oppleve en infusjonsreaksjon eller infusjonsrelaterte symptomer sammen med deres første infusjon av et terapeutisk antistoff. Disse symptomene varierer i alvorlighet og er generelt reversible med medisinsk intervensjoner. Disse symptomene inkluderer influensalignende feber, frysninger/rykninger, kvalme, urticaria, hodepine, bronkospasmer, angioødem. Det vil være ønskelig at behandlingen reduserer infusjonsreaksjoner. Dermed er et annet aspekt av oppfinnelsen anvendelse av et CD-20-bindende antistoff der antistoffet har redusert eller ingen komplementavhengig cytotoksisitet ved behandling av sykdommene som er beskrevet og fører til reduserte infusjonsrelaterte symptomer sammenlignet med behandling med Rituxan. I en utførelsesform er det humaniserte CD-20-bindende antistoffet 2H7.vll6.

Dosering

Avhengig av indikasjonen som skal behandles og faktorer som er relevante for doseringen som en lege som er erfaren på området vil være kjent med, vil antistoffene ifølge oppfinnelsen bli formulert for administrering ved en dosering som er effektiv for behandlingen av denne indikasjonen, mens toksisitet og bivirkninger blir minimalisert. For behandlingen av en CD-20-positiv kreftform eller en autoimmun sykdom, vil den terapeutisk effektive doseringen ligge i området på omtrent 250 mg/m<2>til omtrent 400 mg/m<2>eller 500 mg/m<2>, foretrukket omtrent 250-375 mg/m<2>. I en utførelsesform er doseringsområdet 275-375 mg/m<2>. I en utførelsesform av behandlingen av en CD-20-positiv B-celle-neoplasma blir antistoffet administrert i et område på 300-375 mg/m<2>. For behandlingen av pasienter som lider av B-cellelymfom, slik som ikke-Hodkins lymfom, vil anti-CD-20-antistoffene og de humaniserte anti-CD-20-antistoffene ifølge oppfinnelsen i en spesifikk utførelsesform bli formulert for administrering til en human pasient ved en dosering på 10 mg/kg eller 375 mg/m<2>. For behandling av NHL vil et doseringsregime være å administrere en dose av antistoffpreparatet som en dosering på 10 mg/kg i den første uken med behandling, etterfulgt av et 2 ukers intervall, og deretter blir en andre dose i samme mengde av antistoffet administrert, vanligvis mottar NHL-pasienter slik behandling én gang i løpet av et år, men ved gjenoppståelse av lymfomet kan slik behandling bli gjentatt. I et annet doseringsregime mottar pasienter behandlet med laveregrad-NHL fire uker av en versjon av humanisert 2H7, fortrinnsvis vl6 (375 mg/m<2>ukentlig) etterfulgt i uke fem med tre ytterligere løp av antistoffpulsstandarden CHOP (syklofosfamid, doksorubicin, vinkristin og prednison) eller CVP (syklofosfamid, vinkristin, prednison) kjemoterapi, som ble gitt hver tredje uke i tre sykluser.

For å behandle reumatoid artritt, er doseringsområdet for det humaniserte antistoffet 125 mg/m<2>(ekvivalent med omtrent 200 mg/dose) til 600 mg/m<2>, gitt i to doser, for eksempel blir den første dosen på 200 mg administrert på dag én, etterfulgt av en andre dose på 200 mg på dag 15. I ulike utførelsesformer er doseringen 250 mg/dose, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg.

I behandlingen av sykdommen kan de CD-20-bindende antistoffene bli administrert til pasienten kronisk eller avbrutt, som bestemt av legen som har erfaring med sykdommen.

En pasient som får administrert et legemiddel ved hjelp av intravenøs infusjon eller subkutant, kan oppleve skadelige hendelser slik som feber, frysninger, brennende følelse, asteni og hodepine. For å lindre eller minimalisere slike skadelige hendelser kan pasienten motta en første kondisjonerende dose/doser av antistoffet etterfulgt av en terapeutisk dose. Den kondisjonerende dosen/dosene vil være lavere enn den terapeutiske dosen for å kondisjonere pasienten til å tolerere høyere doseringer.

Administreringsvei

De CD-20-bindende antistoffene blir administrert til en human pasient i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter, slik som ved intravenøs administrering, for eksempel som en bolus eller ved kontinuerlig infusjon over en tidsperiode, enten subkutant, intramuskulært, intraperitonealt, intracerebrospinalt, intra-artikulært, intrasynovialt, intratekalt eller ved inhalering, generelt ved intravenøs eller subkutan administrering.

I en utførelsesform blir det humaniserte 2H7-antistoffet administrert ved intravenøs infusjon med 0,9 % natriumkloridløsning som en infusjonsvehikkel.

Kombinasjonsterapi

Ved behandling av B-celle-neoplasmene beskrevet ovenfor kan pasienten bli behandlet med de CD-20-bindende antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med ett eller flere terapeutiske midler slik som et kjemoterapeutisk middel i et multilegemiddel regime. Det CD-20-bindende antistoffet kan blir administrert samtidig, sekvensielt eller alternerende med det kjemoterapeutiske middelet, eller etter ikke-responsivitet med annen terapi. Standard kjemoterapi for lymfombehandling kan inkluderer syklofosfamid, cytarabin, melfalan og mitoksantron pluss melfalan. CHOP er et av de mest vanlig benyttede kjemoterapiregimer for å behandle non-Hodgkins lymfom. De følgende er legemidlene som blir benyttet i CHOP-regimet: syklofosfamid (artikkelnavn cytoksan, neosar), adriamycin (doksorubicin/hydroksydoksorubicin), vinkristin (oncovin) og prednisolon (noen ganger kalt deltason eller orason). I spesielle utførelsesformer blir det CD-20-bindende antistoffet administrert til en pasient med behov derav i kombinasjon med ett eller flere av de følgende kjemoterapeutiske midlene av doksorubicin, syklofosfamid, vinkristin og prednisolon. I en spesifikk utførelsesform blir en pasient som lider av et lymfom (slik som et non-Hodgkins lymfom) behandlet med et anti-CD20-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse i sammenheng med CHOP (syklofosfamid, doksorubicin, vinkristin og prednison)-terapi. I en annen utførelsesform kan kreftpasienten bli behandlet med et humanisert CD-20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen sammen med CVP (syklofosfamid, vinkristin og prednison)-kjemoterapi. I en spesifikk utførelsesform blir pasienten som lider av CD-20-positiv NHL behandlet med humanisert 2H7.vl6 sammen med CVP. I en spesifikk utførelsesform av behandlingen av CLL blir det CD-20-bindende antistoffet administrert sammen med kjemoterapi med én eller begge av fludarabin og cytoksam.

I behandling av de autoimmune sykdommene eller autoimmunrelaterte tilstander som er beskrevet ovenfor, kan pasienten bli behandlet med de CD-20-bindende antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med et andre terapeutisk middel, slik som et immundempende middel, slik som i et multilegemiddelregime. Det CD-20-bindende antistoffet kan bli administrert samtidig, sekvensielt eller alternerende med det immundempende middelet eller ved ikke-responsivitet med annen terapi. Det immundempende middelet kan bli administrert ved den samme eller ved mindre doseringer enn som fastsatt på fagområdet. Det foretrukne, immundempende tilleggsmiddelet vil være avhengig av mange faktorer, inkludert typen av forstyrrelse som blir behandlet i tillegg til pasientens historie.

"Immundempende middel" som benyttet her for assisterende terapi refererer til substanser som virker for å undertrykke eller maskere immunsystemet til en pasient. Slike midler vil inkludere substanser som undertrykker cytokinproduksjon, nedregulerer eller undertrykker selv-antigenuttrykking eller maskerer MHC-antigenet. Eksempler på slike midler inkluderer steroider slik som glukokortikosteroider, for eksempel prednison, metylprednisolon og deksametason, 2-amino-6-aryl-5-substituerte pyrimidiner (se U.S. patentskrift nr. 4 665 077), azatioprin (eller syklofosfamid, hvis det foreligger en skadelig reaksjon overfor azatioprin), bromkryptin, glutaraldehyd (som maskerer MHC-antigenet, som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 120 649), anti-idiotypiske antistoffer for MHC-

antigener og MHC-fragmenter, syklosporin-A, cytokin- eller cytokinreseptorantagonister inkludert anti-interferon-(-a eller -v-antistoffer, antitumornekrosefaktor -v-antistoffer, antitumornekrosefaktor -3-antistoffer, anti-interleukin-2-antistoffer og anti-IL-2-reseptorantistoffer, anti-L3T4-antistoffer, heterologe anti-lymfocyttglobulin, pan-T-antistoffer, fortrinnsvis anti-CD3- eller anti-CD4/CD4a-antistoffer, løselig peptid inneholdende en LFA-3-bindende domene (WO 90/08187 publisert 7/26/90), streptokinase, TG F -3, streptodornase, RNA eller DNA fra verten, FK506, RS-61443, deoksyspergualin, rapamycin, T-cellereseptor (U.S. patentskrift nr. 5114 721)-T-cellereseptorfragmenter (Offner et al., Science 251:430-432 (1991), WO 90/11294 og WO 91/01133) og T-cellereseptorantistoffer (EP 340109) slik som T10B9.

For behandlingen av reumatoid artritt kan pasienten bli behandlet med et CD-20-antistoff sammen med ethvert av eller flere av de følgende legemidler: DMARDS (sykdomsmodifiserende antireumatiske legemidler (for eksempel metotreksat), NSAI eller NSAID (ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler), HUMIRA (adalimumab, Abbott Laboratories), ARAVA (leflunomid), REMICADE (infliximab, Centocor Inc., Malvern, Pa), ENBREL (etanercept, Immunex, WA), COX-2-inhibitorer. DMARDer som er vanlig benyttet i RA er hydroksyklorokin, sulfasalazin, metotreksat, leflunomid, etanercept, infliximab, azatioprin, D-penicillamin, Gold (oral), Gold (intramuskulær), minosyklin, syklosporin, stafylokokkprotein-A-immunadsorpsjon. Adalimumab er et humant monoklonalt antistoff som binder til TNFv. Infliximab er et kimert monoklonalt antistoff som binder til TNFv. Etanercept er et "immunadhesin"-fusjonsprotein som består av den ekstracellulære ligandbindende delen av den humane 75 kD (p75) tumornekrosefaktorreseptoren (TNFR) bundet til Fc-delen av et humant IgGl. For konvensjonell behandling av RA, se for eksempel "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2):328-346 (februar 2002). I en spesifikk utførelsesform blir RA-pasienten behandlet med et CD-20-antistoff ifølge oppfinnelsen sammen med metotreksat (MTX). Et eksempel på en dose med MTX er omtrent 7,5-25 mg/kg per uke. MTX kan bli administrert oralt og subkutant.

For behandlingen av ankyloserende spondylitt, psoriasis artritt og Crohns sykdom, kan pasienten bli behandlet med et CD-20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen sammen med for eksempel Remicade (infliximab, fra Centocor Inc, Malvern, Pa.), ENBREL (etanercept, Immunex, WA).

Behandlinger for SLE inkluderer høydosekortikosteroider og/eller syklofosfamid

(HDCC).

For behandlingen av psoriasis kan pasientene bli administrert et CD-20-bindende antistoff sammen med topiske behandlinger, slik som topiske steroider, antralin, calcipotrien, clobetasol og tazaroten eller med metotreksat, retioider, syklosporin, PUVA- og UVB-terapier. I en behandlingsform blir psoriasispasienten behandlet med det CD-20-bindende antistoffet sekvensielt eller samtidig med syklosporin.

Farmasøytiske formuleringer

Terapeutiske formuleringer av de CD-20-bindende antistoffene benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse blir fremstilt for lagring ved å blande et antistoff som har den ønskede graden av renhet med eventuelle farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. utgave, Osol, A. utg. (1980)) i formen av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottakere ved doseringene og konsentrasjonene som ble benyttet og inkluderer buffere slik som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter inkludert askorbinsyre og metionin, preser-veringsmidler (slik som oktadesyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener slik som metyl- eller propylparaben, katekol, resorsinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylærvektpolypeptider (mindre enn omtrent 10 rester), proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer slik som olyvinylpyrrolidon, aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner, chelaterende midler slik som EDTA, sukkere slik som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner slik som natrium, metallkomplekser (for eksempel Zn-proteinkomplekser) og/eller ikke-ioniske overflateaktive stoffer slik som TWEEN, PLURONICS eller polyetylenglykol (PEG).

