RU2179028C2

RU2179028C2 - Method to isolate estrogens from mare's urine

Info

Publication number: RU2179028C2
Application number: RU99106508A
Authority: RU
Inventors: Иван БАН; Хеннинг ХАЙНЕМАНН; Герхард МЕХТОЛЬД; Хайнц-Хельмер РАШЕ
Original assignee: Солвей Фармасьютикалс Гмбх
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2002-02-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: the method is applied to obtain a natural mixture of interdependent estrogens which is deficient in phenolic substances out of pregnant mares' urine. Urine or its concentrate or urinary retentant should be contacted with nonionogenic semipolar polymeric adsorptive resin, then the resin loaded by the mixture of interdependent estrogens is isolated from the rest urine, then it should be washed and contacted with eluting fluid and then estrogen-containing eluate is isolated from the resin. EFFECT: higher efficiency in obtaining the product of decreased urinary content of phenolic substances and free of cresol and HPMY. 7 cl, 1 tbl, 3 ex

Description

Настоящее изобретение относится к извлечению природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл. The present invention relates to the extraction of a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of mares.

Эстрогены применяют в медицине для гормонозаместительной терапии. В частности, смеси эстрогенов используют для лечения и профилактики возникающих у женщин жалоб климактерического периода после естественной или искусственной менопаузы. При этом оказались особенно эффективными и хорошо переносимыми природные смеси сопряженных эстрогенов, которые обнаружены в моче жеребых кобыл. Estrogens are used in medicine for hormone replacement therapy. In particular, estrogen mixtures are used for the treatment and prevention of complaints of menopause in women after natural or artificial menopause. At the same time, natural mixtures of conjugated estrogens that were found in the urine of mares were especially effective and well tolerated.

Содержание растворенного твердого вещества в моче жеребых кобыл (= pregnant mares urine, в последующем называемой также сокращенно "PMU") может естественным образом колебаться в широких пределах и обычно находится в диапазоне 40 - 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и другими обычно содержащимися в моче веществами в твердом веществе мочи жеребых кобыл содержатся фенольные составные части в количестве около 2-5 мас.% в пересчете на сухое вещество. Среди этих фенольных составных частей находятся крезолы и известный как HPMF дигидро-3,4-бис[(3- гидроксифенил)метил]-2(3H)-фуранон. Он может находиться в свободной или сопряженной форме. В моче жеребых кобыл (PMU) содержится природная смесь эстрогенов, которые в большей части находятся в сопряженной форме, например, как натриевая соль сложного полуэфира серной кислоты (в последующем называемая кратко "сульфатная соль"). Содержание сопряженных эстрогенов (рассчитанное как эстрогенная сульфатная соль) может составлять между 0,3 и 1 мас.% в пересчете на сухое вещество. The dissolved solids in the urine of the mares (= pregnant mares urine, hereinafter also referred to as abbreviated as "PMU") can naturally fluctuate widely and are usually in the range of 40 - 90 g dry matter per liter. Along with urea and other substances commonly found in urine, the solid mare urine of the mares contains phenolic constituents in an amount of about 2-5 wt.%, Calculated on the dry matter. Among these phenolic constituents are cresols and known as HPMF dihydro-3,4-bis [(3-hydroxyphenyl) methyl] -2 (3H) -furanone. It can be in free or conjugated form. The urine of the mare (PMU) contains a natural mixture of estrogens, which are for the most part in conjugated form, for example, as the sodium salt of the semi-ester of sulfuric acid (hereinafter referred to briefly as “sulfate salt”). The content of conjugated estrogens (calculated as estrogenic sulfate salt) can be between 0.3 and 1 wt.% In terms of dry matter.

Обычно содержащие сопряженные эстрогены экстракты извлекают из мочи жеребых кобыл путем экстракции с помощью полярного органического растворителя, который не смешивается или только незначительно смешивается с водой, например сложного этилового эфира уксусной кислоты, n-бутанола или циклогексанола. Однако при такой жидкость-жидкость-экстракции возникает множество проблем, например сильное образование пены, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Как правило, требуются несколько стадий экстракции, что приводит к потерям и лишь к частичному извлечению содержимого эстрогенов. Usually, conjugated estrogen extracts are removed from the urine of the mares by extraction with a polar organic solvent that does not mix or only mix slightly with water, for example ethyl acetate, n-butanol or cyclohexanol. However, with such liquid-liquid-extraction there are many problems, for example, strong foam formation, precipitate formation, emulsion formation and poor phase separation. As a rule, several stages of extraction are required, which leads to losses and only to partial extraction of estrogen content.

В 1968 году H.L. Bradlow (Steroids II (1968), 265-272) предложил использовать для экстракции сопряженных эстрогенов из мочи Амберлит XAD-2^®, нейтральную неполярную гидрофобную полистирольную смолу фирмы "Rohm und Haas". Указанная адсорбционная емкость незначительна. Согласно методу Bradlow разбавленную при необходимости мочу с низкой скоростью потока пропускают через колонну, содержащую смолу. Эстрогены элюируются метанолом или этанолом. Однако не приводится никаких данных о других веществах, содержащихся в эстрогенсодержащем элюате.In 1968, HL Bradlow (Steroids II (1968), 265-272) proposed the use of Amberlit XAD-2 ^® , a neutral non-polar hydrophobic polystyrene resin from Rohm und Haas, for the extraction of conjugated estrogens from urine. The indicated adsorption capacity is negligible. According to the Bradlow method, diluted if necessary urine with a low flow rate is passed through a resin containing column. Estrogens are eluted with methanol or ethanol. However, no data are provided on other substances contained in the estrogen-containing eluate.

