NO328049B1

NO328049B1 - Sammensetning omfattende et DTPA-derivat samt anvendelse derav

Info

Publication number: NO328049B1
Application number: NO20014194A
Authority: NO
Inventors: Albert Charles Gyorkos; Paul Chinn; Michael J Labarre; Steve Ruhl; Thomas Ryskamp
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-03-03
Filing date: 2001-08-29
Publication date: 2009-11-16
Also published as: AU3509900A; DE60038953D1; MXPA01008784A; PL350903A1; DK1157004T3; US6207858B1; CA2364960A1; JP5357368B2; RU2312852C2; NO20014194D0; ES2304944T3; PL211510B1; AU778816B2; NO20014194L; CN1290830C; ZA200106750B; EP1157004A1; JP2002538137A; JP2013144705A; EP1157004B1

Description

Foreliggende oppfinnelsen vedrører en sammensetning omfattende et regioisomert DTPA-derivat som angitt i krav 1. Et slikt regiospesifikt DTPA-derivat er anvendbart som bi-funksjonell chelatdanner i radioimmunoterapi og avbildning.

Teknologisk bakgrunn

Det er en økende interesse i nye radiomerkende midler for avbildning, tumordeteksjon og immunoterapi, som reduserer de forskjellige ulempene til stede ved konvensjonelle midler .

Konvensjonelle midler er generelt basert på radioaktive halo-forbindelser, slik som radioaktive forbindelser basert på jodisotoper. Derimot representerer disse midler et antall begrensninger. For eksempel, er anvendelsen av jodisotoper svært begrenset ved den høye nedbrytningshastighet av karbon-jodbindingen, in vivo. En annen begrensning vedrører de mindre enn idelle emisjonskarakteristikker og fysiske halveringstid av jodradionuklider. Henholdsvis har det vært innsatser for å utvikle nye tumordeteksjonsmidler for å overgå ulempene med halogen-baserte radioaktive merkende midler.

En måte å tilveiebringe mer effektiv avbildning og tumor-deteks jonsmidler tilbys av organometalliske forbindelser i formen av komplekse metallradionuklider. Å koble av-bildningen og tumordeteksjonsmidlet til proteinet blir vanligvis oppnådd gjennom en kovalent binding dannet mellom chelatet og proteinet ved acylering med aktiverte kar-bonyler, aromatisk diazoniumkobling, bromacetylalkylering eller gjennom tioureabindinger.

Derimot, tilveiebringer ikke eksisterende organometalliske komplekser optimal effektivitet for radiomerking og terapi. For eksempel, utover valget av en spesiell radioisotop, avhenger fremgangsrik tumordeteksjon og radioimmunoterapi, også på valget av et effektivt chelat som lett slutter seg til et spesielt antistoff og tillater radionuklid-innset-ting mens antistoffets integritet preserveres.

Forskjellige faktorer må vurderes i designing av effektive radiometallchelaterte antistoff for avbildning og tumor-deteks jon, og/eller immunoterapi. For eksempel må effektive radionuklider utvelges ifølge deres fysiske, kjemiske og biologiske egenskaper. Et optimalt nuklid bør være rutine-messig tilgjengelig, lett å koble til MAb og ha en passende fysisk halveringstid for selektivt å detektere og/eller eliminere det mål neoplastiske vev mens normalt vev spares.

MAb som tjener til å bære radionuklidet til tumormålet må være valgt basert på fordelingen av dets antigene mål og på spesifisiteten og bindingsaffiniteten av antistoffet til dets mål.

Et annet aspekt å vurdere i designing av effektive radiometall-chelaterte antistoff vedrører valget av chelat-danneren (CA) anvendt for å koble radionuklidet til antistof-fene. For eksempel må effektive radiometall-chelaterte antistoff være stabile in vivo. Stabilitet in vivo avhenger av betingelsen at både chelat-bindingen og de radiomerkende prosedyrer ikke forandrer antistoffspesifisitet og bio-fordeling.

I tillegg, er valg og syntese av chelat-danneren kritisk for å optimere tilstrekkeligheten mellom chelatet og det utvalgte radionuklid og MAb. Spesielt bør valget og syntesen av chelatet unngå upassende frigivning av radionuklidet in vivo. Dette aspekt er av største viktighet ved at de fleste vanlige problemer assosiert med konvensjonelle chelat-dannerer er deres svikt i å binde og sikkert holde seg til antistoffet. Som en konsekvens, er det betydelig dissosiering av radionuklidet in vivo fra MAb-CA-komplekset før levering av disse midler til overflaten av tumorcellen. Akkumulering av frie toksiske radionuklider i normalt vev skader normale vev uten fordelen av å behandle og/eller detektere tumormålet. Et annet viktig aspekt vedrører ønsket at den valgte chelat-danner tillater MAb-CA-komplekset å beholde fordelen tilveiebrakt ved spesifisiteten av det valgte MAb.

Derved må forskjellige kriterier vurderes i utvelgelsen av tilfredsstillende chelater for en valgt MAb. For eksempel,

(a) tilsetning av CA bør ikke forandre spesifisiteten eller bindeaffiniteten av MAb mot det antigene mål; (b) dets tilsetning til MAb bør ikke på annen måte skade antistoffet og derved forandre dets hastigheter for katabolisering eller

mønstrer av vevsfordeling; (c) det bør holde radiometallet sterkt slik at det ikke er noen prematur-elusjon av radio-isotopen fra MAb-CA-komplekset in vivo; (d) binding til MAb bør ikke forandre chelatets evnen til å beholde radionuklidet; (e) bindingsmåten til MAb bør være så spesifikk som mulig for å lette utforming av protokoler for den spesifikke deteksjon og terapi av tumormål samt analysen av dataene relatert til deteksjonen og behandlingen av tumorene; og (f) chelatet bør være i stand til å hjelpe til å fjerne radionuklidet etterfølgende katabolisme av MAb-CA-radionuklidkomplekset.