Eksempler på anti-CD20-antistoff-formuleringer er beskrevet i WO 98/56418. En annen formulering er en flytende multidoseformulering som omfatter anti-CD20-antistoffet ved 40 mg/ml, 25 mM acetat, 150 mM trehalose, 0,9 % benzylalkohol, 0,02 % polysorbat-20 ved pH 5,0 som har et minimalt hylleliv på to års lagring ved 2-8 °C. En annen anti-CD-20-formulering av interesse omfatter 10 mg/ml antistoff i 9,0 mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/ml natriumsitratdihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat-80 og sterilt vann for injeksjon, pH 6,5. Nok en annen farmasøytisk formulering omfatter 10-30 mM natriumacetat fra omtrent pH 4,8 til omtrent pH 5,5, fortrinnsvis ved pH 5,5, polysorbat som et overflateaktivt stoff i en mengde på omtrent 0,01-0,1 % v/v, trehalose ved en mengde på omtrent 2-10 % w/v, og benzylalkohol som et preserveringsmiddel (U.S. 6 171 586). Lyofiliserte formuleringer som er tilpasset til subkutan administrering er beskrevet i WO 97/04801. Slike lyofiliserte formuleringer kan bli rekonstituert med et passende fortynningsmiddel til en høyprotein- konsentrasjon, og den rekonstituerte formuleringen kan bli administrert subkutant til pattedyret som skal bli behandlet her.

En formulering forde humaniserte 2H7-variantene er antistoff ved 12-14 mg/ml i 10 mM histidin, 6 % sukrose, 0,02 % polysorbat-20, pH 5,8.

I en spesifikk utførelsesform blir 2H7-varianter, og spesielt 2H7.vl6, formulert ved 20 mg/ml antistoff i 10 mM histidinsulfat, 60 mg/ml sukrose, 0,2 mg/ml polysorbat-20 og sterilt vann for injeksjon ved pH 5,8.

Formuleringen her kan også inneholde mer enn én aktiv forbindelse som er nødvendig for den spesielle indikasjonen som blir behandlet, fortrinnsvis de med komplementære aktiviteter som ikke skadelig påvirker hverandre. For eksempel kan det være ønskelig å ytterligere tilveiebringe et cytotoksisk middel, kjemoterapeutisk middel, cytokin eller immundempende middel (for eksempel ett som virker på T-celler, slik som syklosporin eller et antistoff som binder T-celler, for eksempel ett som binder LFA-1). Den effektive mengden av slike andre midler avhenger av mengden av antistoff som foreligger i formuleringen, typen av sykdom eller forstyrrelse eller behandling og andre faktorer som er diskutert ovenfor. Disse blir generelt benyttet i de samme doseringene og med administrering som beskrevet her eller omtrent fra 1 til 99 % av de frem til dette benyttede doseringene.

De aktive ingrediensene kan også bli innfanget i mikrokapsler som for eksempel er fremstilt ved hjelp av koaservasjonsteknikker eller ved hjelp av interfasepolymerisering, for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetacylat)-mikrokapsler, i kolloidale legemiddelleveringssystemer (foreksempel liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A. utg.

(1980).

Vedvarende frigjørende preparater kan bli fremstilt. Passende eksempler på vedvarende frigjørende preparater inkluderer halvgjennomtrengelige matriser av faste, hydrofobe polmerer inneholdende antagonisten, der matrisene er i formen av formgitte artikler, for eksempel filmer eller mikrokapsler. Eksempler på vedvarende frigjørende matriser inkluderer polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetyl-metakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (U.S. patentskrift nr. 3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og etyl-L-glutamat, ikke-degraderbar etylen-vinylacetat, degraderbar melkesyre-glykolsyrekopolymerer slik som LUPRON DEPOT (injiserbare mikrokuler sammensatt av melkesyre-glykolsyrekopolymer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre.

Formuleringene som skal bli benyttet til in wVo-administrering må være sterile. Dette kan med letthet bli oppnådd ved filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner.

Fremstilte artikler og sett

Beskrivelsen omtaler også en fremstilt artikkel innholdende materialer som er nyttige til behandlingen av autoimmunsykdommer og relaterte tilstander og CD-20-positive kreftformer slik som ikke-Hodkins lymfom. Den fremstilte artikkelen omfatter en beholder og et merke eller et pakkeinnstikk på eller assosiert med beholderen. Passende beholdere inkluderer for eksempel flasker, rør, sprøyter osv. Beholderen kan bli formet fra en mengde materialer slik som glass eller plastikk. Beholderen inneholder et preparat som er effektivt for å behandle tilstanden og kan ha en steril inngangsport (for eksempel kan beholderen være en intravenøs løsningspakke eller et rør som har et segl som kan bli gjennomstukket ved hjelp av en hypoderm injeksjonsnål). Minst ett aktivt middel i preparatet er et CD-20-bindende antistoff ifølge oppfinnelsen. Merket eller pakkeinnstikket indikerer at preparatet blir benyttet for å behandle den spesielle tilstanden. Merket eller pakkeinnstikket vil ytterligere omfatte instruksjoner for administrering av antistoffpreparatet til pasienten. Pakkeinnstikk refererer til instruksjoner som vanligvis er inkludert i kommersielle forpakninger med terapeutiske produkter og som inneholder informasjon omkring indikasjonene, anvendelsen, doseringen, administreringen, kontraindikasjonene og/eller advarsler som gjelder anvendelsen av slike terapeutiske produkter. I en utførelsesform indikerer pakningsvedlegget at preparatet blir benyttet til å behandle non-Hodgkins lymfom.

I tillegg kan den fremstilte artikkelen ytterligere omfatte en andre beholder som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som bakteriostatisk vann for injeksjon (BWFI), fosfatbufret saltvann, Ringers løsning og dekstroseløsning. Den kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelige sett fra et kommersielt og et brukerståsted, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtre, nåler og sprøyter.

Sett blir også tilveiebrakt som er nyttige for ulike formål, for eksempel for B-celledrepingsanalyser, som en positiv kontroll for apoptoseanalyser, for rensing eller immunpresipitering av CD-20 fra celler. For isolering og rensing av CD-20 kan settet inneholde et anti-CD20-antistoff koblet til kuler (for eksempel sepharosekuler). Sett kan bli tilveiebrakt som inneholder antistoffene for påvisning og kvantitering av CD-20 in vitro, for eksempel i en ELISA eller i et Western-blot. Som for den fremstilte artikkelen omfatter settet en beholder og et merke eller et pakkeinnstikk på eller assosiert med beholderen. Beholderen inneholder et preparat som omfatter minst ett anti-CD20-antistoff ifølge oppfinnelsen. Ytterligere beholdere kan bli inkludert som inneholder for eksempel fortynningsmidler og buffere, kontrollantistoffer. Merket eller pakkeinnstikket kan tilveiebringe en beskrivelse preparatet i tillegg til instruksjoner som gjelder den påtenkte in wfro-anvendelsen eller den diagnostiske anvendelsen.

Cynomolgusape-CD-20

Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 24 til cynomolgusape-CD-20 som vist i figur 19. I en utførelsesform er nukleinsyren en cDNA. I en utførelsesform er nukleinsyren som koder for ape-CD-20 i en ekspresjonsvektor for uttrykking i en vertcelle. Nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 24 i ekspresjonsvektoren er operabelt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens slik som en promotor eller promotor og enhacer. Ekspresjonskontrollsekvensen kan være den native sekvensen som normalt er assosiert med cynomolgus-CD-20-genet eller heterlogt i forhold til genet. Også tilveiebrakt er et isolert polypeptid som omfatter aminosyresekvensen [SEQ ID NO: 25, figur 19 og 20] til cynomolgusape-CD-20, i tillegg til vertceller inneholdende cynomolgus-CD-20-nukeleinsyren. I et aspekt er vertcellene eukaryote celler, for eksempel CHO-celler. Fusjonsproteiner som omfatter cynomolgus-CD-20-aminosyresekvensen eller fragmenter av sekvensen, er også omfattet.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Humanisering av murint 2H7-anti-CD-20-monoklonalt antistoff Humanisering av det murine anti-humane-CD-20-antistoffet 2H7 (også referert til her som m2H7, m for murint) ble utført i en serie seterettede mutagenesetrinn. Variabel-regionsekvensene for det murine 2H7-antistoffet og det kimere 2H7 med muse-V og human-C har blitt beskrevet, se for eksempel U.S. patentskrift nr. 5 846 818 og 6 204 023. CDR-restene til 2H7 ble identifisert ved å sammenligne aminosyresekvensen til de murine 2H7-variabeldomenene (beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 846 818) med sekvensene til kjente antistoffer (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, utg. 5. Public Health Sevice, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). CDR-regionene for lettkjedene og tungkjedene ble definert basert på sekvenshypervariabilitet (Kabat et al., ovenfor) og er henholdsvis vist i figur IA og figur IB. Ved å benytte syntetiske oligonukleotider (tabell 1), ble seterettet mutagenese (Kunkel, Proe. Nati. Acad. Sei. 82:488-492 (1985) benyttet for å introdusere alle de seks murine 2H7-CDR-regionene inn i et fullstendig humant Fab-rammeverk tilsvarende til en konsensussekvens VKI, VHIII (VL-kappa undergruppe-I, VH-undergruppe-II) inneholdt i plasmid pVX4 (figur 2).

Fagemidet pVX4 (figur 2) ble benyttet til mutagenese i tillegg til for uttrykking av F(ab) i E. coli. Basert på fagemidet pb0720, som er et derivat av pB0475 (Cunningham et al., Science 243:1330-1336 (1989)), inneholder pVX4 et DNA-fragment som koder for et humanisert konsensus-K-undergruppe-I-lettkjede-(VLKI-CL) og et humanisert konsensus-undergruppe-III-tungkjede (VHIII-CH1) anti-IFN-a (interferon a)-antistoff. pVX4 har også en alkalisk fosfatasepromotor og en Shine-Dalgamo-sekvens som begge er avledet fra et annet tidligere beskrevet pUC119-basert plasmid, pAK2 (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:4285 (1992)). Et unikt Spel-restriksjonssete ble introdusert mellom DNA som koder for F(ab)-lettkjeden og -tungkjeden. De første 23 aminosyrene i både anti-IFN-a-tungkjeden og

-lettkjeden er StII-sekresjonssignalsekvensen (Chang et a., Gene 55:189-196 (1987)).

For å konstruere CDR-bytteversjonen av 2H7 (2H7.v2) ble seterettet mutagenese utført på et deoksyuridininneholdende templat av pVX4, alle seks CDR'er i anti-IFN-a ble endret til de murine 2H7-CDR'ene. Det resulterende molekylet er referert til som humanisert 2H7-versjon-2 (2H7.v2) eller "CDR-bytteversjonen" av 2H7, den har m2H7-CDR-restene med de humane konsensus-FR-restene vist i Figur IA og IB. Humanisert 2H7.v2 ble benyttet for videre humanisering.

Tabell 1 viser oligonukleotidsekvensen som ble benyttet for å fremstille hver av de murine 2H7 (m2H7)-CDR'ene i H-kjeden og L-kjeden. For eksempel ble CDR-Hl-oligo-nukleotidet benyttet til å gjenskape m2H7-H-kjede CDR1. CDR-H1, CDR-H2 og CDR-H3 refererer til henholdsvis H-kjede-CDRl, -CDR2 og -CDR3, og tilsvarende refererer CDR-L1, CDR-L2 og CDR-L3 til hver av L-kjede-CDR'ene. Substitusjonene i CDR-H2 ble utført i to trinn med to oligonukleotider, CDR-H2A og CDR-H2B.

For sammenligning med humaniserte konstruksjoner ble et plasmid som uttrykker en kimer 2H7-Fab (inneholdende murine VL- og VH-domener og humane CL- og CHi- domener) konstruert ved hjelp av seterettet mutagenese (Kunkel, ovenfor) ved å benytte syntetiske oligonukleotider for å introdusere de murine rammeverks restene inn i 2H7.v2. Sekvensen til den resulterende plasmidkonstruksjon for uttrykking av den kimere Fab kjent som 2H7.v6.8 er vist i Fig. 3. Hver kodet kjede i Fab har en StII-sekresjonssignalsekvens på 23 aminosyrer som beskrevet for pVX4 (Fig. 2) ovenfor.

