NO332990B1

NO332990B1 - Glukose biosensor, fremgangsmate for glukose deteksjon og sammensetning

Info

Publication number: NO332990B1
Application number: NO20043257A
Authority: NO
Inventors: Bruce J Pitner; Javier Alarcon; Christopher J Knors
Original assignee: Becton Dickinson Co
Priority date: 2002-01-04
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2013-02-11
Also published as: ATE548391T1; EP1458760A1; US20030153026A1; DK1458760T3; AU2003201820B2; EP1458760A4; WO2003057734A1; CA2471889C; NO20043257D0; US7629172B2; CA2471889A1; EP1458760B1; JP4576121B2; JP2005539205A; AU2003201820A1; US20050042704A1; ZA200405390B; ES2380922T3; NO20043257L

Abstract

Sammendrag Oppfinnelsen er rettet på innkapslede bindingsprotein, muterte bindingsproteiner · inneholdende reporter grupper, sammensetninger av muterte bindingsproteiner inneholdende reporter grupper i analytt permeable matrikser, og deres anvendelse som analytt biosensorer både in vitro og in vivo. Bindingsproteinene er kovalent bundet til et fluorescin fargestoff slik at konsentrasjonen av en analytt (for eksempel glukose) i en gitt prøve er proporsjonal med det fluorescerende signal på en skala.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Oppfinnelsens område angår bioteknologi. Spesielt er oppfinnelsen rettet mot innkapslede muterte bindingsproteiner, muterte bindingsproteiner som inneholder reporter grupper, sammensetninger av muterte bindingsproteiner inneholdende reporter grupper i analytt permeable matrikser for anvendelse som analytt biosenorer både in vitro og in vivo.

BESKRIVELSE AV RELEVANT TEKNIKK

Kontrollering av glukose konsentrasjoner for å lette adekvat metabolsk kontroll ved diabetes er et ønsket mål og vil øke livskvaliteten for mange mennesker. For tiden anvender de fleste diabetikere "fingerstikk"-metoden for å kontrollere sine blod glukose nivåer og pasientens brukervennlighet er problematisk på grunn av smerte forårsaket av hyppige (flere ganger om dagen) stikk. Som et resultat er det gjort forsøk på å utvikle ikke-invasive eller minimalt invasive in vivo eller mer effektive in vitro metoder for hyppig og/eller kontinuerlig overvåking av blod glukose eller andre glukose-inneholdende biologiske væsker. Noen av de mest lovende av disse metodene involverer anvendelse av en biosensor. Biosensorer er anordninger som er i stand til å frembringe spesifikke kvantitative eller semi-kvantitative analytiske informasjoner ved anvendelse av et biologisk gjenkjennelseselement som kombineres med et omformer (påvisnings) element.

Det biologiske gjenkjennelseselement til en biosensor bestemmer selektiviteten slik at kun den forbindelse som skal måles fører til et signal. Seleksjonen kan baseres på biokjemisk gjenkjennelse av liganden der den kjemiske strukturen til liganden (for eksempel glukose) er uendret, eller biokatalyse der elementet katalyserer en biokjemisk reaksjon ved analytten.

Omformeren oversetter gjenkjennelsen av det biologiske gjenkjennelseselement til et semi-kvantitativt eller kvantitativt signal. Mulige transducer teknologier er optiske, elektrokjemiske, akustiske/mekaniske eller kolorimetriske. De optiske egenskapene som er undersøkt omfatter absorbans, fluorescens/fosforescens, bio/kjemiluminiescens, reflektans, lysspredning og brytningsindeks. Konvensjonelle rapportørgrupper slik som fluorescerende forbindelser kan anvendes, eller alternativt kan det være en mulighet for direkte optisk deteksjon uten behov for en markør.

Biosensorer spesielt utformet for glukose påvisning som anvender biologiske elementer for signal transduksjon anvender typisk elektrokjemisk eller kolorimetrisk deteksjon av glukose oksidase aktiviteten. Anvendelsen av denne metoden er forbundet med vanskeligheter som skylder påvirkning av oksygennivået, tilstedeværelse av inhibitorer i blod og problemer med elektroder blant annet. I tillegg medfører deteksjon konsumpsjon av analytten som kan føre til problemer ved måling av lave glukose konsentrasjoner.

Et raskt utviklende område innenfor biosensor utvikling er anvendelse av fluorescensmerkede periplasmiske bindingsproteiner (PBP). Som beskrevet av Cass ( Anal. Chem. 1994, 66, 3840-3847), ble et merket maltose bindingsprotein (MBP) vist å være nyttig som maltose sensor. I dette arbeidet ble MBP, som ikke naturlig har noen cystein rester, mutert for å frembringe et protein med en enkel cystein rest ved posisjon 337 (S337C). Denne mutasjonen var innenfor den maltose bindende kløften og medførte en stor miljøendring ved maltosebinding. Flere fluoroforer ble studert, noen verken blokkerte ligandbinding eller interfererte med konformasjonsendringen i proteinet. Av disse studiene resulterte IANBD i en vesentlig økning i fluorescens (160%)-intensiteten ved maltosebinding. Dette resultat er konsistent med plasseringen av fluoroforen hvilket endres fra et hydrofilt eller løsningsmiddel eksponert miljø til et mer hydrofobt miljø, slik det teoretisk ville vært forutsett ved å lukke hengselsområdet ved maltosebinding. Imidlertid binder dette muterte protein og den assosierte rapportørgruppen ikke i diagnostisk viktige sukkere i pattedyr kroppsvæsker. Cass beskrev også assosiering av dette proteinet med TiCh-overflater, der det overflatebundene protein imidlertid led av redusert aktivitet med tiden og behøvde konstant hydrering ( Analytical Chemistry 1998, 70(23), 5111-5113).

Hellinga et al (US 6,277,627), rapporterte konstruksjon av en glukose biosensor ved å introdusere en fluorescerende rapportør inn i et galaktose/glukose bindende protein (GGBP) mutert til å inneholde en cystein rest, og utnytter fordelen ved de store konformasjonsendringene som oppstår ved glukosebinding. Hellinga et al (US 6,277,627) beskriver at transmisjon av konformasjonsendringene i muterte GGBP kan utnyttes til å konstruere integrerte signal transduksjonsfunksjoner som konverterer i en glukosebindingshendelse til en endring i fluorescens via en allosterisk koblingsmekanisme. De fluorescente transduksjonsfunksjoner rapporteres å interferere minimalt med de intrinsiske bindingsegenskaper til sukkerbindingslommen i GGBP.

For nøyaktig å bestemme glukose konsentrasjonen i biologiske løsninger slik som blod, interstitsielle væsker, okular løsninger eller svette etc, kan det være ønskelig å tilpasse bindingskonstanten til det følsomme molekyl i en biosensor slik at det tilpasses det fysiologiske og/eller patologiske området i den biologiske løsningen av interesse. Uten en passende bindingskonstant kan et signal være utenfor området for en spesiell fysiologisk og/eller patologisk konsentrasjon. I tillegg kan biosensorer være konfigurert ved anvendelse av mer enn et protein, hver med en forskjellig bindingskonstant, for å frembringe nøyaktige målinger over et bredt spekter av glukose konsentrasjoner slik beskrevet av Lackowicz (US 6,197, 534).

På tross av nytten til disse muterte GGBP er få av disse proteinene utformet og undersøkt, enten med eller uten rapportør grupper. Spesifikke mutasjoner på steder og/eller tilkobling av spesielle rapportør grupper kan fungere ved å modifisere en bindingskonstant på en uforutsigbar måte. I tillegg kan en biosensor inneholdende rapportør grupper ha en ønsket bindingskonstant, men ikke medføre et lett detekterbart signal ved binding til analytten. Det er tydelig ut i fra kjent teknikk at en av de dominerende faktorer som bestemmer sensitiviteten til en spesiell rapportør probe festet til et spesielt protein for deteksjon av en spesifikk analytt er egenskapen til de spesifikke interaksjoner mellom den utvalgte probe og aminosyre restene i proteinet. Det er for tiden ikke mulig å forutsi disse interaksjoner i proteinene ved anvendelse av matematiske metoder, ei heller er det mulig å anvende rasjonell design metodologi for å optimalisere valgt av rapportør prober. I tillegg er det ikke mulig å forutsi effekten på bindingskonstanten basert på posisjoneringen av rapportør gruppen i proteinet (eller vice versa).

For å utvikle reagensløse, egen-inneholdte og/eller implanterbare og/eller gjenbrukbare biosensor proteiner må transduksjonselementet være i forbindelse med en deteksjonsanordning for å sende signalet til og fra transduksjonselementet. Med "sende"

(interrogate) menes den prosess som sender lys til og måler utsendt lys fra en prøve. Typiske fremgangsmåter inkluderer plassering av proteiner innenfor eller på overflaten til optiske fibere eller plan bølgeleder ved anvendelse av immobiliseringsstrategier. Slike immobiliseringsstrategier inkluderer, men er ikke begrenset til, fengsling av proteinet innenfor semi-permeable membraner, organiske polymer matrikser eller uorganiske polymer matrikser. Immobiliseringsstrategien som anvendes kan til syvende og sist bestemme ytelsen til den anvendte biosensor. Tidligere kjent teknikk beskriver mange problemer forbundet med immobilisering av biologiske molekyler. For eksempel gjennomgår mange proteiner irreversible konformasjonsendringer, denaturering og tap av biokjemisk aktivitet. Immobiliserte proteiner kan eksistere i et stort antall mulige orienteringer på en hvilken som helst spesiell overflate der for eksempel noen proteiner er orientert slik at deres aktive seter er eksponert mens andre kan være orientert slik at

deres aktive seter ikke er eksponert og følgelig ikke er i stand til å undergå selektive bindingsreaksjoner med analytten. Immobiliserte proteiner er også gjenstand for tidsavhengig denaturering, denaturering under immobilisering og lekkasje av det fengslede protein etter immobilisering. Dette medfører problemer inkludert for eksempel en manglende mulighet for å opprettholde kalibrering av sensor anordningen og drift av signalet. Generelt krever bindingsproteinene kontroll av orienteringen for å kunne gjøre effektiv bruk av disse, følgelig er fysisk absorpsjon og tilfeldig eller massiv kovalent festing til overflaten eller immobiliseringsstrategier slik angitt i litteraturen vanligvis ikke vellykket.