En gruppe egnete metallchelater er tilveiebrakt ved diety-lentriaminpentaeddiksyre (DTPA) og etylendiamintetraed-diksyre (EDTA) og deres derivater. Kjemiske modifiserte derivater av (DTPA) og (EDTA) har blitt utforsket som metall-ligander i stand til å effektivt chelatere radioaktive metaller, som lett kan kobles til immunoglobuliner. Derimot, var disse reagenser minimalt effektive grunnet deres reduserte affinitet for det bundede radionuklid, og konsekvente akkumulering av radiokjemiske forbindelser i normalt vev.

Et antall konvensjonelle fremgangsmåter er tilgjengelige for å koble EDTA- og DTPA-metallkomplekser til proteiner. Derimot har disse fremgangsmåter ikke nådd de høye effek-tivitets hastigheter nødvendig for effektiv avbildning og tumordeteksjon. For eksempel representerer konvensjonelle fremgangsmåter et antall ulemper, slik som behovet for ekstensiv rensing før radiomerking samt utilstrekkeligheten i å chelatere metallet som stammer fra anvendelsen av et metallbindende sete i dannelsen av den kovalente binding med proteinet. Derved har nye måter for proteinbinding blitt studert og nye måter som beholder alle metallbindende seter, har blitt foreslått.

For eksempel er en detaljert beskrivelse av kjemisk modifiserte ligander som ville reagere raskt og effektivt med antistoff, og som beholder metallet i et tidsrom som er langt sammenlignet med halveringstidene av radionuklider, nyttige for avbildning eller terapi, tilveiebrakt ved Brechbiel et al in "Synthesis of (1-(p-isothiocyanato-benzyl) derivatives DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor-Imagning Studies". Inorg. Chem. 1986, 25, 2772-2781.

Brechbiel et al foreslår EDTA og DTPA kjemisk modifiserte chelater med en isotiocyanatgruppe som er i stand til effektivt å koble to proteiner. Syntesen av chelatene kan oppsummeres som en "to-trinnsprosess", hvori det første trinnet inkluderer å generere et etylendiamin eller et dietylentriamin etterfulgt av alkylering av aminene for å danne den tilsvarende polyeddiksyre, og det andre trinn inkluderer å konvertere en funksjonell gruppe av benzyl-substitusjon for å oppnå en reaktiv andel anvendbar for proteinkobling.

Derimot er den ovennevnte "totrinns"-prosess for syntesen av MX-DTPA- og EDTA-analogen begrenset til et lavt totalt utbytte på mindre enn 2%. Fremgangsmåten krever langsom-melig rensing av intermediatene, som inkluderer kation og anionebytterkromatografi. I tillegg produserer syntesen både regioisomerer av MX-DTPA og har vist dårlig reprodu-serbarhet .

Oppsummering av oppfinnelsen

Nedenfor er det beskrevet en fremgangsmåte for å fremstille DTPA-derivater nyttige som chelatdannere i radioimmunoterapi og avbildning. Fremgangsmåten tilveiebringer en syntese av DTPA-derivater som gir høyt utbytte. Spesielt kan fremgangsmåten anvendes for regioselektiv syntese av DTPA-derivater egnet for å chelatere radioaktive metaller og kobling til immunoglobuliner. Fremgangsmåten inkluderer å koble et monobeskyttet diamin og en forbindelse inneholdende et amin og en andel i stand til å effektivt koble DTPA-derivatet til immunoglobuliner eller en andel i stand til å bli konvertert til effektivt å koble DTPA-derivatet til immunoglobuliner.

Foreliggende oppfinnelse angår en sammensetning omfattende regioisomeren med formel (I)

En slik forbindelse kan fremstilles ved: (a) å koble N-tert-butoksykarbonyl-p-nitro-L-fenylalanin (A) og monobeskyttet diamin (B) for å danne forbindelse (C); (b) å fjerne de aminbeskyttende grupper i (C) for å danne TFA-salter (D); (c) å redusere (D) for å danne (E); (d) å penta-alkylere (E) for å danne (F); (e) å fjerne de aminbeskyttende grupper i (F) for å danne trifluoreddiksyresaltet (G); (f) å redusere nitrogruppen i (G) for å danne trifluoreddiksyresaltet (H); og (g) å konvertere aminogruppen i (H) for å danne DTPA-derivatet.

Fremgangsmåten tillater å syntetisere MX-DTPA.

Ved fremgangsmåten kan det fremstilles MX-DTPA ved: (a) å koble N-tert-butoksykarbonyl-p-nitro-L-fenylalanin (A) og mono-N-tert-butoksykarbonyl beskyttet diamin (B') for å danne N-(2-N-Tert-butoksykarbonyl-aminopropyl)-N-tert-butoksykarbonyl-p-nitrofenylalaninamid (C); (b) å fjerne boc-gruppene i (C) for å danne N-(2-Aminopropyl)-p-nitrofenylalaninamid TFA-salt (D'); (c) å redusere (D') for å danne 2-Metyl-6-(p-nitrobenzyl)dietylentriamin trihydroklorid (E') ; (d) å penta-alkylere (E') for å danne N,N,-N' ,N" ,N" -Pentakis [ (tert-butoksykarbonyl) metyl] -2- [ (4-nitrofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin (F'); (e) å fjerne boc-gruppene i (F') for å danne N,N,N',N'',N''-Pentakis-(karboksymetyl)-2-[(4-nitrofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt (G'); (f) å redusere nitrogruppen i (G') for å danne N,N,N',N'',N''-Pentakis(kar-boksymetyl)-2-[(4-aminofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt (H'); og (g) å konvertere aminogruppen i (H') for å danne 2-(p-Isotiocyanatobenzyl)-6-metyldietylentriamin-N,N,N',N'',N''-pentaeddiksyre (MX-DTPA) .