Basert på en sekvenssammenligning av de murine 2H7-rammeverksrestene med det humane VKI,VHIII-konsensusrammeverket (Figurer IA og IB) og tidligere humaniserte antistoffer (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:4285-4289 (1992)), ble flere rammeverksmutasjoner introdusert inn i 2H7.v2-Fab-konstruksjonen ved hjelp av seterettet mutagenese. Disse mutasjoner fører til en endring av visse humane konsensusrammeverks-rester til dem som ble funnet i det murine 2H7-rammeverket på steder som kan påvirke CDR-konformasjoner eller antigenkontakter. Versjon-3 inneholdt VH(R71V, N73K), versjon-4 inneholdt VH(R71V), versjon-5 inneholdt VH(R71V,N73K) og VL(L46P) og versjon-6 inneholdt VH(R71V, N73K) og VL(L46P, L47W).

Humaniserte og kimere Fab-versjoner av m2H7-antistoff ble uttrykt i E. coli og renset på følgende måte. Plasmidet ble transformert inn i E. co//'-stamme XL-l-Blue (Stratagene, San Diego, CA) for fremstilling av dobbelttrådet og enkelttrådet DNA. For hver variant ble både lettkjeder og tungkjeder fullstendig sekvensert ved å benytte dideoksynukleotidfremgangsmåten (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Plasmider ble transformert inn i E. co//'-stamme 16C9, et derivat av MM294, platet på LB-plate inneholdende 5 \ ig/ m\ karbenicillin og en enkelt koloni ble valgt for proteinuttrykking. Den enkle kolonien ble dyrket i 5 ml LB 100^g pr. ml karbenicillin i 5 timer ved 37 °C. 5 ml-kulturen ble tilsatt til 500 ml AP5 lOO^g pr. ml karbenicillin og tillatt å vokse i 16 timer i en ristet 4-litersflaske ved 37 °C. AP5-media består av: 1,5 g glukose, 11,0 Hycase SF, 0,6 g gjærekstrakt (sertifisert), 0,19 g vannfritt MgS04, 1,07 g NH4CI, 3,73 g KCI, 1,2 g NaCI, 120 ml 1 M trietanolamin, pH 7,4, til 1 I vann og deretter sterilfiltrert gjennom et Sealkeenfilter på 0,1^m.

Celler ble høstet ved sentrifugering i en 1 liters sentrifugeflaske (Nalgene) ved 3000 xg og supernatanten ble fjernet. Etter frysing i 1 time ble pelleten resuspendert i 25 ml kald 10 mM MES-10 mM EDTA, pH 5,0 (buffer-A). 250^1 0,1 M PMSF (Sigma) ble tilsatt for å inhibere proteolyse og 3,5 ml av stokkløsning 10 mg/ml hønseegghvitelysozym (Sigma) ble tilsatt for å hjelpe til med lysering av den bakterielle celleveggen. Etter forsiktig risting på is i 1 time ble prøven sentrifugert ved 40000 xg i 15 min. Supernatanten ble brakt til 50 ml med buffer-A og påsatt på en 2 ml DEAE-kolonne balansert med buffer-A. Det gjennom-strømmende ble deretter påsatt på en protein-G-sefarose-CL-4B (Pharmacia)-kolonne (0,5 ml grunnvolum) balansert med buffer-A. Kolonnen ble vasket med 10 ml buffer-A og eluert med 3 ml 0,3 M glysin, pH 3,0 inn i 1,25 ml 1 M tris, pH 8,0. F(ab) ble deretter byttet med buffer til PBS ved å benytte en Centricon-30 (Amicon) og konsentrert til et sluttvolum på 0,5 ml. SDS-PAGE-geler av alle F(ab) ble kjørt for å forsikre om renhet og molekylvekten for hver variant ble verifisert ved hjelp av elektrospraymassespektrometri.

I cellebaserte ELISA-bindingsanalyser (beskrevet nedenfor) var bindingen av Fab'er, inkludert kimer-2H7-Fab, til CD20 vanskelig å påvise. Derfor ble 2H7-Fab-versjonene reformatert som fullengde-IgGl-antistoffer for analyser og ytterligere mutagenese.

Plasmider for uttrykking av fullengde-IgG'er ble konstruert ved å subklone VL- og VH-domenene til kimert 2H7 (v6.8)-Fab i tillegg til humaniserte Fab-versjoner 2 til 6 inn i

tidligere beskrevne pRK-vektorer for pattedyrecelleuttrykking (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). Kort fortalt ble hver Fab-konstruksjon fordøyd med EcoRV og Blpl for å kutte ut et VL-fragment som ble klonet inn i EcoRV/ Blpl- setene i plasmid pDRl (Fig. 4) for uttrykking av den fullstendige lettkjeden (VL-CL-domener). I tillegg ble hver Fab-konstruksjon fordøyd med Pvull og Apal for å kutte ut et VH-fragment som ble klonet inn i PvuII//4paI-setene i plasmid-pDR2 (Fig. 5) for uttrykking av den fullstendige tungkjeden (VH-CHi-hengsle-CH2-CH3-domener). For hver IgG-variant ble transiente transfeksjoner utført ved å kotransfektere et lettkjedeuttrykkende plasmid og et tungkjedeuttrykkende plasmid inn i en adenovirustransformert human embryonyrecellelinje, (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)). Kort fortalt ble 293-celler splittet på dagen før transfeksjon og platet i seruminneholdende medium. På den følgende dagen ble dobbelttrådet DNA som var fremstilt som et kalsiumfosfatpresipitat tilsatt, etterfulgt av pAdVAntage-DNA (Promega, Madison, WI) og celler ble inkubert over natten ved 37 °C. Celler ble dyrket i serumfritt medium og høstet etter 4 dager. Antistoffer ble renset fra kultursupernatanter ved å benytte protein A-sefarose-CL-4B og deretter ble bufferen byttet til 10 mM natriumsukksinat, 140 mM NaCI, pH 6,0 og konsentrert ved å benytte en Centricon-10 (Amicon). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av kvantitativ aminosyreanalyse.

For å måle relative bindingsaffiniteter til CD20-antigenet ble en cellebasert ELISA-analyse utviklet. Humane B-lymfoblastoid-WIL2-S-celler (ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD) ble dyrket i RPMI 1640 tilsatt 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES, pH 7,2 og 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum i en fuktet 5 % C02-inkubator. Cellene ble vasket med PBS inneholdende 1 % FBS (analysebuffer) og utsådd ved 250-300000 celler pr. brønn i 96 brønners rundbunnede plater (Nunc, Roskilde, Danmark). To-ga ngers-seriefortyn net standard (15,6-1000 ng/ml med 2H7 v6.8 kimer IgG) og treganger seriefortynnede prøver (2,7-2000 ng/ml) i analysebuffer ble tilsatt til platene. Platene ble begravd i is og inkubert i 45 min. For å fjerne det ubundne antistoffet ble 0,1 ml analysebuffer tilsatt til brønnene. Plater ble sentrifugert og supernatanter ble fjernet. Celler ble vasket to eller flere ganger med 0,2 ml analysebuffer. Antistoff bundet til platene ble påvist ved å tilsette peroksidasekonjugert geit-anti-humant FC-antistoff (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) til platene. Etter inkubering i 45 minutter ble cellene vasket som beskrevet tidligere. TMB-substrat (3,3',5,5'-tetrametylbenzidin, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) ble tilsatt til platene. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 1 M fosforsyre. Titreringskurver ble tilpasset med et fire-pa ra meters ikke-lineært regresjonskurvetilpasningsprogram (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Absorbansen ved midtpunktet på titreringskurven (mid-OD) og dens tilsvarende konsentrasjon av standarden ble bestemt. Deretter ble konsentrasjonen av hver variant av denne mid-OD bestemt og konsentrasjonen til standarden ble delt på den for hver variant. Dermed er verdiene et forhold av bindingen av hver variant relativt i forhold til standarden. Standardavvik for relativ affinitet (ekvivalentkonsentrasjon) var generelt +/- 10 % mellom eksperimenter.

Som vist i Tabell 2 var binding av CDR-byttevariant (v.2) ekstremt redusert sammenlignet med kimer 2H7 (v.6.8). Likevel viste versjonene 3 til 6 forbedret binding. For å bestemme det minste antallet av mutasjoner som er nødvendig for å gjenopprette bindingsaffinitet til den for kimer 2H7 ble ytterligere mutasjoner og kombinasjoner av mutasjoner konstruert ved hjelp av seterettet mutagenese for å fremstille variantene 7 til 17 som vist i Tabell 2. Spesielt inkluderte disse VH-mutasjoner A49G, F67A, I69L, N73K og L78A, og VL-mutasjoner M4L, M33I og F71Y. Versjoner 16 og 17 viste de beste relative bindingsaffinitetene, innenfor 2 ganger av den for den kimere versjon, med ingen signifikant forskjell (s.d. = +/- 10 %) mellom de to. For å minimalisere antallet mutasjoner ble versjon 16, som kun har 4 mutasjoner av humane rammeverks reste r til murine rammeverks reste r (Tabell 2), derfor valgt som den humaniserte formen for ytterligere karakterisering.

Tabell 2. Relativ bindingsaffinitet for humaniserte 2H7 IgG-varianter til CD20 sammenlignet med kimer 2H7 ved å benytte cellebasert ELISA. Den relative bindingen er uttrykt som konsentrasjonen av det kimere 2H7 over konsentrasjonen av varianten som er nødvendig for ekvivalent binding, og dermed indikerer et forhold < 1 svakere affinitet for varianten. Standardavvik i relativ affinitetsbestemmelse var i gjennomsnitt +/- 10 %. Rammeverkssubstitusjoner i variabeldomenene er relative i forhold til CDR-bytteversjonen i henhold til nummereringssystemet til Kabat (Kabat et al., ovenfor).

Tabell 3. Oligonukleotidsekvenser benyttet for konstruering av mutasjoner VH(A49G, R71V, N73K) og VL(L46P) i humanisert 2H7-versjon-16 (2H7.vl6). Understrekede kodoner koder for de indikerte aminosyresubstitusjonene. For VH (R71V, N73K) og VL(L46P) er oligoene vist som sens-tråden siden disse ble benyttet til mutagenese på Fab-templatet, mens for VH (A49G) er oligo vist som antisens-tråden, siden denne ble benyttet med pRK (IgG-tungkjede)-templatet. Proteinsekvensen til versjon-16 er vist i Figur 6 og Figur 7.

Eksempel 2

Antigenbindende determinanter (paratop) for 2H7 Alaninsubstitusjoner (Cunningham & Wells, Science 244: 1081 - 1085 (1989) ble utført i 2H7.vl6 eller 2H7.vl7 for å teste bidraget for individuelle sidekjeder i antistoffet i binding til CD20. IgG-varianter ble uttrykt i 293-celler fra pDRl- og pDR2-vektorer, renset og analysert for relativ bindingsaffinitet som beskrevet ovenfor. Flere alaninsubstitusjoner førte til signifikant minskning i relativ binding til CD20 på WIL-2S-celler (Tabell 4).

Tabell 4. Effekter av alaninsubstitusjoner i CDR-regioner i humanisert 2H7.vl6 målt ved å benytte cellebasert ELISA (WIL2-S-celler). Den relative bindingen er uttrykt som konsentrasjonen av den opprinnelige 2H7.vl6 over konsentrasjonen av varianten som er nødvendig for ekvivalent binding, og dermed indikerer et forhold < 1 svakere affinitet for varianten; et forhold > 1 indikerer høyere affinitet for varianten. Standardavvik i relativ affinitetsbestemmelse var i gjennomsnitt +/-10 %. Rammeverkssubstitusjoner i variabeldomene er relative til 2H7.vl6 i henhold til nummereringssystemet til Kabat (Kabat et al., supra). NBD betyr ingen påvisbar binding. De to numrene for versjon-45 er fra separate eksperimenter.