Det foreligger flere rapporter på innkapsling av proteiner og andre biologiske systemer i enkle uorganiske silikon matrikser dannet ved en lav temperatur "sol-gel" fremstillingsmetode (for eksempel Brennan, J.D., Journal of Fluorescence 1999, 9( 4), 295-312, og Flora, K.; Brennan, J.D., Analytical Chemistry 1998, 70 (21), 4505-4513). Noen sol-gel matrikser er optisk gjennomsiktige, hvilket gjør dem nyttige for utvikling av kjemiske og biokjemiske sensorer som baseres på optisk transduksjon, for eksempel absorpsjon eller fluorescens spektroskopiske metoder. For å være funksjonell må imidlertid innkapslede eller immobiliserte bindingsproteiner bibeholde evnen til å undergå minst noen analytt induserte konformasjonsendringer. Konformasjonsbevegelse av bindingsproteiner kan være vesentlig begrenset i de fleste sol-gel matrikser kjent fra litteraturen. Det er rapportert at sol-gel innkapslede proteiner kan ha dramatisk endrede bindingskonstanter, eller bindingskonstanter som endres over forholdsvis korte tidsperioder eller under varierende omgivelsesbetingelser. I tillegg er det rapportert at funksjonen til protein innkapslet i sol-gel matriksen er tidsavhengig, en egenskap som begrenser generell anvendbarhet av sol-geler i biosensorer for in vitro så vel som in vivo anvendelse.

US 6197534 beskriver en biosensor for deteksjon av en analytt i en prøve, der analytten fortrinnsvis er glukose. Sensoren består av et detekterbart proteinmolekyl som er i stand til å binde seg til analytten i prøven og er fortrinnsvis glukose/galaktosebindende protein, GGBP.

Wenner B.R. et al, Proceedings of Spie - the International Society for optical Engineering, 2001, vol. 4252, 2001, s. 59-70 omhandler blant annet genetisk modifisert galaktose/glukose bindende protein (GGBP) til bruk som biosensor for deteksjon av glukose. Det fremgår av teksten at GGBP kan innkapsles og immobiliseres I en sol-gel matriks slik at biosensoren får gode optiske egenskaper og god termisk stabilitet. Marvin J.S. et al, Journal of American Chemical Society, vol. 120,1998, s. 7-11 beskriver hvordan fremstilling av designede, syntetiske proteiner kan være en fordel i utviklingen av biosensorer. Optiske transduksjonsfunksjoner kan bli en integrert egenskap hos proteiner ved å inkorporere fluorescerende grupper som er allosterisk bundet til et ligand bindingssete.

Det er derfor behov innen teknikken for å utforme ytterligere nyttige muterte proteiner og muterte GGBP-proteiner som frembringer detekterbare signaler ved analytt binding for anvendelse som biosensorer, og det er i tillegg behov for inkorporering av disse proteiner i analytt permeable matrikser som grenseflater mot signaloverførings og mottakselementer.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse omfatter glukose biosensor, kjennetegnet ved at den omfatter: minst et mutert glukose/galaktose bindingsprotein (GGBP) og minst én luminescens-reportergruppe (luminescens merke) kovalent festet dertil, hvor nevnte minst én luminescens-reportergruppe er i stand til å tilveiebringe et detekterbart og reversibelt signal som respons på binding til nevnte mutant GGBP og hvor nevnte muterte GGBP har minst en aminosyresubstitusjon av en ikke-reaktiv aminosyre med en reaktiv aminosyre som kan modifiseres med et merkingsmiddel analog til merkingen av cystein med en tiol reaktiv farge og nevnte muterte GGBP bindes til glukose og er innkapslet i en analytt-permeable matrix omfattende sol-geler forsterket ("augmented") med organisk modifiserte silikater eller kovalente kryssbundne hydrogeler eller en kombinasjon derav.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for glukose deteksjon, kjennetegnet ved at den omfatter: a) å tilveiebringe minst en mutert glukose/galaktose bindingsprotein (GGBP) som har minst en aminosyresubstitusjon av en ikke reaktiv aminosyre med en reaktiv aminosyre som kan modifiseres med et merkingsmiddel analogt til merkingen av cystein med en tiol reaktiv farge og minst en luminescens reporter gruppe kovalent bundet dertil, hvori nevnte minst ene luminescens reporter gruppe er i stand til å tilveiebringe et detekterbart og reversibelt signal som respons på binding til nevnte mutante GGBP og hvori nevnte muterte GGBP bindes til glukose; b) å innfange eller innkapsle nevnte muterte glukose/galaktose bindende protein i en analytt-permeable matrix omfattende kryssbundne hydrogeler, sol-geler forsterket med organisk modifiserte silikater eller en kombinasjon derav; c) å eksponere nevnte muterte glukose/galaktose bindende protein til varierende glukose konsentrasjoner; og

d) å detektere et signal fra nevnte luminescens reporter gruppe.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også sammensetning, kjennetegnet ved at den

omfatter en blanding av

a) et mutert glukose/galaktose bindingsprotein (GGBP) som har minst en aminosyre substitusjon valgt fra et cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cystein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 152, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 236, og et cystein i posisjon 296 korresponderende til aminosyreposisjonene til E. coli GGBP, hvori nevnte muterte GGBP bindes til glukose; b) en analytt permeabel matriks som omfatter kovalent kryssbundne hydrogeler, sol-gel forsterket med organisk modifiserte silikater eller en kombinasjon derav;

og

c) minst én luminescens reportergruppe (luminescens merke), hvori nevnte minst en luminescens reporter gruppe evner å tilveiebringe et detekterbart og

reverserbart signal som respons på binding til nevnte mutante GGBP.

Foreliggende oppfinnelse frembringer innesperrede eller innkapslede muterte bindingsproteiner og muterte bindingsproteiner som har festet til seg reporter grupper, for anvendelse som in vivo eller in vitro biosensorer. Videre frembringer oppfinnelsen en glukose biosensor inkludert (a) et mutert bindingsprotein og minst en reporter gruppe festet til dette slik at reporter gruppen frembringer et detekterbart signal når det muterte bindingsprotein eksponeres for glukose og (b) en matriks permeabel for analytt der det muterte glukose/galaktose bindingsprotein og reporter gruppen er i stand til å innkapsles i matriksen.

Oppfinnelsen frembringer også sammensetninger omfattende en blanding som inkluderer (a) minst et mutert glukose/galaktose bindingsprotein og minst en reporter gruppe festet til dette og (b) en hydrogel, dialysemembran, sol-gel eller kombinasjoner av disse for å frembringe en matriks permeabel for analytt der det muterte glukose/galaktose bindingsprotein og reporter gruppe innkapsles i matriksen.

Det er også mulig å frembringe en anordning som inkluderer (a) et mutert maltose bindingsprotein (MBP) og minst en reporter gruppe festet til dette slik at reporter gruppen frembringer et detekterbart signal når det muterte MBP bindes til maltose og der MBP inkluderer et cystein tilstede i posisjon 337 og (b) en matriks permeabel for maltose der det muterte MBP og reporter gruppen er innkapslet i matriksen.

Videre er det mulig å tilveiebringe en anordning og sammensetninger av denne egnet for in vivo anvendelse som inkluderer (a) et mutert glukose/galaktose bindingsprotein og minst en reporter gruppe festet til dette slik at reporter gruppen frembringer et detekterbart og reversibelt signal når det muterte glukose/galaktose bindingsprotein eksponeres for varierende glukose konsentrasjoner og (b) en matriks permeabel for analytten der det muterte glukose/galaktose bindingsprotein og reporter gruppen er innkapslet i matriksen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 illustrerer endringen i fluorescens respons for glukose av A213C/L238C NBD-amid GGBP H.6 i løsning. Figur 2 illustrerer signal forsterkningen av innkapslede bindingsproteiner i fravær og ved tilstedeværelse av analytt i forhold til løsning. Figur 3 viser et innkapslet bindingsprotein i fravær og nærvær av analytt i forhold til løsning. Figur 4 illustrerer reversible signal fra et innkapslet bindingsprotein i følge en utførelsesform i følge oppfinnelsen etter eksponering for løsninger av glukose ved de antydede konsentrasjoner.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Betegnelsen biosensor betegner vanligvis en anordning som anvender spesifikke biokjemiske reaksjoner mediert av isolerte enzymer, immunsystemer, vev, organeller eller hele celler for å påvise kjemiske forbindelser, vanligvis ved elektriske, termiske eller optiske signaler. Slik det anvendes her i dokumentet betegner "biosensor" et protein som er i stand til å binde en analytt som kan anvendes for å påvise analytten eller en endring i analytt konsentrasjonen ved et detektormiddel som beskrevet her i dokumentet. Mer spesielt inkluderer en biosensor i følge oppfinnelsen minst et mutert glukose/galaktose bindingsprotein og minst en reporter gruppe festet til dette og en matriks permeabel for analytten der det muterte glukose/galaktose bindingsprotein og reporter gruppen kan innkapsles i matriksen.

Betegnelsen "bindingsproteiner" betegner proteiner som interagerer med spesifikke analytter på en måte som er i stand til å frembringe eller omforme et detekterbart og/eller reversibelt signal som kan differensiere mellom når analytten ikke er tilstede, når analytten er tilstede i forskjellige konsentrasjoner over tid eller på en konsentrasjonsavhengig måte, ved hjelp av fremgangsmåtene som er beskrevet. Deteksjon av signalhendelsen inkluderer kontinuerlig, programmerte og periodiske hjelpemidler, inkludert engangs eller gjenbrukbare applikasjoner. Dannelse eller deteksjon av reversible signal kan være øyeblikkelige eller kan være tidsavhengige hvilket frembringer etablering av en sammenheng mellom tilstedeværelse eller konsentrasjon av analytt. Bindingsproteiner mutert på en slik måte at slike signaler effektueres er foretrukket.

Betegnelsen "galaktose/glukose bindene protein" eller "GGBP" slik det anvendes her i dokumentet betegner en type protein som naturlig finnes i det periplasmiske området hos bakterier. Disse proteiner er naturlig involvert i kjemotakse og transport av små molekyler (for eksempel sukkere, aminosyrer og små peptider) til cytoplasma. GGBP er et enkeltkjedet protein bestående av to globulære domener som er forbundet med tre tråder for å danne et hengselsområde. Bindingssetet er lokalisert i kløften mellom de to domenene. Når glukose kommer inn i bindingssetet gjennomgår GGBP en konformasjonsendring rundt hengselsområdet, hvilket bringer de to domenene sammen og fengsler glukose i bindingssetet. Røntgen krystallograf strukturen er bestemt for den lukkede form av GGBP fra E. coli (N.K. Vyas, M.N. Vyas, F.A. Quiocho Science 1988, 242, 1290-1295) og S.Typhimurium (S.L. Mowbray, R.D. Smith, L.B. Cole Receptor 1990,1,41-54) og er tilgjengelig gjennom Protein Data Bank

( http:// www. resb. org/ pdb/) som henholdsvis 2GBP og 3GBP. Villtype E. coli GGBP-DNA og aminosyre sekvensen kan finnes ved www. ncbi. nim. nih. gov/ entrez/ accession number D90885 (genomisk klon) og accession number 230520 (aminosyre sekvens). Det foretrukne GGBP er fra E. coli.