Задачей настоящего изобретения является создание технического способа для извлечения природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл с устранением недостатков, известных из применяемой до настоящего времени жидкость-жидкость-экстракции, в котором получают продукт с пониженным содержанием содержащихся в моче фенольных веществ и в значительной степени свободный от крезола и HPMF. The objective of the present invention is to provide a technical method for extracting a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of mares with the elimination of the drawbacks known from the liquid-liquid-extraction used to date, in which a product with a reduced content of phenolic substances contained in the urine and substantially free from cresol and HPMF.

Был найден, таким образом, способ, в котором с помощью твердофазной экстракции на неионогенной полуполярной полимерной адсорбционной смоле можно извлекать обедненную содержащимися в моче фенольными веществами, практически не содержащую крезол и HPMF, однако практически полностью сохраняющую содержание природных эстрогенов мочи жеребых кобыл в смеси, которая может служить исходным материалом для получения фармацевтических средств, содержащих в качестве активного компонента природную смесь сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл. Thus, a method was found in which, by means of solid-phase extraction on a nonionic semipolar polymer adsorption resin, it is possible to extract depleted urinary phenolic substances that practically do not contain cresol and HPMF, but almost completely preserve the content of natural mare urine estrogen in the mixture, which can serve as a starting material for pharmaceutical preparations containing, as an active component, a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of mares.

Способ согласно изобретению для извлечения обедненной содержащимися в моче фенольными веществами природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл отличается тем, что
а) жидкость мочи, которая представляет собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи сконцентрированный ретентат мочи, приводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов количеством полуполярной полимерной адсорбционной смолы и нагруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу отделяют от остальной жидкости мочи,
b) нагруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу промывают промывочной водой с величиной pH по меньшей мере 12,0, в частности 12,5 - 14,
с) промытую адсорбционную смолу приводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной на ней смеси сопряженных эстрогенов количеством элюирующей жидкости, которая представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из смешиваемого с водой органического растворителя и при необходимости щелочной воды, и содержащий естественную смесь сопряженных эстрогенов элюат отделяют от адсорбционной смолы и при необходимости концентрируют.The method according to the invention for the extraction of a natural mixture of conjugated estrogens from urine of mare depleted in phenol substances depleted in urine is characterized in that
a) urine fluid, which is urine purified from mucus and solids, a concentrated concentrate of this urine, or concentrated retentate of urine obtained by membrane filtration of this urine, is brought into contact with a sufficient amount of a semi-polar polymer adsorption resin to contain the mixture of conjugated estrogens contained in the urine fluid and a semi-polar polymer adsorption resin loaded with a conjugated estrogen mixture is separated from the rest of the urine fluid,
b) a semi-polar polymer adsorption resin loaded with a conjugated estrogen mixture is washed with wash water with a pH of at least 12.0, in particular 12.5-14,
c) the washed adsorption resin is brought into contact with a sufficient quantity of an eluting liquid, which is a water-miscible organic solvent from the group of water-miscible esters, lower alkanols and lower aliphatic ketones or a mixture of organic miscible with water, sufficient to desorb the adsorbed mixture of conjugated estrogens adsorbed on it; solvent and, if necessary, alkaline water, and containing a natural mixture of conjugated estrogens, the eluate is separated from the adsorption resin and, if necessary, entriruyut.

Для способа согласно изобретению можно использовать мочу жеребых кобыл как таковую, полученный из нее путем концентрирования концентрат или полученный из нее путем мембранной фильтрации ретентат. Собранную мочу прежде всего известным способом очищают от слизи и твердых веществ. Целесообразно дать осесть твердым веществам и слизи и затем отделить их с помощью известных методов, например, декантацией, сепарацией и/или фильтрацией. Таким образом, мочу жеребых кобыл можно, например, пропустить через известное разделительное устройство, например сепаратор, фильтрационную установку или седиментатор. В качестве разделительного устройства может служить песчаная постель, а также можно использовать предлагаемые в торговле сепараторы, например сопловые или камерные сепараторы. При желании можно использовать также микрофильтрационные установки или ультрафильтрационные установки, при применении которых можно одновременно достигать отсутствие микробов и вирусов в отфильтрованной моче жеребых кобыл. For the method according to the invention, the urine of the mares as such, obtained from it by concentrating a concentrate or obtained from it by membrane filtration of retentate, can be used. First of all, urine collected is cleaned of mucus and solids in a known manner. It is advisable to let solids and mucus settle and then separate them using known methods, for example, decantation, separation and / or filtration. Thus, the urine of the mares can, for example, be passed through a known separation device, for example a separator, a filtration unit or a sedimentator. A sand bed can serve as a separation device, and separators offered in the trade, for example nozzle or chamber separators, can also be used. If desired, microfiltration units or ultrafiltration units can also be used, the use of which can simultaneously achieve the absence of microbes and viruses in the filtered urine of mares.