Det kan også fremstilles MX-DTPA, hvori trinn (a) inkluderer å anvende benzotriazol-l-yloksytris(dimetyl-amino)fosfonium heksafluorofosfat (BOP) som koblende reagens.

Det kan også anvendes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori trinn (a) inkluderer å anvende bis(2-okso-3oksazolidinyl)fosfinklorid (B0P-C1) som koblende reagens.

Det kan også fremstilles MX-DTPA, hvori det mono-boc beskyttede diamin (B') er oppnådd ved en fremgangsmåte som inkluderer (i) å behandle et laktonitril med ammoniumhydroksid for å danne a-aminonitril (2); (ii) å behandle (2) med saltsyre for å danne aminhydrokloridsaltet (3);

(iii) å beskytte aminet med di-tert-butyldikarbonat for å danne det boc-beskyttede derivat (4); og (iv) å redusere nitrilet anvendende Raneynikkel med en mettet løsning av etanol under to atmosfærer hydrogen for å danne det mono-boc beskyttede diamin (B').

Det kan også fremstilles MX-DTPA, hvori det mono-boc beskyttede diamin (B') oppnås ved en fremgangsmåte omfattende (i) å alkylere en Schiff Base (5) under faseover-føringsbetingelser for å danne et mono-alkylert produkt (6); (ii) å avbeskytte (6) med lN-saltsyre etterfulgt av å beskytte aminet med di-tert-butyldikarbonat for å danne det boc-beskyttede amin (4); og (iii) å redusere (4) med Raneynikkel for å danne det mono-boc beskyttede diamin (B').

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori fjerning av boc-gruppene i (C) for å danne (D') utføres anvendende trifluoreddiksyre i diklormetan.

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori trinnet av å redusere (D') inkluderer å behandle (D') med boran-tetrahydrofurankompleks, etterfulgt av behandling av hydrogenklorid for å danne triaminhydrokloridsaltet (E').

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA hvori Penta-alkylering av intermediat (E') utføres anvendende acetonitril og kaliumkarbonat.

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori Penta-alkylering av intermediat (E') utføres anvendende brom-tert-butylacetat i dimetylformamid og natriumkarbonat.

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori (F') renses anvendende kolonnekromatografi på silikagel.

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori trinnet for å avbeskytte karboksylsyrene

(F') for å danne penta-eddiksyrederivatet (G') utføres anvendende trifluoreddiksyre.

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori redusering av nitrogruppen i (G') for å danne (H') utføres anvendende palladium på karbon under to atmosfærer hydrogen i vann.

Det kan også benyttes en fremgangsmåte for å syntetisere MX-DTPA, hvori trinnet for å konvertere (H') til MX-DTPA inkluderer å konvertere aminet (H') "tile" isotiocyanat funksjonalitet via tiofosgen. Konverteringen kan utføres på forskjellige måter. For eksempel ved (i) å tilsette tiofosgen til en bifaseblanding inneholdende penta-eddiksyrederivatet (H) i kloroform og vann; (ii) å raskt omrøre blandingen i to timer; (iii) å fjerne løsemidlet under redusert trykk for å danne en rest; (iv) å rense resten på reversert fase silika; og (v) å eluere med 25% acetonitril i vann inneholdende 1% eddiksyre. Konverteringen kan også utføres anvendende diklormetan og trietylamin, eller acetonitril og natriumbikarbonat eller natriumkarbonat.

Oppfinnelsen tilveiebringer en forbedret MX-DTPA-sammensetning, hvori sammensetningen omfatter den aktuelle regioisomer, relativt til hver annen regioisomer i en mengde på minst 90 %, mer fordelaktig minst 95 %, og mest fordelaktig minst 99 %.

I enda et annet aspekt, er oppfinnelsen rettet mot anvendelsen av slik forbedret MX-DTPA-sammensetning for produk-sjonen av protein eller antistoff chelator og radiomerket form derav.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er et reaksjonsskjema som oppsummerer syvtrinns prosessen for den regiospesifikke syntese av DTPA-derivater med formel (I). Figur 2 er et reaksjonsskjema som oppsummerer syvtrinns prosessen for den regiospesifikke syntese av MX-DTPA. Figur 3 er et firetrinns reaksjonsskjema for syntesen av

(B') .

Figur 4 er et alternativt reaksjonsskjema for syntesen for

(B' ) .

Figur 5 er et reaksjonsskjema for et alternativt trinn 1 i reaksjonsskjema i figur 2. Figur 6 er et reaksjonsskjema som representerer mislykket kondensasjon av (B') med 4-nitro-L-fenylalaninmetylester (a) i metanol og (b) i toluen. Figur 7 viser to alternative reaksjonsskjemaer (a) og (b) for alkyleringen av (E') for å danne (F'). Figur 8 er et alternativt reaksjonsskjema for konverteringen av (H') til MX-DTPA. Figur 9 er et reaksjonsskjema som oppsummerer syvtrinns prosessen for den regiospesifikke syntese av CHx-DTPA. Figur 10 er et skjema som avbilder regioisomerene av CHx-DTPA selektivt fremstilt ved fremgangsmåten av oppfinnelsen . Figur 11 er et totrinns reaksjonsskjema for syntesen av

(B" ) .