"Mutert bindingsprotein" (for eksempel "mutert GGBP") slik det anvendes her i dokumentet betegner bindingsproteiner fra bakterier inneholdende en aminosyre som er erstattet, fjernet eller tilført aminosyrene tilstede i det naturlig forekommende protein. Eksempler på mutasjoner i bindingsproteiner inkluderer addisjon eller substitusjon av cystein grupper, ikke-naturlig forekommende aminosyrer (Turcatti, et al, J. Bio. Chem. 1996 271, 33, 19991-19998) og erstatning av hovedsakelig ikke-reaktive aminosyrer med reaktive aminosyrer for å frembringe kovalent festing av elektrokjemiske eller foto responsive rapportør grupper. Med "reaktive" aminosyrer menes en aminosyre som kan modifiseres med et markør stoff analogt med merkingen av cystein med et tiol reaktivt fargestoff. Ikke-reaktive aminosyrer inkluderer alanin, leucin, fenylalanin og andre, som har sidekjeder som ikke enkelt kan modifiseres når de er inkorporert i et protein (se Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, San Diego, s. 4-16 for klassifisering av aminosyre sidekjede reaktivitet).

Eksempler på mutasjoner av GGBP-proteinet inkluderer et cystein som erstatter ly sin ved posisjon 11 (Kl 1C); et cystein som erstatter asparginsyre ved posisjon 14 (D14C); et cystein som erstatter valin ved posisjon 19 (VI9C); et cystein som erstatter asparagin ved posisjon 43 (N43C); et cystein som erstatter et glysin ved posisjon 74 (G74C); et cystein som erstatter tyrosin ved posisjon 107 (Y107C); et cystein som erstatter treonin ved posisjon 110 (Tl 10C); et cystein som erstatter serin ved posisjon 112 (Sl 12C); en dobbelt mutering som inkluderer et cystein som erstatter serin ved posisjon 112 og et serin som erstatter leucin ved posisjon 238 (Sl 12C/L238S); et cystein som erstatter lysin ved posisjon 113 (Kl 13C); et cystein som erstatter et lysin ved posisjon 137 (K137C); et cystein som erstatter glutaminsyre ved posisjon 149 (E149C); en dobbelt mutasjon som inkluderer en cystein som erstatter glutaminsyre ved posisjon 149 og en serin som erstatter leusin ved posisjon 238 (E149C/L238S); en dobbelt mutasjon omfattende en cystein som erstatter histidin ved posisjon 152 og et cystein som erstatter metionin ved posisjon 182 (H152C/M182C); en dobbelt mutasjon som inkluderer serin som erstatter en alanin ved posisjon 213 og et cystein som erstatter et histidin ved posisjon 152 (H152C/A213S); et cystein som erstatter et metionin ved posisjon 182 (M182C); et cystein som erstatter et alanin ved posisjon 213 (A213C); en dobbelt mutasjon som inkluderer et cystein som erstatter et alanin ved posisjon 213 og et cystein som erstatter et lysin ved posisjon 238 (A213C/L238C); et cystein som erstatter et metionin ved posisjon 216 (M216C); et cystein som erstatter asparginsyre ved posisjon 236 (D236C); et cystein som erstatter et leucin ved posisjon 238 (L238C); et cystein som erstatter en asparginsyre ved posisjon 287 (D287C); et cystein som erstatter en arginin ved posisjon 292 (R292C); et cystein som erstatter et valin ved posisjon 296 (V296C); en dobbelt mutasjon som inkluderer et cystein som erstatter glutaminsyre ved posisjon 149 og et arginin som erstatter alanin ved posisjon 213 (E149C/A213R); en trippel mutasjon som inkluderer en cystein som erstatter en glutaminsyre ved posisjon 149, et alanin som erstatter en serin ved posisjon 213 og en serin som erstatter leucin ved posisjon 238 (E149C/A213S/L238S); og en trippel mutasjon som inkluderer en cystein som erstatter en glutaminsyre ved posisjon 149, en arginin som erstatter en alanin ved posisjon 213 og en serin som erstatter en leucin ved posisjon 238 (E149C/A213R/L238S). Ytterligere eksempler er vist i tabell 1. Tallet på aminosyre resten henviser til den publiserte sekvensen for E. coli som har 309 rester, som nevnt ovenfor, eller tilsvarer aminosyre restene i en hvilken som helst vesentlig homolog sekvens fra en alternativ kilde (for eksempel glukose/galaktose bindingsproteiner fra Citrobacter freundii eller Salmonella typhimurium, sekvens accession nr. henholdsvis P23925 og P23905).

De innesperrede eller innkapslede muterte bindingsproteiner i følge oppfinnelsen kan anvendes i en in vitro eller in vivo analytt analyse som for eksempel er i stand til å følge kinetikken til biologiske reaksjoner som involverer en analytt (for eksempel glukose), så vel som kliniske analyser eller testing av produkter fra mat og drikkevare industrien. Konsentrasjonen av bindingsproteinet i matriksen er fortrinnsvis mindre enn bindingskonstanten (K4) mellom protein og dens analytt.

Mutasjonen kan tjene en eller flere hensikter. For eksempel kan et naturlig forekommende protein muteres for å endre langtidsstabilitet av proteinet; for å konjugere, binde, koble eller på annen måte assosiere proteinet til en spesiell innkapslingsmatriks, polymer eller overflate; for å justere dens bindingskonstant med hensyn på en spesiell analytt, eller en hvilken som helst kombinasjon av disse.

I foreliggende oppfinnelse fungerer analytten og det muterte protein som bindingspartnere. Betegnelsen "assosieres" eller "bindes" slik det anvendes her i dokumentet betegner bindingspartnere med en relativ bindingskonstant (Ka) tilstrekkelig sterk til å muliggjøre deteksjon av binding til proteinet ved et deteksjonsmiddel. IQ kan beregnes som den konsentrasjon av fri analytt ved hvilket halvparten av proteinet er bundet eller vice versa. Når analytten av interesse er glukose er Kj-verdiene for bindingspartnerne fortrinnsvis mellom cirka 0.0001 mM til cirka 30 mM.

I følge foreliggende oppfinnelse er det vist at de muterte GGBP kan anvendes for å påvise glukose binding ved å feste til disse en repeter gruppe som frembringer et detekterbart signal ved glukose binding. Å "frembringe et detekterbart signal", slik det anvendes her i dokumentet betegner evnen til å gjenkjenne en endring i en egenskap ved en reporter gruppe på en måte som gjør det mulig å detektere ligand-protein bindingen. I en utførelsesform omfatter for eksempel de muterte GGBP en detekterbar reporter gruppe der de detekterbare egenskaper endres ved en endring i proteinkonformasjonen som oppstår ved glukose binding. I en foretrukken utførelsesform er reporter gruppen en luminiscent markør som resulterer i et mutert GGBP med en affinitet for glukose som viser et detekterbart skift i luminiscens egenskapene ved glukosebinding. Endringen i de detekterbare egenskaper kan være forårsaket av en endring i omgivelsene til markøren bundet til det muterte GGBP.

Den luminiscente markør kan være en fluorescent markør eller en fosforescent markør. Anvendelse av fluorescente markører, som kan eksiteres til fluorescens ved eksponering for visse bølgelengder av lys er foretrukket.

I en utførelsesform er reporter gruppen en fluorofor. Slik det anvendes her i dokumentet betegner "fluorofor" et molekyl som absorberer en energi og deretter emitterer lys. Ikke-begrensende eksempler på fluoroforer nyttige som reporter grupper i følge oppfinnelsen inkluderer fluorescin, koumariner, rodaminer, 5-TMRIA (tetrametylrodamin-5-jodoacetamid), Quantum Red , Texas Red , Cy3, N-((2-jodoacetoksy)etyl)-N-metyl)amino-7-nitrobenzoksadiazol (IANBD), 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalen (akrylodan), pyren, Lucifer Yellow, Cy5, Dapoxyl<®>(2-bromacetamidoetyl)sulfonamid, (N-(4,4-difluor-l,3,5,7-tetrainetyl-4-bora-3a,4a-diaza-5-indacen-2-yl)jodoacetamid (Bodipy507/545 IA), N-(4,4-difluor-5,7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-N-jodoacetyletylendiamin (BODIPY<®>530/550 IA), 5-((((2-jodoacetyl)amino)etyl)amino)naftalen-l-sulfonsyre (1,5-IAEDANS), og karboksy-X-rodamin, 5/6-jodoacetamid (XRIA 5,6). Fortinnsvis anvendes IANBD. Mange detekterbare intrinsiske egenskaper til en fluorofor reporter gruppe kan følges for å detektere glukosebinding. Noen egenskaper som kan vise endringer ved glukose binding inkluderer fluorescens levetiden, fluorescens intensiteten, fluorescens anisotropi eller polarisering, og spekterskifte av fluorescens emisjon. Endringer i disse fluorofor egenskaper kan induseres av endringer i fluorofor omgivelsene slik som de som er et resultat av endringer i proteinkonformasjon. Miljø sensitive fargestoffer slik som IANBD er særlig nyttige i denne sammenheng. Andre endringer i fluorofor egenskaper kan være et resultat av interaksjoner med analytten selv eller av interaksjoner med en annen reporter gruppe, for eksempel når FRET (fluorescens resonans energi overføring) anvendes for å overvåke endringer i avstanden mellom to fluoroforer.

Selv om anvendelse av fluorescent markører foretrekkes, er det tiltenkt at andre reporter grupper kan anvendes. For eksempel kan elektrokjemiske reporter grupper anvendes der en endring i reporter miljøet gir opphav til en endring i redox tilstanden for denne. En slik endring kan detekteres for eksempel ved anvendelse av en elektrode.

Videre er det tiltenkt andre spektroskopiske detekterbare markører, for eksempel markører detekterbare av NMR (kjernemagnetisk resonans) kan anvendes.

Reporter gruppen kan kobles til det muterte protein eller GGBP ved en hvilken som helst konvensjonell fremgangsmåte kjent innen teknikken. For eksempel kan reporter gruppen kobles via aminer eller karboksylrester på proteinet. Imidlertid er kovalent kobling via tiol grupper på cystein rester spesielt foretrukket. For mutert GGBP er cysteiner i posisjon 11, posisjon 14, posisjon 19, posisjon 43, posisjon 74, posisjon 107, posisjon 110, posisjon 112, posisjon 113, posisjon 137, posisjon 149, posisjon 152, posisjon 213, posisjon 216, posisjon 238, posisjon 287 og posisjon 292 foretrukket i følge foreliggende oppfinnelse.

Enhver tiol reaktiv gruppe kjent innen teknikken kan anvendes for å koble reporter gruppene slik som fluoroforer til et cystein i det konstruerte eller muterte protein. Jodacetamid, bromacetamid eller maleimid er velkjente tiol reaktive grupper som kan anvendes i denne hensikt.

