NO335683B1 - Automatisert system og metode for innhøsting og flertrinnsscreening av plante-embryoer - Google Patents

Abstract

Sammendrag Det beskrives en metode og et system for automatisk å høste og å screene planteembryoer i flere trinn for å identifisere de embryoer som er egnet for innarbeiding i produserte frø. Fremgangsmåten omfatter generelt tre trinn. For det første blir planteembryoer automatisk sortert i henhold til deres omtrentlige størrelse/formog også singulert til diskrete embryoenheter, for eksempel ved bruk av vibrasjonssikting. For det andre blir de sorterte og singulerte planteembryoer klassifisert ved bruk av en første klassifiseringsmetode, for eksempel kan hvert embryo avbildes ved hjelp av et kamera hvorefter bildet benyttes for å sikre embryoets mer nøyaktige størrelse/form. For det tredje anvendes det, for de embryoer som har passert den første klassifiseringsmetode, en andre klassifiseringsmetode. For eksempel kan det benyttes en på forhånd utviklet klassifiseringsalgoritme for å klassifisere embryoer i henhold til deres putative germineringskraft, på det samme bilde som ble benyttet ved den første klassifiseringsmetode, for å identifisere de embryoer som sannsynligvis vil spire.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse er generelt rettet mot fremstilte frø og mer spesielt en fremgangsmåte og et system for automatisk innhøsting og screening av masseproduserte planteembryoer i flere trinn for å identifisere de som er velegnet for innarbeiding i fremstilte frø.

Oppfinnelsens bakgrunn

Reproduksjon av valgte plantevarieteter ved vevkultur har vært en kommersiell suksess i mange år. Teknikken har muliggjort masseproduksjon av genetisk identiske, utvalgte ornamentplanter, landbruksplanter og skogsspecier. Treplantene i denne siste gruppe har sannsynligvis gitt de største utfordringer. En viss suksess med koniferer ble oppnådd i 1970-årene ved bruk av organogeneseteknikker der en knopp, eller et annet organ, ble anbragt på et kulturmedium der det til slutt ble replikert mange ganger. De nygenererte knopper ble anbragt på et annet medium som induserte rotutvikling. Derefter ble knop-pene med stammer og røtter plantet i jord.

Mens koniferorganogesen var et gjennombrudd var omkostningene høye på grunn av den store mengde av nødvendig håndtering. Det var også en viss bekymring i forbindelse med mulig genetisk modifisering. Det varte et tiår før somatisk embryogenese gav en tilstrekkelig suksessgrad til å bli den overveiende vei for konifer vevkultur. Med somatisk embryogenese ble et eksplantat, vanligvis et frø eller et frøembryo, anbragt på et initieringsmedium der det multiplikerte til et stort antall genetisk identisk, umodne embryoer. Disse kan holdes i kultur i lange perioder og multipliseres for å fylle opp en spesielt ønskelig klon. Til slutt blir de umodne embryoer anbragt på et utviklingsmedium der de vokser til somatiske analoger av mature frøembryoer. Som benyttet i foreliggende oppfinnelse er et "somatisk" embryo et planteembryo som er utviklet ved laborato-riedyrking av totipotente planteceller eller ved indusert spaltingspolyembryogeni i mot-setning til en zygotisk embryo som er et planteembryo som er fjernet fra et frø av den tilsvarende plante. Disse embryoer blir så individuelt valgt og anbragt på et spiringsme-dium for ytterligere utvikling. Alternativt kan embryoene benyttes i kunstige frø, kjent som produserte frø.

Det finnes nu en stor mengde generell teknisk litteratur og en voksende mengde patent-litteratur på embryogenese av planter. Eksempler på prosedyrer for konifer vevkultur finnes i US 5 036 007 og 5 23 841 i navnet Gupta et al.; 5 183 757 i navnet Roberts; 5 464 769 i navnet Attree et al., og 5 563 016 i navnet Gupta. Videre kan eksempler på fremstilte eller produserte frø finnes i US 5 701 699 i navnet Carlson et al., hvis beskrivelse gjøres til del av foreliggende beskrivelse. Typisk består et produsert frø av et frø-deksel (eller en kapsel) fremstilt av et antall materialer som cellulosematerialer, fylt med en syntetisk gametofytt (et germineringsmedium) hvori det opptas et embryo om-gitt av en rørlignende fastholder. Efter at det produserte frø er plantet i jorden utvikler embryoet inne i frødekslet røtter og kaster til slutt av fastholdingen sammen med frøbe-legget under germinering.

Et av de mer arbeidsintensive og subjektive trinn i embryogeneseprosedyren er den se-lektive høsting fra utviklingsmediet av individuelle embryoer som er egnet for germinering (for eksempel egnet for innarbeiding i produserte frø). Embryoene kan være til ste-de i et antall modenhets- og utviklingstrinn. De som mest sannsynlig vil spire med hell til normale planter selekteres preferensielt ved bruk av et antall visuelle bedømmel-seskriterier. En fagperson evaluerer de morfologiske trekk for hvert embryo som er innleiret i utviklingsmediet, for eksempel embryoets størrelse, form (for eksempel aksialsymmetri), kotyledonutvikling, overflatetekstur, farve og andre, og plukker manuelt ut ønskede embryoer fra utviklingsmediet ved hjelp av pinsetter. De utplukkede, ønskede embryoer blir så forsiktig lagt ut på en skål i et todimensjonalt mønster for ytterligere prosessering. Dette er en ytterst krevende og viktig oppgave som både er tidskrevende og kostbar. Videre utgjør denne prosess en produksjonsflaskehals når det endelige, ønskede produkt skal være millioner av planter.

Det har vært foreslått å bruke en viss form for instrumentell billedanalyse for emb-ryoseleksjon for å supplere eller erstatte den visuelle bedømmelse som beskrevet ovenfor. For eksempel beskriver WO 01/13702 A2 et embryoavleveringssystem for produserte frø inkludert et billedkamera som tar og digitalt lagrer bilder av embryoer. Bildene sendes så til en datamaskin som klassifiserer embryoene i henhold til deres ønskelighet (det vil si sannsynlighet for spiring og vekst til normale planter) basert på forhånd bestemte parametre (aksialsymmetri, kotyledonutvikling, overflatetekstur, farve og så videre) ved bruk av en klassifiseringsmetode som beskrevet i WO 99/63057. De embryoer som klassifiseres som ønskelige blir derefter fjernet ved minirobotutplukkings- og

-plasseringssystemer og innført i produserte frø.

Mens instrumentell billedanalyse og etterfølgende automatisk innføring av ønskede embryoer i produserte frø har vært vellykket med henblikk på å øke effektiviteten av embryogeneseprosedyren er det ikke utviklet noen fullstendig automatisert prosess for høsting av embryoer, for eksempel fjerning av embryoer fra et utviklingsmedium, sortering av embryoene i henhold til størrelse/form og plukke dem ut i diskrete enheter (for eksempel ved å fjerne uønsket vev og annen debris) med efterfølgende klassifisering i henhold til ønskelighet for innarbeiding i produserte frø. Med andre ord har det ikke vært tilgjengelig noen automatisert prosess som kunne erstatte dagens manuelle operasjon med plukking av ønskede frø fra et utviklingsmedium og anbringelse av disse i et mønster egnet for ytterligere matureringsbehandling. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot å tilveiebringe en fullstendig, automatisert prosess for høsting av somatiske embryoer som kan erstatte dagens manuelle operasjon.

Oppsummering av oppfinnelsen

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en metode og et system for automatisk innhøsting av planteembryoer.