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelser

Med mindre annet er definert, har alle tekniske og viten-skapelige betegnelser benyttet heri de samme meningene som vanligvis forstått av fagpersonen som den oppfinnelsen tilhører. Selv om enhver metode og materiale like eller ekvivalente med de beskrevet heri kan benyttes i praksisen eller ut-testing av foreliggende oppfinnelsen, er de foretrukne fremgangsmåter og materialer beskrevet.

Som angitt ovenfor kan den aktuelle regioisomereren MX-DTPA fremstilles ved en fremgangsmåte for høyt utbytte regioselektiv syntese av kjemisk modifiserte DTPA-derivater som eliminerer behovet for ioneveksle kromatografisk separasjon av intermediater. Videre, ettersom denne fremgangsmåten gir en enkel regioisomer av chelatet, tilveiebringer den den regiospesifikke syntese av ønskede chelater nyttige som radiomerkende midler.

Mer spesifikt, er figur 1 et reaksjonsskjema som oppsummerer syvtrinnsprosessen for den regiospesifikke syntesen av DTPA-derivater med formel (I). I denne utførelse, fremstilles et DTPA-derivat med formel (I), ved: (a) å koble N-tert-butoksykarbonyl-p-nitro-L-fenylalanin (A) og et monobeskyttet diamin (B) for å danne forbindelse (C); (b) å fjerne de amin-beskyttende grupper i (C) for å danne TFA-saltet (D); (c) å redusere (D) for å danne (E); (d) å penta-alkylere (E) for å danne (F); (e) å fjerne de amin-beskyttende grupper i (F) for å danne trifluoreddiksyresaltet (G); (f) å redusere nitrogruppen i (G) for å danne trifluoreddiksyresaltet (H); og (g) å konvertere aminogruppen i (H) for å danne DTPA-derivatet av formel (I).

Figur 2 inneholder et reaksjonsskjema som oppsummerer syvtrinns prosessen for den regiospesifikke syntese av MX-DTPA. Her utføres den regioselektive syntese av MX-DTPA i de følgende trinn: (a) å koble N-tert-butoksykarbonyl-p-nitro-L-fenylalanin (A) og mono-N-tert-butoksykarbonyl beskyttet diamin (B') for å danne N-(2-N-Tert-butoksykarbonyl-aminopropyl)-N-tert-butoksykarbonyl-p-nitrofenylalaninamid (C); (b) å fjerne boc-gruppene i (C ) for å danne N-(2-Aminopropyl)-p-nitrofenylalaninamid TFA-salt (D'); (c) å redusere (D') for å danne 2-Metyl-6-(p-nitrobenzyl)dietylentriamin trihydroklorid (E'); (d) å penta-alkylere (E') for å danne N,N, N', N" ,N"-Pentakis[(tert-butoksykarbonyl)-metyl]-2-[(4-nitrofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin (F'); (e) å fjerne boc-gruppene i (F') for å danne N,N,N',N'',N''-Penta-kis (karboksymetyl)-2-[(4-nitrofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt (G'); (f) å redusere nitrogruppen i (G') for å danne N,N,N',N'N''-Pentakis(kar-boksymetyl) -2-[(4-aminofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt (H'); og (g) å konvertere aminogruppen i (H') for å danne 2-(p-Isotiocyanatobenzyl)-6-metyldietylentriamin-N,N,N',N'',N''-pentaeddiksyre (MX-DTPA) .

Fremgangsmåten for den regiospesifikke syntese av MX-DTPA har et totalt utbytte på omtrent 20 % som starter fra det mono-boc beskyttede diamin (B') og boc-p-nitro-L-fenylalanin (A) og kan endres til oppskalering. Derved, tillater syntetisering av MX-DTPA å oppnå totale synteseutbytter ved omtrent en størrelsesorden høyere enn det totale utbytte oppnådd med den tidligere fremgangsmåte (mindre enn 2 %). Videre nødvendiggjorde tidligere synteseprosesser rensing av et intermediat via omstendelig anion og kation-utvekslingskromatografi. I motsetning til dette eliminerer den beskrevne fremgangsmåten denne kostbare renseprosess og tilveiebringer målforbindelsen i høy renhet. For eksempel, er det kun nødvendig med normal fasekolonnekromatografi og en reversert fasekolonne for å rense sluttforbindelsen.

Figur 3 er et firetrinns reaksjonsskjema for syntesen av det mono-boc beskyttede diamin (B'). Syntesen av (B') er oppnådd via behandling av kommersielt tilgjengelig laktonitril med ammoniumhydroksid for å få a-aminonitrilet (2) som ved behandling med saltsyre gir aminsaltsyresalt (3). Beskyttelse av aminet med di-tert-butyldikarbonat resulterer i det boc-beskyttede derivat (4). Reduksjon av nitrilet anvendende Raneynikkel med en mettet løsning av etanol under to atmosfærer hydrogen gir det nødvendige mono-boc beskyttede diamin (B'). Denne reaksjonssekvens er delvis attraktivt fra et økonomisk synspunkt fordi det er reproduserbart og lett kan forandres til oppskalering.

Flere andre betingelser for fremstillingen av (B') ble også undersøkt. For eksempel, viser figur 4 et reaksjonsskjema for syntensen av (B'), hvori (B') er fremstilt ved å alkylere en Schiff-base (5) under faseoverføringsbetingelser for å produsere det mono-alkylerte produkt (6) i moderat utbytte. Avbeskyttelse av (6) med lN-saltsyre etterfulgt av beskyttelse med di-tert-butyldikarbonat tilveiebringer det boc-beskyttede aminet (4) som ved reduksjon med Raneynikkel produserer det nødvendige mono-boc beskyttede diamin (B').