Fluoroforer som fungerer med lange eksiterings- og emisjonsbølgelengder (for eksempel cirka 600 nm eller større eksiterings- eller emisjonsbølgelengder) er foretrukket når molekylsensoren skal anvendes in vivo, for eksempel inkorporert i en implanterbar biosensor anordning (huden er ugjennomskinnelig under 600 nm). For tiden er det gå miljøsensitive prober tilgjengelig i dette området av spekteret og kanskje ingen med tiol reaktive funksjonelle grupper. Imidlertid kan tiol reaktive derivater av Cy-5 fremstilles for eksempel slik beskrevet av H.J. Gruber, et al, Bioconjugate Chem.,

(2000), 11,161-166. Konjugater inneholdende disse fluoroforer festes for eksempel ved forskjellige cystein grupper som finnes i muterte GGBP kan screenes for å identifisere hvilke som resulterer i den største endringen i fluorescens ved glukose binding. Muterte GGBP nyttige i følge foreliggende oppfinnelse kan konstrueres eller muteres til å ha en histidin merkelapp på proteinets N-terminale ende, C-terminale ende eller begge. Histidin fusjonsproteiner er bredt anvendt innen feltet molekylær biologi for å lette rensing av proteiner. Eksempler på merkelappsystemer frembringer proteiner med en merkelapp inneholdende cirka seks histidiner og fortrinnsvis forstyrrer ikke denne merkelappen bindingaktiviteten til det muterte GGBP.

Slik det anvendes her i dokumentet betegner "matriks" et hovedsakelig tredimensjonalt miljø som er i stand til å immobilisere, innesperre eller innkapsle minst et bindingsprotein i den hensikt å måle et detekterbart signal fra en ligand-protein interaksjon. Forholdet mellom bestanddelene i matriksen og bindingsproteinet inkluderer, men er ikke begrenset til, kovalente, ioniske og Van derWals interaksjoner og kombinasjoner av disse. Det romlige forhold mellom matriksen og bindingsproteinet inkluderer heterogen og homogen fordeling innenfor og/eller deler eller hele matriksvolumet. Matriksen kan omfatte organiske stoffer, uorganiske stoffer, glass, metall, plastikk eller kombinasjoner av disse. Matriksen legger til rette for bindingsprotein omformer elementkonfigurasjon som for eksempel kan inkorporeres i den distale enden av en fiber eller en annen svært liten invasiv probe som skal innføres i vev hos en pasient, for å muliggjøre en periodisk, kontinuerlig eller programmert avlesning hos pasienten. Informasjon fra omformerelementet til pasienten kan for eksempel frembringes ved telemetri, optikk, lyd eller andre teknikker kjent innen området, for eksempel som beskrevet i US 5,517,313, US 5,910,661, US 5,894,351, og US 5,342,789 så vel som i Beach, R.D., et al. IEEE Transactions on Instrumentation andMeasurement (1999) 48, 6, s. 1239-1245. Informasjon inkluderer elektriske, mekaniske og aktinisk stråling egnet for å oppnå analytt konsentrasjon eller endring i konsentrasjon etter behov.

I et aspekt i følge oppfinnelsen anvendes biosensoren for analytt måling in vivo. I dette aspekt innkapsles biosensoren i en matriks som deretter kan anvendes som en implanterbar anordning. Matriksen kan være av en hvilken som helst ønskelig form eller fasong inkludert en eller flere av runde skiver, sylinder, firkanter, nanopartikler, mikrosfærer, porøse polymerer, åpne celle skum, forutsatt at denne er permeabel for analytten. Matriksen forhindrer i tillegg lekkasje av biosensoren. Matriksen tillater lys fra optiske kilder eller en hvilken som helst annet lys respons til eller fra reporter gruppen å passere gjennom biosensoren. Når den anvendes i en in vivo applikasjon vil biosensoren bli eksponert for et hovedsakelig fysiologisk område av analytt og bestemmelsen eller deteksjonen av en endring i analytt konsentrasjonen vil være ønskelig, mens bestemmelse eller deteksjon inkluderer kontinuerlige, programmerte og periodiske deteksjonsmåter. Følgelig omfatter den angitte in vivo biosensor i følge foreliggende oppfinnelse minst et mutert bindingsprotein i en analytt permeabel innkapslings eller innsperringsmatriks slik at det muterte bindingsprotein frembringer et detekterbart og reversibelt signal når det muterte protein eksponeres for varierende analytt konsentrasjoner, og det detekterbare og reversible signal kan relateres til konsentrasjonen av analytten. Den implanterbare biosensor kan i noen utførelsesformer, implanteres inn i eller under huden til et pattedyrs grense mellom epidermis og dermis for å interagere med interstitsial væsken, vevet eller andre biologiske væsker. Informasjon fra implantatet til pasienten kan for eksempel frembringes ved telemetri, optiske metoder, lyd eller andre metoder kjent innen teknikken som beskrevet tidligere.

Fortrinnsvis fremstilles matriksen fra biokompatible materialer eller inkorporeres i materialer som er i stand til å minske skadelige reaksjoner i kroppen. Skadelige reaksjoner fra implantater inkluderer inflammasjon, protein begroing, vevsnekrose, immunrespons og lekkasje av toksiske materialer. Slike materialer eller behandlinger er velkjent og praktisert innen teknikken for eksempel slik beskrevet av Quinn, C.P.; Pathak, C.P.; Heller, A.; Hubbell, I.A., Biomaterials 1995, 75(5), 389-396, og Quinn, C.A.P.; Connor, R.E.; Heller, A., Biomaterials 1997, 18( 24), 1665-1670.

Biosensoren kan innkapsles i en matriks avledet hovedsakelig fra en hydrogel. Polymerdelen av hydrogelen kan inneholde funksjonalitet som er egnet for hydrogen binding eller kovalent binding (for eksempel hydroksyl grupper, amino grupper, eter bindinger, karboksylsyrer og estere og lignende) til enten proteinet eller reporter gruppen.

Mange hydrogeler kan anvendes i følge foreliggende oppfinnelse. Hydrogelene kan for eksempel være polysakkarider slik som agarose, dekstran, carragenan, alginsyre, stivelse, cellulose eller derivater av disse slik som karboksymetyl derivater eller vann-svellbare organiske polymerer slik som for eksempel polyvinyl alkohol, polyakrylsyre, polyakrylamid, polyetylenglykol, kopolymerer av styren og malein anhydrid, kopolymerer av vinyleter og malein anhydrid og derivater av disse. Derivater egnet for kovalente kryssbindingsnettverk er foretrukket. Syntese av biomedisinske og farmasøytiske applikasjoner av hydrogeler omfattende polypeptider er blitt beskrevet av et antall forskere (se for eksempel "Biosensors Fundamentals and Applications", utg. av A.D.F. Turner, I. Karube og G.S. Wilson; publisert fra Oxford Universitu Press, i 1988). Et eksempel på hydrogel matriks avledet fra en vannløselig, UV-kryssbindingspolymer omfatter poly(vinyl alkohol), N-metyl-4(4'-formylstyryl)pyridinium metosulfatacetal (CAS Reg. No. [107845-59-0] tilgjengelig fra PolyScience Warrington, PA.

Innkapslingsprosessen kan tilsettes en eller flere hydrogeler i vann til det muterte bindingsprotein i en vandig bufferløsning med pH i området fra cirka 4 til cirka 10 avhengig av proteinet. Ytterligere behandling av matriksen for eksempel kryssbinding, frembringer en fysisk form. Ved anvendelse av denne teknikken og en konvensjonell fremstillingsprosess (for eksempel blokk støping, revers emulsjonspolymerisering, "screen eller kontakt printing", belegging i fluidisert bad og dypping eller spinn belegging) kan man oppnå matrikser i ulike utforminger (for eksempel granulat, nanopartikler, mikropartikler, monolitter og tykke og tynne filmer) egnet for in vitro og in vivo anvendelse.

I en utførelsesform kan matriksen omfatte modifiserte sol-geler. Modifiserte sol-geler inkluderer minst delvis herdede (eller fortykkede) tilberedninger som omfatter permeable metalloksid glasstrukturer inneholdende i tillegg til sol-gel forløpermaterialer, fortrinnsvis en eller flere organiske komponenter som kondenserer hydrolyttisk sammen med sol-gel forløperen slik at den dannede sol-gel matriks får egenskaper for eksempel egnet for implantering. Egnede egenskaper inkluderer lav volumsskrumping over tid, motstand mot rift eller andre fysiske defekter, opprettholdelse av proteinfunksjon og kompatibilitet med proteinet og/eller reporter gruppen, og kompatibilitet med dyret eller individet til hvilket det skal implanteres. Egnede organiske materialer inkluderer polyoler slik som glyserol, etylen glykol, propylen glykol, polyetylen glykol, og lignende, for eksempel slik beskrevet av Gill og Ballesteros Journal of the American Chemical Society 1998, 720(34), 8587-8598. Det skal forstås at disse fagpersonene kan oppfatte egenskapene beskrevet men er vanligvis ikke forutsigbare for en gitt protein/sol-gel/reporter gruppe kombinasjon, følgelig kan optimalisering av sol-gel forløperen, den organiske komponent og protein løsningsmaterialer forventes for ethvert gitt bindingsprotein-reporterpar. Det er funnet i følge foreliggende oppfinnelse at slik optimalisering kan frembringe uventede øket signal, endring i bindingskonstant; forbedret fysikalsk utøvelsesegenskaper av matriksen og kombinasjoner av disse i forhold til andre matrikser eller vandige løsninger av disse. Optimalisering av ytelsesegenskaper til protein-reporterparet og funksjonelle ytelsesegenskaper til innkapslingsmatriksen kan oppnås for eksempel ved å kombinere metoder eller andre statistikkbaserte designmetoder kjent innen teknikken. Sol-gel matrikser nyttige i følge foreliggende oppfinnelser inkluderer materialer tilberedt ved konvensjonelle velkjente sol-gel metoder og inkluderer uorganiske materiale, organiske materialer eller blandinger av organiske og uorganiske materialer. Materialene som anvendes til å produsere sol-gelen kan inkludere, men er ikke begrenset til, aluminater, aluminiumsilikater og titanater. Disse materialene kan forsterkes med de opprinnelige modifiserte silikater, (ormosiler) og funksjonaliserte siloksaner, for å frembringe en aveny av tildelene og manipulerende hydrofilisitet og hydrofobisitet, ioneladning, kovalent festing av proteiner og lignende. Slik det anvendes her i dokumentet angir betegnelsen "hydrolyttisk kondenserbart siloksan" sol-gel forløpere med totalt fire substituenter, minst en, fortrinnsvis to, og helst tre eller fire av substituentene er alkoksy substituenter kovalent bundet til silikon gjennom oksygen og blandinger av disse. I tilfelle av tre, to eller en alkoksy substituent forløper, er minst en av de gjenværende substituenter fortrinnsvis kovalent bundet til silikon gjennom karbon og gjenværende substituenter inneholder en organisk funksjonalitet utvalgt fra alkyl, aryl, amin, amid, tiol, cyano, karboksyl, ester, olefin, epoksy, silyl, nitro og halogen.