I henhold til ett aspekt til veiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for automatisk høsting og screening av planteembryoer i flere trinn, omfattende: automatisk sortering og singulering av planteembryoer; anvendelse av et kamera for å avbilde hvert av de sorterte og singulerte embryoene; overføre avbildningen av hvert embryo til en datamaskin for å bli analysert ved en to-trinns kamera bildeanalyse og klassifisert, hvori: datamaskinen analyserer avbildningene og automatisk klassifiserer de sorterte og singulerte planteembryoer ved bruk av en første klassifiseringsmetode basert på formen og størrelsen til embryoene for å identifisere de embryoene som ikke oppfyller basis størrelse- og formkriterier; og

kjennetegnet ved at datamaskinen bare analyserer de avbildningene av planteembryoene som har passert den første klassifiseringsmetoden ved anvendelse av en andre klassifiseringsmetode basert på den putative germineringskraften til embryoene som identifiserer de embryoene som har en lavere sannsynlighet for spiring;

embryoene som er avvist i det første eller andre klassifiseringstrinnet fjernes slik at de gjenværende ønskede embryoene forblir; og

den andre klassifiseringsmetoden omfatter én eller flere av: multippelbetrak-nings-fargeavbildningsanalyse ved anvendelse av en klassifiseringsmodell, en apikaldom analyse; og en spektroskopisk analyse.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et system for automatisk høsting og screening av planteembryoer i flere trinn, omfattende: midler 22, 24, 28, 34; 21,22,25, 30; 21, 22, 27, 34 for automatisk sortering og singulering av planteembryoer;

et kamera 38 for å avbilde hvert av de sorterte og singulerte planteembryoer, hvori datamaskinen 40 automatisk klassifiserer de sorterte og singulerte planteembryoer ved bruk av en første klassifiseringsmetode;

kjennetegnet ved at:

datamaskinen 40 automatisk klassifiserer bare de planteembryoene som har passert den første klassifiseringsmetoden ved anvendelse av en andre klassifiseringsmetode basert på den putative germineringskraften til embryoene som identifiserer de embryoene som har en lavere sannsynlighet for spiring;

den andre klassifiseringsmetoden omfatter én eller flere av: multippelbetrak-nings-fargeavbildningsanalyse ved anvendelse av en klassifiseringsmodell, en apikaldom analyse; og en spektroskopisk analyse; og

en luft-/væskestråle 42 kontrollert av datamaskinen 40 støter ut til en avfallsbeholder 44 de embryoer som er avvist enten i den første klassifiseringsmetoden eller i den andre klassifiseringsmetoden.

I henhold til ett aspekt screener den automatiske høstemetode ifølge oppfinnelsen planteembryoer i flere trinn for å identifisere de embryoer som er egnet for innarbeiding i produserte frø, det vil si de embryoer som både fysisk er egnet for innarbeiding i fremstilte frø (ikke for store, ikke for små, ikke for bøyet, og så videre) og også kvalitativt bestemt til sannsynligvis å kunne spire og vokse til normale planter. Den automatiske innhøstingsmetode inkluderer generelt tre trinn. Først blir planteembryoer automatisk sortert i henhold til størrelse/form og også singulert til diskrete embryoetheter. For eksempel må embryoene vaskes fri for utviklingsmedium (for eksempel fra en utviklingspute) ved bruk av vandig væske, og så siktes gjennom et porøst materiale. Under sik-tingen kan embryoene ytterligere sprayes med vandig væske for å lette fjerning og bort-vasking av ethvert uønsket materiale som embryoer som er for små, vev, og restembryonale suspensormasser (ESM), gjennom hullene i det porøse materialet. I en foretrukken utførelsesform er det porøse materialet tildannet som et bevegelig, porøst transportbelte slik at embryoene sorteres og singuleres og samtidig transporteres til det etterfølgende klassifiseringstrinn. For det andre blir så de sorterte og singulerte planteembryoer klassifisert ved bruk av en første klassifiseringsmetode. For eksempel kan bilder av hvert embryo tas av et kamera hvorefter bildet benyttes for å sikre embryoets størrelse/form. De embryoer som ligger innenfor et på forhånd definert størrelses-/formområde anses for å ha passert den første klassifiseringsmetode. For det tredje, og i det minste for de embryoer som har passert den første klassifiseringsmetode, benyttes en andre klassifiseringsmetode for ytterligere å plukke ut de embryoer som er ønskelige for innarbeiding i produserte frø. For eksempel kan det på det samme bildet som ble benyttet ved den førs-te størrelses/formklassifiseringsmetode benyttes en på forhånd utviklet klassifiseringsalgoritme for å klassifisere embryoer i henhold til den putative germineringskraft (det vil si sannsynligheten for vellykket germinering) for å identifisere de embryoer som sannsynligvis vil spire. Embryoene som har passert både den første og den andre klassifiseringsmetode identifiseres som egnet for innarbeiding i produserte frø.

I henhold til ett aspekt ved oppfinnelsen blir den første og den andre klassifiseringsmetode gjennomført langs et klassifiseringstransportbelte mens de sorterte og singulerte embryoer transporteres på dette. I enkelte klassifiseirngsmetoder er det foretrukket at embryoene generelt er anordnet i en enkel rekke på klassifiseringstransportbeltet. Forskjellige midler for å oppnå en enkeltrekkekonfigurering er foreslått. For eksempel kan klassifiseringstransportbeltet være anordnet generelt loddrett på det porøse transportbeltet på hvilket embryoene sorteres og singuleres. I henhold til denne konfigurasjon kan de sorterte og singulerte embryoer som transporteres til enden av den porøse transportør falle ved tyngekraftinnvirkning ned på klassifiseringstransportbeltet under generell dan-nelse av en enkelt rekke. For å oppnå tilstrekkelig avstand mellom embryoene i en enkelt rekke kan initialhastigheten for awasking av embryoer fra et utviklingsmedium på det porøse transportbelte, eller hastigheten for det porøse transportbelte, justeres, eventuelt basert på den virkelige mengde av embryoer som faller fra det porøse transportbelte ned på klassifiseringstransportbeltet som observert ved et egnet, optisk scannings-system.

I henhold til et annet aspekt inkluderer metoden videre et trinn med automatisk fjerning av de uønskede embryoer som ikke passerte den første eller andre klassifiseringsmetode fra klassifiseringstransportbeltet. For eksempel kan en datamaskinstyrt luft- eller væskestråle benyttes for å fjerne uønskede embryoer. Den nøyaktige tidsinnstilling for stråle-aktivering kan være datamaskinstyrt fordi posisjonen for hvert uønskede embryo nøyak- tig er kjent basert på opptakstiden for kameraet som avbilder hvert embryo, og hastigheten for klassifiseringstransportbeltet.

I henhold til nok et aspekt inkluderer metoden videre et trinn med automatisk fjerning av de ønskede embryoer som har gått gjennom både den første og andre klassifiseringsmetode fra klassifiseringstransportbeltet. I en utførelsesform blir de ønskede embryoer automatisk overført til en mottakeroverflate i et jevnt fordelt mønster, egnet for ytterligere matureringsbehandling. For eksempel kan mottakeroverflaten være utstyrt med en skål montert på en motorisert plattform som er konfigurert for å justere posisjonen av skålen relativt klassifiseringstransportbeltet. Ved å justere posisjonen for skålen basert på den kjente posisjon for hver ønsket embryo når denne faller fra klassifiseringstransportbeltet kan de ønskede embryoer tas imot på skålen i et jevnt fordelt, todimensjonalt mønster.

I henhold til nok et aspekt kan metoden inkludere et trinn med automatisk fjerning av de ønskede embryoer som har passert en eller flere initialklassifiseringsmetoder fra et transportbelte. For eksempel kan et minirobotsystem benyttes for å plukke opp de embryoer som er bestemt til å ligge innen et akseptabelt størrelses-/formområde og nøyaktig å anbringe disse i et jevnt fordelt, todimensjonalt mønster på en mottakerskål eller et mottakerbrett. På dette tidspunkt kan embryoene være orientert enhetlig, for eksempel med kotyledonendene i samme retning. De riktige orienterte og nøyaktig anbragte embryoer på brettet eller skålen kan så føres videre for ytterligere behandling, for eksempel ved etterfølgende tørking og ytterligere klassifiseringsmetoder. Deretter kan disse riktig orienterte og anordnede embryoer på brettet lett overføres og innføres i produserte frø som på fordelaktig måte kan være anordnet i et tilsvarende, jevnt fordelt mønster.