I en utførelse vist i figur 1, benytter syntesen N-tert-butoksykarbonyl-p-nitro-L-fenylalanin (A) som er koblet til det mono-N-tert-butoksykarbonyl beskyttede diamin (B'). Det foretrukne koblingsmiddel for å utføre dette trinn er benzotriazol-l-yloksytris(dimetylamino)fosfonium heksafluorofosfat (BOP). Disse betingelser tilater syntesen av forbindelse (C) i et isolert utbytte som varierer fra 72 til 83%. Rensing av (C) kan oppnås via syre/basevask etterfulgt triturering med heksaner.

Figur 5 er et reaksjonsskjema som representerer et alternativt trinn 1 i reaksjonsskjema i figur 2. Som vist i figur 5, resulterer anvendelse av bis(2-okso-3oksazoli-dinyl)fosfinklorid (B0P-C1) også i dannelsen av det ønskede produkt (C); derimot, er utbyttet for denne reaksjon 23% sammenlignet med utbyttet på 83% som kan oppnås med trinn 1 ifølge figur 2.

Andre reaksjonsveier for syntesen av (C) var mislykket. For eksempel, som vist skjematisk i figur 6, var innsatser for å generere et beslektet derivat av (C) via direkte kondensasjon av (B') med 4-nitro-L-fenylalaninmetylester (1) enten ved (a) å omrøre i metanol eller (b) å oppvarme ved refluks i toluen ikke fremgangsrike.

Når en gjennomførbar syntese er oppnådd for forbindelse ( C), kan de boc-beskyttende grupper deretter fjernes anvendende trifluoreddiksyre i diklormetan for å danne diaminet (D'). I denne fremgangsmåte, produseres (D') i kvantitativ utbytte (100 %) som et faststoff.

Som avbildet i figur 2, produserer reduksjonen av amidet (D') med et borantetrahydrofurankompleks, etterfulgt av behandling med hydrogenklorid, det triaminsaltsyresalt (E'). I tillegg til alkyleringstrinnet avbildet i figur 2, kan andre reaksjonsveier anvendes. For eksempel, viser figur 7 to reaksjonsskjemaer (a) og (b) for alkyleringen av (E') for å danne (F'). Penta-alkylering av intermediat (E') kan oppnås anvendende brom-tert-butylacetat i dimetylformamid og natriumkarbonat som base eller alternativt anvendende acetonitril som løsemiddel og kaliumkarbonat. De siste betingelser er mer konduktivte for oppskalering og eliminerer anvendelsen av dimetylformamid som vanligvis er vanskelig å fjerne. Det isolerte utbytte for dette trinn er i området av 60 % når reaksjonen tillates å fortsette i 72 til 96 timer. Rensing av (F') utføres fortrinnsvis via kolonnekromatografi på silikagel.

Som vist skjematisk i figur 2, kan penta-eddiksyrederivatet (G') oppnås ved avbeskyttelse av karboksylsyrene, fortrinnsvis anvendende trifluoreddiksyre. Reduksjon av nitrogruppen oppnås anvendende palladium på karbon under to atmosfærer hydrogen i vann. Det bør noteres her at det er unngått utilstrekkelighetene ved tidligere kjente synteseprosesser. For eksempel blir det unngått å anvende ammoniumhydroksid, som er vanskelig å fjerne, å komplisere synteseprosessen ved å kreve et trinn for å generere isotiocyanatet grunnet dannelsen av et tiourea biprodukt.

Slutt-trinnet i reaksjonsskjema i figur 2 vedrører å konvertere aminet til det aktuelle isotiocyanatet via tiofosgen. I dette henseende er det undersøkt forskjellige operasjonsbetingelser.

De foretrukne betingelser for å konvertere (H') til MX-DTPA er avbildet i det siste trinnet av skjemaet i figur 2. Disse betingelser inkluderer å tilsette tiofosgen til en bi-faset blanding inneholdende penta-eddiksyrederivatet (H') i kloroform og vann og raskt omrøre blandingen i to timer. Fjerning av løsemidlet under redusert trykk etterfulgt av rensing av resten på reversert fasesilika og eluering med 25% acetonitril i vann inneholdende 1% eddiksyre produserte målforbindelsen MX-DTPA i godt utbytte.

Andre operasjonsbetingelser har også blitt undersøkt. For eksempel viser figur 8 et reaksjonsskjema for konverteringen av (H') til MX-DTPA anvendende diklormetan som løsemiddel og trietylamin som en base. Derimot i tillegg til MX-DTPA, produserer reaksjonen også trietylaminsaltsyre som et biprodukt som ikke lett kunne fjernes.

Konvertering av (H') til MX-DTPA kan også utføres anvendende acetonitril som løsemiddel og natriumbikarbonat eller natriumkarbonat som base. Denne reaksjon produserte også andre urenheter.

MX-DTPA kan effektivt anvendes i forskjellige applikasjoner som krever en chelatdanner. For eksempel tilveiebringer MX-DTPA effektive radiomerkende chelatdannere, antistoff-chelatdannere og protein-chelatdannere. Radiomerket MX-DTPA tilveiebringer et effektivt verktøy for forskjellige applikasjoner, slik som scintigrafi, radioterapi og radioimmunoassy.