Eksempel 3

Ytterligere mutasjoner i 2H7-CDR-regioner

Substitusjoner av ytterligere rester og kombinasjoner av substitusjoner på CDR-posisjoner som ble identifisert som viktige ved hjelp av Ala-skanning ble også testet. Flere kombinasjonsvarianter, spesielt v.96 så ut til å binde mer tett enn v. 16.

Tabell 5. Effekter av kombinasjoner av mutasjoner og ikke-alanin-substitusjoner i CDR-regionene til humanisert 2H7.vl6 målt ved å benytte selvbasert ELISA (WIL2-S-celler). Den relative bindingen til CD20 er uttrykt som konsentrasjonen av den opprinnelige 2H7.vl6 over konsentrasjonen til varianten som er nødvendig for ekvivalent binding, og dermed indikerer et forhold < 1 svakere affinitet for varianten, et forhold på > 1 indikerer høyere affinitet for varianten. Standardavvik i relativ affinitetsbestemmelse var i gjennomsnitt 10%. Rammeverksubstitusjoner i variabeldomene er relative til 2H7.vl6 i henhold til nummereringssystemet til Kabat (Kabat et al., supra).

Eksempel 4

Mutasjoner på seter med rammeverkshumaniseringssubstitusjoner Substitusjoner av ytterligere rester på rammeverksposisjoner som ble endret i løpet av humaniseringen ble også testet i 2H7.vl6-bakgrunnen. Spesielt ble alternative rammeverkssubstitusjoner som verken ble funnet i det opprinnelige murine 2H7 eller det humane konsensusrammeverket gjort på VL(P46) og VH(G49, V71 og K73).

Disse substitusjonene førte generelt til liten endring i relativ binding (Tabell 6) noe som tyder på at det er noe fleksibilitet i rammeverks reste r på disse posisjonene.

Tabell 6. Relativ binding i en cellebasert (WIL2-S) analyse av rammeverkssubstitusjoner. IgG-varianter er vist med mutasjoner med hensyn til 2H7.vl6-bakgrunnen. Den relative bindingen er uttrykt som konsentrasjonen av den kimere 2H7.v6.8 over konsentrasjonen til varianten som er nødvendig for ekvivalent binding, og dermed indikerer et forhold <1 svakere affinitet for varianten; et forhold >1 indikerer høyere affinitet for varianten. Standardavvik i relativ affinitetsbestemmelse var i gjennomsnitt +/- 10 %. Rammeverkssubstitusjoner i variabeldomenene er relative til 2H7.vl6 i henhold til nummereringssystemet til Kabat (Kabat et al., supra).

(<*>) Varianter som ble analysert med 2H7.vl6 som standardsammenligning, relative verdier er normaliserte til den for kimeren.

Eksempel 5

Humaniserte 2H7-varianter med forbedrede effektorfunksjoner

Fordi 2H7 kan mediere lysering av B-celler via både komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) søkte vi å fremstille varianter av humanisert 2H7.vl6 med forbedret CDC- og ADCC-aktivitet. Mutasjoner av visse rester inne i Fc-regionene til andre antistoffer har blitt beskrevet (Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571 (2001) for å forbedre CDC via forbedret binding til komplement-komponenten Clq. Mutasjoner er også blitt beskrevet (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591 (2001); Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)) for å forbedre ADCC via forbedret IgG-binding til aktiverende Fcy-reseptorer og redusert IgG-binding til inhibitoriske Fcy-reseptorer. Spesielt har tre mutasjoner blitt identifisert for å forbedre CDC-og ADCC-aktivitet: S298A/E333A/K3334A (også referert til her som en trippel Ala-mutant eller variant, nummerering i Fc-regionen er i henhold til EU-nummereringssystemet, Kabat et al., supra) som beskrevet (Idusogie et al., supra (2001); Shields et al., supra).

For å forbedre CDC- og ADCC-aktivitet for 2H7 ble en trippel Ala-mutant av 2H7-Fc fremstilt. En humanisert variant av anti-HER2-antistoffet 4d5 har blitt fremstilt med mutasjoner S298A/E333A/K334A og er kjent som 4D5FcllO (dvs. anti-pl85HER2-IgGl (S298A/E333A/K334A), Shields et al., supra). Et plasmid p4D5FcllO som koder for antistoff 4D5FcllO (Shields et al., supra) ble fordøyd med Apal og Hindlll, og Fc-fragmentet (inneholdende mutasjoner S298A/E333A/K334A) ble ligert inn i Apal/ Hindlll- seter i 2H7-tungkjedevektoren pDR2-vl6 for å fremstille pDR2-v31. Aminosyresekvensen til den komplette H-kjeden til versjon 31 er vist i Figur 8. L-kjeden er den samme som den for vl6.

Selv om konstantdomenet i Fc-regionen til IgGl-antistoffer er relativt konserverte innenfor en gitt art forekommer allelevariasjoner (gjennomgått av Lefranc og Lefranc, i The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, s. 43-78, F. Shakib (red.), Pergammon Press, Oxford (1990)).

Tabell 7. Effekter av substitusjoner i Fc-regionen på CD20-binding. Relativ binding til CD20 ble målt i en cellebasert (WIL2-S) analyse av rammeverkssubstitusjoner. Fc-mutasjoner (<*>) er indikert ved EU-nummerering (Kabat, supra) og er relative til den opprinnelige 2H7.vl6. Kombinasjonen av tre Ala-endringer i Fc-regionen til v.31 er beskrevet som "FcllO". IgG-varianter er vist med mutasjoner med hensyn til 2H7.vl6-bakgrunnen. Den relative bindingen er uttrykt som konsentrasjonen av 2H7.v6.8-kimeren over konsentrasjonen til varianten som er nødvendig for ekvivalent binding, dermed indikerer et forhold <1 svakere affinitet for varianten. Standardavvik i relativ affinitetsbestemmelse var i gjennomsnitt +/- 10 %.

Eksempel 6

Humaniserte 2H7-varianter med forbedret stabilitet

For utvikling som terapeutiske proteiner er det ønskelig å velge varianter som forblir stabile med hensyn til oksidering, deamidering eller andre prosesser som kan påvirke produktkvalitet, i en hensiktsmessig formuleringsbuffer. I 2H7.vl6 ble flere resterer identifiserte som mulige kilder for ustabilitet: VL (M32) og VH (M34, N100). Derfor ble mutasjoner introdusert på disse setene for sammenligning med vl6.

Tabell 8. Relativ binding av 2H7-varianter designet for forbedret stabilitet og/eller effektorfunksjon, til CD20 i en cellebasert (WIL2-S)-analyse. IgG-varianter er vist med mutasjoner med hensyn til 2H7.vl6-bakgrunnen. Den relative bindingen er uttrykt som konsentrasjonen av den kimere 2H7.v6.8 over konsentrasjonen av varianten som er nødvendig for ekvivalent binding, og dermed indikere et forhold <1 svakere affinitet for varianten. Standardavvik i relativ affinitetsbestemmelse var i gjennomsnitt +/- 10 %. Rammeverkssubstitusjoner i variabeldomenene er relative til 2H7.vl6 i henhold til nummereringssystemet til Kabat og Fc-mutasjoner (<*>) er indikert ved EU-nummerering (Kabat et al., supra). (<**>) Varianter som ble målt med 2H7.vl6 som standardsammenligning, relative verdier er normaliserte til de for kimeren.

Ytterligere Fc-mutasjoner ble kombinert med stabilitets- eller affinitetsøkende mutasjoner for å endre eller forbedre effektorfunksjoner basert på tidligere rapporterte mutasjoner (Idusogie et al. (2000); Idusogie et al. (2001); Shields et al. (2001)). Disse endringene inkluderte S298, E333A, K334A som beskrevet i Eksempel 5, K322A for å redusere CDC-aktivitet, D265A for å redusere ADCC-aktivitet, K326A eller K326W for å forbedre CDC-aktivitet og E356D/M358L for å teste effektene av allotypiske endringer i Fc-regionen. Ingen av disse mutasjoner forårsaket signifikante forskjeller i CD20-bindingsaffinitet.

relativ bindingsverdier er normaliserte til de for kimeren.

For å teste effektene av stabilitetsmutasjoner på hastigheten av proteindegradering ble 2H7.vl6 og 2H7.v73 formulert ved 12-14 mg/ml i 10 mM histidin, 6 % sukrose, 0,02 % polysorbat-20, pH 5,8 og inkubert ved 40 °C i 16 dager. De inkuberte prøvene ble deretter analysert for endringer i ladningsvarianter ved ionebytterkromatografi, aggregering og fragmentering ved hjelp av størrelseseksklusjonskromatografi og relativ binding ved hjelp av testing i en cellebasert (WIL2-S) analyse.

Resultatene (Fig. 9) viser at 2H7v.73 har større stabilitet sammenlignet med 2H7v.l6 med hensyn til tap i fraksjonen i hovedtopp ved ionebytterkromatografi under akselererte stabilitetsbetingelser. Ingen signifikante forskjeller ble sett med hensyn til aggregering, fragmentering eller bindingsaffinitet.

Eksempel 7

Scatchard-analyse av antistoffbinding til CD20 på WIL2-S-celler

Likevektsdissosieringskonstanter (Kd) ble bestemt for 2H7-IgG-varianter som binder til WIL2-S-celler ved å benytte radiomerket 2H7-IgG. IgG-varianter ble fremstilt i CHO-celler. Rituxan (kilde for alle eksperimenter er Genentech, S. San Francisco, CA) og murint 2H7 (BD PharMingen, San Diego, CA) ble benyttet til sammenligning med humaniserte varianter. Det murine 2H7-antistoffet var også tilgjengelig fra andre kilder, f.eks. eBioscience og Calbiochem (begge i San Diego, CA), Accurate Chemical & Scientific Corp., (Westbury, NY), Ancell (Bayport, MN) og Vinci-Biochem (Vinci, Italia). Alle fortynninger ble utført i bindingsanalysebuffer (DMEM-medium inneholdende 1 % bovint serumalbumin, 25 mM HEPES pH 7,2 og 0,01 % natriumazid). Volumer (0,025 ml) med<125>I-2H7.vl6 (jodert med laktoperoksidase) ved en konsentrasjon på 0,8 nM ble tilsatt i brønner i en V-bundet 96-brønners mikroanalyseplate og seriefortynninger (0,05 ml) av kaldt antistoff ble tilsatt og blandet. WIL2-S-celler

(60 000 celler i 0,025 ml) ble deretter tilsatt. Platen ble forseglet og inkubert ved romtemperatur i 24 timer, deretter sentrifugert i 15 minutter ved 3 500 RPM. Supernatanten ble deretter aspirert og cellepelleten ble vasket og sentrifugert. Supernatanten ble igjen aspirert og pelletene ble løst i IN NaOH og overført til rør for gammatelling. Dataene ble benyttet til Scatchard-analyse (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980) ved å benytte programmet Ligand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17:107-114

(1983)). Disse resultatene som er vist i Tabell 9 indikerer at humaniserte 2H7-varianter hadde tilsvarende CD20-bindingsaffinitet som sammenlignet med murint 2H7, og lignende bindingsaffinitet til Rituxan. Det er forventet at 2H7.v31 vil ha svært lik Kdmed v.16 på basis av bindingen som er vist i Tabell 7 ovenfor.

Eksempel 8

Komplementavhengig cytotoksisitet (CDC)-analyser 2H7-IgG-varianter ble analysert for deres evne til å mediere komplementavhengig lysering av WIL2-S-celler, som er CD20-uttrykkende lymfoblastoid B-cellelinje, i all hovedsak som beskrevet (Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)). Antistoffer ble seriefortynn et 1:3 fra en stokkløsning på 0,1 mg/ml. Et volum på 0,05 ml av hver fortynning ble tilsatt til en 96 brønners vevskulturplate som inneholdt 0,05 ml av en løsning med normalt humant komplement (Quidel, San Diego, CA). Til denne blandingen ble 50 000 WIL2-S-celler tilsatt i et volum på 0,05 ml. Etter inkubering i 2 timer ved 37 °C ble 0,05 ml av en løsning av Alamar-bått (Accumed International, Westlake, OH) tilsatt og inkubering ble fortsatt

i ytterligere 18 timer ved 37 °C. Beskyttelsene ble deretter fjernet fra platene og de ble rystet i 15 minutter ved romtemperatur på en orbital rister. Relative fluorescensen heter (RFU) ble avlest ved å benytte et eksitasjonsfilter på 530 nm og et emisjonsfilter på 590 nm. En EC50-verdi ble kalkulert ved å tilpasse RFU som en funksjon av konsentrasjon for hvert antistoff ved å benytte KaleidaGraph-programvare.