Klassifisering av embryoene i flere trinn gir en effektiv screening av embryoer. Ved klassifisering av embryoer ved bruk av en relativt mindre sofistikert og mindre tidkrevende klassifiseringsmetode først kan man for eksempel redusere antallet embryoer som skal føres videre til den andre klassifiseringsmetode som er mer sofistikert og mer tidkrevende. Ved derfor omhyggelig å velge egnede klassifiseringsmetoder for kombina-sjon kan man oppnå en økende selektiv og diskriminerende klassifisering av embryoer på en tidseffektiv måte. Videre tilbyr foreliggende oppfinnelsen en fullautomatisert prosess for høsting av somatiske embryoer inkludert sortering og singulering av disse (som starter med å fjerne embryoer fra et utviklingsmedium), klassifisering av de utsorterte og singulerte embryoer i henhold til deres putative germineringskraft, og videre arrange-ring av disse embryoer som er klassifisert som ønskelige, på en måte som er velegnet for ytterligere matureringsbehandlinger, for eksempel i et jevnt fordelt todimensjonalt mønster på et egnet underlag som et brett eller en skål. Således kan en automatisert inn-høstingsmetode og et system ifølge oppfinnelsen erstatte dagens manuelle operasjon med plukking av ønskede embryoer fra utviklingsmediet.

Kort beskrivelse av figurene

Aspektene ovenfor og mange av de dertil hørende fordeler ifølge oppfinnelsen vil frem-gå tydeligere og forstås bedre under henvisning til den følgende, detaljerte beskrivelse i forbindelse med de vedlagte figurer der: FIGUR IA skjematisk viser et system for automatisk innhøsting og flertrinnsscreening av planteembryoer, i henhold til oppfinnelsen; FIGUR IB skjematisk viser et alternativ system for automatisk høsting og flertrinn-screening av planteembryoer ifølge oppfinnelsen; FIGUR 2 er et flytskjema som viser den totale flyt for en metode for automatisk høsting og screening av embryoer i flere trinn, ifølge oppfinnelsen; og FIGURENE 3A og 3B viser alternative metoder for automatisk sortering og singulering av embryoer, ifølge oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte og et system for automatisk høsting og screening av masseproduserte embryoer, for eksempel somatiske embryoer, fortrinnsvis i flere trinn med økende kompleksitet, for å identifisere de embryoer som er egnet for innarbeiding i produserte frø. Som benyttet her betyr et embryo som er egnet for innarbeiding i et produsert frø et embryo som både er biokjemisk modnet (det vil si som sannsynligvis vil spire og vokse til en normal plante), og som morfologisk eller fysisk er egnet for innarbeiding i et produsert frø (det vil si har en størrelse/form som er hensiktsmessig for innarbeiding i et produsert frø).

Under henvising til FIGUR IA er det i et utviklingsrom 10 utviklet somatiske embryoer fra embryonale suspensormasser (ESM) og er båret/understøttet i eller på en utviklingsoverflate 16. En utviklingsoverflate kan være tilveiebragt ved hjelp av en utviklingspute som vist, eller kan tilveiebringes ved hjelp av et hvilket som helst annet egnet utviklingsmedium inkludert et medium i gelform, eller kan videre være tilveiebragt ved en intervenerende overflate som er anbragt på et utviklingsmedium, for eksempel en duk av rustfritt stål. Mens den følgende beskrivelse illustrerer et tilfelle der det benyttes en utviklingspute for å gi en utviklingsoverflate skal det være klart at en utviklingsoverflate, slik uttrykket benyttes ifølge oppfinnelsen, henviser til en hvilken som helst overflate som bærer eller suspenderer embryoer som er utviklet fra ESM.

Metoder for utvikling av somatiske embryoer er velkjente og er beskrevet i tallrike pub-likasjoner som diskutert i avsnittet om bakgrunnsteknologi ovenfor. Ønskede embryoer er i varierende grad festet til og innleiret i suspensorvev og gjenværende underutviklet ESM (eller kulturmateriale) i puten 16, sammen med ufullstendig utviklede embryoer, abnormalt formede embryoer, embryoer som er for små eller for store, og andre partik-ler av ikke-embryoplantemateriale. Embryoene som er suspendert i en utviklingspute 16 føres videre til et innhøstings- og klassifiseringsrom 12 hvori embryoene (innleiret i kulturmaterialet) fjernes fra utviklingsputen og sorteres, singuleres og klassifiseres ytterligere på automatisk måte i henhold til ønskelighet. Klassifiseringen kan gjennomfø-res ved bruk av flere trinn med økende sofistikerte og også tidskrevende klassifiseringsmetoder for å oppnå progressivt høyere seleksjonsnøyaktighet og driftseffektivitet. De embryoer som er klassifisert som ønskelige føres derefter videre til en ytterligere matureringsbehandling, for eksempel til et efterutviklingsbehandlingsrom (tørkerom i den viste utførelsesform) 14 for tørking for lagring og etterfølgende innarbeiding i produserte frø. Oppfinnelsen er generelt rettet mot den automatiserte prosess for innhøsting og klassifisering av embryoer som inntrer i innhøstings- og klassifiseringsrom 12. Det er tatt sikte på at innhøstingen og klassifiseringen fortrinnsvis gjennomføres i et fuktig, rent rom som er kondisjonert for å understøtte levedyktigheten for de embryoer som behandles.

Under henvisning til figur 2 omfatter en metode ifølge oppfinnelsen i en utførelsesform generelt fire trinn. Først blir i et trinn "A" i figurene IA og 2, embryoer vasket fri fra utviklingsoverflaten (for eksempel utviklingsputeoverflaten) 16 ved bruk av trykk-kontrollert spray av vandig væske (for eksempel isotonisk næringsoppløsning) fra en egnet anordnet dyse 18. Denne awaskingsprosess skiller kulturmaterialet inkludert embryoer, fra utviklingsoverflaten 16, men minst noen av embryoene forblir innleiret i eller festet til suspensorvevet, gjenværende, underutviklet ESM, eller annet materiale, på dette punkt. Som vist kan utviklingsoverflaten 16 være anbragt på en skrådd overflate 20 for å lette avvasking og fjerning av kulturmaterialet inkludert embryoer ved hjelp av tyngdekraften mot et reservoar 22 (eller en separator av hydrocyklon-typen). Bunnen 26 av reservoaret 22 har en langstrakt åpning (sliss) som strekker seg i det vesentlige loddrett på retningen av et transportbelte og forløper i det vesentlige over bredden av transportbeltet 24 slik at embryoer (innleiret i eller festet til suspensorvevet eller gjenværende SEM) anbringes på transportbeltet 24 på en generelt utspredt eller rommelig enhetlig måte. Alternativt kan en strøm av væskedispergerte embryoer fra reservoaret 22 reguleres ved forskjellige andre midler som begrensninger, justeringer av strømnings-veielengden og så videre, for å anbringe embryoene på transportbeltet 24 på en regulert og rommelig enhetlig måte.

Under henvisning til trinn "B" er transportbeltet 24 tildannet som et porøst, kontinuerlig belte 28 som drives av en egnet (ikke vist) motor som sorterer ut og singulerer embryoene ved sikting. Som benyttet her betyr "sortering og singulering" en rudimentær klassifisering av embryoer i henhold til størrelse/form og også separering av embryoene til diskrete enheter, for eksempel ved separering av embryoer fra hverandre og også ved å fjerne alle uønskede materialer fra hvert embryo. For eksempel gir sikting ved hjelp av det porøse, kontinuerlige belte 28 både sortering og singulering ved å bringe alt uønsket materiale, for eksempel embryoer som er for små, og også debris, til å falle gjennom hullene.

