NO318378B1 - Process for the preparation of oestrogens from jump urine - Google Patents

Process for the preparation of oestrogens from jump urine Download PDF

Info

Publication number
NO318378B1
NO318378B1 NO19990953A NO990953A NO318378B1 NO 318378 B1 NO318378 B1 NO 318378B1 NO 19990953 A NO19990953 A NO 19990953A NO 990953 A NO990953 A NO 990953A NO 318378 B1 NO318378 B1 NO 318378B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
urine
silica gel
mixture
water
conjugated estrogens
Prior art date
Application number
NO19990953A
Other languages
Norwegian (no)
Other versions
NO990953D0 (en
NO990953L (en
Inventor
Ivan Ban
Heinz-Helmer Rasche
Henning Heinemann
Friedrich Borchers
Original Assignee
Abbott Products Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Products Gmbh filed Critical Abbott Products Gmbh
Publication of NO990953D0 publication Critical patent/NO990953D0/en
Publication of NO990953L publication Critical patent/NO990953L/en
Publication of NO318378B1 publication Critical patent/NO318378B1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07JSTEROIDS
    • C07J75/00Processes for the preparation of steroids in general
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/30Oestrogens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Vehicle Interior And Exterior Ornaments, Soundproofing, And Insulation (AREA)
  • Organic Insulating Materials (AREA)
  • Silicon Compounds (AREA)
  • Extraction Or Liquid Replacement (AREA)

Abstract

Recovery of a phenolics-depleted natural mixture of conjugated oestrogens from the urine of pregnant mares comprises (a) providing a liquid urine (which comprises a urine freed from mucous and solids, a concentrate of the latter or a urine retentate obtained by membrane filtration) and treating it with a water-soluble base to give a pH of at least 12 and subsequently treating with aqueous acid to adjust the pH to 5-8.5; (b) contacting the urine with a hydrophobised silica gel to adsorb the conjugated oestrogens and separating the gel from the mixture; (c) washing the gel with an aqueous buffer adjusted to pH 5-7; and (d) eluting the oestrogens from the gel using a mixture of water and a water-miscible solvent selected from ethers, lower alcohols and lower aliphatic ketones, and optionally concentrating the eluate;

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en naturlig blanding av konjugerte østrogener fra urinen fra drektige hopper. The present invention relates to the production of a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of pregnant mares.

Østrogenet anvendes i medisinen for hormonerstat-ningsterapi. Spesielt anvendes østrogenblandinger for behand-ling og profylakse av plagene som opptrer hos kvinner under klimakteriet etter naturlig eller kunstig menopause. Naturlige blandinger av konjugerte østrogener, slike som foreligger i urinen hos drektige hopper, har her vist seg som spesielt virksomme og godt forenlige. Estrogen is used in medicine for hormone replacement therapy. In particular, estrogen mixtures are used for the treatment and prophylaxis of the ailments that occur in women during the menopause after natural or artificial menopause. Natural mixtures of conjugated oestrogens, such as are present in the urine of pregnant mares, have here been shown to be particularly effective and well compatible.

Innholdet av faste stoffer i urinen fra drektige hopper {= pregnant mares urine, i det følgende forkortet som "PMU") kan naturligvis variere innenfor brede områder og ligger vanligvis i et område på 40-90 g tørrstoff pr. liter. Foruten urea og slike vanlige urininnholdsstoffer er det i faststoffinnholdet av PMU inkludert fenoliske bestanddeler i mengder på ca. 2-5 vekt% beregnet på tørrstoff. Disse fenoliske bestanddeler fører kresoler og dihydro-3,4-bis[(3-hydro-ksyfenol) metyl] -2 (3H) -f uranon, kjent som HPMF. Disse kan foreligge i fri eller konjugert form. I PMU er det inneholdt en naturlig blanding av østrogener som hovedsakelig foreligger i konjugert form, f.eks. som svovelsyrehalvester-natriumsalt (i det etterfølgende forkortet som "sulfatsalt"). Innholdet av konjugerte østrogener (beregnet som østrogensulfatsalt) kan ligge mellom 0,3 og 1 vekt, beregnet på tørrstoff. The content of solids in the urine of pregnant mares {= pregnant mares' urine, hereinafter abbreviated as "PMU") can of course vary within wide ranges and is usually in a range of 40-90 g dry matter per litres. In addition to urea and such common urine constituents, the solids content of PMU includes phenolic components in amounts of approx. 2-5% by weight calculated on dry matter. These phenolic constituents include cresols and dihydro-3,4-bis[(3-hydroxyphenol)methyl]-2(3H)-furanone, known as HPMF. These can be present in free or conjugated form. PMU contains a natural mixture of estrogens which are mainly in conjugated form, e.g. as sulfuric acid half-ester sodium salt (hereinafter abbreviated as "sulfate salt"). The content of conjugated estrogens (calculated as estrogen sulphate salt) can lie between 0.3 and 1 weight, calculated on dry matter.

Ekstrakter inneholdende konjugerte østrogener fremstilles vanligvis fra PMU ved ekstraksjon med et ikke-vannblandbart eller kun lite vannblandbart, polart, organisk løsningsmiddel, slik som f.eks. eddiksyreetylester, n-butanol eller sykloheksanol. Ved slike væske-væskeekstraksjoner opptrer imidlertid mange problemer, slik som sterk skumdannelse, sedimentdannelse, emulsjonsdannelse og dårlig faseseparasjon. Flere ekstråksjonstrinn er vanligvis nødvendig, hvilket fører til tap og en kun delvis gjenvinning av østrogeninnholdet. Extracts containing conjugated estrogens are usually prepared from PMU by extraction with a non-water-miscible or only slightly water-miscible, polar, organic solvent, such as e.g. acetic acid ethyl ester, n-butanol or cyclohexanol. With such liquid-liquid extractions, however, many problems arise, such as strong foam formation, sediment formation, emulsion formation and poor phase separation. Several extraction steps are usually required, leading to loss and only partial recovery of the estrogen content.

For opparbeidelse av små mengder urin- og plasma-væsker for analytisk bestemmelse av østrogener ved hjelp av gasskromatografi, er det av Heikkinnen et al. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186-1189) og Shackleton et al. (Clinica Chimica Acta 107(1980) 231-243) foreslått en fastfaseektraksjon av østrogener ved hjelp av en patron med silanisert kiselgel inneholdende oktadecylsilanrester ("Sep-Pak" CiB-cartridge, produsent Waters Ass. Inc., Milford, MA, USA). Ved den av Heikkinnen et al. beskrevne fremgangsmåte dreier det seg om en rent analytisk fremgangsmåte som ble utviklet som en hurtig og effektiv ekstraksjonsmetode for isolering av alle østrogener, dvs. fra de lite polare, ukonjugerte østrogener til de sterkt polare, flere ganger konjugerte østrogener, fra biologiske væsker som menneskeurin og -plasma. De ekstraherte østrogener bestemmes deretter ved hjelp av gasskromatografi og massespek-troskopi. Den presenterte fremgangsmåte omfatter følgende trinn: pH-verdiinnstillingen av en urinprøve til en verdi på 3, påfylling av en kolonne med silanisert silikagel som inneholder oktadecylsilanrester, sammen med den således forbehandlede urin, og vasking av den påfylte kolonne med en vandig bufferoppløsning med en pH-verdi på 3. Så elueres østrogenet fra patronen med metanol. Det foreligger imidlertid ingen angivelse om ytterligere stoffer inneholdt i det østrogen-holdige eluat. For processing small amounts of urine and plasma fluids for the analytical determination of estrogens by means of gas chromatography, it is by Heikkinnen et al. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186-1189) and Shackleton et al. (Clinica Chimica Acta 107(1980) 231-243) proposed a solid-phase extraction of estrogens using a silanized silica gel cartridge containing octadecylsilane residues ("Sep-Pak" CiB cartridge, manufacturer Waters Ass. Inc., Milford, MA, USA) . At the one by Heikkinnen et al. described method is a purely analytical method that was developed as a fast and efficient extraction method for the isolation of all oestrogens, i.e. from the less polar, unconjugated oestrogens to the highly polar, multiple conjugated oestrogens, from biological fluids such as human urine and - plasma. The extracted estrogens are then determined by means of gas chromatography and mass spectroscopy. The presented method comprises the following steps: adjusting the pH value of a urine sample to a value of 3, filling a column with silanized silica gel containing octadecylsilane residues, together with the thus pretreated urine, and washing the filled column with an aqueous buffer solution having a pH -value of 3. The estrogen is then eluted from the cartridge with methanol. However, there is no indication of further substances contained in the oestrogen-containing eluate.