При желании в мочу могут быть добавлены консерванты, гербициды, бактерициды и/или антигельминтные средства. If desired, preservatives, herbicides, bactericides and / or anthelmintic agents may be added to the urine.

Если вместо мочи жеребых кобыл необходимо использовать сконцентрированный ретентат мочи жеребых кобыл, то его можно получить из мочи жеребых кобыл с помощью известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут изменяться в зависимости от используемой мочи жеребых кобыл и применяемых для мембранной фильтрации мембран, например, от величины их пор, а также от условий фильтрации. Например, при применении нанофильтрационной мембраны можно достичь почти полностью без потерь содержания эстрогенов в ретентате мочи жеребых кобыл при одновременном удалении до 50 мас.% низкомолекулярных веществ, содержащихся в моче жеребых кобыл. Для способа согласно изобретению можно использовать ретентаты мочи жеребых кобыл, концентрация в которых повышена до соотношения около 1: 10, например до соотношения около 1:7, и объем которых тем самым сконцентрирован до 1/10, например 1/7 первоначального объема мочи жеребых кобыл. If instead of the urine of the mares it is necessary to use a concentrated retentate of the urine of the mares, then it can be obtained from the urine of the mares using the known membrane filtration. The solids content in the retentate and its composition may vary depending on the urine of the mares and the membranes used for membrane filtration, for example, on the size of their pores, as well as on the filtration conditions. For example, with the use of a nanofiltration membrane, it is possible to achieve almost without loss of estrogen content in the urine retentate of the mares while removing up to 50 wt.% Of low molecular weight substances contained in the urine of the mares. For the method according to the invention, you can use the urine retentates of the mares, the concentration of which is increased to a ratio of about 1: 10, for example to a ratio of about 1: 7, and the volume of which is thereby concentrated to 1/10, for example 1/7 of the initial volume of urine of the mares .

Используемые в стадии а) способа полуполярные полимерные адсорбционные смолы являются пористыми органическими неионогенными полимерами, которые в противоположность неполярным гидрофобным полимерным адсорбционным смолам имеют промежуточную полярность (например, с дипольным моментом активной площади поверхности смолы в диапазоне от 1,0 до 3,0, в частности 1,5-2,0 Дебай, и слегка гидрофильную структуру, например смолы сложного эфира поликарбоновых кислот. Целесообразно использовать макропористые полуполярные смолы с предпочтительно макроретикулярной структурой и со средним диаметром пор в диапазоне от 50 до 150, предпочтительно 70-100 Ангстрем и удельной поверхностью в диапазоне от 300 до 900, предпочтительно 400-500 м²/г. Наиболее пригодными являются макропористые, сшитые в сетчатый полимер алифатические смолы сложных эфиров поликарбоновых кислот, в частности сшитые в сетчатый полимер смолы сложных эфиров полиакрила, как например, Амберлит XAD-7^® фирмы Rohm und Haas.The semi-polar polymer adsorption resins used in step a) of the method are porous organic nonionic polymers which, in contrast to non-polar hydrophobic polymer adsorption resins, have an intermediate polarity (for example, with a dipole moment of the resin surface area in the range from 1.0 to 3.0, in particular 1.5-2.0 Debye, and a slightly hydrophilic structure, for example polycarboxylic acid ester resins. It is advisable to use macroporous semi-polar resins with preferably macro etikulyarnoy structure and with an average pore diameter ranging from 50 to 150, preferably 70-100 Angstroms and a surface area in the range from 300 to 900, preferably 400-500 m ² / g. Most suitable are macroporous, crosslinked aliphatic crosslinked polymer resin complex polycarboxylic acid esters, in particular crosslinked resins of polyacrylic esters, such as Amberlite XAD-7 ^® from Rohm und Haas.

