NO325950B1

NO325950B1 - Nye karbohydrater og anvendelse derav

Info

Publication number: NO325950B1
Application number: NO19995985A
Authority: NO
Inventors: Rolf Seljelid
Original assignee: Biotec Pharmacon Asa
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2008-08-25
Also published as: NO995985L; NO995985D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører karbohydratderivater som har immunomodulerende effekt, farmasøytiske blandinger inneholdende dem og anvendelse av krabohydratderivatene i fremstillingen av et medikament for terapi.

Immunomodulatorene i det følgende referert til som IM'er er en gruppe av ikke-endogene forbindelser som modifiserer makrofager og relaterte celletyper, for derigjennom å stimulere eller nedregulere immunforsvaret i kroppen. I de fleste tilfeller består denne moduleringen av stimulering av makrofager og relaterte celletyper.

Ved betegnelsen "makrofag" menes, blant annet, celler som er istand til å omslutte partikler som har en størrelse på 1-10 um og i tillegg som affiserer sitt miljø gjennom å sekretere biologisk aktive substanser. Betegnelsen "makrofag" omfatter også relaterte celletyper, slik som coelomocytter og de fleste fagocytter av lavere dyr (invertebrater), promonocytter, monocytter, Kuffperceller, mikrogliale celler, histiocytter og vevsmakrofager av høyere dyr (virveldyr) og forskjellige typer av syncytiaceller og kjempeceller som er dannet ved fusjon med enkelt-makrofager.

Et stort antall IM'er består av karbohydrater, slik som pi-»3-glukaner og alginater (salter av polymannuronnsyre) eller inneholder karbohydratenheter slik som bakterielle polysakkarider, LPS og peptidoglykaner. Noen av disse forbindelsene for eksempel LPS er toksiske og derfor ikke egnet for anvendelse i human- eller veterinærmedisin i de tilfeller hvor immunitetsforsterkende effekt er ønskelig. Andre IM'er slik som p l-»3-glukaner synes å være i det vesentlige ikke-toksiske selv om de har en klar biologisk aktivitet både in vitro og in vivo. Som eksempler på farmakologiske effekter forårsaket av de sistnevnte forbindelsene kan blant annet nevnes; sterk stimulering av produksjon av cytokin, nitrogenoksid og arakidonsyremetabolitter i makrofager (Seljelid, R. og Eskeland, T., Eur. J. Haematol, 51, 267- 275, 1993; Seljelid, R. og Busund, L-T.R., Eur. J. Haematol., 52, 1-12, 1994; Sveinbjørnsson, B., Olsen, R., Seternes, O.M. og Seljelid, R., Biochem. Biophys. Res Comm., 223, 643-649, 1996, resistens for letale infeksjoner i både pattedyr og lavere virveldyr (dyr) og virvelløse dyr (Dalmo, R.A., Bøgwald, J., Ingebrigtsen, K. og Seljelid, R., J. Fish Diseases, 19, 449-457, 1996; Busund, L.-T., Rasmussen og Seljelid, R. i Molecular Pathogenesis ofSurgical Infections, Wadstrom, T., Holder, LA., Kronvall, G. (eds.), Proceedings of the Eric Fernstrom Symposium, Lund, pp 293-302, 1992), regresjon av syngeneiske tumorer i mus (Seljelid, R., Bioscience Reports, 6, 845-851, 1986, Seljelid, R., Scand. J. Immunol. 29, 181-192, 1989) og forhindring av metastaser i eksperimentelle tumorer i rotter (Sveinbjørnsson et al., i trykken).

I de tilfellene hvor karbohydratimmunomodulatorer, under referert til som CIM^er har blitt hydrolysert i forbindelse med produksjon av oligosakkarider, har den biologiske aktiviteten generelt forsvunnet (Seljelid, R., Bøgwald, J og Lundwall, Å, Exp. Cell. Res., 131, 121-129, 1981, Seljelid, R. et al. Scand. J. Immunol., i trykken 1997).

Det er også kjent å modifisere eksisterende CIN<T>er, mens deres biologiske aktivitet med hensyn til stimulering av makrofager in vitro, opprettholdes. En slik modifikasjon er substitusjonen av hydroksylgruppe med en aminogruppe (Bøgwald, J., Seljelid, R. og Hoffmann, J., J. Carbohydr. Res., 148, 101-107, 1986, Rasmussen, L.-T. og Seljelid, R. Scand J. Immunol., 32, 321-331, 1990), det resulterende aminerte P l->3 glukan viste seg i dessuten å være vannløselig i motsetning til det ikke-modifiserte p l->3 glukan. Dette kan være forårsaket av det faktum at det nettopp er hydroksylgruppene som er viktige for aggregatdannelse i P 1 -»3 glukan ( vide infra) hvor aggregatdannelse nedsetter dets løselighet, som har blitt substituert med aminogrupper som kompliserer aggregatdannelsen, resulterende i den nettoeffekt at løseligheten øker signifikant ved den nevnte aminosubstitusjonen.