Innkapslingsprosessen kan være en eller flere av hydrolyttisk kondenserbare siloksan hydrolysert i vann, enten spontant eller under syre eller base katalysator for å danne derivater med en organisk polyol komponent tilstede i en molar mengde i forhold til det hydrolyttisk kondenserbare siloksan opptil cirka 10:1 til 1:10, fortrinnsvis cirka 5:1 til 1:5, og helst cirka 1:1. Til denne blandingen tilsettes, før endelig gel dannelse, det muterte bindingsprotein i en vandig bufferløsning med en pH i området fra cirka 4 til cirka 10 avhengig av proteinet. I det minste partielle kondenseringsreaksjoner gir opphav til de endelige matrikser.

Videre kan den hydrolytisk kondenserbare siloksan hydrolysert i vann blandes, enten spontant eller under syre eller base katalysator for å danne derivater med organiske polyoler, med en vannløselig polymerkomponent. Egnede vannløselige polymerer inkluderer polyvinyl alkohol (PVA), poly-(maleinsyre ko-olefin) natriumsalt (PMSA), poly-(vinylsulfonsyre) natriumsalt (PVSA), og polyvinyl pyrrolidon (PVP). Poly-(maleinsyre ko-olefin) inkluderer kopolymerer av malein anhydrid med styren, vinyl eter og C1-C8 ole finer og salter av disse, for eksempel natrium, kalium, ammonium, tetraalkylammonium og lignende. Den vannløselige polymerkomponent er fortrinnsvis fra 0 til cirka 30 vekt% av sol-gel sammensetningen.

Videre blandes den hydrolytisk kondenserbare siloksan hydrolysert i vann, enten spontant eller under syre eller base katalysator for å danne derivater med organisk polyol, med en eller flere funksjonaliserte siloksan additiver (FSA) i mengder fra 0 til cirka 0.6 mol % i forhold til hydrolytisk kondenserbart siloksan. Eksempler på FSA inkluderer alkyl derivater: for eksempel metyltrimetoksysilan (MTMOS): amin derivater: for eksempel 3-aminopropyl trietoksysilan (ATEOS): og bis silan derivater: for eksempel (bis(3-metyldimetoksysilil)propyl) polypropylen oksid (BIS).

Videre kan både den vannløselige polymer komponent og det funksjonaliserte silikon additiv med det hydrolytisk kondenserbare siloksan hydrolysert i vann blandes, enten spontant eller under syre eller base katalysator for å danne derivater med organisk polyol, for å frembringe en matriks egnet for innkapsling eller innesperring av bindingsproteinet. Ved anvendelse av de tidligere nevnte sol-gel teknikker og en konvensjonell fremstillingsprosess (for eksempel blokk støping, revers emulsjonspolymerisering, "screen eller kontakt printing", belegging i fluidisert bad og dypping eller spinn belegging) kan man oppmå aerogel- eller xerogel matrikser i ulike konfigurasjoner (for eksempel granulater, nanopartikler, mikropartikler, monolitter og tykke eller tynne filmer) egnet for anvendelse in vitro og in vivo.

Matriksen kan også dannes av dialysemembraner. Dialysemembranene kan konstrueres til fysisk å innkapsle eller fengsle proteinet. Kovalent binding til membranen avsees innenfor rammen av den beskrevne utførelsesform. Membranen bør velges basert på molekylvekts "cut-off' slik at analytten av interesse enkelt kan trenge gjennom membranen mens høymolekylære materialer vil bli hindret fra å trenge gjennom, eller i tilfellet for de muterte bindingsproteiner, forlate membranmatriksen. Den nødvendige molekylvekts cut-off vil være slik at de møter de tidligere nevnte krav og er innenfor det som er kjent innen dette fagområdet. Typisk er membraner med en molekylvekts cut-off mellom cirka 1000 til cirka 25,000 Dalton egnet. Ved anvendelse av denne teknikken kan matrikser i ulike utforminger og fasonger egnet for anvendelse in vitro og in vivo tilberedes.

Det er også overveiet at matrikser inneholdende bindingsproteinet og reporter gruppen kan være kombinasjoner av en eller flere hydrogel, sol-gel og dialysemembraner. For eksempel kan et protein innkapslet eller innesluttet i en hydrogel eller sol-gel plasseres i en dialysemembran av en egnet fasong og størrelse så vel som egnet for implantering i et individ, eller for å manipulere massetransport egenskaper eller permeabiliteten til analytten i matriksen.

Matriks innkapslede eller innesperrede bindingsprotein biosensorer i følge oppfinnelsen er i stand til å måle eller detektere mikromolare (IO"<6>molar) til molare analytt konsentrasjoner uten forbruk av reagens. I noen utførelsesformer kan sensitiviteten til analytten gjøre biosensoren i stand til å anvendes for å måle lave analytt konsentrasjoner kjent for å være tilstede i lave prøvevolum av interstitsiell væske. Implanterbare biosensorer kan, i noen utførelsesformer, implanteres i eller under huden til et pattedyrs forbindelse mellom epidermis og dermis og interagere med interstitsiell væsken, vevet eller andre biologiske væsker. Bindingsprotein biosensorene i følge oppfinnelsen frembringer metoder for å kontrollere analytten kontinuerlig, periodisk eller "etter behov" slik det vil være hensiktsmessig for bruker eller for behandlingen av en tilstand.

I andre utførelsesformer er sensitiviteten av biosensoren for analytten (for eksempel glukose) slik at de kan anvendes for å teste blodanalytt nivåene eller konsentrasjonen av analytten i en biologisk løsning eller annen løsning kan bestemmes. "Biologisk løsning" slik det anvendes her i dokumentet inkluderer, men er ikke begrenset til, blod, svette og/eller øyevæske eller interstitsial væske og kombinasjoner av disse.

EKSEMPLER

De følgende eksempler illustrerer visse foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, men er ikke tilsiktet å være illustrerende for alle utførelsesformer. Mutert maltose bindingsprotein S337C MBP merket med fluorofor reporter proben NBD er anvendt i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Cass, A. et al, ( Anal. Chem. 1994, 66, 3840-3847). Fluorescens emisjonsspekteret til det muterte merkede protein ble målt ved anvendelse av et SLM Aminco Fluorimeter (Ontario, Canada) med spalteinnstilling på 8 og 4 for eksitasjon og innstilling på 5 og 5 på MC250 emisjons monokromator for å sammenligne ligandbinding ytelsen til de innkapslede fluorofor merkede proteiner i ulike matrikser i forhold til ytelsen av de samme proteiner i løsning. Den initielle fluorescens emisjonsintensitet defineres som Io. Det relative forholdet mellom emisjonsintensitet maksima ved tilstedeværelse av proteinets respektive ligand (If) i forhold til fravær av ligand (Io) er definert som AF.

Bindingskonstanten ble bestemt ved titrering med økende konsentrasjoner av glukose i en proteinløsning med blanding etter hver tilsetting av glukose. Spalte innstillingen var som beskrevet ovenfor. BQ ble bestemt ut fra det følgende forhold slik det er tilpasset fra Pisarchick and Thompson (1990): der F er fluorescens intensitet, Finfer fluorescens ved uendelig, F0er fluorescens ved null glukose, og x er fri konsentrasjon av glukose ([Glc]fn) slik det bestemmes ved forholdet:

der [Glc]tot og [Pro]tot er de totale konsentrasjoner av henholdsvis glukose og protein.

EKSEMPEL 1: Dette eksempel beskriver fremgangsmåte for ekspresjon og rensing av mutante proteiner uten histidin merkelapper. GGBP kodes av MglB-1 genet i E. coli. Dette proteinet ble endret ved å introdusere aminosyren cystein ved ulike posisjoner gjennom sete dirigert mutagenese av MglB-1 genet. Disse proteinene ble deretter uttrykt i E. coli og renset.

Kassett mutagenese av MglB-1 ble utført som følger. Villtype Mg 1B-1-genet ble klonet inn i en pTZ18R-vektor (Dr. Anthony Cass, Imperial College, London, England). Mutante plasmider ble dannet fra dette moderplasmid ved anvendelse av kassett mutagenese som frembringer randomiserte aminosyre sekvenser, hovedsakelig som beskrevet av Kunkel (1991) og klonet i E. coli JM109 (Promega Life Science, Madison, WI). Mutante plasmider ble identifisert ved sekvensering. Det mutante protein ble indusert i JM109 og renset som beskrevet nedenfor. En E. coli JM109-koloni inneholdende det mutante plasmid ble dyrket over natten ved 37°C med risting (220 rpm) i LB-næringsløsning inneholdende 50 ug/mL ampicillin (LB/Amp). Kulturen som var dyrket over natten ble fortynnet 1:100 i IL friskt LB/Amp og inkubert ved 37°C med risting inntil OD600 i kulturen var 0.3-0.5. Ekspresjon av mutanten ble indusert ved tilsetting av 1 mM IPTG (Life Technologies, Gaithersburg, MD) sluttkonsentrasjon med fortsatt inkubasjon og risting ved 37°C i 4-6 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugering (10,000 x g, 10 min, 40°C).

Det mutante protein ble høstet ved osmotisk sjokk og ble renset ved kolonne kromatografi. Celle pelleten ble resuspendert i en sukrose buffer (30 mM Tris-HCL, pH 8.0, 20% sukrose, 1 mM EDTA), inkubert ved romtemperatur i 10 minutter og deretter sentrifugert (4000 x g, 15 min, 4°C). Supernatanten ble helt av og oppbevart på is. Celle pelleten ble resuspendert og 10 mL iskald steril deionisert H2O ble tilsatt og suspensjonen ble inkubert på is og sentrifugert. Den gjenværende supernatant ble samlet med de andre samlede supernatanter og sentrifugert en gang til (12,000 x g, 10 min, 4°C). Det sjokkbehandlede samlede supernatant ble filtrert gjennom 0.8 um og deretter et 0.45 (im filter. Streptomycin sulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 5% vekt/volum ble tilsatt supernatanten og omrørt i 30 minutter etterfulgt av sentrifugering (12,000 x g, 10 min, 4°C). Det sjokkbehandlede supernatant ble deretter konsentrert ved anvendelse av Amicon Centriprep 10 (10,000 MWCO)-filtere (Charlotte, NC) og dialysert over natten mot 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM MgCl2. Det dialyserte supernatant ble sentrifugert (12,000 x g, 30 min, 4°C). Den resulterende supernatnat ble satt på en på forhånd ekvilibrert DEAE Fast Flow Sepharose kolonne (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ved 0.5 mL/min. Kolonnen ble vasket med 5-10 kolonne volumer. En lineær gradient fra 0-0.2 M NaCl ble påsatt kolonnen og fraksjonene ble samlet. Fraksjonene inneholdende det mutante protein ble identifisert ved SDS-PAGE med Coomassie Brilliant Blue-farging (molekylvekt cirka 32 kDa). Fraksjonene ble samlet og dialysert over natten (4°C) mot fosfat bufret saltvann (PBS) eller 10 mM ammonium bikarbonat (pH 7.4), konsentrert ved anvendelse av Amicon Centriprep 10-filtere og lagret ved 4°C eller -20°C med glyserol. Det ammonium bikarbonat dialyserte protein ble lyofilisert.