Согласно изобретению адсорбция сопряженных эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле может происходить посредством контактирования мочи жеребых кобыл или ее ретентата с адсорбционной смолой, тем что жидкость мочи вводят в содержащий адсорбционную смолу реактор и там оставляют в контакте с адсорбционной смолой на время, достаточное для адсорбции содержания эстрогенов. После завершенной адсорбции сопряженных эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле загруженную смесью сопряженных эстрогенов адсорбционную смолу можно отделить от остальной жидкости мочи известным образом. Целесообразно пропускать жидкость мочи через содержащую адсорбционную смолу колонну с такой скоростью прохождения, чтобы время контакта было достаточным для адсорбции эстрогенов. Подходящими являются, например, скорости прохождения, которые соответствуют прохождению от 3 до 10, предпочтительно 5 - 7 объемных частей мочи жеребых кобыл на 1 объемную часть адсорбционной смолы в час. Адсорбцию проводят предпочтительно при комнатной температуре. Целесообразно управлять скоростью протекания жидкости мочи через реактор, работая при небольшом избыточном давлении или разрежении. Количество применяемой полуполярной адсорбционной смолы может изменяться в зависимости от вида используемой адсорбционной смолы и количества твердого вещества, содержащегося в жидкости мочи. При использовании мочи жеребых кобыл одна объемная часть адсорбционной смолы, например сшитой в сетчатый полимер алифатической адсорбционной смолы сложного эфира поликарбоновой кислоты, может быть загружена до 80 объемными частями предварительно обработанной мочи жеребых кобыл, так что можно едва обнаружить заметное количество эстрогенов в стекающей жидкости мочи. При применении концентрата мочи жеребых кобыл или ретентата мочи жеребых кобыл емкость загрузки адсорбционной смолы, естественно, понижается в степени, соответствующей концентрации. Так, например, 1 объемная часть сшитой в сетчатый полимер алифатической адсорбционной смолы сложного эфира поликарбоновой кислоты может быть загружена количеством жидкости мочи, соответствующим 20 - 80, предпочтительно 30 - 50 объемным частям мочи жеребых кобыл. According to the invention, the conjugation of conjugated estrogens on a semi-polar adsorption resin can occur by contacting the urine of the mares or its retentate with the adsorption resin, so that the urine liquid is introduced into the reactor containing the adsorption resin and therein is left in contact with the adsorption resin for a time sufficient to adsorb the estrogen content. After the complete adsorption of conjugated estrogens on a semi-polar adsorption resin loaded with a mixture of conjugated estrogens, the adsorption resin can be separated from the rest of the urine fluid in a known manner. It is advisable to pass urine fluid through a column containing adsorption resin with such a passage speed that the contact time is sufficient for the absorption of estrogen. Suitable are, for example, passage speeds that correspond to passage from 3 to 10, preferably 5 to 7 volume parts of the urine of the mares per 1 volume part of the adsorption resin per hour. Adsorption is carried out preferably at room temperature. It is advisable to control the rate of flow of urine fluid through the reactor, operating at a slight excess pressure or vacuum. The amount of semi-polar adsorption resin used may vary depending on the type of adsorption resin used and the amount of solids contained in the urine fluid. When using mare urine, one volumetric part of the adsorption resin, for example polycarboxylic acid ester crosslinked into the aliphatic adsorption resin of the polyester carboxylic acid, can be loaded with up to 80 volumetric parts of the preliminarily processed mare's urine, so that a noticeable amount of estrogen in the flowing liquid of urine can hardly be detected. When using the mare urine concentrate or mare urine retentate of the mares, the loading capacity of the adsorption resin naturally decreases to a degree corresponding to the concentration. Thus, for example, 1 volume part of a polycarboxylic acid ester crosslinked aliphatic adsorption resin crosslinked into a polymer network can be loaded with an amount of urine fluid corresponding to 20 to 80, preferably 30 to 50 volume parts of the urine of the mares.

Загруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную адсорбционную смолу в стадии b) способа промывают промывочной водой, имеющей величину pH по меньшей мере 12, в частности от 12,5 до 14, предпочтительно около 12,5 - 13,5. В качестве промывочной воды можно использовать водные растворы растворимых в жидкости мочи инертных основных веществ, которые достаточно сильны для достижения величины pH по меньшей мере 12,5. В качестве водорастворимых основных веществ, инертных по отношению к полуполярной полимерной адсорбционной смоле, пригодны предпочтительно водорастворимые неорганические основания, как, например, гидроксиды щелочных и щелочноземельных металлов, в частности гидроксид натрия. Промывочная вода содержит, целесообразно, только такое количество основных веществ, которое необходимо для достижения желаемой величины pH, предпочтительно около 13. Количество промывочной воды выбирают так, чтобы его было достаточно для удаления в значительной степени содержащихся в мочи фенольных веществ без вымывания при этом достойного упоминания количества сопряженных эстрогенов. Целесообразно использовать, например, от 2 до 10, в частности от 4 до 6 объемов слоя промывочной жидкости на 1 объем слоя адсорбционной смолы. При этом промывочную воду целесообразно пропускать через содержащий адсорбционную смолу реактор со скоростью прохождения от 3 до 10, предпочтительно 5-7 объемных частей промывочной воды на 1 объемную часть адсорбционной смолы в час. The semi-polar adsorption resin loaded with the conjugated estrogen mixture in step b) of the process is washed with washing water having a pH of at least 12, in particular from 12.5 to 14, preferably about 12.5 to 13.5. As washing water, you can use aqueous solutions of inert basic substances soluble in urine, which are strong enough to achieve a pH of at least 12.5. As water-soluble basic substances inert to a semi-polar polymer adsorption resin, preferably water-soluble inorganic bases, such as, for example, alkali and alkaline earth metal hydroxides, in particular sodium hydroxide, are suitable. Rinsing water contains, expediently, only the amount of basic substances necessary to achieve the desired pH value, preferably about 13. The amount of rinsing water is chosen so that it is sufficient to remove the phenolic substances contained in the urine to a large extent without washing, with a worthy mention the amount of conjugated estrogen. It is advisable to use, for example, from 2 to 10, in particular from 4 to 6 volumes of a layer of washing liquid per 1 volume of a layer of adsorption resin. In this case, it is advisable to pass the washing water through a reactor containing an adsorption resin with a flow rate of 3 to 10, preferably 5-7 volume parts of washing water per 1 volume part of the adsorption resin per hour.