Resultatene (Tabell 10) viser overraskende forbedring i CDC ved humaniserte 2H7-antistoffer, med relativ styrke tilsvarende til Rituxan for v.73, 3 ganger sterkere enn Rituxan for v.75 og 3 ganger svakere enn Rituxan for v.16.

Tabell 10. CDC-aktivitet for 2H7-antistoffer sammenlignet med Rituxan. Verdier > 1 indikerer mindre sterk CDC-aktivitet enn Rituxan og verdier < 1 indikerer sterkere aktivitet enn Rituxan. Antistoffer ble fremstilt fra stabile CHO-linjer, bortsett fra at de som er indikert med (<*>) ble fremstilt transient.

Eksempel 9

Antistoffavhengig cellulær cytotoksisitets (ADCC)-analyser

2H7 IgG-varianter ble analysert for deres evne til å mediere naturlige drepecelle (NK-celle)-lysering av WIL2-S-celler, som er en CD20-uttrykkende lymfoblastoid B-cellelinje, i hovedsak som beskrevet av (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)) ved å benytte en laktatdehydrogenase (LDH) avløsning. NK-celler ble fremstilt fra 100 ml

heparinisert blod, fortynnet med 100 ml PBS (fosfatbufret saltløsning), fremskaffet fra normale humane donorer som hadde blitt isotypet for FcyRIII, også kjent som CD16 (Koene et al., Blood 90:1109-1114 (1997)). I dette eksperimentet var NK-cellene fra humane donorer som var heterozygote for CD16 (F158/V158). Det fortynnede blodet ble lagt over 15 ml med lymfocyttsepareringsmedium (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) og sentrifugert i 20 minutter ved 2000 RPM. Hvite celler i overgangen mellom lag ble overført til 4 rene 50 ml rør, som ble fylt med RPMI-medium inneholdende 15 % føtalt kalveserum. Rør ble sentrifugert i 5 min ved 1400 RPM og supernatanten ble kastet. Pelleter ble resuspendert i MACS-buffer (0,5 % BSA, 2 mM EDTA) og NK-celler ble renset ved å benytte kuler (NK-celleisoleringssett, 130-046-502) i henhold til produsentens protokoll (Miltenyi Biotech). NK-celler ble fortynnet i MACS-buffer til 2xl0<6>celler/ml.

Seriefortynninger av antistoff (0,05 ml) i analysemedium (F12/DMEM 50:50 uten glysin, 1 mM HEPES-buffer pH 7,2, penicillin/streptomycin (100 enheter/ml; Gibco), glutamin og 1 % varmeinaktivert føtalt bovinserum) ble tilsatt til en 96 brønners rundbundet vevskulturplate. WIL2-S-celler ble fortynnet i analysebuffer til en konsentrasjon på 4 x 10<5>/ml. WIL2-S-celler (0,05 ml pr. brønn) ble blandet med fortynnet antistoff i 96 brønnersplaten og inkubert i 30 min ved romtemperatur for å tillate binding av antistoff til CD20 (opsonisering).

ADCC-reaksjonen ble startet ved å tilsette 0,1 ml NK-celler til hver brønn. I kontrollbrønner ble 2 % Triton X-100 tilsatt. Platen ble deretter inkubert i 4 timer ved 37 °C. Nivåer av LDH som ble frigjort ble målt ved å benytte et cytotoksisitets (LDH)-påvisningssett (Kit #1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana) ved å følge instruksjonene til produsenten. 0,1 ml med LDH-utvikler ble tilsatt til hver brønn etterfulgt av blanding i 10 sek. Platen ble deretter dekket med aluminiumsfolie og inkubert i mørket ved romtemperatur i 15 min. Optisk tetthet ved 490 nm ble deretter avlest og benyttet for å beregne % lysering ved å dele på det totale LDH som var målt i kontrollbrønner. Lysering ble plottet som en funksjon av antistoffkonsentrasjon og en 4-parameterkurvetilpasning (KaleidaGraph) ble benyttet for å bestemme EC50-konsentrasjoner.

Resultatene viste at humaniserte 2H7-antistoffer var aktive i ADCC med relativ styrke 20 ganger høyere enn Rituxan for v.31 og v.75, 5 ganger sterkere enn Rituxan for v. 16 og nesten 4 ganger sterkere enn Rituxan for v.73.

Ytterligere ADCC-analyser ble utført for å sammenligne kombinasjonsvarianter av 2H7 med Rituxan. Resultatene av disse analysene indikerte at 2H/.vll4 og 2H7.vll5 har mer enn 10 ganger forbedret ADCC-styrke sammenlignet med Rituxan (Tabell 12).

Eksempel 10

In wVo-effekter av 2H7-varianter i en pilotstudie i cynomolgusaper 2H7-varianter fremstilt ved hjelp av transient transfeksjon av CHO-celler ble testet i normale cynomolgushannaper ( Macaca fascicularis) for å evaluere deres in vivo aktiviteter. Andre anti-CD20-antistoffer, slik som C2B8 (Rituxan) har vist en evne til å depletere B-celler i normale primater (Reff et al., Blood 83:435-445 (1994)).

I én undersøkelse ble humaniserte 2H7-varianter sammenlignet. I en parallell undersøkelse ble også Rituxan testet i cynomolgusaper. Fire aper ble benyttet i hver av fem doseringsgrupper: (1) vehikkel, (2) 0,05 mg/kg hu2H7.vl6, (3) 10 mg/kg hu2H7.vl6, (4) 0,05 mg/kg hu2H7.v31 og (5) 10 mg/kg hu2H7.v31. Antistoffer ble administrert intravenøst ved en konsentrasjon på 0, 0,2 eller 20 mg/ml i totalt to doser, én på dag 1 av undersøkelsen og en annen på dag 8. Den første dagen med dosering er betegnet dag 1 og den foregående dagen blir dermed dag -1, den første dagen for gjeninnhenting (for 2 dyr i hver gruppe) er betegnet dag 11. Blodprøver ble samlet på dagene -19, -12, 1 (før dosering) og ved 6 timer, 24 timer og 72 timer etter den første dosen. Ytterligere prøver ble tatt på dag 8 (før dosering), dag 10 (før avliving av 2 dyr pr. gruppe) og på dagene 36 og 67 (for restituerende dyr).

Perifere B-cellekonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av en FACS-fremgangsmåte som talte CD3-/CD40+-celler. Prosentandelen av CD3-CD40+-B-celler av totale lymfocytter i apeprøver ble fremskaffet ved hjelp av den følgende adgangsstrategien. Lymfocytt-populasjonen ble markert på foroverspredningen/sidespredningen-spredningsdiagrammet for å definere Region 1(R1). Ved å benytte hendelser i RI ble fluorescensintensitetsdotplots vist for CD40- og CD3-markører. Fluorescensmerkede isotypekontroller ble benyttet for å bestemme respektive grensepunkter for CD40 og CD3-positivitet.

Resultatene indikerte at både 2H7.vl6 og 2H7.v31 var i stand til å produsere full perifer B-celledeplesjon ved 10 mg/kg-dosen og partiell perifer B-celledeplesjon ved 0,05 mg/kg-dosen (Fig. 11). Tidsforløpet og omfanget av B-celledeplesjon målt i løpet av de første 72 timene av dosering var tilsvarende for de to antistoffene. Etterfølgende analyser av de restituerende dyrene indikerte at dyr behandlet med 2H7.v31 viste en forlenget uttømming av B-celler sammenlignet med dem som ble dosert med 2H7.vl6. Spesielt viste restituerende dyr som var behandlet med 10 mg/kg 2H7.vl6 vesentlig B-cellegjeninnhenting ved et tidspunkt mellom prøvetaking på dag 10 og på dag 36. For restituerende dyr som var behandlet med 10 mg/kg 2H7.v31 viste likevel ikke B-celler gjeninnhenting inntil et tidspunkt mellom dag 36 og dag 67 (Figur 11). Dette tyder på en lengre varighet av full uttømming på omtrent én måned for 2H7.v31 sammenlignet med 2H7.vl6.

Ingen toksisitet ble observert i apeundersøkelsen ved lave eller høye doser og den overordnede patologien var normal. I andre undersøkelser var vl6 godt tolerert opp til den høyeste dosen som ble vurdert på (100 mg/kg x 2 = 1200 mg/m<2>x 2) etter i.v. administrering av to doser gitt 2 uker imellom til disse apene.

Data fra cynomolgusaper med 2H7.vl6 i forhold til Rituxan tyder på at en 5 gangers reduksjon i CDC-aktivitet ikke skadelig påvirker styrken. Et antistoff med sterk ADCC-aktivitet, men redusert CDC-aktivitet kan ha mer foretrukket sikkerhetsprofil med hensyn til første infusjonsreaksjoner enn et med høyere CDC-aktivitet.

Eksempel 11

Fukoseman<q>lende 2H7- variantantistoffer med forbedret effektorfunksion Normale CHO- og HEK293-celler setter fukose på IgG-oligosakkarid i en høy grad (97-98 %). IgG fra serum er også svært fukosylert.

DP12, som er en dihydrofolatreduktase minus (DHFR ) CHO-cellelinje som er fukosyleringskompetent, og Lecl3, som er en cellelinje som mangler proteinfukosylering ble benyttet for å produsere antistoffer til denne undersøkelsen. CHO-cellelinjen Pro-Lecl3.6a (Lecl3) ble fremskaffet fra Professor Pamela Stanley fra Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University. Morlinjerer Pro- (prolinauxotrof) og Gat- (glysin, adenosin, tymidinauxotrof). CHO-DP12-cellelinjen er et derivat av CHO-Kl-cellelinjen (ATCC#CCL-61), som mangler dihydrofolatreduktase og har et redusert behov for insulin. Cellelinjer ble transfektert med cDNA ved å benytte Superfect-fremgangsmåten (Qiagen, Valencia, CA). Seleksjon av Lecl3-cellene som uttrykker transfekterte antistoffer ble utført ved å benytte puromycindihydroklorid (Calbiochem, San Diego, CA) ved 10 \ ig/ m\ i vekstmedium inneholdende: MEM-alfa-medium med L-glutamin, ribonukleosider og deoksyribonukleosider (GIBCO-BRL), Gaithersburg, MD), tilsatt 10 % inaktivert FBS (GIBCO), 10 mM HEPES og IX penicillin/streptomycin (GIBCO). CHO-cellene ble tilsvarende selektert i vekstmedium inneholdende Hams F12 uten GHT: Lav glukose-DMEM uten glysin med NaHC03 tilsatt med 5 % FBS (GIBCO), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, IX GHT (glysin, hypoksantin, tymidin) og IX penicillin/streptomycin.

Kolonier ble dannet i løpet av to til tre uker og ble slått sammen for ekspansjon og proteinuttrykking. De sammenslåtte cellene ble initialt utsådd ved 3 x IO<6>celler pr. 10 cm plate for proteinuttrykking i liten skala. Cellene ble overført til serumfritt medium med en gang de hadde vokst til 90-95 % konfluens og etter 3-5 dager ble cellesupernatanter samlet og testet i en Fc-IgG- og intakt IgG-ELISA for å beregne proteinuttrykkingsnivåer. Lecl3- og CHO-celler ble utsådd ved omtrent 8xl0<6>celler pr. 15 cm plate én dag før konvertering til PS24-produksjonsmedium tilsatt 10 mg/l rekombinant humant insulin og 1 mg/l sporstoffer.

Lecl3-celler og DP12-celler forble i serumfritt produksjonsmedium i 3-5 dager. Supernatanter ble samlet og klaret ved hjelp av sentrifugering i 150 ml koniske rør for å fjerne celler og avfall. Proteaseinhibitorene PMSF og aprotinin (Sigma, St. Loius, MO) ble tilsatt og supernatantene ble konsentrert 5 ganger på rørte celler ved å benytte MWCO30-filtere (Amicon, Beverly, MA) i forkant av rask rensing ved å benytte protein G-kromatografi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)). Alle proteiner ble byttet buffer på til fosfatbufret saltløsning (PBS) ved å benytte Centripriep-30 konsentratorer (Amicon) og analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å benytte A280 og bekrefte det å benytte aminosyresammensetningsanalyse.