I dette henseende, presenterer fremgangsmåten for syntesen av MX-DTPA et antall fordeler. For eksempel, krever ikke prosessen kation og anion utvekslingskromatografi nødvendig for den omstendelige rensing av intermediater. Å unngå behovet for kation og anion utvekslingskromatografi tilveiebringer en fremgangsmåte som lett kan oppskaleres.

En annen fordel vedrører det høye utbytte gitt ved fremgangsmåten. Som beskrevet over, må chelater effektive for anvendelse i radioimmunotester lett være tilgjengelige i tilstrekkelige mengder for å tilfredsstille en potensiell høy etterspørsel. Den aktuelle fremgangsmåten kan tilveiebringe MX-DTPA med et utbytte så høyt som 20%, en størrelsesorden høyere enn eksisterende fremgangsmåter for syntetiserende MX-DTPA.

De aktuelle MX-DTPA-chelater har høy renhet. Å tilveiebringe chelatet i en ren form tilveiebringer et antall fordeler, slik som lettere kondisjonering og fremstilling av chelaterte MAbs-er, hvori nærværet av uønskede biprodukter er minimert. Å minimere urenhetene i de syntetiserte chelater tillater lettere kondisjonering av chelatet for biologiske anvendelser.

Uten å ønske å være bundet av noen teori, kan regiospesi-fikk syntese av MX-DTPA oppnås ved å anvende forbindelse (A) i formen av en enkel isomer. Når en spesiell isomer av forbindelse (A) er valgt for å starte synteseprosessen, beholdes konfigurasjonen rundt det chirale karbon i (A) gjennom synteseprosessen.

Å anvende MX-DTPA i formen av en enkel regioisomer presenterer flere fordeler. For eksempel i anvendelse av en enkel isomer av MX-DTPA bedre scintigrafi-resultater og unngår tapet av optisk signal assosiert med anvendelsen av raci-miske blandinger. Å anvende en enkel isomer tillater også design av MAb-CA-komplekser med høy spesifisitet. I dette henseende tillater anvendelse av en enkel isomer alle

chelatmolekyler i å bindes til MAb på hovedsakelig samme måte.

En annen fordel med å spesifikt syntetisere en enkel regioisomer av MX-DTPA vedrører kontrollen tilveiebrakt for posisjoneringen av det chelaterte radionuklid i relasjon til MAb og til slutt til måltumoren. Å kontrollere posisjoneringen av radionuklidet er mulig gjennom anvendelsen av en enkel isomer av MX-DTPA. Fordeler med å tilveiebringe en enkel måte for binding ved å anvende en enkel isomer inkluderer den potensielle forbedring i avbildning og immu-noterapeutiske resultater oppnådd med MAb-CA-komplekset.

De aktuelle MX-DTPA-chelatet er egnet for å chelatere en variasjon av radionuklider. Chelatet er også egnet for kompleksering med en variasjon av MAbs og proteiner. Derved er det forventet at MX-DTPA produsert i henhold til den regiospesifikke syntese tilveiebringer like effektiv radiomerking og terapeutiske midler når kombinert med enhver radionuklid eller MAb egnet for kombinasjon med MX-DTPA.

I en utførelse blir MX-DTPA konjugert til 2B8-antistoff for å danne 2B8-MX-DTPA. 2B8 er et anti-CD20-antistoff vist å påvirke B-celle utmattelse ved administrasjon til lymfom-pasienter. Detaljerte protokoler for å danne 2B8-MX-DTPA beskrevet i detalj i US patentnr. 5.736.137.

Derimot, bør det være åpenbart for fagpersonen at de aktuelle MX-DTPA-chelatdannere kan anvendes i radiomerkingen av andre anti-CD20-antistoffer, eller ethvert annet antistoff som har blitt konjugert til DTPA eller annen polyvalent chelatdanner. MX-DTPA-chelatet kan også bli festet til andre proteiner og peptider, for eksempel, reseptorer, hormoner, vekstfaktorer, slik som somatostatonpeptider.

Eksempler

Kommersielt tilgjengelige reagenser og HPLC-grad eller vannfrie løsemidler ble anvendt uten videre rensing. Normal fasekolonnekromatografi og TLC ble utført på ICN-silikagel (63-200, 60A) og Merck silikagel (60A) med fluorescerende indikator henholdsvis. Reversert fasekolonnekromatografi og TLC ble utført på EM Science LiChroprep RP-18 (40-63 um) og Techware RPS-F reversert fasehydrokarbon impregnert silikagel med fluorescerende indikator henholdsvis.

Syntese av l- N- tert- butoksykarbonyl- 2- metyl- etylendiamin

( B' )

a. 2-Aminopropannitrilhydroklorid (3)

En blanding inneholdende 23,1 g (324,99 mol) laktonitril (teknisk grad 90% renhet), 7,1 g (132,74 mmol) ammonium-klorid og 86 ml (2.208,3 mmol) ammoniumhydroksid ble tillatt å omrøres ved romtemperatur i 2 timer. Reaksjonen ble ekstrahert med diklormetan (2 x 500 ml) og den organiske fase tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Blandingen ble filtrert og løsemidlet fjernet under redusert trykk for å produsere 24 g av en gulolje (2). Guloljen ble fortynnet med 250 ml vannfri dietyleter og avkjølt i en isbad. Deretter ble 350 ml (350 mmol) av lN-saltsyre i eter tilsatt. Etter omrøring i 10 minutter, ble det resulterende faststoff filtrert, vasket med eter og tørket under vakuum for å gi 28,79 produkt med et utbytte på 92,83% basert på renheten av utgangslaktonitrilet.

b. N-tert-butoksykarbonyl-2-aminopropannitril (4):