US 4 795 745 A beskriver en blanding i hvilken løselig P l->3 glukan har blitt bundet til en vannuløselig bærer, som resulterer i en blanding som oppnår aktivering av makrofager.

En annen type av modifisert P l->3 glukan er beskrevet i JP 04-2140701 A, i hvilken hydroksylgruppene av et P l-»3 glukan som har en molekylvekt fra 200 og 800 g/mol har blitt eterifisert med både lavere hydroksyalkylgrupper som har 2-4 karbonatomer og høyere alkylgrupper som har 8-26 karbonatomer. Disse forbindelsene er benyttet til for eksempel kosmetiske og medisinske formål.

En felles betegnelse for karbohydratene og spesielt P l->3 glukanene som er kjent opp til nå som immunomodulerende forbindelser er at deres binding til reseptorer på celleoverflatene til makrofagene og relaterte celletyper forekommer i hovedsak via hydrogenbindinger. Dette er innlysende når det observeres at de viktigste funksjonelle gruppene i tillegg til de aktuelle karbonskjelett er enten hydroksyl-eller aminogrupper, under referert til som hydrogenbindmgsgrupper, som begge har kapasitet til å binde til, for eksempel, en reseptor ved hjelp av hydrogenbindinger. Dersom en eller flere av disse hydrogenbindende gruppene blir erstattet med ikke-hydrogenbindende grupper, blir sannsynligvis bindingen av forbindelsene til reseptoren eller reseptorene, svekket siden substratet, for eksempel karbohydratet mister en eller flere bindingsposisjoner. Svekkelsen vil sannsynligvis bli større, dess mindre hydrogenbindingskapasitet de substituerende gruppene representerer. Dessuten er steriske hindringer, dersom der er noen, ofte viktige for bindingen, og siden både hydroksyl- og aminogrupper fra et sterisk synspunkt er relativt uhindrede grupper, kan en sterisk hindret substituent for en av disse gruppene svekke bindingen til reseptoren eller reseptorene. Som en regel øker svekkelsen av bindingen mer jo mer sterisk hindret en substituent er.

For å oppsummere den ovennevnte diskusjonen, kan det derfor etableres at en substituent for hydroksyl- eller aminogrupper som både har en lavere hydrogenbindende kapasitet og en større sterisk hindring enn noen av de andre ovennevnte gruppene i første omgang er forventet å forårsake en svekkelse av bindingen av karbohydratet til reseptoren.

Imidlertid, i henhold til foreliggende oppfinnelse, har det overraskende blitt funnet at immunomodulerende karbohydrater som har blitt eterifisert med alifatiske hydrokarbonkjeder har en immunomodulerende effekt og, følgelig stimulerer makrofager og relaterte celletyper. For disse eterifiserte immunomodulerende karbohydratene, har den forventede svekkelsen av reseptorbinding til makrofagene derfor ikke forekommet.

IM'ene som består av rene karbohydrater, slik som P l->3 glukaner, alginater og agarose, er selvsagt hydrofile, men er alle sammen dårlig løselige i vann på grunn av sin høye molekyl vekt i kombinasjon med aggregatdannelse og intermolekylære hydrogenbindinger. Siden disse egenskapene ofte reduserer den generelle biotilgjengeligheten av forbindelser er dette ufordelaktig for deres anvendelse som farmasøytiske preparater, fremfor alt med hensyn til blant annet dosering, opptak, distribusjon og biologisk halveringstid i kroppen etter administrasjon. Det er kjent ( vide supra) at modifiserte pi-»3 glukaner ofte er mer vannløselige enn de ikke-modifiserte utgangsmaterialene til tross for en tilsynelatende uvesentlig modifikasjon av nevnte type av forbindelse. Det synes derfor sannsynlig at også mindre endringer i mange tilfeller er tilstrekkelige for å betydelig innvirke på, for eksempel, intermolekylære hydrogenbindinger og aggregatdannelse som i høy grad forårsaker den ubetydelige vannløselighet av mange ikke-modifiserte IM'er.