I patentskrift CS 224 881 (Semenka; Chemical Abstracts spalte 104, nr. 11, 1986, Abstract 82747) åpenbares anvendelsen av et nytt middel på basis av sorbenter av poly-mertype til isoleringen av de totale 17-oktasteroider fra biologisk materiale, nemlig anvendelsen av en makroporøs kopolymer med 90-10 vekt % hydroksyetylmetakrylat 10-90 vekt % etylendimetakrylat med utskillelsesgrense for molekylmassen på 1,7 x IO"<23> til 1,6 x IO"19 kg, og en partikkelstørrelse på 20-600 /im. Målet for den beskrevne, rent analytiske fremgangsmåten er isoleringen av de totale 17-oksosteroider i fri form, og deres påfølgende kvantifisering for diagnostiske formål. Den beskrevne fremgangsmåte omfatter følgende trinn: syre-hydrolyse av en urinprøve, påfylling av en kolonne som inneholder makroporøs kopolymer, med den således forbehandlede urin, vasking av den påfylte kolonne med en hydroksidoppløs-ning og vann inntil nøytral reaksjon i eluatet, og eluering av de frie 17-oksosteroider med metanol. In patent document CS 224 881 (Semenka; Chemical Abstracts column 104, no. 11, 1986, Abstract 82747) the use of a new agent based on polymer-type sorbents for the isolation of the total 17-octasteroids from biological material is disclosed, namely the use of a macroporous copolymer with 90-10% by weight hydroxyethyl methacrylate 10-90% by weight ethylene dimethacrylate with a molecular weight cutoff of 1.7 x 10"<23> to 1.6 x 10"19 kg, and a particle size of 20-600 /im . The goal of the purely analytical method described is the isolation of the total 17-oxosteroids in free form, and their subsequent quantification for diagnostic purposes. The described method comprises the following steps: acid hydrolysis of a urine sample, filling a column containing macroporous copolymer with the thus pretreated urine, washing the filled column with a hydroxide solution and water until neutral reaction in the eluate, and elution of the free 17-oxosteroids with methanol.

Patentskrift GB 13 71052 åpenbarer en fremgangsmåte for isolering og rensing av konjugerte østrogener (f.eks. østronsulfat eller natrium-østronsulfat) fra urinen til drektige hester, eller også fra en vandig eller alkoholisk-vandig ekstrakt av urinen fra drektige hester, idet urinvæsken bringes i kontakt med anionbytterharpiksen slik at de konjugerte østrogener først adsorberes på harpiksen. Som anionbytter dreier det seg fortrinnsvis om en sterkt basisk polyamin-harpiks, f.eks. Dowex l-X-2, som har kvaternære ammonium-grupper som funksjonelle rester. De konjugerte østrogener bindes som anioniske sulfatsalter gjennom ionisk vekselvirk-ning på den kationisk ladete adsorpsjonsharpiks. Elueringen av de således adsorberte konjugert østrogener skjer med et vandig-alkoholisk og kloridionholdig oppløsningsmiddel. Patent document GB 13 71052 discloses a method for the isolation and purification of conjugated estrogens (e.g. estrone sulfate or sodium estrone sulfate) from the urine of pregnant horses, or also from an aqueous or alcoholic-aqueous extract of the urine of pregnant horses, the urinary fluid being brought in contact with the anion exchange resin so that the conjugated estrogens are first adsorbed on the resin. The anion exchanger is preferably a strongly basic polyamine resin, e.g. Dowex l-X-2, which has quaternary ammonium groups as functional residues. The conjugated estrogens are bound as anionic sulphate salts through ionic interaction on the cationically charged adsorption resin. The elution of the thus adsorbed conjugated estrogens takes place with an aqueous-alcoholic and chloride ion-containing solvent.

Målet for foreliggende oppfinnelse er å utvikle en teknisk fremgangsmåte for fremstilling av de naturlige blandinger av konjugerte østrogener fra PMU uten ulempene kjent fra de hittil vanlige væske-væskeekstråksjoner, hvilken fremgangsmåte gir hovedsakelig HPMF-fritt produkt med et meget lite innhold av fenoliske urininnholdsstoffer. The aim of the present invention is to develop a technical method for the production of the natural mixtures of conjugated estrogens from PMU without the disadvantages known from the hitherto usual liquid-liquid extractions, which method gives a mainly HPMF-free product with a very low content of phenolic urinary substances.

Det er nå funnet en fremgangsmåte ved hvilken det i en fastfase-ekstraksjon på hydrofobisert kiselgel kan fremstilles en blanding med svært lite fenoliske'urininnholds-stof fer og hovedsakelig HPMF-fri, men som imidlertid har praktisk talt fullstendig det samme naturlige østrogeninnhold som PMU, og som kan anvendes som utgangsmateriale for fremstilling av farmasøytika inneholdende den naturlige blanding av konjugerte østrogener fra PMU som aktive komponenter. A method has now been found by which, in a solid-phase extraction on hydrophobized silica gel, a mixture can be produced with very little phenolic-urine-content substances and mainly HPMF-free, but which, however, has practically completely the same natural estrogen content as PMU, and which can be used as starting material for the manufacture of pharmaceuticals containing the natural mixture of conjugated estrogens from PMU as active components.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av en naturlig blanding av konjugerte østrogener, der fenoliske urininnholdsstoffer hovedsakelig er fjernet, fra PMU, er kjennetegnet ved at a) en urinvæske, befridd for slimstoffer og faste stoffer, som er et inndampet konsentrat av urinen eller et inndampet urinretentat dannet ved membranfiltrering av urinen, behandles med en tilstrekkelig mengde av en vannløselig base for innstilling av en pH-verdi på minst 12, etterfulgt av at pH-verdien i urinvæsken behandlet med basen innstilles til en pH-verdi i området 5-8,5 ved tilsetning av en tilstrekkelig The method according to the present invention for the production of a natural mixture of conjugated estrogens, in which phenolic urinary constituents have mainly been removed, from PMU, is characterized by a) a urine liquid, freed of mucus and solids, which is an evaporated concentrate of the urine or an evaporated urinary retentate formed by membrane filtration of the urine, is treated with a sufficient amount of a water-soluble base to set a pH value of at least 12, followed by the pH value of the urine fluid treated with the base being set to a pH value in the range of 5-8, 5 by adding a sufficient

mengde av en vandig syreløsning, amount of an aqueous acid solution,

b) urinvæsken forhåndsbehandlet med basen og innstilt til pH 5-8,5, bringes i kontakt med en tilstrekkelig mengde av b) the urine fluid pre-treated with the base and adjusted to pH 5-8.5, is brought into contact with a sufficient quantity of