Наконец, в стадии с) способа промытую, загруженную смесью сопряженных эстрогенов адсорбционную смолу обрабатывают количеством элюирующей жидкости, достаточным для элюирования смеси сопряженных эстрогенов, и получают элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов мочи жеребых кобыл. Применяемая согласно изобретению элюирующая жидкость представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из такого смешиваемого с водой растворителя и, при необходимости, щелочной воды. В качестве эфирных компонентов элюирующей жидкости пригодны смешиваемые с водой циклические эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, а также смешиваемые с водой эфиры с открытой цепью, как, например, этиленгликольдиметиловые эфиры (моноглимы), диэтиленгликоль-диметиловые эфиры (диглимы) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших алканолов пригодны смешиваемые с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3 атомами углерода, в частности этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов пригодны смешиваемые с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, в частности ацетон. Особенно предпочтительными являются элюирующие жидкости, в которых органическим растворителем является этанол. Целесообразно использовать в качестве элюирующей жидкости смеси из указанных выше смешиваемых с водой органических растворителей и при необходимости щелочной воды. Величина pH таких водосодержащих элюентов находится в нейтральном до щелочного диапазоне до pH 13 и может предпочтительно составлять примерно 10 - 12. В качестве компонента растворителя в водосодержащей элюирующей жидкости выбирают растворитель, стабильный в используемом диапазоне pH. В водосодержащих щелочных элюирующих жидкостях с величиной pH около 10-12 в качестве компонента растворителя пригодными являются низшие алканолы, предпочтительно этанол. Желаемую величину pH водосодержащего элюента устанавливают путем добавления соответствующего количества водорастворимого инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, в частности гидроксида натрия. В водосодержащей элюирующей жидкости соотношение объемов смешиваемого с водой органического растворителя и воды может составлять от 40:60 до 20:80, предпочтительно около 30: 70. Используемое количество элюента может составлять примерно 3 - 10, в частности около 4 - 6 объемов слоя на 1 объем слоя адсорбционной смолы. Целесообразно пропускать элюирующую жидкость через реактор, содержащий загруженную смесью эстрогенов адсорбционную смолу, с такой скоростью прохождения, чтобы время контакта было достаточным для полного элюирования смеси сопряженных эстрогенов. При использовании смеси этанола с водой с соотношением объемов 30:70 подходит, например, скорость прохождения от 3 до 10, предпочтительно 5-7 объемных частей элюирующей жидкости на 1 объемную часть адсорбционной смолы в час. Целесообразно проводить элюирование в диапазоне температур от комнатной температуры до около 60^oC, предпочтительно при около 40-50^oC. При желании можно регулировать скорость прохождения, работая при слегка повышенном давлении, например при избыточном давлении до 0,2 бар, и улавливать элюат в нескольких фракциях. Содержание в отдельных фракциях элюата сопряженных эстрогенов и содержащихся в моче фенольных веществ, как, например, крезолов и HPMF, можно определять с помощью известного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (сокращенно "HPLC". При элюировании прежде всего получают слабо окрашенную, практически свободную от эстрогенов предварительную фракцию, количество которой соответствует обычно примерно одному объему слоя. Основное количество сопряженных эстрогенов, например, между 80 и 90% имеющихся в исходной моче жеребых кобыл сопряженных эстрогенов, находится в последующих темно желто-коричневых фракциях основного элюата, количество которых составляет обычно 2-4 объема слоя. В последующих фракциях хвостового погона содержатся обычно лишь следы сопряженных эстрогенов. Если получают фракции хвостового погона, которые еще имеют сопряженных эстрогенов более 10 мас.% в пересчете на сухое вещество и менее 0,6 мас. % крезолов и HPMF в пересчете на сухое вещество, то их можно объединить с основным элюатом для дальнейшей обработки.Finally, in step c) of the method, the washed, loaded with a mixture of conjugated estrogens adsorption resin is treated with an amount of an eluting liquid sufficient to elute the mixture of conjugated estrogens, and an eluate containing a natural mixture of conjugated estrogen urine of the mares is obtained. The eluting liquid used according to the invention is a water-miscible organic solvent from the group of water-miscible esters, lower alkanols and lower aliphatic ketones or a mixture of such a water-miscible solvent and, if necessary, alkaline water. Water-miscible cyclic ethers, such as tetrahydrofuran or dioxane, as well as open-chain miscible ethers, such as, for example, ethylene glycol dimethyl ethers (monoglymes), diethylene glycol dimethyl ethers (diglymes) or ethyloxyethyloxyethane are suitable as ether components of the eluting liquid. ) Suitable lower alkanols are water-miscible alkyl alcohols with 1-4, preferably 1-3 carbon atoms, in particular ethanol or isopropanol. Water-miscible ketones with 3-5 carbon atoms, in particular acetone, are suitable as lower aliphatic ketones. Especially preferred are eluting liquids in which ethanol is an organic solvent. It is advisable to use mixtures of the above water-miscible organic solvents and, if necessary, alkaline water as an eluting liquid. The pH of such aqueous eluents is in the neutral to alkaline range to pH 13 and can preferably be about 10-12. A solvent that is stable in the pH range used is selected as the solvent component in the aqueous eluting liquid. In aqueous alkaline eluting liquids with a pH of about 10-12, lower alkanols, preferably ethanol, are suitable as a solvent component. The desired pH of the aqueous eluent is adjusted by adding an appropriate amount of a water-soluble inert base material, preferably an inorganic base, for example an alkali or alkaline earth metal hydroxide, in particular sodium hydroxide. In a water-containing eluting liquid, the ratio of the volumes of the organic solvent mixed with water can be from 40:60 to 20:80, preferably about 30: 70. The amount of eluent used can be about 3 to 10, in particular about 4 to 6 layer volumes per 1 the volume of the adsorption resin layer. It is advisable to pass the eluting liquid through a reactor containing an adsorption resin loaded with an estrogen mixture at such a rate that the contact time is sufficient to completely elute the conjugated estrogen mixture. When using a mixture of ethanol with water with a volume ratio of 30:70, for example, a flow rate of 3 to 10, preferably 5-7 volume parts of the eluting liquid per 1 volume part of the adsorption resin per hour, is suitable. It is advisable to carry out the elution in the temperature range from room temperature to about 60 ^o C, preferably at about 40-50 ^o C. If you wish, you can adjust the speed of passage, working at slightly elevated pressure, for example at overpressure up to 0.2 bar, and to capture the eluate in several fractions. The content of conjugated estrogens and urinary phenolic substances in certain fractions of the eluate, such as cresols and HPMF, can be determined using the well-known method of high performance liquid chromatography (abbreviated as "HPLC". When eluting, first of all, a slightly colored, almost free of estrogen preliminary fraction, the amount of which usually corresponds to approximately one volume of the layer.The main number of conjugated estrogens, for example, between 80 and 90% of the mares of the mares in the initial urine estrogen, it is found in subsequent dark yellow-brown fractions of the main eluate, the amount of which is usually 2-4 volumes of the layer. In subsequent fractions of the tail product usually contains only traces of conjugated estrogens. If you receive the tail product fractions, which still have conjugated estrogen more than 10 wt. .% calculated on the dry matter and less than 0.6 wt.% cresols and HPMF calculated on the dry matter, they can be combined with the main eluate for further processing.