Eterdannelsen av disse forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedring av de lipofile egenskapene til forbindelsene. Disse nye lipofile egenskapene innvirker blant annet på, dosering, opptak, distribusjon og biologisk halveringstid i kroppen etter administrasjon på en fordelaktig måte med opprettholdt eller forbedret biologisk aktivitet. Den økede lipofilisiteten av forbindelsene, i henhold til foreliggende oppfinnelse, resulterer i at deres generelle kapasitet til å penetrere hud er god, hvorigjennom topiske administreringsformer er spesielt fordelaktige på grunn av den forbedrete reseptiviteten.

Et formål med oppfinnelsen er derfor å presentere en helt ny klasse av forbindelser omfattende eterdannede karbohydrater som har en immunomodulerende effekt.

Et annet formål med den foreliggende oppfinnelsen er å fremskaffe nye karbohydratderivater som har blitt gjort til etere med en eller flere alifatiske hydrokarbonkjeder, nevnte karbohydratderivater stimulerer makrofager og relaterte celletyper.

Et videre formål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe eterifiserte karbohydratderivater som har mer fordelaktige preparat- og administrasjonsegenskaper enn de korresponderende ikke-eterdannede karbohydratene.

Nok et annet formål med den foreliggende oppfinnelsen er å fremskaffe eterifiserte karbohydratderivater, hvilke alifatiske hydrokarbonkjeder kan modifiseres ved ytterligere substitusjon eller umetning, for derigjennom å påvirke dosering, opptak, distribusjon og biologisk halveringstid på en fordelaktig måte.

Et annet mål med foreliggende oppfinnelse er å framskaffe eterdannede karbohydratderivater for anvendelse som farmasøytiske preparater.

Ett eller flere mål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe en farmasøytisk blanding omfattende karbohydratderivater som har blitt eterifisert med en elelr flere alifatiske hydrokarbonkjeder.

Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelsen er å fremskaffe anvendelse av eterifiserte karbohydratderivater for fremstilling av et medikament for behandling av tilstander i hvilke makrofager og relaterte celletyper er viktige.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av eterdannede karbohydratderivater som har immunomodulerende effekt.

Detaljert beskrivelse av foreliggende oppfinnelse

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye karbohydratderivater som har immunomodulerende effekt. Med immunomodulerende effekt forstås at de nye karbohydratderivater stimulerer eller nedregulerer makrofager og relaterte celletyper og er egnet for behandling av betennelse, infeksjoner eller degenererte tilstander.

De nye karbohydratderivatene, ifølge den foreliggende oppfinnelsen, har en immunomodulerende effekt og inneholder et oligo- eller polysakkarid, nevnte oligo-eller polysakkarid omfattende i det minste 5 monosakkaridenheter i karbohydratkjeden, foretrukket fra 5 til 100 monosakkaridenheter, mer foretrukket fra 5 til 60 monosakkaridenheter, enda mer foretrukket fra 5 til 20 monosakkaridenheter, og enda mer foretrukket fra 5 til 10 monosakkaridenheter, mest foretrukket fra 5 til 8 monosakkaridenheter, og aller mest foretrukket 6 eller 7 monosakkaridenheter. I disse karbohydratderivatene er en eller flere hydroksylgrupper omgjort til eter med en eller flere identiske eller forskjellige alifatiske hydrokarbonkjeder inneholdende i det minste 7 karbonatomer, foretrukket fra 7 til 30 karbonatomer, mer foretrukket fra 12 til 22 karbonatomer, enda mer foretrukket fra 16 til 20 karbonatomer, og mest foretrukket 18 karbonatomer. Graden av eterdannelse av disse karbohydratderivatene er 10-90 vekt%, foretrukket 30-70 vekt%, mer foretrukket 40-60 vekt% og enda mer foretrukket 50 %. Den mest foretrukne grad av eterifisering kan også uttrykkes som mengde av eteromgjorte hydroksylgrupper, 50 vekt% samsvarer med tilstanden at omtrent 2/9 av hydroksylgruppene er eterifisert med alifatiske hydrokarbonkjeder. Videre kan disse alifatiske hydrokarbonkj edene eventuelt ytterligere substitueres med foretrukket en eller flere halogenatomer og/eller beskyttede eller ubeskyttede hydroksylgrupper.

De eterifiserte karbohydratderivatene ifølge oppfinnelsen er foretrukket derivater eller analoger av P 1—>3 glukaner, kurdlan, alginsyre, agarose, laminaran, gjærglukan eller annen glukan.

En foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter et eterifisert karbohydratderivat som har den følgende generelle formel I:

hvor

n er et heltall i område fra 3 til 98, foretrukket et tall fra 3 til 58, mer foretrukket et heltall fra 3 til 18, enda mer foretrukket et tall fra 3 til 15, enda mer foretrukket et tall fra 3 til 12, enda mer foretrukket et tall fra 3 til 10, spesielt mer foretrukket et tall fra 3 til 8, enda mer spesielt foretrukket et heltall fra 3 til 6, og mest foretrukket n=4 eller 5, og

hver gruppe R uavhengig representerer et hydrogenatom eller en alifatisk hydrokarbonkj ede inneholdende fra 7 til 30 karbonatomer, mer foretrukket fra 12 til 22 karbonatomer, enda mer foretrukket fra 16 til 20 karbonatomer, og enda mest foretrukket 18 karbonatomer, nevnte hydrokarbonkjeder enten mettet eller umettet. Det vil forstås at den alifatiske hydrokarbonkj eden kan være rett eller forgrenet. I den aller mest foretrukne utførelsen er R en n-oktadekanylgruppe.

Dessuten kan R innenfor oppfinnelsens omfang, eventuelt i tillegg substitueres med foretrukket et eller flere halogenatomer og/eller beskyttede eller ubeskyttede hydroksylgrupper. Graden av eterifisering av de foretrukne karbohydratderivatene i henhold til formel I ovenfor, er 10-90 vekt%, foretrukket 30-70 vekt%, eller mer foretrukket 40-60 vekt%, og mest foretrukket 50 vekt%. Den mest foretrukne grad av eterdannelse av karbohydratderivatet i henhold til formel I kan også uttrykkes som mengden av eterdannede hydroksylgrupper, 50 vekt% korresponderer til den tilstanden at 2/9 av hydroksylgruppene er eterifisert med alifatiske hydrokarbonkjeder.

I henhold til den foreliggende oppfinnelsen er det også tilveiebrakt et eterifisert karbohydratderivat i henhold til oppfinnelsen, for anvendelse som et farmasøytika. Derfor kan det anvendes i farmasøytiske blandinger for oral, intravenøs, topisk, intraperitoneal eller subkutan administrasjon, i forbindelse med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler eller adjuvanser som er vel kjent innenfor faget.

Den farmasøytiske blandingen ifølge oppfinnelsen kan administreres topisk, i form av løsninger, suspensjoner eller systemisk, for eksempel ved oral administrasjon i form av tabletter, kapsler, siruper, pulvere eller granuler eller ved parenteral administrasjon i form av løsninger eller suspensjoner eller ved subkutan administrasjon eller ved rektal administrasjon i form av suppositorier eller transdermalt.

Mengden av eterifiserte karbohydratderivater per doseenhet i den farmasøytiske blandingen, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er innen området av fra 1 til 5000 mgj foretrukket fra 10 til 1000 mg, mer foretrukket fra 50 til 500 mg, og mest foretrukket fra 100 til 250 mg. En foretrukket farmasøytisk blanding av de eterifiserte karbohydratderivatene, ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er spesifikt utformet for topisk administrasjon.

Videre tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen anvendelse av de eterdannede karbohydratderivatene, ifølge den foreliggende oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament for terapeutisk eller profylaktisk behandling. Det fremstilte medikament er spesielt, men ikke bare, ment for behandling av ulike inflammatoriske og degenerative tilstander. . Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for medisinsk behandling av immunologiske forstyrrelser i menneske eller dyr (pasienter) i hvilke makrofager og relaterte celletyper er stimulert eller nedregulert, hvor en terapeutisk effektiv mengde av et karbohydratderivat i henhold til oppfinnelsen er administrert til en pasient. Fremgangsmåten for behandling vedrører spesielt, men ikke bare, en immunologisk forstyrrelse som manifesterer seg som en betennelses- eller degenerativ tilstand.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av nye karbohydratderivater, ifølge den foreliggende oppfinnelsen, omfattende trinnet å reagere oligo- eller polysakkaridet med en eterdannende reagens, for eksempel å reagere oligo- eller polysakkaridet med en elektrofil reagens inneholdende en alifatisk hydrokarbonkj ede i en sterkt basisk løsning i et polart løsningsmiddel, foretrukket et polart aprotisk løsningsmiddel, i en inert atmosfære. I en utførelse er oligo- eller polysakkaridet kurdlan, for eksempel P l-»3-D-polyglukopyranose, og i en foretrukket utførelse er oligo- eller polysakkaridet pi-»3-D-heksaglukopyranose. I henhold til en ytterligere utførelse er løsningsmiddelet tørr dimetylsulfoksyd og den elektrofile alifatiske hydrokarbonkj eden er et alkyljodid, foretrukket jodooktadekan. Reaksjonen er foretrukket utført i en nitrogengassatmosfære ved omtrent 20 til 60 °C i omtrent 4 til 120 timer. I henhold til en foretrukket utførelse, utføres reaksjonen ved omtrent 40 °C i omtrent 24 til 120 timer.