EKSEMPEL 2: Dette eksempelet beskriver ekspresjon og rensing av mutante GGBP inneholdende histidin merkelapper. GGBP mutanter ble konstruert ved enten sete-dirigert mutagenese eller kassett mutagenese. Sete-dirigert mutagenese (QuikChange, Stratagene, La Jolla, CA) ble utført for å endre enkelt aminosyrer i pQE70-vektoren ved å erstatte en aminosyre med en annen, spesielt valgte aminosyrer. Kassett mutagenese metoden (Kunkel) ble utført for å randomisere aminosyrer i et spesielt område av GGBP-genet. De mutagenerte kassetter ble deretter subklonet inn i pQE70-ekspresjonsvektoren. pGGBP-His-plasmidet som inneholdt GGBP-genet klonet inn i pQE70-ekspresjonsvektoren (Qiagen, Valencia, CA). Dette konstruktet plasserer seks histidin rester på den C-terminale ende av GGBP-genet. E. coli stammen SG 13009 ble anvendt for å overuttrykke mutant GGBP-His etter standard prosedyrer (Qiagen). Etter overekspresjon i en 250 mL kultur ble cellene samlet ved sentrifugering (6000 rpm) og resuspendert i 25 mL "bugbuster" (Novagen, Madison, WI). 25 mg lysozym ble tilsatt ly såtet og blandingen ble forsiktig blandet ved romtemperatur (RT) i 30 minutter. Klart ly sat ble fremstilt ved sentrifugering (6000 rpm) og til dette ble 0.5 ml imidizol (IM) og 3 ml Ni-NTA-kuler (Qiagen) tilsatt. Etter 30 minutters forsiktig blanding ved RT, ble blandingen sentrifugert (6000 rpm) og lysatet fjernet. Kulene ble vasket med 25 ml løsning (IM NaCl, 10 mM tris, pH 8.0) og sentrifugert om igjen. Det mutante GGBP- His ble eluert fra kulene ved å tilsette 5 mL løsning (160 mM imidazol, IM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0) og blanding i 15 minutter. Proteinløsningen ble umiddelbart filtrert gjennom en Centriplus YM-100 filter (Amicon, Charlotte, NC) og deretter konsentrert til 1-3 mg/ml ved anvendelse av et Centriplus YM-10filter. Proteinet ble dialysert over natten mot 2L lagringsløsning (IM NaCl, 10 mM Tris, 50 mM NaP04, pH 8.0).

EKSEMPEL 3: Dette eksempel beskriver generelt merking av bindingsprotein med reporter probe. En alikvot av mutant GGBP inneholdende cystein (4.0 nmol) i PBS ble behandlet med 2 mM ditiotreitol (5 uL, 10 nmol) i 30 minutter. En stamløsning av N,N'-dime1yl-N-(jodacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-l,3-diazol-4-yl)etylendiamin (IANBD amid, 0.5 mg) ble tilberedt i DMSO (100 uL, 11.9 mM) og 3.36 uL (40 nmol) ble tilsatt proteinet. Reaksjonen fikk gå ved romtemperatur i 4 timer på en Dynal rotamix i mørket. Merket protein ble renset ved gel filtrering på en NAP-5 kolonne (Amersham Pharmacia). Merkingsforholdene ble bestemt ved anvendelse av en estimert ekstinksjons koeffisient (50 mM"<1>cm"<1>) for GGBP som ble beregnet i Gene Works 2.45 (IntelliGenetics),6478(IANBD amid) = 25 mM"<1>cm"<1>), og en måling av O.D. for en standard løsning av IANBD amin ved 280 nm og 478 nm. Fargekonsentrasjonen i proteinet ble beregnet som Cdye= A^g^s- Absorbansen av proteinet ved 280 nm ble beregnet som Aprot(280)<=>Atotai(280) - Adye(280), der Adye(280)<=>A478x (A28o/A47s)dye sta-Konsentrasjonen av proteinet ble deretter Cprot(280) = Aprot(280)/e28o. Figur 1 illustrerer endringen i fluorescens respons for glukose konsentrasjonen av et representativt eksempel, A213C/L238C NBD amid GGBP H6i løsning. Tabell 1 oppsummerer endringen i fluorescens for ulike GGBP mutanter merket med reporter grupper, inkludert reporter grupper med enten eksitasjons- eller emisjonsmaksimum på minst 600 nanometer. Tabell 2 oppsummerer endringen i fluorescens, og de bestemte Kdverdier til mutasjoner av en, to, tre og fire aminosyre substitusjoner. Disse data viser tydelig at mutasjoner av GGBP merket med en reporter gruppe kan frembringe ønskede egenskaper som glukose biosensorer. Dataene viser mutasjon-reporter gruppe forholdet for prøvene som er testet.

<1>AF fra 0 til 1 mM Gle ved 0.5 mM [fargestoff]

2 BQ målt ved 0.1 mM [fargestoff]

3 AF målt fra 0 til 100 mM Gle

4 AF målt fra 0 til 10 mM Gle

<5>Estimat; Sigma Plot beregningene konvergerte ikke

6 Estimat; kurven nådde ikke metning

EKSEMPEL 4: Dette eksempel beskriver immobilisering av en biosensor i følge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av glyserol modifisert silikat kondensat (GMSC). Tilsettinger av glyserol modifisert silikat kondensat (GMSC). Tilsetting av glyserol direkte etter den initielle tetraetoksyortosilikat (TEOS) eller tetrametoksyortosilikat (TMOS) syre hydrolyse. Et område av hydrolyse tider, pH-nivåer, reagens tilsetningsrekkefølge og TEOSrglyserol forhold ble evaluert for å bestemme de optimale betingelser for å starte glyseringsreaksjonen. Foretrukne betingelser ble funnet ved anvendelse av et intervall på 10 til 30 minutter mellom hydrolyse og glyserol tilsetting, et pH-område mellom 0.5 og 1 og et 1:1 mol forhold mellom TEOS og glyserol. Det følgende beskriver en modifisert prosedyre av Gill og Ballesteros for en TEOS-basert glyserol modifisert silikat kondensat (GMSC)-tilberedning ved anvendelse av de følgende reagensforhold: TEOS eller TMOS:l; H-20:l, metanol:4, glyserol: 1. TEOS eller TMOS i metanol ble tilsatt en flaske og nedkjølt til 0°C over is. Deretter ble 0.6M HC1 tilsatt dråpevis til løsningen. Etter 20 minutters omrøring ble glyserol tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble langsomt varmet opp i løpet av 1-2 timer til 20-25°C. Deretter ble reaksjonsbeholderen oppvarmet ytterligere og opprettholdt ved en temperatur i området 60-70°C under nitrogen i mellom 36 og 42 timer. Det optimale tidsrommet var 40 timer. Ufullstendig glyserering ble antydet ved en observerbar fase separasjon for reaksjoner stoppet før 36 timer. Reaksjoner fortsatt utover 42 timer frembrakte GMSC sol-gel-monolitter med kraftig reduserte fysikalske egenskaper, for eksempel økt sprøhet. Etter de 40 reaksjonstimene ved 60-70°C ble løsningsvolumet redusert ved rotasjonsfordamping inntil den ble viskøs og gjennomskinnelig, ved hvilket tidspunkt metanol ble tilsatt til løsningen i et 4:1 forhold basert på vekt. Denne GMSC-løsning ble vist å være stabil og frembrakte konsistente resultater over flere måneder når den ble lagret ved frysetemperaturer. Når GMSC-løsningen skulle benyttes ble metanol fjernet ved rotasjonsfordamping og destillert vann ble tilsatt i et 1:1 forhold basert på vekt i forhold til GMSC-reagens for å katalysere den endelige hydrolyse/gel dannelse. Monolitter, tynn film og pulvere ble dannet ved denne fremgangsmåten ved anvendelse av hensiktsmessige beholdere som fungerte som en støpeform. GMSC sol-gel-monolittene var ikke sprø og hadde en skrumpning på cirka 8% etter herding ved 4°C ved 50% relativ fuktighet i 2 uker (% skrumping var gjennomsnitt av endring i diameter og lengde målt med en mikromåler og sammenlignet med de opprinnelige dimensjoner). Elektron mikroskopi (SEM) illustrerer videre de betydelige forbedringer i overflate frakturering mellom monolitter dannet ved TEOS-hydrolyse og monolitter dannet ved GMSC-fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Dette sett av eksperimenter viser hvordan sol-geler med forbedrede fysikalske egenskaper kan fremstilles i følge fremgangsmåtene beskrevet i følge oppfinnelsen.

EKSEMPEL 5: Dette eksempel beskriver ytterligere optimalisering av fysikalske egenskaper ved GMSC sol-geler der glyserol delvis er substituert med enten etylenglykol (EG) eller polyetylenglykol (PEG). Etylenglykol (EG) ble evaluert som en erstatning for glyserol i blandinger når forholdet mellom glyserol og EG ble variert men mol forholdet mellom totalt glyserol og EG ble bibeholdt konstant i forhold til andre reagenser. Sol-gel-monolitter ble tilberedt ved fremgangsmåten beskrevet i det foregående eksempel, herdet over to uker ved 4°C og 50% relativ fuktighet og deres skrumpingsprosent ble bestemt som vist i tabell 3. Prosentvis skrumping defineres som gjennomsnittet av reduksjon i lengde og diameter i forhold til de opprinnelige dimensjoner. Monolitter anvendt for bestemmelse av skrumping hadde ikke protein/fluorofor tilstede. For F-målinger ble prøvene listet i tabell 1 tilberedt inneholdende Hl52 GGBP-H6 NBD (fra eksempel 3) som beskrevet nedenfor.

1% og 5% EG/GMSC sol-geler (henholdsvis nr 5 og 6 i tabell 3) ble funnet å ha betydelig mindre prosentvis skrumping enn både rene TEOS sol-geler eller GMSC modifisert TEOS sol-geler (henholdsvis nr 2 og 3 i tabell 3 ovenfor). Polyetylenglykol (PEG) ble også evaluert kvantitativt som et partielt substitutt for glyserol i tilsvarende andeler i GMSC sol-geler og frembrakte monolitter med foretrukne overflate egenskaper og gummi lignende fleksibilitet. Oppsummert frembrakte delvis substitusjon av enten etylenglykol (EG) eller polyetylenglykol (PEG) for glyserol i GMSC sol-geler forbedringer i fysikalske egneskaper, for eksempel minsket skrumping og redusert overflatebrudd. Disse sol-gel matrikser inneholdende bindingsprotein ble funnet å inneha ytelse tilsvarende eller bedre enn det for protein i løsning.