CHO-cellene ble transfektert med vektorer som uttrykker humanisert 2H7vl6, 2H7v.31 og selektert som beskrevet. 2H7vl6-antistoffet opprettholder villtype-Fc-regionen mens v.31 (se Eksempel 5, Tabell 7 ovenfor) har en Fc-region der 3 aminosyreendringer ble gjort (S298A, E333A, K334A) noe som fører til høyere affinitet for FcyRIIIa-reseptoren (Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (9):6591-6604 (2001)). Etter transfeksjon og seleksjon ble individuelle kolonier av celler isolert og vurdert for proteinuttrykkingsnivå og de som produserte mest ble utsatt for metotreksatseleksjon for å selektere for celler som hadde forhøyet plasmidkopiantallet og som derfor produserte høyere nivåer av antistoff. Celler ble dyrket, overført til serumfritt medium i en periode på 7 dager og deretter ble mediet samlet, satt på en protein-A-kolonne og antistoffet ble eluert ved å benytte standardteknikker. Sluttkonsentrasjonen av antistoffet ble bestemt ved å benytte en Elisa som måler intakt antistoff. Alle proteiner ble byttet buffer på til fosfatbufret saltløsning (PBS) ved å benytte Centripriep-30-konsentratorer (Amicon) og analysert på SDS-polyakrylamidgelelektroforese.

Matriksassistert laserdesorpsjons-/-ioniserings' Time-of-flight (MALDI-TOF)-massespektralanalyse av asparaginbundne oligosakkarider: N-bundne oligosakkarider ble frigjort fra rekombinante glykoproteiner ved å benytte prosedyren til Papac et al, Glycobiology 8, 445-454 (1998). Kort fortalt ble brønnene i en 96-brønners PVDF-dekt mikrotiterplate (Millipore, Bedford, MA) kondisjonert med 100^1 metanol som ble dratt gjennom PDVF-membranene ved å sette på vakuum på Millipore-Multiscreen-vakuum-manifolden. De kondisjonerte PVDF-membranene ble vasket med 3 x 250^1 vann. Mellom alle vasketrinn ble brønnene drenert fullstendig ved å påsette forsiktig vakuum på manifolden. Membranene ble vasket med reduksjons- og karboksymetyleringsbuffer (RCM) bestående av 6 M guanidinhydroklorid, 360 mM tris, 2 mM EDTA, pH 8,6. Glykoproteinprøver (50^g) ble tilsatt i individuelle brønner, igjen dratt gjennom PVDF-membranene ved hjelp av forsiktig vakuum og brønnene ble vasket med 2 x 50^1 RCM-buffer. De immobiliserte prøvene ble redusert ved å tilsette 50^1 med en 0,1 M ditiotreitol (DTT)-løsning til hver brønn og inkubere mikrotiterplaten ved 37 °C i 1 time. DTT ble fjernet ved hjelp av vakuum og brønnene ble vasket 4 x 250^1 vann. Cysteinrester ble karboksylmetylert ved tilsetningen av 50^1 med en 0,1 M jodeddiksyre (IAA)-løsning som ble friskt klargjort i 1 M NaOH og fortynnet til 0,1 M med RCM-buffer. Karboksymetylering ble utført ved inkubering i 30 min i mørket ved omkringliggende temperatur. Vakuum ble påsatt på platen for å fjerne IAA-løsningen og brønnene ble vasket med 4 x 250^1 renset vann. PVDF-membranene ble blokkert ved tilsetning av 100^1 med 1 % PVP360 (polyvinylpyrrolidin 360000 MW) (Sigma)-løsning og inkubert i 1 time ved omkringliggende temperatur. PVP-360-løsningen ble fjernet ved lett vakuum og brønnene ble vasket 4 x 250^1 vann. PNGase-F (New England Biolabs, Beverly, MA)-fordøyelsesløsningen, 25^1 med en 25 enhet/ml løsning i 10 mM tris-acetat, pH 8,4 ble tilsatt til hver brønn og fordøyingen fortsatte i 3 timer ved 37 °C. Etter fordøying ble prøvene overført til 500^1 Eppendorf-rør og 2,5^1 med en 1,5 M eddiksyreløsning ble tilsatt til hver prøve. De forsurede prøvene ble inkubert i 3 timer ved omkringliggende temperatur for å konvertere oligosakkaridene fra glykosylaminer til hydroksylformen. I forkant av MALDI-TOF-massespektralanalyse ble de frigjorte oligosakkaridene avsaltet ved å benytte et volum på 0,6 ml med kationbytterresin (AG50W-X8-resin i hydrogenformen) (Bio-Rad, Hercules, CA) som var lett pakket i kompakte reaksjonsrør (US Biochemical, Cleveland,

OH).

For MALDI-TOF-massespektralanalyse ble prøvene i den positive modusen, de avsaltede oligosakkaridene (0,5^1 volumer) ble påsatt på det plettfrie målet med 0,5^1 av 2,5-dihydroksybenzosyrematriksen (sDHB) som ble fremstilt ved å løse 2 mg 2,5-dihydroksybenzosyre med 0,1 mg 5-metoksysilicylsyre i 1 ml etanol/10 mM natriumklorid 1:1 (v/v). Prøve/matriks-blandingen ble tørket med vakuum. Foranalyse i den negative modusen ble de avsaltede N-bundne oligosakkaridene (0,5^1 volumer) påsatt på det plettfrie målet sammen med 0,5^1 2', 4', 6'-trihydroksyacetofenonmatriks (THAP) klargjort i 1:3 (v/v) acetonitril/13,3 mM ammoniumsitratbuffer. Prøve/matriks-blandingen ble vakuumtørket og deretter tillatt å absorbere atmosfærisk fuktighet før analyse. Frigjorte oligosakkarider ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF på et PerSeptive- BioSystems-Voyager-DE-massespektrometer. Massespektrometeret ble operert ved 20 kV enten i det positive eller negative modus med den lineære konfigurasjonen og ved å benytte forsinket ekstraksjon. Data ble innsamlet ved å benytte laserstyrke på 1300 og i datasummerings-modus (240 skanninger) for å forbedre signalet i forhold til støy. Instrumentet ble kalibrert med en blanding av standardoligosakkarider og dataene ble tilpasset ved å benytte en 19-punkts Savitsky-Golay-algoritme før massene ble tilordnet. Integrering av massespektral-dataene ble oppnådd ved å benytte Caesar 7.0-dataanalyseprogramvarepakken (SciBridge Software).

Naturlig dreper ( NK)- celleantistoffavhengig cytotoksisitetsanalyser

ADCC-analyser ble utført som beskrevet i Eksempel 9. Forholdet NK-celler til målcelle (WIL2-S) var 4 til 1, analyser ble kjørt i 4 timer og toksisitet ble målt som tidligere ved å benytte laktosedehydrogenaseanalyse. Målceller ble opsonert med konsentrasjonene av antistoff indikert for 30 minutter før tilsetning av NK-celler. Rituxanantistoffet som ble benyttet var fra Genentech (S. San Francisco, CA). Figur 12 viser resultatene for en representativ ADCC-analyse.

Resultatene viser at underfukosylerte antistoffer medierer NK-cellemål-celledreping mer effektivt enn antistoffer med et fullt kompliment med fukose. Det underfukosylerte antistoffet, 2H7v.31, er mest effektivt i å mediere målcelledreping. Dette antistoffet er effektivt ved lavere konsentrasjoner og i stand til å mediere dreping av en større prosentandel av målceller ved høyere konsentrasjoner enn andre antistoffer er. Aktiviteten til antistoffene er som følger: Lecl3-avledet 2H7v31>Lec 13 avledet 2H7vl6>Dpl2-avledet 2H7v31>Dpl2 avledet 2H7vl6> eller = med Rituxan. Protein- og karbohydratendringene er additive. Sammenligning av karbohydratet funnet på nativt IgG fra det Lecl3-produserte og CHO-produserte IgG viste ingen vesentlige forskjeller i omfanget av galaktosylering og dermed kan resultatene bli tilskrevet kun til tilstedeværelsen/fravær av fukose.

Eksempel 12

Fukosemanglende 2H7-variantantistoffer med forbedret ADCC In vivo Dette eksemplet beskriver ADCC-aktivitet in vivo av de fukosemanglende humaniserte 2H7-variantene inkludert v.16 og v.31 produsert i Lecl3 sammenlignet med normale fukosylerte motparter produsert i DP12, i mus som uttrykker human CD16[FcRyIII] og humant CD20.

Fremskaffelse av huCD20Tg<+>huCD16Tg<+>mCDie^- mus

Human-CD20-transgenmus ble fremskaffet fra human CD20-BAC DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mus ble screenet basert på FACS-analysen av human CD20-uttrykking. HuCD20 Tg<+->mus ble deretter krysset med huCD16Tg<+>mCD16"</>"-mus for å fremskaffe huCD20Tg<+>huCD16Tg<+>mCDlG^-mus.

In vivo- behandling

Ti til 100^g av hver av 2H7-variantene eller Rituxan ble administrert til huCD20Tg<+>huCD16Tg<+>mCD16"</>"-mus via intraperitonale injeksjoner. Lik mengde av isotype-matchede antistoffer vil bli tilført tilsvarende til den negative kontrollgruppen med dyr.

Preparering av muselymfocytter

Muselymfocytter fra helt blod, milt, lymfeknuter og benmarg ble klargjort i henhold til standardprotokoll beskrevet i "Current Protocols in Immunology, utgitt av John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach og Warren Strober, 1994".

FACS- analyse

En halv million celler ble vasket og resuspendert i 100^1 FACS-buffer som er fosfatbufret saltløsning med 1 % BSA inneholdende 5^1 fargings- eller kontrollantistoff. Alle fargingsantistoffene inkludert isotypekontroller er fremskaffet fra PharMingen, San Diego, CA. Human-CD20-uttrykking ble undersøkt ved å farge med Rituxan sammen med FITC-konjugert anti-human-IgGl-sekundærantistoff. FACS-analyse ble benyttet ved å benytte FACScan og Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Alle lymfocyttene er definert i foroverlysspredningene og sidelysspredningene mens alle B-lymfocyttene er definert med uttrykkingen av B220 på celleoverflaten.

B-celledeplesjon og gjenvinning ble undersøkt ved å analysere perifere B-celletellinger og analyse av hCD20+-B-celler ved hjelp av FACS i milten, lymfeknute og benmarg på en daglig basis i den første uken etter injeksjon og deretter på ukentlig basis. Serumnivåer av det injiserte 2H7-variantantistoffet ble overvåket.

Resultatene av denne in wVo-analysen bekrefter funnene in vitro når det gjelder økt ADCC-aktivitet og høyere B-celledeplesjon av fukosemanglende 2H7-varianter i forhold til villtype (med hensyn til fukosylering) glykosyleringsmotparter.

Eksempel 13

Apoptoseaktivitet

Anti-CD20-antistoffer inkludert Rituxan er blitt vist å indusere apoptose in vitro når de er kryssbundet til et sekundært antistoff eller på kjemiske måter (Shan et al., Blood 9:1644-1652 (1998); Byrd et al., Blood 99:1038-43 (2002); Pederson et al., Blood 99:1314-19 (2002)). Når kjemisk kryssbundne murine 2H7-dimerer induserte apoptose i Daudi-celler (Ghetie et al., Proe Nati Acad Sei USA 94:7509-14 (1997)). Kryssbinding med et sekundært antistoff induserte også apoptose med det murine 2H7-antistoffet (Shan et al., 1998). Disse aktivitetene er antatt å være fysiologisk relevante fordi en mengde mekanismer kan føre til kryssbinding av anti-CD20-antistoffer bundet til celleoverflate-CD20 in vivo.