De etterfølgende ikke-begrensende eksempler illustrerer oppfinnelsen i mer detalj.

Beskrivelsé av figurene

Fig.l viser et IR-spektrum av kurdlan (A), jodooktadekan (B) og hydrolysert kurdlan eterifisert med jodooktadekan (C). Alle spektra ble registrert i KBr-tabletter. Fig. 2 viser et H!-NMR spektrum (DMSO-d6/CDCl3 1:1) av hydrolysert kurdlan eterdannet med jodooktadekan. Spekteret ble registrert ved en frekvens på 500 MHz ved 50 °C i en time. Fig. 3 viser frigjøringen av interleukin 1 p (IL-1) og tumornekrosefaktor a (a-TNF) fra mus-makrofager (M<j>) ekstrahert fra mus som har blitt behandlet med 50 ug av eterifisert pl->3 glukan (LG) i 12, 24, 48 og 72 t. PBS er frigjøring fra makrofager i dyr som har blitt behandlet med fosfatbuffret saltvann i 24 timer før celleekstraksjonen. Fig.4 viser frigjøring av IL-1 fra mus-makrofager som har blitt behandlet in vitro med eterifisert pi-»3-glukan (LG, 50 ug/ml), bakterielt lipopolysakkarid (LPS, 1 ug/ml) eller emulgert sesamolje (L, 50 ug/ml) etter 24 timers behandling. Fig.5 viser frigjøring av a -TNF fra mus-makrofager in vitro etter 8 timers-behandling. Bokstavene er de samme som i fig.4.

Eksempel 1

Under følger en beskrivelse av en generell og ikke-begrensende fremgangsmåte for fremstilling av eterifiserte karbohydratderivater av p l->3-glukan som har blitt oppnådd fra for eksempel laminaran, kurdlan eller gjærglukan. Eterifikasjonsreaksjonen er basert på deprotonering av et karbohydrat i et dipolart apotonisk løsningsmiddel, slik som dimetylsulfoksid (DMSO), i nærvær av pulverulent natriumhydroksid, derigjennom dannnende et karbohydratoksyanion som i sin tur er eterifisert ved hjelp av et alkyljodid (Ciucanu, I. og Kerek, F., Carbohydr. Res., 131, 209-217, 1984).

Produksjon av pulverulent natriumhydroksid:

Tørret dimetylsulfoksid, under referert til som DMSO er produsert ved å tilsette 4Å mdlkylærsikter (4-8 mesh, Fluka.Co., Buchs, Sveits) til DMSO, hvorpå blandingen røres ved lav hastighet i 3 dager. Så tilsettes 40 ml av tørr DMSO til 1 ml av vandig løsning av natriumhydroksid som har en konsentrasjon på 1 g/ml. Blandingen røres så ved hjelp av ultralyd i 4 min. i et vannbad som har en temperatur på 30 °C (trinn A) og sentrifugeres så i en bordsentrifuge ved 3000 opm i 15 min ved romtemperatur (trinn B). Supernatanten fjernes (trinn C) og ytterligere 40 ml av tørket DMSO tilsettes (trinn D), hvorpå trinnene A-D som over repeteres 5 ganger. Endelig fortynnes det tørre pulverulente natriumhydroksidet i tørr DMSO til en konsentrasjon på 1 g/10 ml.

Produksjon av P l-»3-glukanløsning i DMSO:

Først tørkes P l-»3-glukan over natten i vakuum ved romtemperatur. Det tørre P l-»3-glukan blandes så med tørr DMSO til en konsentrasjon på 1 g/25 ml, hvorpå blandingen rystes ved 40 °C i 3-5 dager.

Eterifikasjonen av p l-»3-glukan med jodooktadekan:

50 ml av suspensjon eller løsning av p l->3-glukan i DMSO av konsentrasjon 1 g/25 ml blandes med 25 ml av en suspensjon av pulverulent natriumhydroksid i DMSO av en konsentrasjon på 1 g/10 ml og 25 ml tørr DMSO i en 250 ml rundkolbe. Kolben fylles med nitrogengass og forsegles, hvorpå blandingen røres ved 40 °C i 24 timer. Syv gram jodooktadekan (Fluka) tilsettes, hvorpå kolben igjen fylles med nitrogengass og forsegles. Etter ytterligere røring ved 40 °C i 24 timer, avkjøles rundkolben langsomt til romtemperatur under kontinuerlig røring.