Til en blanding inneholdende 28,5 g (268,79 mmol) 2-amino-propanitrilhydroklorid i 300 ml vannfritt diklormetan ble det tilsatt 104 ml (746,16 mmol) trietylamin. Blandingen ble avkjølt i et isbad etterfulgt av tilsetning av 64,5 g (295,53 mmol) di-tert-butyldikarbonat i 100 ml vannfri diklormetan over 30 minutter. Reaksjonen ble tillatt å varme til romtemperatur under omrøring i 48 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en glass-sintrert trakt og filtratet ble redusert under redusert trykk. 1 1 dietyleter ble tilsatt og blandingen ble tillatt å omrøre i 15 minutter. Blandingen ble igjen filtrert gjennom en glass-sintrert trakt for å fjerne det gjenværende trietylaminhydroklorid. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Kolonnekromatografi av resten på silikagel eluert med 30% etylacetat/heksaner ga 18,50 g produkt med et utbytte på 40,44%. c. l-N-tert-butoksykarbonyl-2-metyl-etylendiamin (B'): Til en 500 ml Parr-flaske ble det tilsatt 18,4 g (108,10 mmol) N-tert-butoksykarbonyl-2-aminopropannitril og 200 ml absolutt etanol mettet med ammoniakk. Raneynikkel ble deretter tilsatt, (10 g av en 50 % slurry i vann) og flasken ble trykksatt til 50 psi hydrogengass og utluftet. Flasken ble igjen trykksatt til 50 psi hydrogengass og utluftet. Deretter ble flasken trykksatt til 50 psi hydrogengass og ristet inntil det ikke var mer opptak av hydrogen, som vanligvis oppnås over natten. Flasken ble utluftet og blandingen filtrert gjennom en pute celitt 521. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi 19,2 g produkt som en fargeløs olje med fullstendig utbytte (100 %).

Alternativt kan 2- Amino- propannitrilhydroklorid ( 3) fremstilles fra N-( Difenylmetylen) aminoacetonitril som følger:

a. N-(Difenylmetylen)-2-metyl-aminoacetonitril (6):

Til en løsning inneholdende 50 g (226,98 mmol) N-(difenylmetylen)aminoacetonitril i 250 ml toluen ble det tilsatt 4,5 g (19,76 mmol) benzytrietylammoniumklorid (BTEAC) etterfulgt av tilsetning av 28,3 g (707,50 mmol) natrium-hydroksid i 50 ml vann. Reaksjonen ble avkjølt i et isbad etterfulgt av en dråpevis tilsetning av 22 ml (232,51 mmol) av metylsulfat i 1 time. Reaksjonen ble tillatt å oppvarme seg til romtemperatur over 24 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 1 liter diklormetan og ble vasket med vann (2x1 1). Den organiske fase ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering, fjerning av løsemiddel og kolonnekromatografi av resten på silikagel ved elusjon med 20% etylacetat/heksaner ga 46,2 g produkt med et utbytte på 62,05%.

b. 2-Amino-propannitrilhydroklorid (3):

En blanding inneholdende 3,0 g (12,80 mmol) N-difenylmetylen-2-metyl-aminoacetonitril i 30 ml heksan og 25 ml (25 mmol) IN vandig saltsyre ble tillatt å omrøres ved romtemperatur i 72 timer. Den vandige fase ble separert og vasket med heksan. Konsentrasjon av den vandige fase under redusert trykk ga 1,25 g av produkt med et utbytte på 92,10%.

N-(2-N-Tert-butoksykarbonyl-aminopropyl)-N-tert-butoksykarbonyl-p-nitrofenylalaninamid (C): Til en løsning inneholdende 25 g (80,57 mmol) av N-t-boc-p-nitro-L-fenylalanin i 300 ml vannfri diklormetan ble det tilsatt 12,5 ml (89,68 mmol) trietylamin etterfulgt av 37 g (83,66 mmol) benzotriazol-l-yloksytris(dimetylamino)fos-foniumheksafluorfosfat (BOP). Etter omrøring ved romtemperatur i 1 time, ble 15,1 g (86,66 mmol) 1-N-tert-butoksykarbonyl-2-metyl-etylendiamin i 40 ml vannfri diklormetan tilsatt. Reaksjonen ble tillatt å omrøres ved romtemperatur i 20 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 300 ml diklormetan og vasket med IN vandig saltsyre (2 x 500 ml), mettet vandig natriumbikarbonat (2 x 500 ml) og vann (1 x 500 ml). Den organiske fase ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering og fjerning av løsemiddel under redusert trykk ga et gult faststoff. Heksaner ble deretter tilsatt (600 ml) og blandingen tillatt å omrøres i 20 minutter. Faststoffet ble filtrert og tørket for å gi 27,0 g (71,83%) av produkt som et hvitt faststoff.

N-(2-Aminopropyl)-p-nitrofenylalaninamid TFA-salt

(D' ) :

Til en løsning inneholdende 26,50 g (56,80 mmol) av N-(2-N-Tert-butoksykarbonyl-aminopropyl)-N-tert-butoksykarbonyl-p-nitrofenylalaninamid i 300 ml diklormetan ble det tilsatt 65 ml (843,77 mmol) trifluoreddiksyre. Reaksjonen ble tillatt å omrøres ved romtemperatur i 1 time. Løsemidlet ble fjernet under redusert trykk etterfulgt av tilsetningen av 500 ml vannfri dietyleter. Det resulterende faststoff ble filtrert gjennom en glass-sintrert trakt og vasket med 400 ml dietyleter. Faststoffet ble tørket under vakuum for å gi 32,0 g (100 %) produkt inneholdende noen rest trifluoreddiksyre og dietyleter. Materialet anvendes uten videre rensing.