RhuMAb 2H7.vl6 [humanisert 2H7 vl6; RhuMAb står for rekombinant humant monoklonalt antistoff] og Retuxan ble sammenlignet i apoptoseanalyse in vitro ved å benytte et sekundært kryssbindende antistoff. Ramos-celler (CRL-1596, ATCC, Manassas, VA), som er en CD20-uttrykkende human B-lymfocyttcellelinje, ble benyttet til å måle evnen til de monoklonale anti-CD20-antistoffene rhuMAb 2H7.vl6 og Rituximab versus et negativt kontrollantistoff, Trastuzumab (Herceptin, Genentech, South San Francisco, CA), til å indusere apoptose som målt ved Annexin-V-farging og propidiumjodfargestoffeksklusjon (Vybrant Apoptosis Assay Kit, Molecular Probes, Seattle, WA). Ramos-cellene ble dyrket i RPMI-1640-medium (Gibco, Rockville, MD) inneholdende 10 % føtalt bovinserum (Biosource International, Camarillo, CA) og 2 mM L-glutamin (Gibco). Før de ble analysert ble cellene vasket to ganger i friskt medium og deretter justert til en cellekonsentrasjon på 2 x IO6 per ml. Celler (150^1) ble tilsatt til 96-brønners analyseplater (Becton Dickinson, Palo Alto, CA) som inneholdt 150^1 med en forhåndsbestemt mengde av kontroll-IgGl, rhuMAb 2H7.vl6 eller Rituximab sammen med F(ab)'2-geit-anti-human-Fc (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). De endelige IgG-konsentrasjonene var 100, 10, 1,0, 0,1, 0,001 og 0,001 nM og F(ab)'2-geit-anti human-Fc-antistoffkonsentrasjonen ble satt til to ganger den respektive prøveantistoffkonsentrasjon. Hver fortynning ble satt opp i triplikat. Etter en 24 timers inkubering ved 37 °C ble cellene vasket to ganger med PBS og deretter farget med Annexin-V og propidiumjodid i henhold til produsentens anbefalinger. Fargingsmønstrene for Ramos-cellene ble analysert ved hjelp av Flowcytometri ved å benytte et FACscan-flow-cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) og data ble samlet i 10 sekunders perioder. Dataene ble redusert ved å benytte Cellquest-pro-programvaren (Becton Dickinson). Ramos-celler som var positive for (1) Annexin-V-farging, (2) Annexin-V- og propidiumjodidobbeltfarging og (3) antallet ufargede levende celler, ble talt og plottet ved å benytte KaleidaGraph-programvare (Synergy Software, Reading, PA).

Både rhuMAb 2H7.vl6 og Rituximab induserte apoptose i Ramos-celler når de var kryssbundet med anti-human-Fc og som sammenlignet med et irrelevant IgGl-kontrollantistoff (Figurer 13-15). Den apoptopiske aktiviteten til (rhuMAb 2H7) var noe lavere enn den for Rituximab. Ved 10 nM konsentrasjoner av kryssbundet rhuMAb 2H7, Rituximab og kontroll-IgGl-antistoff var fraksjoner av Annexin-V-fargede celler henholdsvis 18,5, 16,5, 2,5 %, fraksjoner av dobbeltmerkede celler var 29, 38 og 16 % og antall av levende celler talt pr. 10 sek var 5200, 3100 og 8600.

Disse in wfro-dataene viser at apoptose er én potensiell mekanisme for in vivo- B-celle-uttømming. In wVo-kryssbinding av rhuMAB 2H7 eller Rituximab bundet til celleoverflate-CD20 kan foregå via FcyR på overflatene til immuneffektorceller.

Eksempel 14

In wVo-untertrykking av tumorvekst

Evnen til rhuMAb 2H7.vl6 til å inhibere veksten av de humane Raji-B-cellene, som er en lymfomcellelinje (ATCC CCL 86), ble evaluert i Balb/c-nakenmus (athymisk). Raji-cellene uttrykker CD20 og er blitt rapportert å vokse i nakenmus der de fører til metastatisk sykdom, tumorvekst blir inhibert av Rituxan (Clynes et al., Nature Medicine 6, 443-446

(2000)). Femtiseks 8-10 uker gamle Balb/c-nakenmus ble delt i 7 grupper (A-G) der hver gruppe består av 8 mus. På dag 0 mottok hver mus en subkutan injeksjon av 5 x IO<6>Raji-B-lymfomceller i flanken. Startende på dag 0 mottok hver mus enten 100^1 av negativkontrolløsningen (PBS, fosfatbufret saltløsning), Rituxan eller 2H7.vl6. Dosering var avhengig av vekt og legemiddellevering var intravenøs via halevenen. Gruppe-A-mus mottok PBS. Gruppene B-D mottok Rituxan ved hhv. 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg og 0,05 mg/kg. Grupper E-G-mus mottok 2H7v.l6 ved hhv. 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg og 0,05 mg/kg. Injeksjonene ble gjentatt hver uke i 6 uker. Ved ukentlige intervaller i løpet av behandlingen ble hver mus inspisert for tilstedeværelsen av tydelige tumorer på stedet for injeksjon, og volumet av tumorene hvis de var til stede ble målt og registrert. En siste inspeksjon ble gjort på uke 8 (etter et to-ukers intervall med ingen behandlinger).

Resultatene av denne undersøkelsen viste at både rhuMAb 2H7.vl6 og Rituxan var effektive til å inhibere subkutan Raji-celletumorvekst i nakenmus (FIG 16-18). Tumorvekst ble observert i PBS-kontrollgruppen fra fjerde uke. Likevel ble ingen tumorvekst observert i grupper behandlet med Rituxan eller 2H7.vl6 ved 5 mg/kg eller 0,5 mg/kg i løpet av 8 ukers varigheten av undersøkelsen. I lavdosebehandlingsgruppene med 0,05 mg/kg ble tumor observert i ett dyr i 2H7-gruppen og i ett dyr i Rituxan-gruppen (FIG. 18)

Eksempel 15

Kloning av cynomolgusape CD20 og antistoffbinding CD20-DNA-sekvensen for cynomolgusape (Macaca fascicularis) ble bestemt ved isoleringen av cDNA som koder for CD20 fra et bibliotek med cynomolgusmilt cDNA. Et SUPERSCRIPT-plasmidsystem for cDNA-syntese og plasmidkloning (Kat. nr. 18248-013, Invitrogen, Carlsbad, CA) ble benyttet med små modifikasjoner for å konstruere biblioteket. cDNA-biblioteket ble ligert inn i en pRK5E-vektor ved å benytte restriksjonssetene Xho I og Not I. mRNA ble isolert fra miltvev (California Regional Research Primate Center, Davis, CA). Primere får amplifisere cDNA som koder for CD20 ble designet basert på ikke-kodende sekvenser fra human CD20. N-terminalregionprimer 5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3' (SEQ ID NO. 37) og C-terminalregionprimer 5'-AAGCTATGAACACTAATG-3' (SEQ ID NO. 38) ble ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) benyttet til å klone cDNA som koder for cynomolgusaper-CD20. PCR-reaksjonen ble utført ved å benytte Platinum-Taq-DNA- polymerase-High Fidelity i henhold til produsentens anbefaling (Gibco, Rockville, MD). PCR-produktet ble subklonet inn i pCR 2.1-TOPO-vektor (Invitrogen) og transformert inn i XL-1-blue E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Plasmid-DNA inneholdende ligerte PCR-produkter ble isolert fra individuelle kloner og sekvensert.

Aminosyresekvensen for cynomolgusape CD20 er vist i Figur 19. Figur 20 viser en sammenligning av cynomolgus-CD20 og human CD20. Cynomolgusape-CD20 er 97,3 % lik human CD20 med 8 ulikheter. Det ekstracellulære domene inneholder én endring på V157A mens de gjenværende 7 restene kan bli funnet i cytoplasma- eller transmembranregionene.

Antistoffer rettet mot human CD20 ble analysert for evnen til å binde og fortrenge FITC-konjugert murin 2H7-binding til cynomolgusapeceller som uttrykker CD20. Tyve ml blod ble tappet fra 2 cynomolgusaper (California Regional Research Primate Center, Davis, CA) inn i natriumheparin og fraktet direkte til Genentech Inc. På samme dag ble blodprøvene slått sammen og fortynnet 1:1 ved tilsetning av 40 ml fosfatbufret saltløsning (PBS). 20 ml med fortynnet blod ble lagt over på 4 x 20 ml Ficoll-Paque™Plus (Amersham, Biosciences, Uppsala, Sverige) i 50 ml koniske rør (Kat. nr. 352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ) og sentrifugert ved 1300 rpm i 30 minutter R.T. i en Sorval 7-sentrifuge. (Dupont, Newtown, CT). PBMC-laget ble isolert og vasket i PBS. Røde blodceller ble lysert i en 0,2 % NaCI-løsning, brakt tilbake til isotonisitet med et ekvivalent volum av en 1,6 % NaCI-løsning og sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm. PBMC-pelleten ble resuspendert i RPMI 1640 (Gibco, Rockville, MD) inneholdende 5 % føtalt bovint serum (FBS) og tilsatt til en 10 cm vevs ku It urs kå I i 1 time ved 37 °C. De ikke-fastsittende B- og T-cellepopulasjoner ble fjernet ved aspirering, sentrifugert og talt. Total 2,4 x IO<7>celler ble gjenvunnet. Det resuspenderte PBMC ble distribuert inn i tyve 12 x 75 mm kulturrør (Kat nr.352053, Falcon), der hvert rør inneholdt 1 x IO<6>celler i et volum på 0,25 ml. Rør ble fordelt i fire sett av fem rør. Til hvert sett ble det tilsatt enten medium (RPMI1640, 5 % FBS), titrerte mengder av human kontroll IgGi-antistoff, Rituxan, 2H7.vl6 eller 2H7.v31. Sluttkonsentrasjonen av hvert antistoff var 30, 10, 3,3 og 1,1 nM. I tillegg mottok hvert rør også 20^1 Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-konjugert anti-human-CD20 (Kat.nr. 555622, BD Biosciences, San Diego, CA). Cellene ble forsiktig blandet, inkubert i 1 time på is og deretter vasket to ganger i kald PBS. Celleoverflatefargingen ble analysert på en Epic-XL-MCL (Coulter, Miami, FL), de geometriske midlene ble utledet, plottet (KaleidaGraph Synergy Software, Reading, PA) mot antistoffkonsentrasjoner.

Data i Figur 21 viser at 2H7 v. 16 og 2H7 v.31 fullstendig fortrengte FITC-murin 2H7-binding til cynomolgusapeceller. Videre fortrengte også Rituxan FITC-murin-2H7-binding og viste dermed at både 2H7 og Rituxan binder til en overlappende epitop på CD20. I tillegg viser dataene at IC50-verdien for 2H7 v. 16, 2H7 v.31 og Rituxan er lignende og faller innenfor 4-6 nM-området.

Eksempel 16

Fase-I/II-undersøkelse av rhuMAb 2H7 (2H7.vl6) i moderat

til alvorlig revmatoid artritt

Protokollsynopsis

En randomisert, placebokontrollert, multisenter, blindet fase-I/II-undersøkelse av sikkerheten av å eskalere doser av PRO70769 (rhuMAb 2H7) i individer med moderat til alvorlig revmatoid artritt som mottar stabile doser av samtidig metotreksat.

Mål

Det primære målet med denne undersøkelse er å evaluere sikkerheten og tolererbarheten av eskalerende intravenøse (IV) doser av PRO70769 (rhuMAb 2H7) i individer med moderat til alvorlig revmatoid artritt (RA).

Utforming av undersøkelse

Dette er en randomisert, placebokontrollert, multisenter, blindet fase-I/II, undersøke- og individblindet undersøkelse av sikkerheten av å eskalere doser av PRO70769 i kombinasjon med MTX i individer med moderat til alvorlig RA. Undersøkelsen består av en dose eskaleringsfase og en andre fase med innrullering av et større antall individer. Sponsoren vil forbli uinnblandet i behandlingsutforming.

Individer med moderat til alvorlig RA som ikke har respondert på ett til fem sykdomsmodifiserende antirevmatiske legemidler eller biologiske midler som per dato har utilfredsstillende kliniske responser i forhold til behandling med MTX vil bli innrullert.