Rensing av produktet:

Reaksjonsblandingen sentrifugeres ved 3000 opm i 15 min ved romtemperatur, hvorpå den nedre væskefasen fjernes. Den faste fasen suspenderes igjen i 150 ml metanol og røres i 1 time ved romtemperatur (trinn A). Så sentrifugeres suspensjonen ved 3000 opm i 15 min ved romtemperatur (trinn B), og væskefasen fjernes (trinn C). Trinnene A-C gjentas 3 ganger, hvorpå den tørre resten vaskes tre ganger med absolutt etanol på samme måte som i trinnene A-C. Resten tørkes under en strøm av nitrogengass og så finner ytterligere tørking sted i en desikator i vakuum i 2-3 dager.

Det resulterende utbyttet oppgår vanligvis til 100 % med hensyn til mengde av konsumert karbohydrat. Konjugatet mellom hydrolysert kurdlan og jodooktadekan, under referert til som C-C 18, er et lysgult pulver, som er løselig i vegetabilske oljer, slik som sesamolje, men har lav løselighet i kloroform (CHCI3). Videre er K-C18 svært lett dispergert i etanol eller aceton. Strukturen til K-C18 representeres ved den generelle formel I (s. 7).

Renset K-C18 ble analysert ved hjelp av HPLC ved bruk av analytisk reversert fase C-18 kolonne (Millipore, Milford, MA, USA) ved en bølgelengde på 280 nm. Den benyttede mobile fase var enten metanol/CHCl3 20:80, CHC13 eller petroleum/CHCb 20:80 og retensjonstiden på K-C18 ble i alle klasser forskjellige fra retensjonstiden for jodooktadekan og oktadekanol, den siste er et biprodukt av reaksjonen (tabell I). Denne analysen demonstrerer at renset K-C18 var fri for kontaminasjon av jodooktadekan og oktadekanol.

IR-spektra av kurdlan (A), oktadekanol (B) og K-C18 (C) er vist i fig.l. Disse spektra viser klart at hydroksylgrupper av kurdlan har blitt eterifisert. I fig.2, 'H-NMR spektrum i området 8 4,92-5,85 viser de anomere protoner og protoner av karbonskjelettet av sakkaridenheter, metylenprotoner av karbohydratskjelettet som er nabostilt med et oksygenatom (-O-CH2-) i eterbindingen ved 8 3,37-3,41, korresponderende metylenprotoner

(CH2- CH7-O-) av alkylskjelettet ved 8 1,25 og metylprotoner ved 8 0,88. På grunn av den dårlige løseligheten til K-C18 i CHCI3, var det ikke mulig å gjennomføre en <13>C-NMR analyse av K-C18.

En elementanalyse viste at K-C18 besto av 65,04 % C, 10,30% H og 24,66% O. Ved hjelp av forholdet C, H og O som ble oppnådd i elementanalysen er det mulig å bestemme at gjennomsnittlig tre monosakkaridenheter ble bundet til to Cl8 alkylgrupper. Uttrykt i vekt%, inneholdt K-C18 51% Cl8 alkylgrupper og 49% sakkaridenheter. I de fleste tilfeller, fant 6- 0 alkylering trolig sted, men også 2- og 4-0 alkylering kan forekomme.

Den samme metoden, eventuelt med mindre endringer, kan suksesivt bli utført med et større antall andre pi-»3-glukaner, slik som laminaran (fremskaffet av US Biochemical Co., Cleveland, Ohio, USA), gjærglukan (fremstilt av Institutt for eksperimentell patologi ved Universitetet i Tromsø), alginsyrer, agaroser og andre oligo- eller polysakkarider inneholdende en P l-»3-grukanenhet.

Den samme metoden kan også generelt benyttes for eterifikasjon ved hjelp av et reagens inneholdende mettede eller umettede elektrofile alifatiske hydrokarbonkjeder med minst 7 karbonatomer, nevnte hydrokarbonkjeder substitueres eventuelt ytterligere med et eller flere halogenatomer og/eller beskyttede eller ubeskyttede hydroksylgrupper. Den alifatiske hydrokarbonkj eden affiserer de lipofile egenskapene av karbohydratderivatet og er derfor viktig for blant annet resepsjonen, organdistribusjonen og generell kapasitet av karbohydratderivatet til penetrering av hud og andre vev.