en hydrofobisert kiselgel for adsorpsjon av blandingen av konjugerte østrogener inneholdt i urinvæsken, og etterfulgt av at den hydrofobiserte kiselgel inneholdende blandingen av konjugerte østrogener separeres fra den overflødige urinvæske, c) den hydrofobiserte kiselgel inneholdende blandingen av konjugerte østrogener vaskes med en vandig buffer-løsning innstilt til et pH-område på 5-7, d) den vaskede, hydrofobiserte kiselgel bringes i kontakt med en tilstrekkelig mengde av en elueringsvæske for a hydrophobized silica gel for adsorption of the mixture of conjugated estrogens contained in the urine fluid, and followed by separating the hydrophobized silica gel containing the mixture of conjugated estrogens from the excess urine fluid, c) the hydrophobized silica gel containing the mixture of conjugated estrogens is washed with an aqueous buffer solution set to a pH range of 5-7, d) the washed, hydrophobized silica gel is contacted with a sufficient amount of an elution liquid for

desorpsjon av den adsorberte blanding av konjugerte østrogener, som er en blanding av vann og et vannblandbart organisk løsningsmiddel utvalgt fra gruppen vannblandbare etere, lavere alkanoler og lavere alifatiske ketoner, etterfulgt av at eluatet inneholdende blandingen av konjugerte østrogener separeres fra den hydrofobiserte kiselgel og eventuelt inndampes. desorption of the adsorbed mixture of conjugated estrogens, which is a mixture of water and a water-miscible organic solvent selected from the group of water-miscible ethers, lower alkanols and lower aliphatic ketones, followed by the eluate containing the mixture of conjugated estrogens being separated from the hydrophobized silica gel and optionally evaporated .

Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan det anvendes PMU som sådan, et konsentrat dannet fra PMU ved inndamping eller et retentat dannet ved membranfiltrering. Den samlede urin befris først på kjent måte for slim- og faste stoffer. Fortrinnsvis lar man faste stoffer og slimstoffer bunnfelle seg, og disse separeres deretter etter kjente separasjonsmetoder, f.eks. dekantering, separering og/eller filtrering. PMU kan således f.eks. ledes gjennom en kjent separasjonsanordning, f.eks. en separator, et filtrerings-anlegg eller en sedimentator. Som separasjonsanordning kan det f.eks. anvendes et sandsjikt, eller det kan anvendes kommersi-elt tilgjengelige separatorer, f.eks. dyse- eller kammer-separatorer. Om ønskelig kan det også anvendes et mikrofiltreringsanlegg eller et ultrafiltreringsanlegg for samtidig oppnåelse av et hovedsakelig kim- og virusfritt filtrert PMU. In the method according to the present invention, PMU can be used as such, a concentrate formed from PMU by evaporation or a retentate formed by membrane filtration. The collected urine is first freed of mucus and solids in a known manner. Preferably, solids and mucus are allowed to settle, and these are then separated according to known separation methods, e.g. decantation, separation and/or filtration. PMU can thus e.g. is passed through a known separation device, e.g. a separator, a filtration plant or a sedimentator. As a separation device, it can e.g. a sand layer is used, or commercially available separators can be used, e.g. nozzle or chamber separators. If desired, a microfiltration system or an ultrafiltration system can also be used to simultaneously obtain a mainly germ- and virus-free filtered PMU.

Om ønskelig kan urinen tilsettes konserveringsmidler, germicider, baktericider" og/eller antiheIminitika. If desired, preservatives, germicides, bactericides" and/or antiheminics can be added to the urine.

Når det i stedet for PMU skal anvendes et oppkonsentrert PMU-retentat kan dette fremstilles på kjent måte fra PMU ved membranfiltrering. Faststoffinnholdet i retentatet og sammensetningen av dette kan variere alt etter den anvendte PMU og den anvendte membran for membranfiltreringen, f.eks. dens porestørrelse, så vel som filtreringsbetingelsene. Ved anvendelse av en nanofiltreringsmembran kan det f.eks. oppnås en nesten tapsfri konsentrasjon av østrogeninnholdet i PMU-retentatet ved samtidig fjerning av minst inntil 50 vekt% av de lavmolekylære PMU-innholdsstoffer. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det anvendes PMU-retentater som er blitt oppkonsentrert til et forhold på ca. 1:10, f.eks. et forhold på ca. 1:7, og volumene kan også være inndampet til ca. 1/10, f.eks. ca. 1/7, av de opprinnelige PMU-volumer. When a concentrated PMU retentate is to be used instead of PMU, this can be prepared in a known manner from PMU by membrane filtration. The solids content in the retentate and its composition can vary according to the PMU used and the membrane used for the membrane filtration, e.g. its pore size, as well as the filtration conditions. When using a nanofiltration membrane, it can e.g. an almost loss-free concentration of the estrogen content in the PMU retentate is achieved by simultaneous removal of at least up to 50% by weight of the low molecular weight PMU ingredients. In the method according to the invention, PMU retentates can be used which have been concentrated to a ratio of approx. 1:10, e.g. a ratio of approx. 1:7, and the volumes can also be evaporated to approx. 1/10, e.g. about. 1/7, of the original PMU volumes.

I fremgangsmåtetrinn a) tilsettes urinvæsken en tilstrekkelig mengde av en vannløselig base for innstilling av en pH-verdi på minst 12, spesielt 13-14. Egnede som vannløselige baser er uorganiske eller organiske baser som er inerte og løselige i urinvæsken, og som er sterke nok til å oppnå en pH-verdi på minst 12. Alkalimetall- eller jordalkalimetall-hydroksider, spesielt natriumhydroksid, eller også organiske baser som kvaternære lavere alkylammoniumhydroksider, er således egnede. Basen tilsettes fortrinnsvis i form av en vandig løsning med et baseinnhold på minst 20 vekt%, fortrinnsvis 20 til 60 vekt%. En 45- til 55 % vandig natronlut har vist seg som spesielt fordelaktig. Ved denne alkaliske forbehandling blir pH-verdien i urinvæsken innstilt på minst 12, f.eks. i et område på 12-14, fortrinnsvis ca. 13, og denne alkaliske pH-verdi opprettholdes i en tilstrekkelig tid for spaltning av 1aktongrupperinger inneholdt i urininnholds-stof f er, som vanligvis kan oppgå til en 1/2 til 2 timer. Be-handl ingsbetingel sene må velges slik at de konjugerte østrogener ikke angripes. Behandlingen utføres således fortrinnsvis ved romtemperatur under begrensning av basetilsetning til en mengde nødvendig for å oppnå den ønskede pH-verdi i området 12-14. Den nødvendig mengde base for å oppnå en pH-verdi i området 12-14 kan variere alt etter sammensetningen av den anvendte PMU. Ved anvendelse av 50 % natronlut har vanligvis mengder på ca. 100 til 700 ml 50 % natronlut, beregnet på 10 1 PMU, vist seg som tilstrekkelige. Urinvæsken innstilles deretter ved tilsetning av en vandig syreløsning til en pH-verdi i området 5-8,5, fortrinnsvis 7-8,5, spesielt 8-8,5. Egnede som syrer i urinvæsken er løselige, inerte uorganiske eller organiske syrer, slik som f.eks. saltsyre, svovelsyre, fosfor-syre eller lavere karboksylsyrer som eddiksyre. En konsentrert, vandig saltsyreløsning har f.eks. vist seg som formålstjenelig. Den nødvendige syremengde for å oppnå de ovennevnte pH-områder kan variere alt etter sammensetning av den anvendte PMU og den anvendte basemengde for alkalisering. Ved anvendelse av konsentrert saltsyreløsning kan den ønskede pH-verdi vanligvis oppnås ved tilsetning av ca. 25 til 100 g konsentrert saltsyreløsning, beregnet på 1 1 PMU. In method step a) a sufficient amount of a water-soluble base is added to the urine fluid to set a pH value of at least 12, especially 13-14. Suitable as water-soluble bases are inorganic or organic bases which are inert and soluble in the urinary fluid, and which are strong enough to achieve a pH value of at least 12. Alkali metal or alkaline earth metal hydroxides, especially sodium hydroxide, or also organic bases such as quaternary lower alkylammonium hydroxides, are thus suitable. The base is preferably added in the form of an aqueous solution with a base content of at least 20% by weight, preferably 20 to 60% by weight. A 45 to 55% aqueous caustic soda has been found to be particularly beneficial. With this alkaline pretreatment, the pH value in the urine fluid is set to at least 12, e.g. in an area of 12-14, preferably approx. 13, and this alkaline pH value is maintained for a sufficient time for the cleavage of 1actone groupings contained in urine content substance f er, which can usually amount to 1/2 to 2 hours. Treatment conditions must be chosen so that the conjugated oestrogens are not attacked. The treatment is thus preferably carried out at room temperature while limiting base addition to an amount necessary to achieve the desired pH value in the range 12-14. The necessary amount of base to achieve a pH value in the range 12-14 can vary according to the composition of the PMU used. When using 50% caustic soda, quantities of approx. 100 to 700 ml of 50% caustic soda, calculated at 10 1 PMU, proved to be sufficient. The urine fluid is then adjusted by adding an aqueous acid solution to a pH value in the range 5-8.5, preferably 7-8.5, especially 8-8.5. Suitable acids in the urine fluid are soluble, inert inorganic or organic acids, such as e.g. hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or lower carboxylic acids such as acetic acid. A concentrated, aqueous hydrochloric acid solution has e.g. proved to be useful. The amount of acid required to achieve the above-mentioned pH ranges can vary according to the composition of the PMU used and the amount of base used for alkalization. When using a concentrated hydrochloric acid solution, the desired pH value can usually be achieved by adding approx. 25 to 100 g of concentrated hydrochloric acid solution, calculated on 1 1 PMU.