Основной элюат, отделенный описанным выше образом от адсорбционной смолы, содержит имеющуюся в моче жеребых кобыл природную смесь сопряженных эстрогенов наряду с лишь незначительной долей имеющихся первоначально в моче жеребых кобыл фенольных веществ. Этот элюат можно использовать в качестве исходного материала для получения содержащих природную смесь сопряженных эстрогенов лекарственных средств. При желании элюат можно сконцентрировать далее известным образом для получения в значительной степени свободного от органического растворителя концентрата, пригодного для дальнейшей галеновой обработки. При желании можно получить не содержащую элюент смесь твердых веществ путем сушки распылением. Если природная смесь сопряженных эстрогенов должна использоваться в твердых лекарственных средствах, то может быть целесообразным подмешивать в содержащий сопряженные эстрогены элюат твердое вещество уже перед концентрацией или сушкой распылением, чтобы таким образом получать смесь твердых веществ, содержащую сопряженные эстрогены и носители. Как содержащий смесь эстрогенов элюат, так и изготовленный из него концентрат или высушенный распылением твердый продукт можно известным образом внести в твердые или жидкие галеновые препараты, как, например, таблетки, драже, капсулы или эмульсии. Эти галеновые препараты могут быть изготовлены с помощью известных методов с использованием обычных или жидких носителей, как, например, крахмал, целлюлоза, молочный сахар или тальк, или жидкие парафины и/или с использованием обычных фармацевтических вспомогательных веществ, например средств для разрушения таблеток, средств, улучшающих растворимость, или консервантов. Содержащий сопряженные эстрогены продукт можно смешивать известным образом с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами и переводить смесь в подходящую форму дозирования. The main eluate, separated in the manner described above from the adsorption resin, contains a natural mixture of conjugated estrogens in the urine of mares, along with only a small fraction of the phenolic substances originally found in the urine of mares. This eluate can be used as starting material for the preparation of a natural mixture of conjugated estrogen drugs. If desired, the eluate can be further concentrated in a known manner to obtain a concentrate substantially free of organic solvent, suitable for further galenic treatment. If desired, an eluent-free mixture of solids can be obtained by spray drying. If a natural conjugated estrogen mixture is to be used in solid medicines, it may be advisable to mix the solid substance into the conjugated estrogen eluate already before concentration or spray drying to thereby obtain a solid mixture containing conjugated estrogens and carriers. Both the eluate-containing estrogen mixture and the concentrate made from it or spray dried solid product can be introduced into solid or liquid galenic preparations in a known manner, such as tablets, dragees, capsules or emulsions. These galenic preparations can be made using known methods using conventional or liquid carriers, such as starch, cellulose, milk sugar or talc, or liquid paraffins and / or using conventional pharmaceutical excipients, for example, tablet disintegrating agents, solubility enhancers or preservatives. The product containing conjugated estrogens can be mixed in a known manner with pharmaceutical carriers and excipients and the mixture can be converted into a suitable dosage form.