Spesielt, og mens de befinner seg på det porøse, kontinuerlige belte 28, kan embryoer som fremdeles muligens er innleiret i suspensorvev og gjenværende ESM, sprayes ytterligere med vandig væske fra en andre dyse 30 for å bringe embryoene (og annet adherende materiale) til ytterligere dispergering i den vandige væske. Væskesprayen forår-saker at adherende suspensorvev og gjenværende ESM løsgjøres fra embryoene og vaskes bort og faller ned gjennom hullene i det porøse beltet 28. Alle for små eller ufullstendig formede embryoer vil også falle ut av det porøse beltet 28.1 en utførelsesform kan transportbeltet 24 være av vibrerende type som velkjent på transportbelteområdet, for ytterligere å lette sortering og singulering. Ethvert materiale som faller gjennom det porøse beltet 28 kan samles i en avfallsmottaker 32 som befinner seg under det porøse beltet 28. Eventuelt kan et andre, grovere porøst belte (ikke vist) være anordnet i serie med det første transportbeltet 24 med det første porøse beltet 28, eventuelt før det første porøse beltet 28, for å fjerne eventuelle for store embryoer og andre store stykker av materiale. Således forblir kun de for det meste singulerte embryoer av generelt ønsket størrelse og/eller form, som er mer eller mindre frie for suspensorvev og annet fint plantemateriale, på det første porøse beltet 28. Ved å justere maskevidde/maskeform for det porøse beltet 28 (og for eventuelle andre, ytterligere porøse belter) kan man velge ut kun de embryoer som ligger innenfor et ønsket størrelses/formområde. Det skal påpekes at alternativt til denne ene eller de flere porøse transportbelter som er beskrevet ovenfor, kan det benyttes en eller flere sikter av tråd eller annen duk, for eksempel vibrerende, skrådde duker, selv om bruk av et eller flere porøse transportbelter er foretrukket fordi de sikter og transporterer (til det neste trinn) embryoer, samtidig.

Som beskrevet ovenfor er, under trinnene "A" og "B", det heterogene miljø (inneholdende for eksempel embryoer av akseptabel kvalitet, ikke-akseptable embryoer, suspensorvev, gjenværende ESM og annet plantemateriale) dispergert i vandig væske og underkastes separering av komponenter ved fysiske krefter (for eksempel ved sikting) som innvirker forskjellig på komponentene, basert på deres fysiske egenskaper (masse, stør-relse, form, spesifikk vekt, friksjonskoeffisisent, fuktbarhet og så videre). Som et resul-tat blir fint plantemateriale og embryoadherende suspensorvev fjernet, noe som reduse-rer mengden av andre uønskede komponenter, for å gi en populasjon som omfatter for det meste singulerte embryoer i det vesentlige frie for suspensorvev.

Efter den sprayassisterte sikteprosess, angitt som trinn "C", ved enden av det første transportbeltet 24, faller de sortere og singulerte embryoer på grunn av tyngdekraften ned på et annet transportørbelte eller et klassifiseringstransportbelte 34. Klassifiseringstransportbeltet 34 er anordnet i det vesentlige loddrett på det første transportbeltet 24 slik at de fallende embryoer generelt danner en enkelt rekke 36 langs lengden av selek-sjonstransportbeltet 34, egnet for etterfølgende billedtaking. I det tilfellet embryoer har en tendens til å klebe til det første transportbeltet 24 og ikke faller lett, kan separeringen av embryoene fra det første transportbeltet 24 understøttes på forskjellige måter. For eksempel kan embryofjerningen understøttes av en luft/væskestråle (for eksempel en forsiktig sprut av næringsoppløsning eller et luftpust, ikke vist), hensiktsmessig anordnet under det porøse beltet 28 nær enden 35 av det første transportbeltet 24, eller en fin, vibrerende duk anbragt loddrett på og akkurat over det første transportbeltet 24 nær enden 35, for å bryte overflatespenningen og å slå embryoene av det første transportbeltet 24. Alternativt kan en (ikke vist) tørke anordnes ved siden av det første transportbeltet 24 for å tørke av embryoene efter hvert som de beveger seg ned det første transportbeltet 24.

For etterfølgende billedopptak er embryoene i tilstrekkelig stor avstand fra hverandre på klassifiseringstransportbeltet 34. For å oppnå tilstrekkelig avstand mellom embryoene i en enkelt rekke 36 kan awaskingshastigheten for embryoene fra fremkallingsoverflaten 16, justeres. Videre kan konfigurasjonen for reservoaret 22 (eller en separator av hydro-cyklontypen) justeres, som diskutert ovenfor, for å oppnå kontrollert avsetning av embryoene på det første transportbeltet 24 og derved kontrollert fall av embryoene fra det første transportbeltet 24 ned på klassifiseringstransportbeltet 35. Mens reservoaret 22 er vist posisjonert oppstrøms spraysikteprosessen i figur IA, skal det være klart at reservoaret 22 kan befinne seg nedstrøms fra spraysikteprosessen, nær enden 35 av det første transportbeltet 24, for å motta og kontrollerbart å slippe embryoene fra det første transportbeltet 24 ned på klassifiseringstransportbeltet 34. Som nok et eksempel kan en elektroniske embryoposisjonsbestemmer (ikke vist), kontrollert av en datamaskin 40, befinne seg nær enden 35 av det første transportbeltet 24 nedstrøms spraysikteprosessen. Embryoposisjonsbestemmeren består av en egnet, optisk sensor- og detektorkom-binasjon for å bestemme posisjonen for hvert embryo når denne føres på det første transportbeltet 24. Datamaskinen 40 justerer kontinuerlig, basert på den posisjonsinfor-masjon som mottas fra embryoposisjonsbestemmelsen, beltehastigheten for det første transportbeltet 24 og/eller klassifiseringstransportbeltet 34 for å oppnå en enhetlig slipphastighet for embryoene fra det første transportbeltet 24 ned på klassifiseringstransportbeltet 34. En hvilken som helst av de ovenfor beskrevne metoder kan også kombineres med andre. For eksempel kan embryoposisjonsbestemmeren som befinner seg nær enden 35 av det første transportbeltet 24 benyttes for å kontrollere initialavvas-kingshastigheten for embryoene fra utviklingsoverflaten 16. Videre kan man benytte hvilke som helst andre metoder for å oppnå tilstrekkelig avstand mellom embryoene når disse plasseres på det første transportbeltet 24, slik fagmannen lett vil se.

I en alternativ utførelsesform kan enkeltrekkekonfigurasjonen som foretrekkes for billed-opptaksformål oppnås ved å føre strømmen av væskedispergerte embryoer langs et rør. Spesifikt og under henvisning til figur 3 A, blir embryoer vasket av utviklingsoverflaten 16 ved bruk av en vandig væske fra en egnet anordnet dyse 18 og anbragt på et reservoar 22, for eksempel som i den utførelsesform som er vist i figur IA. Reservoaret står i forbindelse med et rør 22 med egnet valgt diameter, gjennom hvilken de væskedispergerte embryoer strømmer, fremdeles sammenfiltret med annet vev, ESM og plan-tedebris, fortrinnsvis i en på forhånd bestemt og kontrollerbar hastighet, og trer så ned på den porøse transportør 25.1 en utførelsesform er røret 21 av et klart materiale slik at en optisk scanner 23 som befinner seg langs det klare rør 21 kan observere strømmen og derved gi informasjon om initialhastigheten for awasking av embryoer fra fremkal-lingsmediet for å sikre et ønsket nivå av avstand mellom materialene (for eksempel embryoer) som passer gjennom røret 21. Som før er transportbeltet 25 porøst, i det minste i oppstrømsdelen, slik at alle for små embryoer og annet fint materiale (suspensorvev, rest ESM og så videre) faller gjennom beltet 25, ytterligere lettet ved en vandig væskespray fra en dyse 30. Som vist og fordi kulturstrømmen som avgis fra røret 21 generelt er innrettet på det porøse transportbeltet 25 vil embryoene som forblir på beltet 25 efter spraysikteprosessen allerede befinne seg i en enkeltrekkekonfigurasjon 34. Så ledes kan embryoene fortsette direkte for ytterligere klassifisering på det samme transportbeltet 25, for eksempel for billedopptak ved hjelp av et kamera 38 og etterfølgende selektiv fjerning av ikke-ønskede embryoer ved hjelp av en ejektor 42, begge styrt av en datamaskin 40. Embryoene faller til slutt fra enden av transportørbeltet 25 mot en mot-takerplate 54 slik det skal forklares nærmere nedenfor.

Som en ytterligere, alternativ metode for å oppnå enkeltrekkekonfigurasjonen kan, under henvisning til figur 3B, strømningscytometer benyttes for å sortere ut og å singulere embryoer. I denne utførelsesform blir embryoene vasket av utviklingsoverflaten 16 ved bruk av vandig væske fra en egnet arrangert dyse 18 og anbragt i et reservoar 22 på samme måte som de tidligere utførelsesformer, og beveger seg derefter gjennom et klart rør 21. Et strømningscytometer (eller en celleseparator) 27, som er velkjent i teknikken, er anordnet langs det klare rør 21 for å observere og å separere de ønskelige embryoer fra andre materialer som for små eller for store embryoer, suspensorvev og rest ESM. Kort sagt differensierer strømningscytometeret forskjellige celler som transporteres i væske basert på celleegenskapene som observert ved hjelp av optiske sensorer 27a og sorterer (separerer) videre elektrostatisk cellene ved bruk av detektorer 27b basert på blekkstråleteknologi, for eksempel ved å deflektere selektivt ladede væskedråper inneholdende de ønskede celler. I den viste utførelsesform benyttes strømningscytometeret 27 for å sortere ut og å separere (avgrene) embryoer 31 som tilfredsstiller de på forhånd bestemte størrelses-/formkriterier mot klassifiseringstransportbeltet 34 mens andre materialer som for små eller for store embryoer og suspensorvev og rest ESM, faller ned i en avfallsmottaker 29. Derfor ikke bare sorterer og singulerer strømningscytometeret 27 embryoene men anbringer dem også generelt i en rekke på klassifiseringstransportbeltet 34.

Under ny henvisning til figurene IA og 2 blir, i trinn "C", de sorterte og singulerte embryoer, fortrinnsvis plassert i en enkelt rekke og i tilstrekkelig stor avstand fra hverandre på klassifiseringstransportbeltet 34, klassifisert i henhold til ønskelighet. For eksempel kan hver av embryoene avbildes ved hjelp av et kamera 38 plassert nær (for eksempel over) klassifiseringstransportbeltet 34. Bildet av hvert embryo overføres til datamaskinen 40 for analyse og klassifisering i henhold til en eller flere høyhastighetsalgoritmer.

I en utførelsesform blir hvert bilde (monokromatisk eller i farve) av et embryo analysert i to trinn. Først, og under henvisning til figur 2, blokk 46, blir en egnet algoritme benyttet for å identifisere de embryoer som ikke tilfredsstiller de prinsipielle størrelses- og formkriterier for å kunne innarbeides i de produserte frø. For det andre, og under henvi sing til blokk 48, blir en på forhånd utviklet klassifiseringsmodell, for eksempel som beskrevet i WO 99/63057 som diskutert ovenfor, anvendt på de gjenværende embryoer (det vil si embryoer som tilfredsstiller de første størrelses-/formkriterier) for å identifisere de embryoer som har en lavere sannsynlighet for spiring (mangler germineringskraft). Kort sagt kan en egnet klassifiseringsmodell utvikles basert på en prøvepopulasjon av embryoer for hvilke bilder og virkelige spiringsdata er oppnådd. I et foretrukket eksempel blir en på forhånd utviklet klassifiseringsmodell for å klassifisere embryoer i henhold til putativ germineringskraft, anvendt på det samme bilde som ble benyttet i det første størrelsesVformklassifiseringstrinn slik at et enkelt bilde kan benyttes i både det første og andre klassifiseringstrinn. Under ytterligere henvisning til figur IA er pro-grammene (algoritmene) som bevirker den virkelige klassifisering og annen bedømmel-se av embryoene, basert på bilder som produseres av kamera 38, for eksempel på forhånd utviklede klassifiseringsmodeller, lagret i datamaskinen 40.

De embryoer som er avvist enten i det første klassifiseringstrinn for ikke å tilfredsstille størrelses-/formkriteriene (blokk 46) eller i det andre klassifiseringstrinn som sannsynligvis ikke egnet til å spire (blokk 48) kan derefter støtes ut fra klassifiseringstransportbeltet 34, for eksempel ved en nøyaktig tidsinnstilt væske/luftstråle 42, kontrollert av datamaskinen 40, til en avfallsbeholder 44. Den nøyaktige timing av stråleaktiveringen kan være datamaskinkontrollert på grunn av at posisjonen for hvert uønskede embryo nøyaktig er kjent basert på det nøyaktige opptakstidspunktet for kameraet 38 som har tatt bilde av hvert embryo, og den kjente hastighet for klassifiseringstransportbeltet 34. Bruken av en billedaktivert presisjonsstråle for å fjerne uønsket materiale fra et transportbelte er velkjent i næringsindustrien, for eksempel for å sortere ut næringsstoffer basert på visuelle karakteristika. Efter at uønskede embryoer er fjernet forblir kun de embryoer som har passert både det første og andre klassifiseirngstrinn, tilbake på klassifiseringstransportbeltet 34. Alternativt kan ejektoren 42 konfigureres for å fjerne uønskede embryoer fra klassifiseringstransportbeltet 34 til en annen lokasjon, for eksempel et annet transportbelte, eller et innhøstingskammer, for ytterligere matureringsbehandling, slik fagmannen umiddelbart vil erkjenne.

Embryoklassifiseringstrinnet "C" kan inkludere ytterligere trinn for dataervervelse og klassifisering/screeningoperasjoner. Efter at to-trinnskamerabilledanalysen (blokkene 46 og 48 i figur 2) er gjennomført som beskrevet ovenfor kan for eksempel embryoene underkastes en ytterligere billedanalyse (for eksempel blokk 50) eller en spektroskopisk analyse ved bruk av IR, NIR, eller Råman spektroskopi (blokk 52) slik det skal beskrives i større detalj nedenfor, før uønskede embryoer fjernes fra seleksjonstransportørbel- tet 34. Efter at to-trinnskamerabilledanalysen som beskrevet ovenfor er avsluttet og alle uønskede embryoer er fjernet kan alternativt de gjenværende, ønskede embryoer anbringes på en overflate og tørkes for lagringsformål (trinn "D") og derefter (på et senere tidspunkt) underkastes ytterligere trinn med dataervervelse og klassifisering, eller det "sekundære" klassifiseringstrinn "E", slik det skal forklares i større detalj nedenfor. Ifølge oppfinnelsen kan med andre ord embryoene underkastes et hvilket som helst antall klassifiseirngstrinn og videre behøver disse klassifiseirngstrinn ikke alle å skje samtidig.

Kameraet 38 kan være av en hvilken som helst egnet type slik fagmannen vil erkjenne, enten monokromatisk eller farve, fortrinnsvis benyttes imidlertid et digitalt kamera inneholdende en ladningskoblet innretning (CCD) forbundet med en digital lagringsinn-retning, for å tillate etterfølgende digitalprosessering av det oppnådde bilde. Videre kan kameraet 38 være et enkeltbetraktningskamera (for eksempel som kun tar toppbilde av hvert embryo som bæres på klassifiseringstransportbeltet 34) eller et multippelbetrakt-ningskamera (som for eksempel tar toppbilde, sidebilde og endebilde av hvert embryo). For å oppnå flere bilder av et embryo kan et kamera beveges til flere posisjoner eller det kan benyttes flere kameraer. Imidlertid kan det fortrinnsvis benyttes en metode og et system for samtidig å ta flere bilder av et embryo ved bruk av et enkelt kamera og egnet anordnede reflektive overflater (for eksempel prismer) kan benyttes for å forkorte tiden og arbeidet som er nødvendig for å oppnå flere bilder. En slik metode og et slikt system for samtidig å ta bilde fra flere betraktningsvinkler av et embryo er beskrevet i en paral-leltløpende US-søknad med tittelen "Fremgangsmåte og system for samtidig billedtak-ning fra flere betraktningsvinkler av et planteembryo" (interndokument WEYE-1-20651), som ansees som del av foreliggende beskrivelse. En klassifiseringsmodellalgo-ritme kan så anvendes på hver av de forskjellige betraktninger av et embryo for å klassifisere denne i henhold til dens putative germineringskraft.