De anvendelige, hydrofobiserte kiselgeler i frem-gangsmåtet r inn b) er kjente omvendt-fase-kiselgeler {= revers-fase-kiselgeler, forkortet "RP-kiselgeler"), dvs. kjemisk modifiserte kiselgeler som inneholder hydrofobe funksjonelle grupper, hhv. ligander. Egnede er således f.eks. silaniserte RP-kiselgeler inneholdende som hydrofobe funksjonelle grupper n-oktadecyldimetylsilyloksy-, n-oktyldimetylsilyloksy- eller dimetylhydroksysilyloksyrester. Egnede er f.eks. silaniserte kiselgeler med midlere kornstørrelse på 15 til 500 um. Kiselgeler inneholdende dimetylhydroksysilyloksyrester med en midlere kornstørrelse i området med 0,05-0,3 mm, f.eks. "Kiselgel 60/dimetylsilanderivat" fra firmaet Merck, har vist seg som spesielt formålstjenelig. The applicable hydrophobized silica gels in the method r in b) are known reverse-phase silica gels {= reverse-phase silica gels, abbreviated "RP silica gels"), i.e. chemically modified silica gels containing hydrophobic functional groups, or ligands. Thus, e.g. silanized RP silica gels containing n-octadecyldimethylsilyloxy, n-octyldimethylsilyloxy or dimethylhydroxysilyloxy acid residues as hydrophobic functional groups. Suitable are e.g. silanized silica gels with an average grain size of 15 to 500 µm. Silica gels containing dimethylhydroxysilyloxy acid residues with an average grain size in the range of 0.05-0.3 mm, e.g. "Silica gel 60/dimethylsilane derivative" from the company Merck has proven to be particularly useful.

Adsorpsjonen av de konjugerte østrogener til den hydrofobiserte kiselgel ved at den eventuelt oppkonsentrerte PMU, eller dens retentat, bringes i kontakt med den hydrofobiserte kiselgel, kan ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved at den forbehandlede urinvæske i fremgangsmåtetrinn a) innføres i en reaktor inneholdende kiselgelen og holdes i kontakt med kiselgelen i en tilstrekkelig tid for adsorpsjon av østrogeninnholdet. Etter adsorpsjon av de konjugerte østrogener til den hydrofobe kiselgel, kan kiselgelen inneholdende blandingen av konjugerte østrogener separeres fra den over-flødige urinvæske på kjent måte. Urinvæsken kan fortrinnsvis ledes gjennom en kiselgelinneholdende søyle med en slik gjennomstrømningshastighet at kontakttiden er tilstrekkelig for adsorpsjon av østrogeninnholdet. Gjennomstrømningshastig-heter som tilsvarer en gjennomstrømning av 5 til 10 volumdeler PMU/1 volumdel kiselgel/time, er f.eks. egnede. Adsorpsjonen utføres fortrinnsvis ved romtemperatur. Gjennomstrømnings-hastigheten av urinvæsken gjennom reaktoren kan fortrinnsvis styres ved et lite overtrykk eller undertrykk. Mengden av anvendt hydrofobisert kiselgel kan variere alt etter type anvendt kiselgel og mengde faststoffinnhold i den forbehandlede urinvæske i fremgangsmåtetrinn a). Ved anvendelse av forbehandlet PMU kan f.eks. 1 volumdel hydrofobisert kiselgel inneholde minst 80 volumdeler forbehandlet PMU uten at merkbare mengder østrogener kan påvises i den utstrømmende urinvæske. Ved anvendelse av et forbehandlet PMU-konsentrat, eller PMU-retentat, blir naturligvis adsorpsjonskapasiteten til den hydrofobiserte kiselgel redusert i den grad de er oppkonsentrert. 1 volumdel hydrofobisert kiselgel kan således tilsettes en mengde urinvæske som tilsvarer 3 0 til 80, fortrinnsvis 40 til 50, volumdeler PMU. The adsorption of the conjugated estrogens to the hydrophobized silica gel by bringing the possibly concentrated PMU, or its retentate, into contact with the hydrophobized silica gel can, according to the present invention, be carried out by introducing the pre-treated urine fluid in method step a) into a reactor containing the silica gel and keeping in contact with the silica gel for a sufficient time for adsorption of the estrogen content. After adsorption of the conjugated estrogens to the hydrophobic silica gel, the silica gel containing the mixture of conjugated estrogens can be separated from the excess urine fluid in a known manner. The urine fluid can preferably be passed through a silica gel-containing column at such a flow rate that the contact time is sufficient for adsorption of the estrogen content. Flow rates corresponding to a flow of 5 to 10 volume parts PMU/1 volume part silica gel/hour are, for example, suitable. The adsorption is preferably carried out at room temperature. The flow rate of the urine liquid through the reactor can preferably be controlled by a slight positive or negative pressure. The amount of hydrophobized silica gel used can vary depending on the type of silica gel used and the amount of solids content in the pre-treated urine fluid in method step a). When using pre-treated PMU, e.g. 1 part by volume of hydrophobized silica gel contain at least 80 parts by volume of pre-treated PMU without noticeable amounts of estrogens being detectable in the outflowing urine fluid. When using a pre-treated PMU concentrate, or PMU retentate, the adsorption capacity of the hydrophobized silica gel is naturally reduced to the extent that they are concentrated. 1 part by volume of hydrophobized silica gel can thus be added to an amount of urine fluid corresponding to 30 to 80, preferably 40 to 50, parts by volume of PMU.