EKSEMPEL 6: Innkapsling av bindingsprotein i GMSC sol-geler inneholdende funksjonaliserte silikon additiver (FSA) og polymerer. Dette eksempelet beskriver tilsetting av polymer og organiske polyol additiver for å optimalisere GMSC sol-geler for innkapsling av bindingsproteiner for både å opprettholde og økt deres spekter egenskaper ved ligand binding. Bindingsproteinene ble merket med en fluorofor (som beskrevet i eksempel 3). Proteinløsningene ble tilsatt under det endelige hydrolyse/gel dannings trinnet beskrevet tidligere for å frembringe sluttkonsentrasjoner på 2-4 uM protein i sol-gelen. Polymer additivene og de funksjonaliserte silikon additiver (FSA) ble skaffet fra Sigma Aldrich Chemicals (St. Louis, MO). Polymer additivene ble undersøkt i mengde mellom 0 og 30 vekt%. FSA ble undersøkt som additiver til GMSC sol-gelene i mengder fra 0 til cirka 0.6 % mol forhold. Følgelig rotasjonsfordamping av GMSC-reagenset for å fjerne metanol fra dens lagringsløsning ble etterfulgt av rekonstituering i vann i et 1:1 vektforhold. Til 400 uL alikvot av denne blandingen ble 800 uL buffer (HEPES, PBS eller Tris) med en forblandet vannløselig polymer additiv tilsatt sammen med en hvilken som helst FSA-modifisert GMSC. Et mutert bindingsprotein i løsning ble deretter tilsatt, og etter grundig blanding ble 100 uL av blandingen utporsjonert i en 96-brønns mikrotiter plate (Falcon med flat bunn, produkt # 35-3941, BD Labware, NJ). Sol-gel inneholdende mikroplater ble herdet 12-18 timer ved 4°C og 50% relativ fuktighet. GMSC-BIS ble tilberedt ved samme prosedyre som TEOS-basert GMSC, men (Bis(3-metyldimetoksysily)propyi) polypropylenoksid erstattet TEOS. GMSC-MTMOS og GMSC-ATEOS ble tilberedt på samme måte med unntak av at hydrolysen ble utført enten med 10% syre eller ingen syre i hydrolysetrinnet, sammenlignet med den TEOS-baserte GMSC-prosedyren. Fluorescens emisjon ble målt med et Varian Cary Eclipse scanning fluorometer med mikrobrønns plateadapter (Varian Instruments, Victoria, Australia). Eksiteringen var ved 475 nm og emisjon ble registrert fra 500 til 600 nm hvilket typisk registrerer maksimal emisjons fluorescens. Spaltebredden var 5 nm for eksitering og 10 nm for emisjon. Individuelle Io-bestemmelser ble utført for hver brønn og 100 uL av en ligand løsning (1 mM maltose i tilfellet S337C MBP) ble tilsatt og If avlesning ble oppnådd, fira hvilket AF verdiene ble beregnet. De modifiserte sol-gel innkapslede proteiner viste høyere initiell fluorescens (Io) i fravær av ligand sammenlignet med like konsentrasjoner av samme protein i løsning. Figur 2 viser fluorescens emisjonen før og etter glukose tilsetting for GGBP Hl52 His6 NBD i den H152-optimaliserte sol-gel og i løsning. Io-spekteret for hvert eksperiment ble normalisert til et maksimum på 1.0. Figuren viser cirka 2-3 ganger forsterkning av AF oppnådd for optimaliserte sol-gel matrikser inneholdende bindingsprotein når disse ble utsatt for analytt sammenlignet med proteinet i løsning. Følgelig ble en økning av AF observert etter optimalisering av sol-gel formuleringene for hvert protein. Det bør bemerkes at emisjons maksimum ble endret for sol-gel innkapslet protein-reporter gruppe prøver i forhold til løsning. I tillegg frembrakte disse modifiserte sol-gel matrikser forbedrede fysikalske egenskaper slik det vises for nr 4 i tabell 3. Tabell 4 viser et omtrentlig område for komponenter i formuleringene som gir en forbedret respons for hvert av de enkelte proteinene som ble undersøkt.

Fomulerings optimaliserings eksperimentene beskrevet ovenfor anvendte "Design-Expert 6.0.5" (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) for å designe ulike eksperiment design (DOE). Blant andre variable i formuleringen som ble optimalisert for hver DOE var buffertype (HEPES, PBS og Tris) og pH (fra 6.6 til 7.8). Overraskende var de optimale formuleringsbestanddeler og konsentrasjonsområder svært forskjellig for hvert protein. I alle tilfeller ble imidlertid vesentlig ytelsesforbedringer oppnådd for de optimaliserte formuleringer sammenlignet med enten ytelse i løsning eller ytelse i umodifiserte sol-geler.

EKSEMPEL 7: Dette eksempel beskriver innkapsling av GGBP H152C i UV kryssbundede hydrogel matrikser og effekten av matriksen på fluorescens endringen og bindingsaffiniteten. I dette eksperiment ble SbQ-PVA fra Polysciences Inc. tilsatt 100 ul av PBS-buffer og blandet i en time for omrøring i en rotary mixer. 80 ul av denne løsningen ble deretter blandet med 20 (il av merket protein. Sluttproteinkonsentrasjonen ble bestemt spektroskopisk til å være 0.15 mg/ml. Etter blanding ble alikvoter utporsjonert på 96-brønns plater og tørket i et kammer opprettholdt ved 20% luftfuktighet i 12 timer etterfulgt av herding med UV-lys. Brønner inneholdende protein innkapsles i matrik ble utfordret med 2 (il 10 mM glukose og sammenlignet med proteinløsning uten matriks med tilsvarende proteinmengde. Figur 3 viser evnen til det muterte protein matriks har til å respondere ovenfor analytten på en måte, og med en sensitivitet, ekvivalent med den oppnådd i løsning. IQ for det innkapslede protein ble sammenlignet med det oppnådd i løsning.

EKSEMPEL 8: Dette eksempel beskriver immobilisering av biosensor i følge foreliggende oppfinnelse på en dialysemembran matriks og evnen denne matriks har til å frembringe reversible og kontinuerlige avlesninger. Ved anvendelse av et "Varian Eclipse fluorimeter" med en fiberoptisk tilkobling, GGBP L238C/A213C protein (2 uM i PBS buffer) innkapslet med en dialysemembran med en molekyl cut-off på 3500 Dalton påmontert den distale ende av fiberen. Løsninger ble tilberedt inneholdende PBS-buffer, 2 mM og 20 mM glukose i PBS-buffer. Med proben i PBS-løsning ble avlesninger registrert ved 0.02 sekunders intervall for emisjonsbølgelengde 521 nm, etterfulgt av innføring av fiberen i glukose løsningene. Forflytning av fiberen til kun bufferløsning resulterte i at signalet ble returnert til det initielle signal. Figur 4 viser flere sykluser som alternerer mellom buffer og glukose løsninger hvilket viser reversibiliteten til biosensoren innkapslet i en permeabel matriks innenfor fysiologiske områder. Tilsvarende resultater ble observert med sol-gel innkapslede prøver hvilket viser anvendbarhet for kontinuerlig anvendelse.

Claims

1. Glukose biosensor,karakterisert vedat den omfatter: minst et mutert glukose/galaktose bindingsprotein (GGBP) og minst én luminescens-reportergruppe (luminescens merke) kovalent festet dertil, hvor nevnte minst én luminescens-reportergruppe er i stand til å tilveiebringe et detekterbart og reversibelt signal som respons på binding til nevnte mutant GGBP og hvor nevnte muterte GGBP har minst en aminosyresubstitusjon av en ikke-reaktiv aminosyre med en reaktiv aminosyre som kan modifiseres med et merkingsmiddel analog til merkingen av cystein med en tiol reaktiv farge og nevnte muterte GGBP bindes til glukose og er innkapslet i en analytt-permeable matrix omfattende sol-geler forsterket ("augmented") med organisk modifiserte silikater eller kovalente kryssbundne hydrogeler eller en kombinasjon derav.

2. Biosensor i følge krav 1,karakterisert vedat luminescens-reportergruppen er et fluorescens merke eller et fosforescens merke.

3. Biosensor i følge krav 1 eller 2,karakterisert vedat nevnte aminosyresubstitusjon er valgt fra et cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cystein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 152, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 236, og et cystein i posisjon 296 korresponderende til aminosyreposisjonene til E. coli GGBP.

4. Biosensor i følge krav 3,karakterisert vedat nevnte aminosyresubstitusjon er valgt fra et cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cystein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 152, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 236, og et cystein i posisjon 296 av E. coli GGBP.

5. Biosensor i følge krav 3,karakterisert vedat Den omfatter minst to aminosyresubstitusjoner valgt fra et cystein i posisjon 112 og et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 152 og et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 152 og et serin i posisjon 213, et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et treonin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et leucin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et tyrosin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et asparagin i posisjon 223, et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 256, et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 256, et cystein i posisjon 152 og et arginin i posisjon 213, et cystein i posisjon 152 og et asparagin i posisjon 223, og et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 255 av E.coli GGBP.

6. Biosensor i følge krav 3,karakterisert vedat den omfatter minst tre aminosyresubstitusjoner valgt fra et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et asparagin i posisjon 223; og et cystein i posisjon 149, et asparagin i posisjon 223 og et arginin i posisjon 256 av E.coli GGBP.

7. Biosensor i følge krav 3,karakterisert vedat den omfatter minst fire aminosyresubstitusjoner valgt fra et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; og et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 213 og et serin i posisjon 238 av E.coli GGBP.

8. Biosensor i følge et hvilket som helst av kravene 3 til 7, karakteri sert ved at nevnte bindingsprotein ytterligere omfatter minst et histidin merke.