Последующие примеры должны пояснять более подробно изобретение, не ограничивая его объема. The following examples should explain in more detail the invention, without limiting its scope.

Примеры 1 - 3
Общая инструкция для извлечения из мочи жеребых кобыл экстракта, в значительной степени обедненного содержащимися в моче фенольными веществами и содержащего природную смесь сопряженных эстрогенов в моче жеребых кобыл.Examples 1 to 3
General instructions for extracting an extract of mares from urine that are substantially depleted in urine containing phenolic substances and containing a natural mixture of conjugated estrogens in the urine of mares.

А) Адсорбция содержащихся в моче жеребых кобыл эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле сложного полиакрилового эфира
Колонну высотой 30 см с диаметром 2,4 см 65 мл наполняют набухшей в воде полуполярной адсорбционной смолой сложного полиакрилового эфира (Амберлит XAD-7 фирмы Rohm und Haas, величина зерна 0,3 - 1,2 мм, дипольный момент 1,8 Дебай, средний диаметр пор 80 Ангстрем, удельная поверхность около 450 м²/г в сухом виде). Через колонну пропускают 2 л отфильтрованной в микрофильтрационной установке или очищенной путем пропускания через сепаратор мочи жеребых кобыл (содержание сухого вещества=(TS), а также определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF приведены в таблице) при комнатной температуре со скоростью прохождения 6 мл/мин (около 5,5 объемов слоя в час). Содержащийся в моче жеребых кобыл эстроген полностью адсорбируется на загруженной таким образом колонне полуполярной адсорбционной смолы. Вытекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание сопряженных эстрогенов (в расчете на эстрон-сульфатную соль), и она оказывается практически не содержащей эстрогенов. Процесс останавливают.A) Adsorption of urinary mares of estrogens on a semi-polar polyacrylic ester adsorption resin
A column 30 cm high with a diameter of 2.4 cm 65 ml is filled with a polyacrylic ester (Amberlite XAD-7 from Rohm und Haas, grain size 0.3 - 1.2 mm, dipole moment 1.8 Debye, swollen with water-swollen hemispolar adsorption resin). the average pore diameter is 80 Angstroms, the specific surface is about 450 m ² / g in dry form). 2 l of mares filtered in a microfiltration unit or purified by passing through a urine separator (dry matter content = (TS), as well as the contents of estrone sulfate salt, cresol and HPMF determined by high performance liquid chromatography are shown in the table) at room temperature are passed through the column at room temperature temperature with a flow rate of 6 ml / min (about 5.5 bed volumes per hour). The estrogen contained in the urine of the mares is completely adsorbed on the column of a semi-polar adsorption resin so loaded. The urine flowing out liquid is examined using high performance liquid chromatography for the content of conjugated estrogens (based on estrone sulfate salt), and it turns out to be practically free of estrogen. The process is stopped.

В) Промывание загруженной колонны адсорбционной смолы
Загруженную колонну адсорбционной смолы промывают 300 мл водного раствора гидроксида натрия с указанным в таблице значением pH. Для этого через колонну пропускают щелочную промывочную волу со скоростью прохождения 6 мл/мин (около 5,5 объемов слоя в час). Стекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Исследование показало, что во время фазы промывки вымывается менее чем 5 % всех введенных в колонну эстрогенов.C) Washing the loaded adsorption resin column
The loaded adsorption resin column is washed with 300 ml of an aqueous solution of sodium hydroxide with the pH value indicated in the table. To do this, an alkaline wash wave is passed through the column at a flow rate of 6 ml / min (about 5.5 bed volumes per hour). Flowing urine fluid is examined using high performance liquid chromatography for the content of estrone sulfate salt, cresol and HPMF. The study showed that less than 5% of all estrogens introduced into the column are washed out during the wash phase.

С) Десорбция сопряженных эстрогенов из промытой колонны с адсорбционной смолой. C) Desorption of conjugated estrogens from a washed column with an adsorption resin.

315 мл элюирующей жидкости (путем добавки гидроксида натрия щелочная смесь воды и растворителя, состав и pH смотри в таблице) пропускают со скоростью потока около 6 мл/мин через колонну, предварительно нагретую до указанной в таблице температуры элюирования. Стекающий элюат собирают в 6 фракций. Первая фракция составляет около 65 мл (примерно 1 объем слоя), остальные фракции составляют около 50 мл каждая. Отдельные фракции исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание в них эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Первую фракцию собирают, пока элюат кажется бесцветным до слабо желтого цвета. Эта фракция содержит лишь следы сульфатной соли эстрогенов. 315 ml of the eluting liquid (by adding an sodium hydroxide alkaline mixture of water and solvent, composition and pH see in the table) are passed at a flow rate of about 6 ml / min through a column pre-heated to the elution temperature indicated in the table. Flowing eluate is collected in 6 fractions. The first fraction is about 65 ml (about 1 layer volume), the remaining fractions are about 50 ml each. Individual fractions are examined by high performance liquid chromatography for the content of estrone sulfate salt, cresol and HPMF. The first fraction is collected until the eluate appears colorless to faintly yellow. This fraction contains only traces of the estrogen sulfate salt.