Den hydrofobiserte kiselgel tilført blandingen av konjugerte østrogener blir i fremgangsmåtetrinn c) vasket med en vandig bufferløsning innstilt til et pH-område på 5-7, fortrinnsvis ca. 5. Som vaskevæske anvendes fortrinnsvis en vandig eddiksyre/acetat-bufferløsning innstilt til ca. pH 5. Egnede er spesielt 0,1 til 1 molar, fortrinnsvis 0,1 til 2 molar, eddiksyre/acetat-bufferløsninger. Mengde vaskevæske utvelges slik at den er tilstrekkelig til at hovedsakelig alle fenoliske urininnholdsstoffer utvaskes uten at nevneverdige mengder av konjugerte østrogener utvaskes sammen med disse. Anvendelse av 8 til 15, spesielt 9 til 10, søylevolumer vaskevæske pr. søylevolum hydrofobisert kiselgel har vist seg som formålstjenelig. Vaskevæsken ledes fortrinnsvis gjennom en reaktor inneholdende den hydrofobiserte kiselgel med en gjennomstrømningshastighet på 5 til 20 volumdeler vaskevæske/1 volumdel kiselgel/time. The hydrophobized silica gel added to the mixture of conjugated estrogens is washed in process step c) with an aqueous buffer solution adjusted to a pH range of 5-7, preferably approx. 5. An aqueous acetic acid/acetate buffer solution adjusted to approx. pH 5. Particularly suitable are 0.1 to 1 molar, preferably 0.1 to 2 molar, acetic acid/acetate buffer solutions. The amount of washing liquid is selected so that it is sufficient so that essentially all phenolic urine constituents are washed out without significant amounts of conjugated estrogens being washed out together with these. Application of 8 to 15, especially 9 to 10, column volumes of washing liquid per column volume hydrophobized silica gel has proven to be useful. The washing liquid is preferably passed through a reactor containing the hydrophobized silica gel with a flow rate of 5 to 20 parts by volume of washing liquid/1 part by volume of silica gel/hour.

I fremgangsmåtetrinn d) blir deretter den vaskede, hydrofobiserte kiselgel inneholdende blandingen av konjugerte østrogener behandlet med en tilstrekkelig mengde av en elueringsvæske for eluering av blandingen av de konjugerte østrogener, og det gjenvinnes et eluat inneholdende den naturlige blanding av de konjugerte østrogener i PMU. Elueringsvaesken anvendt ved foreliggende oppfinnelse er en blanding av vann og en vannblandbar eter, lavere alkanol og/eller alifatisk keton. Egnede som eterbestanddeler i elueringsvaesken er vannblandbare sykliske etere som tetrahydrofuran eller dioksan, men også vannblandbare rettkjedete etere som f.eks. etylenglykol-dimetyleter (= monoglym), dietylenglykoldimetyleter (= diglym) eller etyloksyetyloksyetanol (= karbitol). Egnede som lavere alkanoler er vannblandbare alkylalkoholer med 1-4, fortrinnsvis 1-3 karbonatomer, spesielt etanol eller isopropanol. Egnede som lavere alifatiske ketoner er vannblandbare ketoner med 3-5 karbonatomer, spesielt aceton. Spesielt gunstige er elueringsvæsker hvori det organiske løsningsmiddel er etanol. I elueringsvæsken kan det foreligge et volumforhold mellom vannblandbart organisk løsningsmiddel og vann i området 40:60 til 20:80, fortrinnsvis ca. 30:70. Den anvendte mengde eluer-ingsmiddel kan oppgå til ca. 3 til 5 søylevolumer pr. søyle-volum hydrofobisert kiselgel. Elueringsvæsken ledes fortrinnsvis gjennom en reaktor inneholdende den hydrofobiserte kiselgel inneholdende østrogenblåndingen, med en slik gjennomstrøm-ningshastighet at kontakttiden er tilstrekkelig til fullstendig eluering av blandingen av konjugerte østrogener. Ved anvendelse av en blanding av tetrahydrofuran og/eller etanol og vann i volumforholdet 30:70 er egnede gjennomstrømnings-hastigheter f.eks. fra 5 til 20 volumdeler elueringsvæske pr. volumdel kiselgel pr. time. Gjennomstrømningshastigheten reguleres formålstjenelig ved å arbeide ved lett forhøyet trykk, f.eks. ved et overtrykk på inntil 0,2 bar, og eluatet oppsamles i flere fraksjoner. Innholdet av konjugerte østrogener og fenoliske urininnholdsstoffer som kresoler og HPMF i de enkelte eluatfraksjoner, kan bestemmes på kjent måte ved høyytelsesvæskekromatografi (= high performance liquid chromatography, forkortet som "HPLC"). In process step d), the washed, hydrophobized silica gel containing the mixture of conjugated estrogens is then treated with a sufficient amount of an elution liquid to elute the mixture of the conjugated estrogens, and an eluate containing the natural mixture of the conjugated estrogens in PMU is recovered. The elution liquid used in the present invention is a mixture of water and a water-miscible ether, lower alkanol and/or aliphatic ketone. Suitable as ether components in the elution liquid are water-miscible cyclic ethers such as tetrahydrofuran or dioxane, but also water-miscible straight-chain ethers such as e.g. ethylene glycol dimethyl ether (= monoglyme), diethylene glycol dimethyl ether (= diglyme) or ethyloxyethyloxyethanol (= carbitol). Suitable as lower alkanols are water-miscible alkyl alcohols with 1-4, preferably 1-3 carbon atoms, especially ethanol or isopropanol. Suitable as lower aliphatic ketones are water-miscible ketones with 3-5 carbon atoms, especially acetone. Particularly favorable are elution liquids in which the organic solvent is ethanol. In the elution liquid, there may be a volume ratio between water-miscible organic solvent and water in the range 40:60 to 20:80, preferably approx. 30:70. The amount of eluent used can amount to approx. 3 to 5 column volumes per column-volume hydrophobized silica gel. The elution liquid is preferably passed through a reactor containing the hydrophobized silica gel containing the estrogen mixture, with such a flow rate that the contact time is sufficient for complete elution of the mixture of conjugated oestrogens. When using a mixture of tetrahydrofuran and/or ethanol and water in the volume ratio 30:70, suitable flow rates are e.g. from 5 to 20 parts by volume of elution liquid per volume part silica gel per hour. The flow rate is regulated expediently by working at a slightly elevated pressure, e.g. at an overpressure of up to 0.2 bar, and the eluate is collected in several fractions. The content of conjugated estrogens and phenolic urinary substances such as cresols and HPMF in the individual eluate fractions can be determined in a known manner by high performance liquid chromatography (= high performance liquid chromatography, abbreviated as "HPLC").

Ved elueringen blir det først oppnådd en svakt farget til fargeløs, praktisk talt østrogenfri forløperfraksjon som vanligvis tilsvarer en mengde på ca. 1 søylevolum. Hovedmengden av de konjugerte østrogener, f.eks. mellom 80 og 99 % av de konjugerte østrogener i utgangs-PMU, befinner seg i de etterfølgende mørkegul-brunfargede hovedeluatfraksjoner hvis mengde vanligvis er 1 til 2 søylevolumer. De etterfølgende fraksjoner inneholder vanligvis kun spor av konjugerte østrogener. Dersom det oppnås etterfraksjoner som fremdeles har et innhold av konjugerte østrogener på over 10 vekt%, beregnet på tørrstoff, og mindre enn 0,6 vekt%, beregnet på tørrstoff, kresoler og HPMF, kan disse forenes med det østrogenrike hovedeluat for videre bearbeidelse. During the elution, a weakly colored to colourless, practically estrogen-free precursor fraction is first obtained which usually corresponds to an amount of approx. 1 column volume. The bulk of the conjugated estrogens, e.g. between 80 and 99% of the conjugated estrogens in the starting PMU are in the subsequent dark yellow-brown main eluate fractions whose amount is usually 1 to 2 column volumes. The subsequent fractions usually contain only traces of conjugated estrogens. If after-fractions are obtained which still have a content of conjugated estrogens of more than 10% by weight, calculated on dry matter, and less than 0.6% by weight, calculated on dry matter, cresols and HPMF, these can be combined with the estrogen-rich main eluate for further processing.