9. Biosensor ifølge krav 1,karakterisert vedat (i) nevnte luminescens merke har en eksitasjonsbølgelengde på mer enn omtrent 600 nanometer; eller (ii) nevnte luminescens merke har en emmisjonsbølgelengde på mer enn omtrent 600 nanometer; eller (iii) nevnte luminescens merke er kovalent koblet til nevnte minst ene glukose/galaktose bindingsprotein ved reaksjon med et medlem valgt fra fluorescein, coumariner, rhodaminer, tetrametylrhodamin-5-jodacetamid (5-TMRIA), R-fykoerytrin bundet til (9-(2-(eller 4)-(N-2-maleimidyletyl)-sulfonamidyl)-4(eller 2)-sulfofenyl)-23,6,7,12,13,16,17-oktahydro-(lH,5H,llH,15H-xanteno(23,4-ij:5,6,7-i'j')dikinolizin-18-ium salt (Quantum Red™), 9-(2(eller 4)- (N-(2-maleimidyletyl)-sulfonamidyl)-4(eller 2)-sulfofenyl)-2,3,5,7i,12,13,16,17-oktahydro-(lH,5H,llH,15H-xan-teno(2,3,4-ij: 5,6,7-i'j')dikinolizin-18-ium salt (Texas Red™), 2-(5-(l-(6-(N-(2-maleimidyletyl)-amino)-6-oksoheksyl)-1,3-dihyro-3,3-dimetyl-5-sulfo-2H-indol-2-yliden)-1,3-propyldienyl)-l-etyl-3,3-dimetyl-5-sulfo-3H-indolium salt (Cy3™), N-((2-jod-acetoksy)etyl)-N-metyl)amino-7-nitrobenzoksadiazol (IANBD), 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalen (akrylodan), pyrene, 6-amino-2,3-dihydro-2-(2-((jodacetyl)amino)etyl)-l,3-diokso-lH-benz(de)isokinolin-5,8-disulfonsyre salt (Lucifer Yellow), 2-(5-(l-(6-(N-(2-maleimidyletyl)-amino)-6-oksoheksyl)-l,3-dihydro-3,3-dimetyl-5-sulfo-3H-indol-2-yliden)-l,3-pentadienyl)-l-etyl-3,3-dimetyl-5-sulfo-3H-indoliumsalt (Cy5™), (2-bromacetamidetyl)-sulfonamid): 4-(5-(4-dimetylaminofenyl)oksazol-2-yl)fenyl-N-(2-bromacetamidetyl)sulfonamid (Dapoxyl®) (2-bromacetamidoetyl)sulfonamid, (N-(4,4-difluor-1,3,5,7-tetrametyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-yiliodoacetamid (BODIPY® 507/545 IA), A^-(4,4-difluor-5-7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-7V-jodacetyl-etylendiamin (BODIPY ® 530/550 IA), 5-((((2-jodacetyl)-amino)etyl)amino)naftalen-l-sulfonsyre (1,5-IAEDANS), og karboksy-X-rhodamin, 5/6-jodacetamid (XRIA 5,6).

10. Biosensor i følge krav 1,karakterisert vedat nevnte analytt er glukose.

11. Biosensor i følge krav 1,karakterisert vedat nevnte analytt permeable matriks omfatter en kovalent kryssbundet hydrogel, fortrinnsvis er nevnte kovalente kryssbundne hydrogel valgt fra polypeptider, polysakkarider, polysakkarid derivater, polyvinyl alkoholer, polyakrylsyrer, polyakrylamid, polyetylenglykoler, kopolymerer av styren og malein anhydrid, kopolymerer av olefin og malein anhydrid, og kopolymerer av vinyleter, malein anhydrid, kopolymerer av vinyleter og malein anhydrid, mest foretrukne kryssbundne hydrogel er en polyvinyl-alkohol omfattende poly(vinyl alkohol) og N-metyl-4(4'-formylstyryl)pyridinium acetalsalter.

12. Biosensor i følge krav 1,karakterisert vedat nevnte analytt permeable matriks omfatter en sol-gel forsterket med organisk modifiserte silikater, fortrinnsvis er nevnte analytt permeable matriks en glycerol modifisert silicat kondensat (GMSC)-avledet sol-gel.

13. Biosensor i følge et hvilket som helst av kravene 1-12,karakterisert vedat GGBP innkapslet i matriksen er omsluttet av en ytterligere matrix, fortrinnsvis er ytterligere nevnte matriks en hydrogel, en sol-gel eller en dialysemembran.

14. Biosensor i følge et hvilket som helst av kravene 1-13,karakterisert vedat den er en implantabel anordning.

15. Biosensor i følge et hvilket som helst av kravene 1-14, for anvendelse som en diagnostisk anordning.

16. Fremgangsmåte for glukose deteksjon,karakterisertved at den omfatter: a) å tilveiebringe minst en mutert glukose/galaktose bindingsprotein (GGBP) som har minst en aminosyresubstitusjon av en ikke reaktiv aminosyre med en reaktiv aminosyre som kan modifiseres med et merkingsmiddel analogt til merkingen av cystein med en tiol reaktiv farge og minst en luminescens reporter gruppe kovalent bundet dertil, hvori nevnte minst ene luminescens reporter gruppe er i stand til å tilveiebringe et detekterbart og reversibelt signal som respons på binding til nevnte mutante GGBP og hvori nevnte muterte GGBP bindes til glukose; b) å innfange eller innkapsle nevnte muterte glukose/galaktose bindende protein i en analytt-permeable matrix omfattende kryssbundne hydrogeler, sol-geler forsterket med organisk modifiserte silikater eller en kombinasjon derav; c) å eksponere nevnte muterte glukose/galaktose bindende protein til varierende glukose konsentrasjoner; og d) å detektere et signal fra nevnte luminescens reporter gruppe.

17. Fremgangsmåten i følge krav 16,karakterisert vedat i) i tillegg omfatter trinnet for å eksponere nevnte luminescens reporter gruppe til en energi kilde i stand til å utløse nevnte reporter gruppe til å avgi nevnte signal eller; ii) hvor nevnte detektering omfatter reversibel signal deteksjon korresponderende til nevnte varierende glukose konsentrasjoner eller iii) hvor nevnte detektering er kontinuerlig, programmert, episodisk eller kombinasjoner derav.

18. Fremgangsmåte i følge krav 16 eller 17,karakterisertv e d at nevnte glukose/galaktose bindingsprotein og/eller nevnte reporter er som definert i kravene 3 til 9.

19. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter en blanding av a) et mutert glukose/galaktose bindingsprotein (GGBP) som har minst en aminosyre substitusjon valgt fra et cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cystein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 152, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 236, og et cystein i posisjon 296 korresponderende til aminosyreposisjonene til E. coli GGBP, hvori nevnte muterte GGBP bindes til glukose; b) en analytt permeabel matriks som omfatter kovalent kryssbundne hydrogeler, sol-gel forsterket med organisk modifiserte silikater eller en kombinasjon derav; og c) minst én luminescens reportergruppe (luminescens merke), hvori nevnte minst en luminescens reporter gruppe evner å tilveiebringe et detekterbart og reverserbart signal som respons på binding til nevnte mutante GGBP.

20. Sammensetning i følge krav 19,karakterisert vedat nevnte bindingsprotein omfatter minst én kombinasjon av aminosyresubstitusjoner valgt fra et cystein i posisjon 112, et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 152 og et cystein i posisjon 182; et cystein i posisjon 152 og et serin i posisjon 213; et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238; et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 213; et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 213; et cystein i posisjon 149, og et treonin i posisjon 213; et cystein i posisjon 149 og et leucin i posisjon 213; et cystein i posisjon 149 og et tyrosin i posisjon 213; et cystein i posisjon 149 og et asparagin i posisjon 223; et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 238; et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 256; et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 256; et cystein i posisjon 152 og et arginin i posisjon 213; et cystein i posisjon 152 og et asparagin i posisjon 223; et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 255; et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et aspargin i posisjon 223; et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et asparagin i posisjon 223; et cystein i posisjon 149, et asparagin i posisjon 223 og et arginin i posisjon 256; et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; og et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 213 og et serin i posisjon 238 korresponderende til aminosyreposisj oner av E. coli GGBP.

21. Sarnmensetning i følge krav 19 eller 20,karakterisertv e d at nevnte muterte glukose/galaktose bindingsprotein ytterligere omfatter minst et histidin merke.

22. Sammensetning i følge krav 19 eller 20,karakterisertv e d at i) nevnte luminescens merke har en eksitasjonsbølgelengde på mer enn omtrent 600 nanometer, eller ii) nevnte luminescens merke har en emmisjonsbølgelengde på mer enn omtrent 600 nanometer, eller iii) nevnte luminescens merke er kovalent koblet til nevnte minst en glukose/galaktose bindingsprotein ved reaksjon med et medlem valgt fra fluorescein, coumariner, rhodaminer, tetrametylrhodamin-5-jodacetamid (5-TMRIA), R-fykoerytrin bundet til (9-(2-(eller 4)-(N-2-maleimidyletyl)-sulfonamidyl)-4(eller 2)-sulfofenyl)-2,3,6,7,12,13,16,17-oktahydro-(1 H,5H, 11H, 15H-xanteno(2,3,4-ij :5,6,7-i'j ')dikinolizin-18-ium salt (Quantum Red™), 9-(2(eller 4)- (N-(2-maleimidyletyl)-sulfonamidyl)-4(eller 2)-sulfofenyl)-2,3,5,7i, 12,13,16,17-oktahydro-( 1 H,5H, 11H, 15H-xan-teno(2,3,4-ij: 5,6,7-i'j')dikinolizin-l 8-ium salt (Texas Red™), 2-(5-(l-(6-(N-(2-maleimidyletyl)-amino)-6-oksoheksyl)-l,3-dihyro-3,3-dimetyl-5-sulfo-2H-indol-2-yliden)-1,3-propyldienyl)-1 -etyl-3,3-dimetyl-5-sulfo-3H-indolium salt (Cy3™), N-((2-jod-acetoksy)etyl)-N-metyl)amino-7-nitrobenzoksadiazol (IANBD), 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalen (akrylodan), pyrene, 6-amino-2,3-dihydro-2-(2-((jodacetyl)amino)etyl)-l,3-diokso-lH-benz(de)isokinolin-5,8-disulfonsyre salt (Lucifer Yellow), 2-(5-(1 -(6-(N-(2-maleimidyletyl)-amino)-6-oksoheksyl)-1,3-dihydro-3,3-dimetyl-5-sulfo-3H-indol-2-yliden)-l,3-pentadienyl)-l-etyl-3,3-dimetyl-5-sulfo-3H-indoliumsalt (Cy5™), (2-bromacetamidetyl)-sulfonamid): 4-(5-(4-dimetylaminofenyl)oksazol-2-yl)fenyl-N-(2-bromacetamidetyl)sulfonamid (Dapoxyl®) (2-bromacetamidoetyl)sulfonamid, (N-(4,4-difluor-l,3,5,7-tetrametyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-yiliodoacetamid (BODIPY® 507/545 IA), 7V-(4,4-difluor-5-7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-N-jodacetyl-etylendiamin (BODIPY ® 530/550 IA), 5-((((2-jodacetyl)-amino)etyl)amino)naftalen-l-sulfonsyre (1,5-IAEDANS), og karboksy-X-rhodamin, 5/6-jodacetamid (XRIA 5,6).

23. Sammensetning i følge krav 19,karakterisert vedat nevnte analytt permeable matriks er definert i kravene 11 til 12.