После того как пройдет первый объем слоя элюата, происходит изменение цвета элюата на интенсивный темно-коричневый тон. В последующих фракциях 2 - 4 содержится около 80-90% общего количества адсорбированных на колонне сопряженных эстрогенов. Остальные фракции содержат лишь незначительное количество сульфатной соли эстрогенов. Это можно наблюдать также по сильному уменьшению интенсивности цвета. При необходимости остаточные фракции после отделения дистилляцией растворителя можно еще раз подать в стадию А) способа. After the first volume of the eluate layer has passed, the color of the eluate changes to an intense dark brown tone. Subsequent fractions 2 to 4 contain about 80-90% of the total amount of conjugated estrogens adsorbed on the column. The remaining fractions contain only a small amount of sulfate salt of estrogen. This can also be observed by a strong decrease in color intensity. If necessary, the residual fractions after separation by distillation of the solvent can again be submitted to stage A) of the method.

В таблице для фракций, содержащих основное количество сопряженных эстрогенов, указаны содержание сухого вещества TS в мас.% и определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Эти фракции представляют собой экстракты, пригодные для дальнейшей галеновой обработки. The table for fractions containing the majority of conjugated estrogens shows the dry matter content of TS in wt.% And the content of estrone sulfate salt, cresol and HPMF determined by high performance liquid chromatography. These fractions are extracts suitable for further galenic treatment.

D) Регенерация колонны адсорбционной смолы
Для регенерации колонну прежде всего промывают 100 мл смеси этанола с водой, содержащей 5% этанола и имеющей pH 12, затем 150 мл 10%-ого водного раствора цитрата натрия и еще раз 150 мл смеси этанола с водой и, наконец, 100 мл дистиллированной воды. Всю регенерацию проводят при температуре 45^oC. Колонну можно много раз, например до 40 раз, загружать и снова регенерировать.D) Regeneration of the adsorption resin column
For regeneration, the column is first washed with 100 ml of a mixture of ethanol with water containing 5% ethanol and having a pH of 12, then 150 ml of a 10% aqueous solution of sodium citrate and again 150 ml of a mixture of ethanol with water and, finally, 100 ml of distilled water . The entire regeneration is carried out at a temperature of 45 ^o C. The column can be many times, for example up to 40 times, load and regenerate again.

Claims

1. A method of obtaining a natural mixture of conjugated estrogens depleted in phenolic substances from the urine of mares, characterized in that a) a urine liquid, which is urine purified from mucus and solids, a concentrated concentrate of this urine or a concentrated concentrate obtained by membrane filtration of this urine urine retentate is brought into contact with a sufficient amount of nonionic semi-polar polymer adsorption resin to adsorb the mixture of conjugated estrogens contained in the urine liquid, and a semi-polar polymer adsorption resin loaded with a conjugated estrogen mixture from the rest of the urine liquid, b) a semi-polar polymer adsorption resin loaded with a conjugated estrogen mixture is washed with washing water with a pH of at least 12.0, and c) the washed adsorption resin is brought into contact with adsorption sufficient for desorption it contains a mixture of conjugated estrogens with the amount of an eluting liquid, which is a water-miscible organic solvent from the group miscible with water esters, lower alkanols and lower aliphatic ketones or a mixture of a water-miscible organic solvent and optionally alkaline water, and containing a natural mixture of conjugated estrogens depleted in phenolic substances, the eluate is separated from the adsorption resin and, if necessary, concentrated.

2. The method according to p. 1, characterized in that in step a) of the method, a macroporous polycarboxylic acid ester resin is used as a nonionic semi-polar adsorption resin.

3. The method according to p. 2, characterized in that the polycarboxylic acid ester resin used is a crosslinked aliphatic polymer, an aliphatic polycarboxylic acid ester resin, preferably a polyacrylic ester resin crosslinked into the polymer network, preferably with a macroreticular structure.

4. The method according to one of paragraphs. 1-3, characterized in that in stage a) of method 1, the volume part of the nonionic semi-polar adsorption resin is loaded with an amount of urine liquid corresponding to 20-80, preferably 30-50 vol. h urine.

5. The method according to one of paragraphs. 1-4, characterized in that in step a) of the method, urine fluid is passed through a reactor containing a nonionic semi-polar polymer adsorption resin with a flow rate that corresponds to a flow rate of 3 to 10, preferably 5-7 vol. h. urine per 1 vol. including adsorption resin per hour.

6. The method according to one of paragraphs. 1-5, characterized in that the washing water used in stage b) of the method is an aqueous solution of sodium hydroxide with a pH value set at about 12.5-13.5.

7. The method according to one of paragraphs. 1-6, characterized in that in stage c) of the method as an eluting liquid, a mixture of water and a water-miscible organic solvent is used with a volume ratio of organic solvent and water in the range from 20: 80 to 40: 60, in particular 30: 70 .

8. The method according to one of paragraphs. 1-7, characterized in that in step c) of the method, an eluting liquid containing ethanol is used.