Hovedeluatet separert fra kiselgelen på den ovenfor beskrevne måte inneholder den naturlige blanding av konjugerte østrogener som opptrer i PMU, foruten kun en liten andel av innholdet av fenoliske urininnholdsstoffer i den opprinnelige PMU. Dette eluat kan anvendes som utgangsmateriale for fremstilling av legemidler inneholdende den naturlige blanding av konjugerte østrogener. Om ønskelig kan eluatet inndampes på kjent måte for å oppnå et egnet konsentrat, hovedsakelig uten innhold av organiske løsningsmidler, for galenisk viderebearbeidelse. Om ønskelig kan også en elueringsmiddelfri fast-stoff blanding fremstilles ved sprøytetørking. Når den naturlige blanding av konjugerte østrogener skal anvendes for fremstilling av faste legemidler kan det være formålstjenlig at eluatet inneholdende de konjugerte østrogener tilsettes et fast bærerstoff allerede før konsentrering eller sprøytetørk-ing, for på denne måte å oppnå en faststoffblanding inneholdende de konjugerte østrogener og bærerstoffer. Både eluatet inneholdende østrogenblandingen og også et konsentrat frem-stilt fra dette, eller et sprøytetørket faststoffprodukt, kan på kjent måte innarbeides i faste eller flytende galeniske preparater, slik som f.eks. tabletter, drageer, kapsler eller emulsjoner. Disse galeniske preparater kan fremstilles etter kjente metoder under anvendelse av vanlige faste eller flytende bærerstoffer, som f.eks. stivelse, cellulose, melkesukker eller talkum, eller flytende parafiner, og/eller anvendelse av vanlige farmasøytiske hjelpestoffer, f.eks. tablettdesintegra-sjonsmidler, løsningsmidler eller konserveringsmidler. Det The main eluate separated from the silica gel in the manner described above contains the natural mixture of conjugated estrogens that appear in the PMU, besides only a small proportion of the content of phenolic urinary constituents in the original PMU. This eluate can be used as starting material for the production of pharmaceuticals containing the natural mixture of conjugated oestrogens. If desired, the eluate can be evaporated in a known manner to obtain a suitable concentrate, essentially free of organic solvents, for galenic further processing. If desired, an eluent-free solid mixture can also be prepared by spray drying. When the natural mixture of conjugated estrogens is to be used for the production of solid pharmaceuticals, it may be expedient that a solid carrier substance is added to the eluate containing the conjugated estrogens already before concentration or spray drying, in order to obtain a solid mixture containing the conjugated estrogens and carrier substances in this way . Both the eluate containing the estrogen mixture and also a concentrate produced from this, or a spray-dried solid product, can be incorporated in a known manner into solid or liquid galenic preparations, such as e.g. tablets, dragees, capsules or emulsions. These galenic preparations can be prepared according to known methods using usual solid or liquid carriers, such as e.g. starch, cellulose, milk sugar or talc, or liquid paraffins, and/or the use of common pharmaceutical excipients, e.g. tablet disintegrants, solvents or preservatives. The

fremstilte produkt inneholdende de konjugerte østrogener kan således blandes med de farmasøytiske bærer- og hjelpestoffer manufactured product containing the conjugated oestrogens can thus be mixed with the pharmaceutical carriers and excipients

på kjent måte, og blandingen kan overføres i en egnet doser-ingsform. in a known manner, and the mixture can be transferred into a suitable dosage form.

De etterfølgende eksempler gir en nærmere belysning av foreliggende oppfinnelse. The following examples provide a more detailed explanation of the present invention.

Eksempler 1- 5 Examples 1-5

Generell arbeidsinstruksjon for fremstilling av et ekstrakt fra PMU der fenoliske urininnholdsstoffer hovedsakelig er fjernet og som inneholder den naturlige blanding av konjugerte østrogener i PMU. General working instructions for the preparation of an extract from PMU in which phenolic urinary constituents have been mainly removed and which contains the natural mixture of conjugated estrogens in PMU.

A) Forbehandling av PMU A) Pretreatment of PMU

10 1 av en PMU filtrert gjennom et 5 cm høyt sandsjikt, eller et mikrofiltreringsanlegg, (tørrstoffinnhold (=TS) og også innhold av østronsulfatsalt, kresol og HPMF bestemt ved hjelp av HPLC, se etterfølgende eksempeltabell) innstilles til pH 13 under kraftig omrøring ved tilsetning av en 50 % vandig natriumhydroksidløsning (tetthet ved 20 °C = 10 1 of a PMU filtered through a 5 cm high sand layer, or a microfiltration system, (dry matter content (=TS) and also content of estrone sulfate salt, cresol and HPMF determined by means of HPLC, see subsequent example table) is adjusted to pH 13 under vigorous stirring by addition of a 50% aqueous sodium hydroxide solution (density at 20 °C =

1,52 g/ml) (tilsatt mengde NaOH-løsning, se eksempeltabell), og omrøres i én time ved romtemperatur. Den alkaliske urinvæske innstilles til en pH-verdi på 8-8,5 ved tilsetning av en konsentrert, vandig saltsyreløsning (ca. 35 %). 1.52 g/ml) (added amount of NaOH solution, see example table), and stirred for one hour at room temperature. The alkaline urine fluid is adjusted to a pH value of 8-8.5 by adding a concentrated, aqueous hydrochloric acid solution (approx. 35%).

B) Adsorpsjon av østrogeninnholdet i PMU på RP- kiselgel B) Adsorption of the estrogen content in PMU on RP silica gel

En søyle med høyde 50 cm og diameter 5 cm, fylles med 100 g (et volum på ca. 193 ml = 1 søylevolum) RP-kiselgel (= "Kiselgel 60/dimetylsilanderivat11 fra Fa. Merck, bestillings-nummer 7719, kornstørrelse 63-200 um) . Søylen vaskes deretter med 0,5 1 vann, deretter med 0,25 1 metanol og på nytt med 0,5 1 vann. A column with a height of 50 cm and a diameter of 5 cm is filled with 100 g (a volume of approx. 193 ml = 1 column volume) RP silica gel (= "Silica gel 60/dimethylsilane derivative11 from Merck, order number 7719, grain size 63- 200 µm) The column is then washed with 0.5 L of water, then with 0.25 L of methanol and again with 0.5 L of water.

Urinvæsken forbehandlet under A) ledes gjennom søylen med et overtrykk på 0,2 bar og med en gjennomstrømningshastig-het på 60 ml/minutt. Østrogeninnholdet i PMU blir således fullstendig adsorbert til RP-kiselgelsøylen. Den utstrømmende urinvæske undersøkes ved hjelp av HPLC med hensyn til dens innhold av østronsulfatsalt, og viste seg som praktisk talt østrogenfri. Avløpet kastes. The urine fluid pretreated under A) is led through the column with an overpressure of 0.2 bar and with a flow rate of 60 ml/minute. The estrogen content of the PMU is thus completely adsorbed to the RP silica gel column. The outflowing urine fluid is examined by HPLC for its content of estrone sulfate salt, and was found to be practically estrogen-free. The drain is thrown away.