2-Metyl-6-(p-nitrobenzyl)dietylentriamintrihydroklorid

(E' )

Til en løsning inneholdende 35 g (70,80 mmol) N-(2-amino-propyl)-p-nitrofenylalaninamid TFA-salt i 500 ml vannfritt tetrahydrofuran ble det tilsatt 500 ml av lM-boran-tetrahydrofurankompleks over 30 minutter. Reaksjonen ble opp-varmet ved refluks i 16 timer. Etter avkjøling av reaksjonen i et isbad, ble 122 ml metanol sakte tilsatt for å eliminere overskuddet av boranreagens. Etter fullstendig gassutvikling, ble løsemidlet fjernet under redusert trykk. Resten ble tatt opp i 265 ml absolutt etanol og løsningen ble mettet med saltsyre (g) under avkjøling i isbad. Blandingen ble deretter fortynnet med 200 ml vannfritt dietyleter og det resulterende faststoff filtrert og tørket under vakuum for å gi 19,39 g produkt med et utbytte på 75,72 %.

N,N,N',N'',N''-Pentakis[(tert-butoksykarbonyl)metyl]-2-[(4-nitrofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin (F'): Til en blanding inneholdende 19,0 g (52,53 mmol) 2-metyl-64 p-nitrobenzyl)dietylentriamintrihydroklorid i 550 ml vannfritt acetonitril ble det tilsatt 86,60 g (626,58 mmol) kaliumkarbonat etterfulgt av 42 ml (284,44 mmol) tert-butylbromacetat. Etter omrøring ved romtemperatur i 90 timer, ble reaksjonen fortynnet med 500 ml vann og ekstrahert med etylacetat (2 x 500 ml). Den organiske fase ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Filtrering og fjerning av løsemidlet under redusert trykk ga en gul olje. Kolonnekromatografi av denne olje på silikagel ved eluering med 30% etylacetat/heksaner ga 26,37 g produkt med et utbytte på 60,99%.

N,N,N',N'',N''-Pentakis(karboksymetyl)-2-[(4-nitro-fenyl) metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt

(G') :

En løsning inneholdende 5,0 g (6,08 mmol) N,N,N', N" ,N''-pentakis[(tert-butoksykarbonyl)metyl]-2-[(4-nitrofenyl)-metyl]-6-metyldietylentriamin i 35 ml trifluoreddiksyre ble tillatt å omrøre ved romtemperatur i 48 timer. Løsemidlet ble fjernet under redusert trykk og det resulterende faststoff tørket under vakuum for å gi 4,02 g produkt som et blekt gult faststoff med et utbytte på 74,75%.

N,N,N',N'',N''-Pentakis(karboksymetyl)-2-[(4-amino-fenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt

(H') :

Til en Parr-flaske ble det tilsatt 3,40 g (3,84 mmol) N,N,-N',N'',N''-pentakis(karboksymetyl)-2-[(4-nitrofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin trifluoreddiksyresalt og 50 ml vann etterfulgt av tilsetningen av 0,3 g 5% palladium på karbon. Flasken ble trykksatt til 30 psi hydrogen og utluftet to ganger. Beholderen ble deretter trykksatt til 45 psi hydrogen og ristet. Når hydrogenopptaket sluttet, typisk etter 2 til 4 timer, ble flasken luftet og blandingen filtrert gjennom en pute celitt. Celitten ble vasket med 20 ml vann. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi 3,02 g produkt med et utbytte på 92,03%. De spektrale data oppnådd for dette produkt er sammenfallende med de av en referansestandard.

2-(p-Isotiocyanotobenzyl)-6-metyldietylentriamin-N,N,-N' , N" , N" -pentaeddiksyre (MX-DTPA)

I en 1 1 rundbunnet flaske utstyrt med en magnetisk om-rører, ble 7,0 g (7,23 mmol) N,N,N',N" ,N"-Pentakis-(karboksymetyl)-2-[(4-aminofenyl)metyl]-6-metyldietylentriamin-trifluoreddiksyresalt tilsatt til en blanding inneholdende 150 ml vann og 300 ml kloroform, etterfulgt av 4,67 g (44,06 mmol) natriumkarbonat. Den resulterende løsning hadde en pH på omtrent 9,0. Til denne bifaseblanding ble det tilsatt 0,64 ml (8,39 mmol) tiofosgen og løsningen ble tillatt å omrøre ved romtemperatur i 2 timer. Løsemidlet ble fjernet under redusert trykk for å danne en rest. Resten ble løst i 15 ml 1 % eddiksyre i vann og plas-sert på en reversert fase silikagel kolonne som eluerte med 1% eddiksyre etterfulgt av 25% acetonitril/vann inneholdende 1% eddiksyre. Fraksjonene inneholdende produktet ble samlet og løsemidlet fjernet under redusert trykk for å gi 2,47 g produkt som et blekt gult faststoff i et utbytte på 61,60 %.

Claims

1. Sammensetning omfattende regioisomeren 2-(p-isotiocyanatobenzyl)-6-metyldietylentriamino-N,N, N' ,N",N"-pentaeddiksyre (MX-DTPA) av formelen: hvor prosentdelen av nevnte regioisomer i forhold til enhver annen regioisomer, er minst 90%.

2. Anvendelse av sammensetningen ifølge krav 1 for fremstilling av et radiomerket MX7DTPA.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor det radiomerkede MX-DTPA er bundet til et protein.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor proteinet er et antistoff.