I tillegg, eller alternativt, kan, under embryoklassifiseringstrinnet "C", en apikaldom som er lokalisert ved kotyledonenden av et planteembryo, avbildes tredimensjonalt og analyseres for å bestemme embryoets spiringskraft (det vil si potensiale for hurtig epi-kotylutvikling efter germinering) (se figur 2, blokk 50). Fordi den apikale dom er det sted de fleste planteceller som produserer plantelegemet dannes, er det bestemt at do-mens morfologiske trekk (størrelse, form og så videre) er pålitelige indikatorer for embryoets tendens til hurtig vekst efter spiring. Med andre ord kan den tredimensjonale informasjon om den apikale dom hos et embryo benyttes som input i en klassifiserings-modellalgoritme for ytterligere å klassifisere embryoet i henhold til ønskelighet. Noen metoder for tredimensjonalt billedopptak av en apikaldom av et planteembryo kan finnes i den paralleltløpende søknad med tittelen "Metode og system for tredimensjonalt billedopptak av en apikaldom av et planteembryo", fullmektigdokument WEYE-1-20665, som ansees som del av foreliggende beskrivelse.

Videre kan, i tillegg eller alternativt, under embryoklassifiseringstrinnet "C", et embryo analyseres ved bruk av en spektroskopisk analysemetode som IR spektroskopi, NIR

spektroskopi eller Råman spektroskopi (se figur 2, blokk 52). Den klassifiseringsmodell som er beskrevet i WO 99/63057, supra, kan anvendes på hvilke som helst absorpsjons-, transmittans- eller reflektansspektra av embryoer for ytterligere kvalitativt å klassifisere embryoene i henhold til den kjemiske sammensetning. Kort sagt tillater en spektroskopisk analyse identifisering av kjemien for hvert embryo og derved identifisering av målkjemikalier eller analytter i et embryo. Embryoer som er biokjemisk mature og til-bøyelige til spiring er kjente for å inneholde visse nivåer av målkjemikalier eller analytter, for eksempel sukkeralkoholer. Således er spektroskopisk analyse av embryoer en pålitelig metode for kvalitativt å identifisere biokjemisk mature embryoer. Noen metoder for spektroskopisk analysering av klassifisering av embryoer ved bruk av NIR spektroskopi er beskrevet i WO 99/63057 supra. Videre er en metode for å bedømme emb-ryokvaliteten ved bruk av Råman spektroskopi beskrevet i den paralleltløpende US-søknad med tittelen "Fremgangsmåte for klassifisering av planteembryoer ved bruk av Råman spektroskopi" med internreferanse WEYE-1-20649, som også ansees som del av foreliggende beskrivelse. Som benyttet her omfatter spektroskopisk analyse en analyse av et bilde tatt i ett eller flere spesifikke spektralbånd, vanligvis kjent som multi-spektralbilled-opptak (eller kjemisk billedopptak, kjemisk mapping).

Det skal påpekes at andre billed- eller spektroskopiske teknologier for å bestemme den biokjemiske sammensetning eller morfologiske struktur for et embryo, kan benyttes i tillegg til eller alternativt til en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne klassifiseringsmetoder. Da nye billed- og spektroskopiske teknologier stadig dukker opp kan disse teknologier lett innarbeides i foreliggende metode for automatisert høsting og flertrinnsscreening av planteembryoer. For eksempel kan Teraherz stråler (T-stråler) benyttes for spektroskopisk å avbilde et planteembryo for å avgjøre den kjemiske og fysiske sammensetning. Som et ytterligere eksempel kan fluorescentmerkingsteknologi, for eksempel den kvantumdotteknologi som er utviklet av Quantum Dot Corporation, Hay-ward, California, benyttes for å detektere spesifikke forbindelser og også å spore biolo-giske evenementer i et planteembryo. Videre kan kosmiske stråler benyttes for å måle densiteten av et embryo. Slik det vil være klart for fagmannen kan, basert på disse ek sempler, hvilke som helst andre teknologier som kan bestemme de biokjemiske eller morfologiske (strukturelle) egenskaper for et planteembryo, basert på bruken av et bredt spektrum av elektromagnetisk stråling, benyttes i henhold til oppfinnelsen.

Det skal påpekes at metoden som beskrevet ovenfor screener eller klassifiserer embryoer i flere trinn, først ved sikting basert på rudimentære størrelses-/formkriterier (trinn "B") og så ved økende sofistikerte og generelt mer tidskrevende midler under trinn "C" som en billedbasert størrelse-formanalyse (blokk 46), billedbasert klassifiseringsmo-dellanalyse (blokk 48), billedbasert apikaldomanalyse (blokk 50), og spektralbasert kjemisk analyse (blokk 52). Det skal være klart at flere klassifiseringsmetoder kan føyes til efter hvert som ytterligere screeningkriterier utvikles. For eksempel kan en metode for å bestemme sykdomsresistensen hos et embryo utvikles ved bruk av en form for sensor. Derefter kan et klassifiseringstrinn for å klassifisere embryoer basert på syk-domsresistenskriterier føyes til for ytterligere å raffinere den totale klassifiseringsprosess. Efter hvert som flere screeningkriterier utvikles og deres tilsvarende klassifiseringsmetoder innarbeides i foreliggende metode, vil denne være i stand til å identifisere de embryoer som mest sannsynlig vil vokse til planter som er sterke, sunne og har forskjellige andre, ønskede egenskaper.

Det er klart at kun de embryoer som har passert det foregående klassifiseringstrinn vil føres videre til det etterfølgende screeningtrinn slik at et mindre antall embryoer må bedømmes ved et senere screeningstrinn som eventuelt er mer sofistikert og komplekst fordi komplekse screeningstrinn har en tendens til å være mer tidskrevende. I en viss situasjon kan imidlertid to eller flere screeningtrinn gjennomføres parallelt, i det vesentlige samtidig. Når for eksempel flere bilder (for eksempel toppbilde, sidebilde og endebilde) av et embryo tas og analyseres i henhold til en klassifiseringsmodell (blokk 48), kan ett av bildene (for eksempel kotyledonendebildet inneholdende tredimensjonal informasjon om en apikal dom) analyseres samtidig i dybde for å sikre de morfologiske trekk ved embryoets epikale dom (blokk 50).

Under ytterligere henvisning til figurene IA og 2 faller, i trinn "D", ved enden av klassifiseringstransportbeltet 34, de ønskelige embryoer som er tilbake på transportørbeltet 34 via tyngdekraften (eventuelt assistert av en ikke-vist luft/væskestråle) ned på et underlag (en skål, et brett eller en pute eller en hvilken som helst egnet overflate) 54 som er montert på et todimensjonalt drivsystem (eller motorisert plattform) 56, som også kontrolle-res av datamaskinen 40. Drivsystemet 56 justerer todimensjonalt (eller eventuelt tredimensjonalt) posisjonen for underlaget 54 i forholdet til enden av klassifiseringstrans portbeltet 34 for å motta embryoer som faller derfra inn i et jevnt anordnet mønster (for eksempel et todimensjonalt mønster). Posisjoneringen av underlaget 54 i forhold til enden av klassifiseringstransportbeltet 34 bestemmes basert på den nøyaktig kjente posisjon for hvert embryo på klassifiseringstransportbeltet 34 i henhold til opptakstiden for kameraet 38 og hastigheten for transportbeltet 34. Således kan selv et noe irregulært lineært mønster av ønskede embryoer på klassifiseringstransportbeltet 34 transformeres til et jevnt fordelt todimensjonalt mønster på underlaget 54. Konstruksjonen og driften av drivsystemet 56 vil være åpenbare for fagmannen på området og må derfor ikke beskrives i detalj her. Underlaget 54, eventuelt inneholdende 100 pluss embryoer anordnet i et jevnt fordelt mønster, kan derefter føres videre for å motta ytterligere matureringsbehandling. For eksempel kan underlaget 54 føres videre til efterutviklingsbehandlingsrommet (tørkerom i den viste utførelsesform) 14 for å tørke embryoene for lagring og for etterfølgende innarbeiding i produserte frø.

I tillegg kan, under spesiell henvisning til figur 2, embryoene som er plassert og tørket på underlaget 54, i trinn "E" underkastes ytterligere, sekundære serier av klassifiseringstrinn før innarbeiding i produserte frø. Embryoene kan rehydratiseres før den sekundære serie av klassifiseirngstrinn eller kan forbli tørket under en eller flere av de sekundære serier av klassifiseringstrinn, avhengig av hver applikasjon. Som med det tidligere klassifiseringstrinn "C" kan det sekundære klassifiseringstrinn "E" også inkludere ett eller flere klassifiseringstrinn som i økende grad er mer sofistikerte og komplekse for å oppnå progressivt høyere seleksjonsnøyaktighet og driftseffektivitet. Fordi kun en relativt liten mengde embryoer som har passert det tidligere klassifiseirngstrinn "C" er tilbake på dette tidspunkt kan det utføres mer sofistikerte og derved tidskrevende tidskrevende klassifiseringsmetoder som for eksempel flerbetraktningsfarvebilledanalyse ved bruk av en klassifiseirngsmodell (blokk 54), en apikaldomanalyse (blokk 56) eller en spektroskopisk analyse, eventuelt også ved bruk av multiple betraktninger (blokk 58). Det er også tatt sikte på at når robotopplukkings- og -plasseringssystemene benyttes for automatisk å plukke opp og innføre embryoer inn i produserte frø, kan en viss digital billed-teknologi være nødvendig for å sikre posisjonen av hvert embryo for dette formål og derfor kan dette digitale billedopptak med fordel kombineres med billedervervelsen som er nødvendig for ett eller flere av klassifiseringstrinnene under dette sekundære klassifiseringstrinn "E".

I en utførelsesform, for eksempel efter å være fjernet fra et utviklingsmedium i trinn "A", og ytterligere å ha vært sortert og singulert i trinn "B", kan embryoene under embryoklassifiseringstrinnet "C" undergå to klassifiseringstrinn. Først utføres en enkeltbe- trakterings (for eksempel toppbilde) monokromatisk billedanalyse for å eliminere de embryoer som ikke tilfredsstiller basis størrelses-/formkriteriene (blokk 46). For det andre anvendes det en klassifiseirngsmodell på det samme enkeltbetraktningsmonokro-matiske bilde for å eliminere de embryoer som sannsynligvis ikke vil spire (blokk 58). I trinn "D" anbringes de gjenværende embryoer som har passert begge de to klassifiseringstrinn, på et underlag, og tørkes. Under det sekundære klassifiseirngstrinn "E" blir derefter embryoene fra trinn "D" underkastet en ytterligere serie klassifiseringstrinn som eventuelt er mer sofistikerte og derfor mer tidkrevende. For eksempel kan embryoene underkastes en multippel betraktning (for eksempel toppbilde, sidebilde og endebilde) farvebilledanalyse for å eliminere uønskede embryoer i henhold til en klassifiseringsmodell (blokk 54), og videre til en apikaldomanalyse (blokk 56) og/eller spektroskopisk analyse (blokk 58) for i tillegg ytterligere å bestemme uønskede embryoer, igjen i henhold til den egnede klassifiseringsmodell.

Figur IB viser en alternativ utførelsesform av et system for automatisk innhøsting og flertrinnsscreening av planteembryoer. På samme måte som med utførelsesformen i figur IA blir embryoene vasket av en utviklingsoverflate og anbragt på det porøse transportørbelte 24 og siktet, eventuelt understøttet av ytterligere vasking med vandig væske (tilsvarende figur 2, trinnene "A" og "B"). De embryoer som er tilbake på transportbeltet 24 blir så avbildet med et kamera 38. Billedet av hvert embryo overføres til datamaskinen 40 for analyse og klassifisering i henhold til de foreliggende morfologiske trekk (tilsvarende figur 2, trinn "C"). For eksempel benyttes en egnet algoritme for å identifisere de embryoer som tilfredsstiller basiske størrelses- og formkriterier for innarbeiding i produserte frø.

Derefter benyttes et smart minirobotoverføringssystem 60 under kontroll av datamaskinen 40 for å plukke opp og anbringe hver av disse embryoer som tilfredsstiller de prinsipielle størrelsestrekk og formkriterier på en mottakerflate 54 i et jevnt fordelt mønster. Kort sagt inkluderer overføringssystemet 60 et hus 61 som lateralt kan beveges langs en skinne 62, og en robotarm 63 som forløper fra huset 56 og inkluderer en vakuumspis-sende. Robotarmen 63 kan forlenges i lengderetning og kan også dreies aksialt. Detaljer når det gjelder et eksempel på et minirobotoverføringssystem 60 som er egnet for bruk ifølge denne utførelsesform av oppfinnelsen er beskrevet i WO 01/13702 A2, og anses som del av beskrivelsen. I den viste utførelsesform i figur IB blir, efter at et embryo er plukket opp fra transportbeltet 24 ved hjelp av armen 63, huset 61 translatert langs skinnen 62 til en ny posisjon 61', ved hvilket punkt armen 63 forlenges nedover for å anbringe embryoet på overflaten 54. På dette punkt kan armen 61' være kontrollerbart dreiet aksialt, basert på den opprinnelige orientering av embryoet som avbildet av kameraet 38 og lagret i datamaskinen 40, slik at embryoene som anbringes på brettet eller overflaten 54 er riktig orientert, for eksempel slik at deres kotyledonender alle vender i samme retning. I en foretrukken utførelsesform blir embryoene plassert nøyaktig på brettet 54 i samme orientering og med deres kotyledonender nøyaktig innrettet med hverandre. I foreliggende beskrivelse blir et brett hvorpå embryoer er arrangert i samme orientering og i et nøyaktig mønster (for eksempel med posisjonene for kotyledonendene nøyaktig kjent) kalt et "indeksbrett".

Derefter blir indeksbrettene 54 ført videre for å motta matureringsbehandling, for eksempel til efterutviklingsbehandlingsrommet (tørkerommet i den viste utførelsesform) 14 for dehydratisering av embryoene (tilsvarende figur 2, trinn "D"). Derefter kan embryoene rehydratiseres og underkastes en andre klassifiseringsprosess (tilsvarende figur 2, trinn "E"). Spesielt kan indeksbrettene 54 som hver bærer et riktig orientert og jevnt fordelt mønster av embryoer, anbringes på et sekundærklassifiseringstransportbelte 64 og embryoene kan underkastes ytterligere klassifiseringstrinn efter hvert som de transporteres på transportbeltet 64. For eksempel benyttes en egnet scanner 68, koblet til en datamaskin 70, for ytterligere å klassifisere embryoene for å identifisere de som sannsynligvis vil spire med hell og vokse til normale planter. Under den sekundære klassifisering kan bruken av indeksbrettet 54 være fordelaktig fordi dette tillater lokalisert analyse av hvert embryo på brettet. For eksempel kan visse billed- eller spektroskopiske analyser gjennomføres med henblikk på et lokalisert område av hvert embryo (for eksempel kotyledonendedelen). Fordi den nøyaktige posisjon for embryoene (for eksempel deres kotyledonender) på indeksbrettet 54 er kjent, er slik lokalisert analyse mulig.

Ved enden av det sekundære klassifiseringstransportbeltet 64 er det tilveiebragt et ytterligere robotembryoplasseringssystem 71 for å plukke opp kun de embryoer som er ytterligere valgt som ønskelige, og å innføre disse i produserte frø 76.1 den viste utførelses-form inkluderer embryoplasseringssystemet 71 et hus 72 som translateres langs en skinne 73 og en robotarm 74 som forløper fra huset 72. Efter at en ønsket embryo er plukket opp av armen 74 translateres huset 72 langs skinnen 73 til en ny posisjon 72', ved hvilket punkt armen 74' kan senkes for å anbringe den angjeldende embryo i et produsert frø 76 (eller en rørformet holder for det produserte frø). Detaljene ved egnede embryoplas-seringssystemer er beskrevet i WO 01/13702 A2, supra. Forskjellige andre alternative systemer for overføring og innføring av embryoer inn i produserte frø er mulige slik det vil være åpenbart for fagmannen. For eksempel kan huset 72 og armen 74 være to- eller tredimensjonalt bevegelige. Videre kan et brett som holder antallet produserte frø 76 være tildannet en-, to- eller tre-dimensjonalt bevegelige for nøyaktig å posisjonere hvert frø 76 i forhold til et embryo som bæres av embryoplasseringssystemet 71.

Fordi den nøyaktige posisjon for embryoene på indeksbrettet 54 er kjent behøver embryoplasseringssystemet 71 ikke å ha evnen til å bestemme eller korrigere posisjonen og/eller orienteringen for hvert embryo når denne plukkes opp fra brettet 54. Basert på den kjente posisjon og orienteringen for hvert embryo er det for eksempel mulig at embryoplasseringssystemet 71 nøyaktig posisjonerer kotyledonenden av hvert embryo inne i det produserte frø 76.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes det en komplett metode og et fullstendig system for automatisk å høste somatiske embryoer og som kan erstatte dagens manuelle arbeide inkludert trinnene med sortering og utplukking og ytterligere klassifisering av masseproduserte embryoer i henhold til den putative germineringskraft. Klassifisering av embryoene gjennomføres i flere trinn for effektivt å identifisere de embryoer som er egnet for innarbeiding i produserte frø. Ved omhyggelig å velge egnede klassifiseringsmetoder for kombinering kan man oppnå progressivt høyere seleksjonsnøyaktighet som vil være lik eller sogar overskride nivået av selektivitet som i dag kan oppnås kun ved bruk av høyt kvalifiserte teknikere. Videre er ytelsen for oppfinnelsens automatiserte metode med flertrinnsscreening (klassifisering) beregnet å være rundt 5 millioner embryoer per år, noe som er tilstrekkelig til å tilfredsstille den 1,5-2 sekunder/embryo hastighet som er nødvendig for klassifisering av sorterete og singulerte embryoer for masseproduksjonsformål når det gjelder produserte frø.

Mens oppfinnelsen er illustrert og beskrevet som foretrukne utførelsesformer vil det være klart at forskjellige endringer kan foretas uten å gå utenfor oppfinnelsens ånd og ramme.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for automatisk høsting og screening av planteembryoer i flere trinn, omfattende: automatisk sortering og singulering av planteembryoer; anvendelse av et kamera for å avbilde hvert av de sorterte og singulerte embryoene; overføre avbildningen av hvert embryo til en datamaskin for å bli analysert ved en to-trinns kamera bildeanalyse og klassifisert, hvori: datamaskinen analyserer avbildningene og automatisk klassifiserer de sorterte og singulerte planteembryoer ved bruk av en første klassifiseringsmetode basert på formen og størrelsen til embryoene for å identifisere de embryoene som ikke oppfyller basis størrelse- og formkriterier; ogkarakterisert vedat datamaskinen bare analyserer de avbildningene av planteembryoene som har passert den første klassifiseringsmetoden ved anvendelse av en andre klassifiseringsmetode basert på den putative germineringskraften til embryoene som identifiserer de embryoene som har en lavere sannsynlighet for spiring; embryoene som er avvist i det første eller andre klassifiseringstrinnet fjernes slik at de gjenværende ønskede embryoene forblir; og den andre klassifiseringsmetoden omfatter én eller flere av: multippelbetrak-nings-fargeavbildningsanalyse ved anvendelse av en klassifiseringsmodell, en apikaldom analyse; og en spektroskopisk analyse.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat trinnet med automatisk sortering og singulering omfatter automatisk fjerning av planteembryoer fra et utviklingsmedium.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat den automatiserte fjerning av planteembryoer omfatter vasking av planteembryoene fra utviklingsmediet ved bruk av vandig væske.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat trinnet med sortering og singulering av embryoer omfatter bruk av et strømningscytometer.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat trinnet med sortering og singulering av embryoer omfatter plassering av disse på et porøst materiale for sikting.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat embryoene som er plassert på det porøse materialet sprayes med vandig væske for å fjerne eventuelt suspensorvev eller restembryonale suspensormasser (ESM) fra embryoene.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5 eller krav 6,karakterisertv e d at det porøse materialet omfatter et porøst transportørbelte.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat embryoene er anbragt i et reservoar som avsetter embryoene på det porøse transportør-beltet idet reservoaret er konfigurert for å avgi embryoene til beltet på regulær måte.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat reservoaret omfatter et rør.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 7 til 9,karakterisert vedat planteembryoer som er sortert og singulert efter sikting anbringes på et klassifiseringstransportbelte langs hvilket de første og andre automatiserte klassifiseringsmetoder gjennomføres.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat de sorterte og singulerte planteembryoer overføres fra det porøse transportørbeltet til klas-sifiseringstransportørbeltet ved hjelp av tyngdekraften.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller krav 11,karakterisertv e d at klassifiseringstransportørbeltet forløper generelt loddrett på det porøse transportørbeltet.

13. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 10 til 12,karakterisert vedat de sorterte og singulerte planteembryoer anbringes på klassifiseringstransportørbeltet i en enkeltrekke langs lengden av klassifiserings-transportørbeltet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat planteembryoene anbringes i en enkeltrekke i avstand fra hverandre.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 10 til 14,karakterisert vedat videre trinnet med automatisk fjerning av de embryoer som er klassifisert som uønsket ved den første eller andre automatiske klassifiseringsmetode, omfatter å fjerne nevnte embryoer fra klassifiseringstransportørbeltet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat den automatiske fjerning av uønskede embryoer gjennomføres ved hjelp av en stråle.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 10 til 16,karakterisert vedat den videre omfatter et trinn med automatisk fjerning av de embryoer som er klassifisert som ønsket ved den første og andre automatiserte klassifiseringsmetode, fra klassifiseringstransportbeltet.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat trinnet med automatisk fjerning av ønskede embryoer omfatter overføring av disse ønskede embryoer til en mottakeroverflate i et på forhånd definert mønster.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat den mottakende overflate omfatter et brett montert på en motorisert plattform som er konfigurert til å justere posisjonen for brettet relativt klassifiseringstransportørbeltet for å motta embryoer som faller ved tyngdekraften fra klassifiseringstransportørbeltet inn i et på forhånd bestemt mønster.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat fallet av embryoer ved tyngdekraften fra klassifiseringstransportørbeltet understøttes av en stråle.

21. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 7 til 20,karakterisert vedat de sorterte og singulerte planteembryoer klassifiseres i henhold til den første klassifiseringsmetode mens de befinner seg på det porøse transportørbeltet og at planteembryoer som har passert den første klassifiseringsmetode overføres fra det porøse transportørbeltet til et indeksbrett i et på forhånd bestemt møns-ter.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21,karakterisert vedat den andre klassifiseringsmetode gjennomføres på planteembryoene som er anbragt på indeksbrettet.

23. System for automatisk høsting og screening av planteembryoer i flere trinn, omfattende: midler (22,24, 28, 34; 21, 22, 25, 30; 21, 22, 27, 34) for automatisk sortering og singulering av planteembryoer; et kamera (38) for å avbilde hvert av de sorterte og singulerte planteembryoer, hvori datamaskinen (40) automatisk klassifiserer de sorterte og singulerte planteembryoer ved bruk av en første klassifiseringsmetode;karakterisert vedat: datamaskinen (40) automatisk klassifiserer bare de planteembryoene som har passert den første klassifiseringsmetoden ved anvendelse av en andre klassifiseringsmetode basert på den putative germineringskraften til embryoene som identifiserer de embryoene som har en lavere sannsynlighet for spiring; den andre klassifiseringsmetoden omfatter én eller flere av: multippelbetrak-nings-fargeavbildningsanalyse ved anvendelse av en klassifiseringsmodell, en apikaldom analyse; og en spektroskopisk analyse; og en luft-/væskestråle (42) kontrollert av datamaskinen (40) støter ut til en avfallsbeholder (44) de embryoer som er avvist enten i den første klassifiseringsmetoden eller i den andre klassifiseringsmetoden.