C) Vasking av den adsorberte RF- kiselgelsøyle C) Washing the adsorbed RF silica gel column

Den adsorberte RP-kiselgelsøyle vaskes med 2 1 (ca. 10 søylevolumer) av en 0,15 molar eddiksyre/natriumacetat-bufferløsning. Bufferløsningen fremstilles ved at det til 0,15 molar vandig eddiksyreløsning tilsettes fast natrium-acetat (ca. 107 g) inntil pH = 5. Den utstrømmende vaskevæske undersøkes ved hjelp av HPLC med hensyn til dens innhold av østronsulfatsalt, kresol og HPMF, og inneholder under 5 % av østrogeninnholdet i utgangs-PMU. D) Desorpsjon av de konjugerte østrogener fra den vaskede RP- kiselgelsøyle og separasjon av en østro-genrik eluatfraksjon 1 1 av elueringsvæsken (vann/løsningsmiddelblanding, sammensetning se den etterfølgende eksempeltabell) ledes gjennom søylen med et overtrykk på 0,2 bar og en gjennomstrøm-ningshastighet på ca. 60 ml/minutt. Det utstrømmende eluat oppsamles i flere fraksjoner (volum ca. 2 ml ca. 1 søyle-volum). De enkelte fraksjoner undersøkes ved hjelp av HPLC med hensyn til deres innhold av østronsulfatsalt, kresol og HPMF. Den første fraksjon oppsamles så lenge som eluatet er farge-løst til lys gulfarget. Volumet av denne fraksjon oppgår til 150 til 200 ml. Denne fraksjon inneholder kun spor av østrogensulfatsalt. The adsorbed RP silica gel column is washed with 2 L (about 10 column volumes) of a 0.15 molar acetic acid/sodium acetate buffer solution. The buffer solution is prepared by adding solid sodium acetate (approx. 107 g) to a 0.15 molar aqueous acetic acid solution until pH = 5. The flowing washing liquid is examined using HPLC with regard to its content of estrone sulfate salt, cresol and HPMF, and contains below 5% of the estrogen content in the starting PMU. D) Desorption of the conjugated estrogens from the washed RP silica gel column and separation of an estrogen-rich eluate fraction 1 1 of the elution liquid (water/solvent mixture, composition see the following example table) is passed through the column with an overpressure of 0.2 bar and a flow through - ning speed of approx. 60 ml/minute. The flowing eluate is collected in several fractions (volume approx. 2 ml approx. 1 column volume). The individual fractions are examined by means of HPLC with regard to their content of estrone sulphate salt, cresol and HPMF. The first fraction is collected as long as the eluate is colorless to light yellow. The volume of this fraction amounts to 150 to 200 ml. This fraction contains only traces of estrogen sulphate salt.

Så snart det inntrer et fargeskifte i eluatet til en intensiv mørk gul til brun farge, oppsamles den neste fraksjon på ca. 200 ml. Denne fraksjon inneholder ca. 80 til 98 % av den samlede mengde konjugerte østrogener inneholdt i søylen. De resterende fraksjoner inneholder kun mindre mengder av østrogensulfatsalt. Etter avdestillering av løsningsmidlet kan de om ønskelig på nytt tilføyes til fremgangsmåtetrinn B). As soon as a color change occurs in the eluate to an intensive dark yellow to brown color, the next fraction of approx. 200 ml. This fraction contains approx. 80 to 98% of the total amount of conjugated estrogens contained in the column. The remaining fractions contain only smaller amounts of estrogen sulfate salt. After distilling off the solvent, they can, if desired, be added again to method step B).

For hovedmengden av fraksjon 2 inneholdende de konjugerte østrogener er det i den etterfølgende eksempeltabell angitt TS-innholdet i vektprosent og innholdet av østrogen-sulf at salt, kresol og HPMF, bestemt ved hjelp av HPLC. Denne fraksjon representerer et egnet ekstrakt for en galenisk viderebearbeidelse. For the main amount of fraction 2 containing the conjugated oestrogens, the following example table shows the TS content in weight percent and the content of estrogen sulphate salt, cresol and HPMF, determined by HPLC. This fraction represents a suitable extract for a galenic further processing.

E) Regenerering av RP- kiselgelsøylen E) Regeneration of the RP silica gel column

For regenerering vaskes søylen først med 2 1 vann, deretter med 0,5 1 metanol og på nytt med 2 1 vann. Søylen kan deretter anvendes på nytt ved fremgangsmåten. Søylen kan regenereres flere ganger, f.eks. inntil 10 ganger, og anvendes videre. For regeneration, the column is first washed with 2 1 of water, then with 0.5 1 of methanol and again with 2 1 of water. The column can then be used again in the process. The column can be regenerated several times, e.g. up to 10 times, and used further.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en naturlig blanding av konjugerte østrogener, der fenoliske urininnholdsstoffer hovedsakelig er fjernet, fra urinen fra drektige hopper, karakterisert ved at a) en urinvæske, befridd for slimstoffer og faste stoffer, som er et inndampet konsentrat av urinen eller et inndampet urinretentat dannet ved membranfiltrering av urinen, behandles med en tilstrekkelig mengde av en vannløselig base for innstilling av en pH-verdi på minst 12, etterfulgt av at pH-verdien i urinvæsken behandlet med basen innstilles til en pH-verdi i området 5-8,5 ved tilsetning av en tilstrekkelig mengde av en vandig syreløsning, b) urinvæsken forhåndsbehandlet med basen og innstilt til pH 5-8,5, bringes i kontakt med en tilstrekkelig mengde av en hydrofobisert kiselgel for adsorpsjon av blandingen av konjugerte østrogener inneholdt i urinvæsken, og etterfulgt av at den hydrofobiserte kiselgel inneholdende blandingen av konjugerte østrogener separeres fra den overflødige urinvæske, c) den hydrofobiserte kiselgel inneholdende blandingen av konjugerte østrogener vaskes med en vandig buffer-løsning innstilt til et pH-område på 5-7, d) den vaskede, hydrofobiserte kiselgel bringes i kontakt med en tilstrekkelig mengde av en elueringsvæske for desorpsjon av den adsorberte blanding av konjugerte østrogener, som er en blanding av vann og et vannblandbart organisk løsningsmiddel utvalgt fra gruppen vannblandbare etere, lavere alkanoler og lavere alifatiske ketoner, etterfulgt av at eluatet inneholdende blandingen av konjugerte østrogener separeres fra den hydrofobiserte kiselgel og eventuelt inndampes.1. Process for the preparation of a natural mixture of conjugated estrogens, in which phenolic urinary constituents have been mainly removed, from the urine of pregnant mares, characterized in that a) a urine fluid, freed from mucus and solids, which is an evaporated concentrate of the urine or an evaporated urine retentate formed by membrane filtration of the urine, is treated with a sufficient amount of a water-soluble base to set a pH value of at least 12, followed by the pH value in the urine fluid treated with the base being adjusted to a pH value in the range 5-8.5 by adding a sufficient amount of an aqueous acid solution, b) the urine fluid pre-treated with the base and adjusted to pH 5-8 ,5, is brought into contact with a sufficient amount of a hydrophobized silica gel for adsorption of the mixture of conjugated estrogens contained in the urinary fluid, and followed by the hydrophobized silica gel containing the mixture of conjugated estrogens being separated from the excess urinary fluid, c) the hydrophobized silica gel containing the mixture of conjugated estrogens is washed with an aqueous buffer solution adjusted to a pH range of 5-7, d) the washed, hydro phobized silica gel is contacted with a sufficient amount of an eluent for desorption of the adsorbed mixture of conjugated estrogens, which is a mixture of water and a water-miscible organic solvent selected from the group of water-miscible ethers, lower alkanols and lower aliphatic ketones, followed by the eluate containing the mixture of conjugated estrogens is separated from the hydrophobized silica gel and possibly evaporated. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at, i fremgangsmåtetrinn a), urinvæsken blandes med basen, fortrinnsvis en vandig løsning av basen, og oppbevares ved en pH-verdi på minst 12 i en tilstrekkelig tid for spaltning av laktongrupperinger inneholdt i urininnholdsstoffene.2. Method according to claim 1, characterized in that, in method step a), the urine fluid is mixed with the base, preferably an aqueous solution of the base, and stored at a pH value of at least 12 for a sufficient time for cleavage of lactone groups contained in the urine constituents. 3. Fremgangsmåte ifølge ett av de foregående krav, karakterisert ved at det som hydrofobisert kiselgel anvendes en silanisert kiselgel inneholdende en di-metylhydroksysilyloksyrest.3. Method according to one of the preceding claims, characterized in that a silanized silica gel containing a dimethylhydroxysilyloxy acid residue is used as hydrophobized silica gel. 4. Fremgangsmåte ifølge ett av de foregående krav, karakterisert ved at, i fremgangsmåtetrinn b), en volumdel hydrofobisert kiselgel tilsettes en mengde urinvæske som tilsvarer 30 til 80, fortrinnsvis 40 til 50 volumdeler urin.4. Method according to one of the preceding claims, characterized in that, in process step b), one part by volume of hydrophobized silica gel is added to an amount of urine fluid corresponding to 30 to 80, preferably 40 to 50 parts by volume of urine. 5. Fremgangsmåte ifølge ett av de foregående krav, karakterisert ved at, i fremgangsmåtetrinn b) , urinvæsken elueres gjennom reaktoren inneholdende den hydrofobiserte kiselgel med en gjennomstrømningshastighet som tilsvarer en gjennomstrømning av 5 til 20 volumdeler urin/l volumdel hydrofobisert kiselgel/time.5. Method according to one of the preceding claims, characterized in that, in process step b), the urine fluid is eluted through the reactor containing the hydrophobized silica gel with a flow rate corresponding to a flow rate of 5 to 20 parts by volume of urine/l part by volume of hydrophobized silica gel/hour. 6. Fremgangsmåte ifølge ett av de foregående krav, karakterisert ved at, i fremgangsmåtetrinn c) , den vandige bufferløsning anvendt som vaskevæske er en vandig eddiksyre/acetatbufferløsning innstilt til ca. pH 5.6. Method according to one of the preceding claims, characterized in that, in process step c), the aqueous buffer solution used as washing liquid is an aqueous acetic acid/acetate buffer solution set to approx. pH 5. 7. Fremgangsmåte ifølge ett av de foregående krav, karakterisert ved at, i fremgangsmåtetrinn d) , det som elueringsvæske anvendes en blanding av vann og et vannblandbart organisk løsningsmiddel med et volumforhold mellom organisk løsningsmiddel og vann i området 20:80 til 40:60, spesielt 30:70.7. Method according to one of the preceding claims, characterized in that, in process step d), a mixture of water and a water-miscible organic solvent with a volume ratio between organic solvent and water in the range of 20:80 to 40:60 is used as elution liquid, especially 30:70.
NO19990953A 1996-08-30 1999-02-26 Process for the preparation of oestrogens from jump urine NO318378B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP1996/003819 WO1998008525A1 (en) 1996-08-30 1996-08-30 Process to obtain oestrogens from mare's urine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO990953D0 NO990953D0 (en) 1999-02-26
NO990953L NO990953L (en) 1999-02-26
NO318378B1 true NO318378B1 (en) 2005-03-14