Eksempel 2

Under følger en beskrivelse av en generell og ikke-begrensende metode for sur hydrolytisk produksjon av oligo- eller polysakkarider som er egnet for eterifikasjon ved hjelp av alifatiske hydrokarbonkjeder. 10 g kurdlan (tilveiebrakt av Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) suspenderes i 500 ml 90% maursyre i en tre-halset rundkolbe utstyrt med en refluks avkjøler og et termometer, hvorpå blandingen røres kraftig inntil all kurdlan er oppløst. Kolben plasseres i et vannbad og kurdlanet hydrolyseres i omtrent 20-25 minutter ved omtrent 90 °C. Så fjernes kolben fra vannbadet og avkjøles til romtemperatur. Hydro ly såtet evaporeres til tørrhet i vakuum, hvorpå 300 ml destillert vann tilsettes og løsningen kokes i 2 t. Deretter fordampes hydrolysatet en gang til for fullstendig å fjerne maursyren, hvorpå hydrolysatet dialyseres mot destillert vann i 3 dager med 5 skift av vann. Innholdet av dialyserøret sentrifugeres ved 3 500 opm i 20 min og supernatanten frysetørkes.

Eksempel 3

Bestemmelsen in vivo av karbohydratderivatenes biologiske aktivitet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er angitt nedefor.

Immunomodulerings eksperimenter i mus:

0,5 mg K-C18 ble oppløst i sesamolje og suspendert ved hjelp av risting i 1 ml PBS. 0,1 ml av denne suspensjonen ble injisert inn i bukhulen i mus. Etter 12, 24, 48 og 72 t, ble peritoneal-makrofager høstet ved hjelp av "lavage" fra grupper på 5 dyr hver. Kontrollen besto av makrofager fra dyr til hvilke en lignende mengde sesamolje har blitt administrert. Så ble makrofagene dyrket in vitro under serumfrie betingelser og mengden a-TFN og IL-1 i mediet ble analysert ved hjelp av kjent ELISA-teknikk (fig.3).

Som det fremgår fra fig.3, stimulerer K-C18 i det vesentlige frigjøring av IL-1 etter 12, 24 og 48 timer. Etter 72 timer synes effekten å avta. Det er også opplagt fra fig.3 at forsøksdyrene som ble behandlet med K-C18 presenterte lav sekresjon til a-TFN fra makrofager.

Eksempel 4

Immunologiske eksperimenter in vitr :

Makrofager fra normale ikke-behandlete dyr ble inkubert med det eteromgjorte P l-»3-glukan K-C18 (LG) ved en konsentrasjon på 50 ug/ml i 24 timer, hvorved en betydelig sekresjon av IL-1 ble observert (Fig.4). Positive og negative kontroller ble oppnådd ved hjelp av inkubasjon med henholdsvis LPS (1 ug/ml) og sesamolje (L, 50 ug/ml).

Eksempel 5

En analyse av a-TFN under inkuberingsbetingelser i henhold til eksempel 4 i 8 timer demonstrerte ikke vesentlig høyere sekresjon enn den oppnådd i den negative kontrollen med sesamolje (fig.5).

Diskusjon

Som det fremgår av de eksperimentelle data stimulerer de nye karbohydratene, ifølge den foreliggende oppfinnelsen, makrofager in vivo så vel som in vitro. Det forventes at nevnte karbohydratderivater vil ha et bredt område av anvendelser som immunitetsforsterkende agens i foretrukket topisk og oral administrasjon. Spesielt interessante anvendelser er farmasøytiske preparater ment for behandling av betennelses-, infektiøse- eller degenerative tilstander.

Claims

1. Karbohydratderivat som har en immunomodulerende effekt omfattende et oligo- eller polysakkarid, karakterisert ved at nevnte oligo- eller polysakkarid omfattende i det minste 5 monosakkaridenheter i karbohydratkjeden og at en eller flere av hydroksylgruppene av karbohydratkjeden har blitt eterifisert med enten en eller flere identiske eller forskjellige, mettede eller umettede alifatiske hydrokarbonkjeder som har i det minste 7 karbonatomer, nevnte hydrokarbonkjeder substitueres eventuelt ytterligere med en eller flere substituenter fra halogenatomer og hydroksylgrupper.

2. Karbohydratderivat som krevet i krav 1, karakterisert ved at den eller hver hydrokarbonkj ede inneholder fra 7 til 30 karbonatomer.

3. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at karbohydratkjeden inneholder fra 5 til 100 monosakkaridenheter.

4. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at karbohydratkjeden omfatter et derivat eller en analog av P l-»3-glukan, alginsyre, agarose, kurdlan, laminaran, gjærglukan eller noen andre glukaner.

5. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved den generelle formelen I: hvor n er et heltall i området fra 3 til 98, og hver gruppe R uavhengig representerer et hydrogenatom eller en alifatisk, mettet eller umettet hydrokarbonkj ede som har fra 7 til 30 karbonatomer.

6. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at den eller hver hydrokarbonkj ede inneholder fra 12 til 22 karbonatomer.

7. Karbohydratderivat som krevet i krav 6, karakterisert ved a t den eller hver hydrokarbonkj ede inneholder fra 16 til 20 karbonatomer og fortrinnsvis 18 karbonatomer.

8. Karbohydratderivat som krevet i krav 7, karakterisert ved at det eller hver hydrokarbonkj ede inneholder en n-oktadekanylgruppe.

9. Karbohydratderivat som krevet i krav 5, eller ethvert av kravene 6 til 8 når avhengig av krav 5, karakterisert ved a t n er et heltall fra 3 til 58.

10. Karbohydratderivat som krevet i krav 9, karakterisert ved atneret heltall fra 3 til 18.

11. Karbohydratderivat som krevet i krav 10, karakterisert ved atneret heltall fra 3 til 15.

12. Karbohydratderivat som krevet i krav 11, karakterisert ved atneret heltall fra 3 til 12.

13. Karbohydratderivat som krevet i krav 12, karakterisert ved atneret heltall fra 3 til 10.

14. Karbohydratderivat som krevet i krav 13, karakterisert ved atneret heltall fra 3 til 8, mer foretrukket fra 3 til 6 og mest foretrukket n=4 eller 5.

15. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det er 6- 0 alkylert.

16. Karbohydratderivat som krevet i krav 15, karakterisert ved at det er 6- 0- og 2-0-alkylert.

17. Karbohydratderivat som krevet i krav 16, karakterisert ved at det er 6- 0-, 4- 0- og 2-Oalkylert.

18. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at de alifatiske hydrokarbonkj edene utgjør 10-90 vekt% av molekylvekten av karbohydratderivatet.

19. Karbohydratderivat som krevet i krav 18, karakterisert ved at de alifatiske hydrokarbonkj edene utgjør 30 - 70 vekt% av molekylvekten.

20. Karbohydratderivat som krevet i krav 19, karakterisert ved at de alifatiske hydrokarbonkj edene utgjør 40-60 vekt% av molekylvekten og foretrukket 50% av molekylvekten.

21. Karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1-20, karakterisert ved at det anvendes i et legemiddel.

22. Legemiddelblanding, karakterisert ved at den omfatter et karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1-20 i forbindelse med en farmasøytisk akseptabel adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

23. Blanding som krevet i krav 22, karakterisert ved at mengden av karbohydratderivat per doseenhet er innenfor området på 1 til 5000 mg.

24. Blanding som krevet i krav 23, karakterisert ved at mengden av karbohydratderivat per doseenhet er innenfor området på 10 til 1000 mg, mer foretrukket fra 50 til 500 mg, og mest foretrukket fra 100 til 250 mg.

25. Blanding ifølge ethvert av kravene 22-24 , karakterisert ved at den er tilpasset topisk administrasjon.

26. Anvendelse av et karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1-20 i fremstilling av et medikament for anvendelse i terapeutisk eller profylaktisk behandling av en menneske- eller dyrekropp.

27. Anvendelse som krevet ifølge krav 26, karakterisert ved at medikamentet er ment for behandling av en betennelsestilstand.

28. Anvendelse som krevet i krav 26, karakterisert ved at medikamentet er ment for behandling av degenerative tilstander.

29. Fremgangsmåte for fremstilling av et karbohydratderivat som krevet i ethvert av kravene 1 -20, karakterisert ved at den omfatter trinnet å reagere oligo- eller polysakkaridet med et eterdannende reagens.

30. Fremgangsmåte som krevet i krav 29, karakterisert ved at nevnte eterdannende reagens inneholder en elektrofil alifatisk hydrokarbonkj ede som fortrinnsvis er et alkyljodid, mest foretrukket jodooktadekan.

31. Fremgangsmåte som krevet i ethvert av kravene 29 til 30, karakterisert ved at oligo- eller polysakkaridet er p l->3-D-polyglukopyranose og fortrinnsvis P l->3-heksaglukopyranose.