Individer vil bli påkrevd å motta MTX i området på 10-25 mg ukentlig i minst 12 uker før studieinntreden og å være på en stabil dose i minst 4 uker før de mottar deres første dose med undersøkelseslegemiddel (PRO70769 eller placebo). Individer kan også motta stabile doser av orale kortikosteroider (opp til 10 mg daglig eller prednisonekvivalent) og stabile doser av ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler (NSAID). Individer vil motta to IV-infusjoner av PRO70769 eller placeboekvivalent med den indikerte dosen på dagene 1 og 15 i henhold til den følgende doseeskaleringsplan (se Figur 22).

Doseeskalering vil foregå i henhold til spesifikke kriterier og etter gjennomgang av sikkerhetsdata av en intern sikkerhetsdatagjennomgangskomité og vurdering av akutt toksisitet 72 timer etter den andre infusjon i det siste individet som blir behandlet i hver avdeling. Etter doseeskaleringsfasen vil 40 ytterligere individer (32 aktive og 8 placebo) bli randomisert til hvert av de følgende dosenivåene: 2x50 mg, 2x200 mg, 2x500 mg og 2x1000 mg hvis doseringsnivåene er blitt vist å være tolererbare i løpet av doseeskaleringsfasen. Omtrent 205 individer vil bli innrullert i undersøkelsen.

B-celletellinger vil bli fremskaffet og registrert. B-celletellinger vil bli evaluert ved å benytte flow-cytometri i en 48 ukers oppfølgingsperiode etter 6 måneders effektivitetsevalueringen. B-celledeplesjon vil ikke bli vurdert å være en dosebegrensende toksisitet (DLC) men heller det forventede farmokodynamiske utkomme av PRO70769-behandling.

I en eventuell ytterligere undersøkelse vil blod for serum og RNA-analyser, i tillegg til urinprøver, bli fremskaffet fra individer ved ulike tidspunkter. Disse prøvene kan bli benyttet til å identifisere biomarkører som kan være prediktive på respons overfor PRO70769-behandling hos individer med moderat til alvorlig RA.

Resultater

De primære resultatene av denne undersøkelsen er sikkerheten og tolererbarheten av PRO70769 individer med moderat til alvorlig RA.

Undersøkelsesbehandling

Avdelinger med individer vil motta to IV-infusjoner med PRO70769 eller placeboekvivalent med den indikerte dosen på dagene 1 og 15 i henhold til den følgende eskaleringsplan:

- 10 mg PRO70769 eller placeboekvivalent: 4 individer aktivt legemiddel, 1 kontroll

- 50 mg PRO70769 eller placeboekvivalent: 8 individer aktivt legemiddel, 2 kontroller

- 200 mg PRO70769 eller placeboekvivalent: 8 individer aktivt legemiddel, 2 kontroller

- 500 mg PRO70769 eller placeboekvivalent: 8 individer aktivt legemiddel, 2 kontroller

- 1000 mg PRO70769 eller placeboekvivalent: 8 individer aktivt legemiddel, 2 kontroller

Effektivitet

Effektiviteten til PRO70769 vil bli målt ved hjelp av ACR-responser. Prosentandelen av individer som oppnår en ACR20-, ACR50- og ACR70-respons vil bli oppsummert ved behandlingsgruppe og 95 % konfidensintervaller vil bli generert for hver gruppe. Komponentene i disse responsene og deres endringer fra baselinje vil bli oppsummert ved behandling og besøk.

Konklusjon

Dataene ovenfor demonstrerer vellykketheten i å produsere humaniserte CD20-bindende antistoffer, spesielt humaniserte 2H7-antistoffvarianter, som opprettholdt og til og med forbedret deres biologiske egenskaper. De humaniserte 2H7-antistoffene ifølge oppfinnelsen bandt til CD20 med affiniteter tilsvarende til de murine donor- og kimer-2H7-antistoffene og var effektive i å drepe B-celler i en primat, noe som fører til B-celledeplesjon. Visse varianter viste forbedret ADCC i forhold til et kimert anti-CD20-antistoff som per i dag ble benyttet til å behandle NHL, noe som fremmer anvendelsen av lavere doser av den

terapeutiske antistoffet til pasienter. I tillegg, hvorvidt det kan være nødvendig for et kimert antistoff som har murine FR-rester å bli administrert ved en dose som er effektiv til å oppnå

komplett B-celledeplesjon for å unngå en antistoffrespons mot den, kan de foreliggende humaniserte antistoffene bli administrert ved doseringer som oppnår partiell eller komplett B-celledeplesjon, og i ulik tidsvarighet, som ønsket for den spesielle sykdom og pasient. I tillegg viste disse antistoffene stabilitet i løsning. Disse egenskapene for de humaniserte 2H7-antistoffene gjør dem ideelle til bruk som immunterapeutiske midler i behandlingen av CD20-positive kreftformer og autoimmunsykdommer, og disse antistoffene er ikke forventet å være immunogene eller vil i det minste være mindre immunogene enn fullt murine eller kimere anti-CD20-antistoffer i humane pasienter.

Referanser.

Utøvelsen av foreliggende oppfinnelse vil benytte, hvis ikke annet er indikert, konvensjonelle teknikker for molekylær biologi og lignende, som ligger innenfor kjent teknikk på fagområdet. Slike teknikker er fullt ut forklart i litteraturen. Se f.eks. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., red. 1987 oppdatert); Essential Molecular Biology (T. Brown red., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel red., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. red., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al., red., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonukleotide Synthesis (M. Gait red., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams red., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos red., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler red., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al., red., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2. utgave (R. Freshney et al., red., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al., red., Wiley-Liss 1990); seriene Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M. and Hausser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3. utgave. A Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock& P. Petrusz red., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir&C. Blackwell, red.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. red. 1991); Immunoassay (E.P. Diamandis &T.K. Christopoulos, red., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. utgave) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratorial Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2. utgave (C. Borrebaeck, red., Oxford University Press, 1995); og seriene Annual Review of Immunology; seriene Advances in Immunology.

Claims (22)

1. Humanisert antistoff som binder human CD20 eller et antigenbindende fragment derav, karakterisert vedat antistoffet er effektivt til å depletere primat-B-celler in vivo, hvor eventuelt primat B-cellene er fra menneske, hvor antistoffet omfatter a) en tungkjede variabel region (VH) som omfatter CDRl-sekvens ifølge SEQ ID NO. 10; CDR2-sekvensen ifølge SEQ ID NO. 11 og CDR3-sekvens ifølge SEQ ID NO. 12, og i all vesentlighet de humane konsensusrammeverks-(FR)-restene fra human tungkjede undergruppe-III (VHIII), hvor de tungkjede variable regionen videre omfatter aminosyre substitusjonene R71V; N73K og A49G, og b) en lettkjede variabel region (VL) som omfatter CDRl-sekvens ifølge SEQ ID NO. 4; CDR2-sekvens ifølge SEQ ID NO. 5; CDR3-sekvens ifølge SEQ ID NO. 6 og i all vesentlighet de humane konsensusrammeverks-(FR)-restene til human lettkjede-K-undergruppe I (VkI), hvor den lettkjede variable regionen videre omfatter aminosyre substitusjonen L46P

2. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 1, hvor det omfatter VH-sekvensen ifølge SEQ ID NO. 8.

3. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 1, hvor det omfatter VL-sekvensen ifølge SEQ ID NO. 2.

4. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor VH-regionen er koblet til en human IgG-kjede konstantregion, eventuelt hvor det humane IgG er IgGl eller IgG3.

5. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 3, men med aminosyre-substitusjonene D56A og N100A i H-kjeden og S92A i L-kjeden.

6. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det ytterligere omfatter minst én aminosyre-substitusjon i Fc-regionen som forbedrer ADCC- og/eller CDC-aktivitet, eventuelt hvor aminosyre-substitusjonene er S298A/E333A/K334A; eller ytterligere omfatter minst én aminosyre-substitusjon i Fc-regionen som minsker CDC-aktivitet, eventuelt omfatter det minst substitusjonen K322A.

7. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det er konjugert til et cytotoksisk middel, eventuelt hvor det cytotoksiske middel er en radioaktiv isotop eller et toksin.

8. Isolert nukleinsyre eller ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den koder for antistoffet eller det antigenbindende fragmentet derav ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

9. Vertscelle, karakterisert vedat den omfatter en nukleinsyre ifølge krav 8 eller ekspresjonsvektorer som koder for antistoffet eller det antigenbindende fragmentet derav, eventuelt hvor vertscellen produserer antistoffet eller det antigenbindende fragmentet derav, og hvor vertscellen eventuelt er en CHO-celle.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert vedat den omfatter å dyrke cellen som produserer antistoffet eller det antigenbindende fragmentet derav ifølge krav 9 og gjenvinne antistoffet eller det antigenbindende fragmentet derav.

11. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 7 for anvendelse ved behandling av en autoimmun sykdom, eventuelt hvor den autoimmunsykdommen er valgt fra gruppen som består av multippel sklerose, revmatoid artritt, juvenil revmatoid arteritt, systemisk lupus erytematosus (SLE), Wegeners sykdom, inflammatorisk bowelsykdom, idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), autoimmun trombocytopeni, psoriasis, IgA-neuropati, IgM-polyneuropatier, myasthenia gravis, vaskulitt, ANCA-vaskulitt, diabetes mellitus, Reynauds syndrom, Sjøgrens syndrom og glomerulonefritt.

12. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav for anvendelse ifølge krav 11, hvor den autoimmune sykdommen er multippel sklerose.

13. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 7 for anvendelse for å depletere B-celler in vivo.

14. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 7 for anvendelse ved behandling av en CD20-positiv kreftform, eventuelt hvor den CD20-positive kreftformen er et B-cellelymfom eller en leukemi, eventuelt hvor den CD20- positive kreftformen er non-Hodgkins lymfom (NHL) eller lymfocyttpredominant Hodgkins sykdom (LPHD), og eventuelt hvor kreftformen er kronisk lymfocyttleukemi eller SLL.

15. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 14, hvor den CD20-positive kreftformen er et B-cellelymfom eller en leukemi og der antistoffet blir formulert for administrering i et doseringsområde fra omtrent 275 til 375 mg/m<2>.

16. Antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 14, for anvendelse i kombinasjon med minst ett kjemoterapeutisk middel, eventuelt hvor kreftformen er non-Hodgkins lymfom (NHL) og det kjemoterapeutiske midlet er valgt fra gruppen som består av doxorubicin, syklofosfamid, vincristin og prednisolon.

17. Anvendelse av antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 7 for fremstilling av et medikament for anvendelse ved behandling av en autoimmunsykdom, eventuelt hvor den autoimmunsykdommen er valgt fra gruppen som består av multippel sklerose, revmatoid artritt, j uven il revmatoid arteritt, systemisk lupus erytematosus (SLE), Wegeners sykdom, inflammatorisk bowelsykdom, idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), autoimmun trombocytopeni, psoriasis, IgA-neuropati, IgM-polyneuropatier, myasthenia gravis, vaskulitt, ANCA-vaskulitt, diabetes mellitus, Reynauds syndrom, Sjøgrens syndrom og glomerulonefritt.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor den autoimmunsykdommen er multippel sklerose.

19. Anvendelse av antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 7 for fremstilling av et medikament til anvendelse for å depletere B-celler in vivo.

20. Anvendelse av antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 7 for fremstilling av et medikament for anvendelse ved behandling av en CD20-positiv kreftform, eventuelt hvor den CD20-positive kreftformen er et B-cellelymfom eller en leukemi, eventuelt hvor den CD20-positive kreftformen er non-Hodgkins lymfom (NHL) eller lymfocyttpredominant Hodgkins sykdom (LPHD), og eventuelt hvor kreftformen er kronisk lymfocyttleukemi eller SLL.

21. Anvendelse av antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 20, hvor den CD20-positive kreftformen er et B-cellelymfom eller en leukemi og der antistoffet blir formulert for administrering i et doseringsområde fra omtrent 275 til 375 mg/m<2>.

22. Anvendelse av antistoff eller et antigenbindende fragment derav ifølge krav 21, for anvendelse i kombinasjon med minst ett kjemoterapeutisk middel, eventuelt hvor kreftformen er non-Hodgkins lymfom (NHL) og det kjemoterapeutiske midlet er valgt fra gruppen som består av doxorubicin, syklofosfamid, vincristin og prednisolon.