Family

ID=8166299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19990953A NO318378B1 (en) 1996-08-30 1999-02-26 Process for the preparation of oestrogens from jump urine

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0927040B1 (en)
JP (1) JP4125788B2 (en)
AT (1) ATE264110T1 (en)
AU (1) AU722084B2 (en)
CA (1) CA2263904C (en)
CZ (1) CZ298762B6 (en)
DE (3) DE19681616D2 (en)
DK (1) DK0927040T3 (en)
ES (1) ES2219697T3 (en)
HK (1) HK1023063A1 (en)
HU (1) HU228765B1 (en)
IL (1) IL128671A (en)
NO (1) NO318378B1 (en)
PL (1) PL185920B1 (en)
PT (1) PT927040E (en)
SK (1) SK281367B6 (en)
WO (1) WO1998008525A1 (en)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10037389A1 (en) 2000-08-01 2002-02-14 Solvay Pharm Gmbh Method and device for the enrichment and stabilization of conjugated estrogens from mare's urine
DE10159161A1 (en) * 2001-12-01 2003-06-18 Solvay Pharm Gmbh Process for obtaining estrogens from mare's urine
TWI332400B (en) 2001-12-14 2010-11-01 Solvay Pharm Gmbh Preformulation for the tableting of natural mixtures of conjugated estrogens
TWI252111B (en) 2001-12-14 2006-04-01 Solvay Pharm Gmbh Matrix film tablet with controlled release of a natural mixture of conjugated estrogens
US20040072814A1 (en) 2002-10-11 2004-04-15 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens depleted in non-conjugated lipophilic compounds
AR041121A1 (en) * 2002-10-11 2005-05-04 Solvay Pharm Gmbh PROCEDURE FOR OBTAINING A NATURAL MIXTURE OF CONJUGATED STROGENS
CN1332973C (en) * 2003-03-06 2007-08-22 深圳市海达克实业有限公司 Extraction process of conjugated female hormone
CA2529009C (en) * 2003-07-17 2011-06-28 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens

Also Published As

Publication number Publication date
PT927040E (en) 2004-08-31
EP0927040A1 (en) 1999-07-07
DK0927040T3 (en) 2004-05-10
EP0927040B1 (en) 2004-04-14
DE59610986D1 (en) 2004-05-19
HK1023063A1 (en) 2000-09-01
CZ298762B6 (en) 2008-01-23
DE19681616D2 (en) 1999-09-30
HU228765B1 (en) 2013-05-28
CZ59999A3 (en) 1999-06-16
NO990953D0 (en) 1999-02-26
JP2000517309A (en) 2000-12-26
AU6985696A (en) 1998-03-19
CA2263904A1 (en) 1998-03-05
CA2263904C (en) 2007-08-07
JP4125788B2 (en) 2008-07-30
WO1998008525A1 (en) 1998-03-05
PL185920B1 (en) 2003-08-29
SK24499A3 (en) 1999-10-08
IL128671A (en) 2001-03-19
HUP9903670A2 (en) 2000-03-28
ES2219697T3 (en) 2004-12-01
SK281367B6 (en) 2001-02-12
AU722084B2 (en) 2000-07-20
HUP9903670A3 (en) 2000-05-29
ATE264110T1 (en) 2004-04-15
DE19681616B4 (en) 2006-03-09
PL331885A1 (en) 1999-08-16
IL128671A0 (en) 2000-01-31
NO990953L (en) 1999-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO318378B1 (en) Process for the preparation of oestrogens from jump urine
NO318390B1 (en) Process for the preparation of oestrogens from jump urine.
US5723454A (en) Method for obtaining estrogens from pregnant mare urine by solid phase extraction on a semi-polar adsorber resin
US5814624A (en) Method for obtaining estrogens from pregnant mare urine by solid-phase extraction
AU2002352161B2 (en) Method for obtaining oestrogen from mare urine
CA2529009C (en) Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens
RU2179029C2 (en) Method to obtain estrogens from mare&#39;s urine
CN1101683C (en) Process to obtain oestrogens from mare&#39;s urine
JPH0421669B2 (en)
RU2179028C2 (en) Method to isolate estrogens from mare&#39;s urine
MXPA99001851A (en) Process to obtain oestrogens from mare&#39;s urine
CN1240397C (en) Process for preparing conjugated oestrogens from urine of pregnant mare
CN1101682C (en) Method to obtain oestrogens from mare&#39;s urine
US20020156303A1 (en) Process for the preparation of conjugated estrogens from pregnant mare urine
JPS6257637B2 (en)
MXPA99001923A (en) Method toobtain oestrogens from mare&#39;s urine

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees