RU2179029C2 - Method to obtain estrogens from mare's urine - Google Patents
Method to obtain estrogens from mare's urine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2179029C2 RU2179029C2 RU99106510A RU99106510A RU2179029C2 RU 2179029 C2 RU2179029 C2 RU 2179029C2 RU 99106510 A RU99106510 A RU 99106510A RU 99106510 A RU99106510 A RU 99106510A RU 2179029 C2 RU2179029 C2 RU 2179029C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- urine
- silica gel
- mixture
- water
- hydrophobized silica
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к получению природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл. The invention relates to the production of a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of mares.
Эстрогены применяют в медицине для гормонозамещающей терапии. В частности, смеси эстрогенов используют для лечения и профилактики возникающих у женщин жалоб климактерического периода после естественной или искусственной менопаузы. Для этого оказались особенно эффективными и хорошо переносимыми природные смеси сопряженных эстрогенов, которые содержатся в моче жеребых кобыл. Estrogens are used in medicine for hormone replacement therapy. In particular, estrogen mixtures are used for the treatment and prevention of complaints of menopause in women after natural or artificial menopause. For this, natural mixtures of conjugated estrogens found in the urine of mares turned out to be especially effective and well tolerated.
Содержание растворенного твердого вещества в моче жеребых кобыл (в последующем называемой также сокращенно МЖК), может, естественно, колебаться в широких пределах и обычно находится в диапазоне 40-90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и другими обычными ингредиентами мочи в твердом остатке МЖК содержатся фенольные составляющие в количестве около 2-5 мас.% по отношению к сухому веществу. Среди этих фенольных составляющих находятся крезолы и известный как ГФМФ дигидро-3,4-бис[(3-гидроксифенил) метил]-2-(3H)-фуранон. Они могут находиться в свободной или сопряженной форме. В МЖК содержится природная смесь эстрогенов, которые в большей части находятся в сопряженной форме, например в виде натриевой соли сложного полуэфира серной кислоты (в последующем называемая кратко "сульфатная соль"). Содержание сопряженных эстрогенов (рассчитываемое как эстрогенсульфат соль) может составлять между 0,3 и 1 вес.% по отношению к сухому веществу. The dissolved solids content in the urine of the mares (hereinafter also referred to as abbreviated as MFA) can naturally vary widely and is usually in the range of 40-90 g dry matter per liter. Along with urea and other common urine ingredients, the solid residue of MFA contains phenolic constituents in an amount of about 2-5 wt.% With respect to the dry matter. Among these phenolic constituents are cresols and known as HFMF dihydro-3,4-bis [(3-hydroxyphenyl) methyl] -2- (3H) -furanone. They can be in free or conjugated form. MFA contains a natural mixture of estrogens, which for the most part are in conjugated form, for example, in the form of the sodium salt of the sulfuric acid half-ester (hereinafter referred to briefly as “sulfate salt”). The content of conjugated estrogens (calculated as estrogen sulfate salt) can be between 0.3 and 1 wt.% With respect to dry matter.
Обычно экстракты, содержащие сопряженные эстрогены, получают из мочи жеребых кобыл путем экстракции полярным органическим растворителем, который не смешивается или только незначительно смешивается с водой, как, например, этилацетат, н-бутанол или циклогексанол. Однако при такой жидкостной экстракции возникает множество проблем, как, например, сильное пенообразование, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Как правило, требуется несколько стадий экстракции, что приводит к потерям и только к частичному извлечению эстрогенов. Typically, extracts containing conjugated estrogens are obtained from the urine of mares by extraction with a polar organic solvent that does not mix or only mix slightly with water, such as ethyl acetate, n-butanol or cyclohexanol. However, with such liquid extraction, many problems arise, such as, for example, strong foaming, precipitate formation, emulsion formation and poor phase separation. As a rule, several stages of extraction are required, which leads to losses and only to partial recovery of estrogen.
Для подготовки малых количеств жидкостей мочи и плазмы для аналитического определения эстрогенов с помощью газовой хроматографии Хайккинен с сотр. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186- 1189) и Шеклетон с сотр. (Clinica Chimica Acta 107 (1980), 231- 243) предложили твердофазную экстракцию эстрогенов с помощью патрона с силанизированным силикагелем, содержащим октадецилсилановые остатки (C18-картридж Sep-Pak®, , изготовитель Waters Ass. Inc. Milfold, Ma, США). При этом эстрогены элюируют из патрона с помощью метанола. Однако не приводится данных о других веществах, содержащихся в элюате, содержащем эстрогены.For the preparation of small quantities of urine and plasma fluids for the analytical determination of estrogen by gas chromatography Heikkinen et al. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186-1189) and Shackleton et al. (Clinica Chimica Acta 107 (1980), 231- 243) have proposed a solid-phase extraction of estrogens using a cartridge with silanized silica gel containing oktadetsilsilanovye residues (C -kartridzh 18 Sep-Pak ®,, manufactured by Waters Ass. Inc. Milfold, Ma, USA) . In this case, estrogens are eluted from the cartridge using methanol. However, data on other substances contained in the eluate containing estrogen are not provided.
Задачей настоящего изобретения является создание технического способа получения природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл с устранением недостатков, известных из применяемой до настоящего времени жидкостной экстракции из жидкости, в котором получают продукт, обедненный фенольными компонентами мочи, и в значительной степени свободной от ГФМФ. The objective of the present invention is to provide a technical method for producing a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of mares with the elimination of the drawbacks known from the liquid extraction used to date from liquid, which produces a product that is depleted in phenolic components of urine and is substantially free of HFMP.
Был разработан способ, с помощью которого путем твердофазной экстракции на гидрофобизированном силикагеле можно получать смесь, обедненную фенольными компонентами мочи, в значительной мере свободную от ГФМФ, однако практически полностью содержащую природные экстрогены МЖК. Смесь может служить исходным материалом для получения фармацевтических средств, содержащих в качестве активного компонента природную смесь сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл. A method was developed by which, by solid-phase extraction on hydrophobized silica gel, it is possible to obtain a mixture depleted in the phenolic components of urine, which is substantially free of HFMP, but which almost completely contains the natural exogenous MFAs. The mixture can serve as a starting material for pharmaceutical preparations containing, as an active component, a natural mixture of conjugated estrogens from the urine of mares.
Согласно изобретению способ получения обедненной фенольными компонентами природной смеси сопряженных эстрогенов из МЖК отличается тем, что
а) жидкость мочи, которая очищена от слизи и твердых веществ, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем ультрафильтрации этой мочи, сконцентрированный ретентат мочи обрабатывают водорастворимым основанием в количестве, достаточном для установления pH, равного, по меньшей мере, 12, и затем устанавливают значение pH в диапазоне от 5 до 8,5 жидкости мочи, обработанной основанием посредством добавления достаточного количества водного кислотного раствора;
б) обработанную предварительно основанием, имеющую величину pH 5-8,5 жидкость мочи приводят в контакт гидрофобизированным силикагелем в количестве, достаточном для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов, и отделяют загруженный смесью сопряженных эстрогенов гидрофобизированный силикагель от остальной жидкости мочи;
в) гидрофобизированный силикагель, загруженный смесью сопряженных эстрогенов, промывают водным буферным раствором со значением pH в диапазоне от 5 до 7, в особенности 5;
г) промытый гидрофобизированный силикагель приводят в контакт с элюирующей жидкостью, взятой в количестве, достаточном для десорбции адсорбированной на нем смеси сопряженных эстрогенов, жидкость представляет собой смесь воды со смешиваемым с водой органическим растворителем из группы смешиваемых с водой простых эфиров, низших спиртов и низших алифатических кетонов, и отделяют элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов от гидрофобизированного силикагеля и при необходимости концентрируют.According to the invention, the method of producing a phenol-depleted natural mixture of conjugated estrogens from SFAs is characterized in that
a) urine liquid that is purified from mucus and solids, a concentrated concentrate of this urine, or obtained by ultrafiltration of this urine, concentrated urine retentate is treated with a water-soluble base in an amount sufficient to establish a pH of at least 12, and then set the value a pH in the range of 5 to 8.5 urine liquid treated with a base by adding a sufficient amount of an aqueous acid solution;
b) pre-treated with a base having a pH value of 5-8.5, the urine liquid is brought into contact with hydrophobized silica gel in an amount sufficient to adsorb the conjugated estrogen mixture contained in the urine liquid, and the hydrophobized silica gel loaded with the conjugated estrogen mixture is separated from the rest of the urine liquid;
c) hydrophobized silica gel loaded with a mixture of conjugated estrogens is washed with an aqueous buffer solution with a pH in the range from 5 to 7, in particular 5;
d) the washed hydrophobized silica gel is brought into contact with an eluting liquid, taken in an amount sufficient to desorb the conjugated estrogen mixture adsorbed on it, the liquid is a mixture of water with a water-miscible organic solvent from the group of water-miscible ethers, lower alcohols and lower aliphatic ketones, and the eluate containing the natural mixture of conjugated estrogens is separated from the hydrophobized silica gel and, if necessary, concentrated.
Для способа согласно изобретению можно использовать мочу жеребых кобыл как таковую, полученный из нее путем концентрирования концентрат или полученный из нее путем мембранной фильтрации ретентат. Собранную мочу сначала известным образом очищают от слизи и твердых веществ. Целесообразно сначала осадить твердые вещества и слизь и затем отделить их с помощью известных методов, например декантации, сепарации и/или фильтрации. Таким образом, мочу жеребых кобыл можно, например, пропустить через известное само по себе разделительное устройство, например сепаратор, фильтрационную установку или седиментатор. В качестве разделительного устройства может служить песчаная постель, а также можно использовать предлагаемые в торговле сепараторы, например сопловые или камерные сепараторы. При желании можно использовать также микрофильтрационные установки или ультрафильтрационные установки, при использовании которых можно одновременно обеспечить отсутствие микробов и вирусов в отфильтрованной моче жеребых кобыл. For the method according to the invention, the urine of the mares as such, obtained from it by concentrating a concentrate or obtained from it by membrane filtration of retentate, can be used. The collected urine is first cleaned of mucus and solids in a known manner. It is advisable to first precipitate solids and mucus and then separate them using known methods, for example decantation, separation and / or filtration. Thus, the urine of the mares can, for example, be passed through a separation device known per se, for example a separator, a filtration unit or a sedimentator. A sand bed can serve as a separation device, and separators offered in the trade, for example nozzle or chamber separators, can also be used. If desired, microfiltration units or ultrafiltration units can also be used, by using which it is possible to simultaneously ensure the absence of microbes and viruses in the filtered urine of mares.
При желании в мочу могут быть добавлены консерванты, гермициды, бактерициды и/или противоглистные средства. If desired, preservatives, germicides, bactericides and / or anthelmintics can be added to the urine.
Если вместо мочи жеребых кобыл должен быть использован сконцентрированный ретентат мочи жеребых кобыл, то его можно получить из МЖК с помощью само по себе известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут изменяться в зависимости от используемой МЖК и применяемых для фильтрации мембран, например, от размера их пор, а также от условий фильтрации. Например, при использовании нанофильтрационной мембраны можно достигать почти полной концентрации содержания эстрогенов в ретентате МЖК при одновременном удалении до 50 мас.% низкомолекулярных веществ, содержащихся в МЖК. Для способа согласно изобретению можно использовать ретентаты МЖК, которые сконцентрированы до соотношения около 1:10, например до соотношения около 1: 7, и объем которых тем самым сконцентрирован до 1/10, например 1/7, первоначального объема МЖК. If concentrated mare urine retentate is to be used in place of urine for mares, then it can be obtained from SFAs using membrane filtration per se known. The solids content in the retentate and its composition may vary depending on the FFA used and the membranes used for filtering, for example, on the size of their pores, as well as on the filtration conditions. For example, when using a nanofiltration membrane, it is possible to achieve an almost complete concentration of the estrogen content in the MFA retentate while removing up to 50 wt.% Of low molecular weight substances contained in the MFA. For the method according to the invention, retentates of fatty acids can be used, which are concentrated to a ratio of about 1:10, for example, to a ratio of about 1: 7, and the volume of which is thereby concentrated to 1/10, for example 1/7, of the initial volume of fatty acids.
На стадии а) в мочу добавляют достаточное для установления величины pH, по меньшей мере, 12, в частности от 13 до 14, количество водорастворимого основания. В качестве водорастворимого основания пригодны неорганические или органические, растворимые в моче инертные основания, которые являются достаточно сильными для достижения величины pH, по меньшей мере, 12. Так, например, пригодными являются гидроокиси щелочных или щелочноземельных металлов, в частности гидроокись натрия, или же органические основания, как четвертичные гидроокиси низшего алкиламмония. Основание добавляют предпочтительно в виде водного раствора с содержанием основания, по меньшей мере, 20 мас.%, предпочтительно от 40 до 60 мас.%. Наиболее целесообразно использовать 45-55%-ный водный раствор едкого натра. При этой предварительной щелочной обработке устанавливают значение pH жидкости мочи, равное, по меньшей мере, 12, например в диапазоне от 12 до 14, предпочтительно около 13, и это щелочное значение pH поддерживают в течение времени, достаточного для расщепления содержащихся в веществах мочи лактоновых группировок, которое обычно может составлять от 1/2 до 2 часов. Условия обработки необходимо выбирать так, чтобы при этом не происходило воздействия на сопряженные эстрогены. Обработку проводят предпочтительно при комнатной температуре при ограничении добавления основания количеством, необходимым для достижения желательного значения pH в области от 12 до 14. Необходимое для достижения pH в области от 12 до 14 количество основания может изменяться в зависимости от состава используемой мочи жеребых кобыл. При применении 50%-ного раствора едкого натра обычно достаточно около 100 - 700 мл 50%--ного раствора едкого натра на 10 л мочи жеребых кобыл. Затем за счет добавления в жидкость мочи водного кислотного раствора значение pH устанавливают в диапазоне от 5 до 8,5, предпочтительно от 7 до 8,5, в особенности от 8 до 8,5. В качестве кислоты пригодны растворимые в жидкости мочи инертные неорганические или органические кислоты, как, например, соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота или низшие карбоновые кислоты, как уксусная кислота. Целесообразно, например, использовать концентрированный водный раствор соляной кислоты. Необходимое для достижения указанного диапазона значения pH количество кислоты может изменяться в зависимости от состава МЖК и используемого для установки щелочного значения количества основания. При применении концентрированного раствора соляной кислоты можно достичь желаемого значения pH обычно путем добавления от около 25 до 100 г концентрированного раствора соляной кислоты на 1 л мочи жеребых кобыл. In step a), a sufficient amount of a water-soluble base is added to the urine to establish a pH of at least 12, in particular 13 to 14. Inorganic or organic, urine-soluble, inert bases which are strong enough to achieve a pH of at least 12 are suitable as a water-soluble base. For example, alkali or alkaline earth metal hydroxides, in particular sodium hydroxide, or organic are suitable bases like quaternary lower alkylammonium hydroxides. The base is preferably added in the form of an aqueous solution with a base content of at least 20 wt.%, Preferably from 40 to 60 wt.%. It is most advisable to use a 45-55% aqueous solution of caustic soda. With this preliminary alkaline treatment, the pH of the urine fluid is set to at least 12, for example in the range from 12 to 14, preferably about 13, and this alkaline pH is maintained for a time sufficient to break down the lactone groups contained in the urine which can usually be from 1/2 to 2 hours. Processing conditions must be selected so that there is no effect on conjugated estrogens. The treatment is preferably carried out at room temperature while restricting the addition of the base to the amount necessary to achieve the desired pH in the range of 12 to 14. The amount of base required to achieve a pH in the range of 12 to 14 may vary depending on the composition of the urine of the mares. When using a 50% caustic soda solution, usually about 100 - 700 ml of a 50% caustic soda solution per 10 l urine of mares is sufficient. Then, by adding an aqueous acidic solution to the urine liquid, the pH is adjusted to a range of from 5 to 8.5, preferably from 7 to 8.5, in particular from 8 to 8.5. Inert urine inert inorganic or organic acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or lower carboxylic acids, such as acetic acid, are suitable as uric acid. It is advisable, for example, to use a concentrated aqueous solution of hydrochloric acid. The amount of acid required to achieve the indicated pH range may vary depending on the composition of the MFA and the base amount used to set the alkaline value. When using a concentrated hydrochloric acid solution, the desired pH can be achieved, usually by adding about 25 to 100 g of a concentrated hydrochloric acid solution per 1 liter of mares urine.
Используемые на стадии б) способа гидрофобизированные силикагели являются само по себе известными фазообратимыми силикагелями, которые являются химически модифицированными силикагелями, которые включают гидрофобные группы или лиганды. Так, например, пригодными являются силанизированные фазообратимые силикагели, которые в качестве гидрофобных функциональных групп содержат н-октадецилдиметилсилилокси-, н- октилдиметилсилилокси- или диметилгидроксисилилокси остаток. Пригодными являются, например, силанизированные силикагели со средней величиной зерна от 15 до 500 мкм. Особенно целесообразно использовать силикагель, содержащий диметилгидроксисилилокси группы со средней величиной зерна от 0,05 до 0,3 мм, например "Силикагель 60/производное диметилсилана" фирмы Мерк. The hydrophobized silica gels used in step b) of the process are per se known phase-reversible silica gels, which are chemically modified silica gels that include hydrophobic groups or ligands. Thus, for example, silanized phase-reversible silica gels are suitable which contain a n-octadecyldimethylsilyloxy, n-octyldimethylsilyloxy or dimethyl hydroxy silyloxy residue as hydrophobic functional groups. Suitable are, for example, silanized silica gels with an average grain size of from 15 to 500 microns. It is especially advisable to use silica gel containing dimethylhydroxysilyloxy groups with an average grain size of 0.05 to 0.3 mm, for example, "Silica gel 60 / dimethylsilane derivative" from Merck.
Согласно изобретению адсорбция сопряженных эстрогенов на гидрофобизированном силикагеле может происходить посредством контактирования мочи жеребых кобыл, при необходимости сконцентрированной или ее ретентата с гидрофобизированным силикагелем, тем что предварительно обработанную на стадии а) жидкость мочи вводят в реактор, содержащий силикагель, и там осуществляют контакт с силикагелем в течение времени, достаточного для адсорбции эстрогенов. После завершенной адсорбции сопряженных эстрогенов на гидрофобизированном силикагеле можно отделить загруженный смесью сопряженных эстрогенов силикагель от остальной жидкости мочи известным образом. Целесообразно пропускать жидкость мочи через колонну, содержащую силикагель, с такой скоростью прохождения, что время контакта достаточно для адсорбции эстрогенов. Подходящими являются, например, скорости прохождения, которые соответствуют прохождению от 5 до 20 об. ч. МЖК на 1 об. ч. силикагеля в час. Адсорбцию проводят предпочтительно при комнатной температуре. Целесообразно управлять скоростью прохода мочи через реактор за счет работы при небольшом избыточном давлении или разрежении. Количество применяемого гидрофобизированного силикагеля может изменяться в зависимости от вида используемого силикагеля и количества твердого вещества, содержащегося в предварительно обработанной на стадии а) жидкости мочи. При применении предварительно обработанной МЖК одна объемная часть гидрофобизированного силикагеля может быть загружена до 80 об. ч. предварительно обработанной мочи жеребых кобыл, так что можно едва установить заметное количество эстрогенов в стекающей жидкости мочи. При применении предварительно обработанного концентрата МЖК или ретентата МЖК емкость загрузки гидрофобизированного силикагеля, естественно, понижается в степени, соответствующей концентрации. Так, например, 1 об. ч. гидрофобизированного силикагеля может быть загружена количеством жидкости мочи, соответствующим 30-80, предпочтительно 40-50 об. ч. мочи жеребых кобыл. According to the invention, the adsorption of conjugated estrogens on hydrophobized silica gel can occur by contacting the urine of the mares, if necessary concentrated or its retentate, with the hydrophobized silica gel, so that the urine liquid pretreated in step a) is introduced into the reactor containing silica gel, and therein is contacted with silica gel in the passage of time sufficient for the absorption of estrogen. After complete adsorption of conjugated estrogens on hydrophobized silica gel, silica gel loaded with a mixture of conjugated estrogens can be separated from the rest of the urine fluid in a known manner. It is advisable to pass urine fluid through a column containing silica gel, with such a speed that the contact time is sufficient for adsorption of estrogen. Suitable are, for example, passage speeds that correspond to passage from 5 to 20 vol. h. MJK on 1 about. including silica gel per hour. Adsorption is carried out preferably at room temperature. It is advisable to control the rate of passage of urine through the reactor by operating at a slight overpressure or vacuum. The amount of hydrophobized silica gel used may vary depending on the type of silica gel used and the amount of solids contained in the urine fluid pretreated in step a). When using pre-treated SFA, one volume part of hydrophobized silica gel can be loaded up to 80 vol. h. pre-treated urine of mares, so that you can hardly establish a noticeable amount of estrogen in the flowing liquid of urine. When using a pre-treated MFA concentrate or MFA retentate, the loading capacity of hydrophobized silica gel naturally decreases to a degree corresponding to the concentration. So, for example, 1 vol. including hydrophobized silica gel can be loaded with an amount of urine fluid corresponding to 30-80, preferably 40-50 vol. h urine mares.
Загруженный смесью сопряженных эстрогенов гидрофобизированный силикагель на стадии в) промывают водным буферным раствором с величиной pH от 5 до 7, предпочтительно около 5. В качестве промывочной жидкости предпочтительно использовать водный буферный раствор уксусная кислота/ацетат с величиной pH около 5. Пригодными являются в особенности 0,1 - 1-молярные, предпочтительно 0,1 - 0,2-молярные буферные растворы уксусная кислота/ацетат. Количество промывочной жидкости выбирают так, что его достаточно для удаления фенольных составляющих без вымывания значимого количества сопряженных эстрогенов. Целесообразно использовать, например, от 8 до 15, в особенности от 9 до 10 объемов слоя промывочной жидкости на 1 объем слоя гидрофобизированного силикагеля. При этом промывочную жидкость пропускают, целесообразно, через реактор, содержащий гидрофобизированный силикагель, со скоростью пропускания от 5 до 20 об. ч. промывочной жидкости на 1 об. ч. силикагеля в час. The hydrophobized silica gel loaded with a conjugated estrogen mixture in step c) is washed with an aqueous buffer solution with a pH value of 5 to 7, preferably about 5. As a washing liquid, it is preferable to use an aqueous buffer solution of acetic acid / acetate with a pH value of about 5. Especially suitable are 0 , 1 to 1 molar, preferably 0.1 to 0.2 molar acetic acid / acetate buffer solutions. The amount of washing liquid is chosen so that it is sufficient to remove phenolic components without leaching a significant amount of conjugated estrogens. It is advisable to use, for example, from 8 to 15, in particular from 9 to 10 volumes of a layer of washing liquid per 1 volume of a layer of hydrophobized silica gel. In this case, the washing liquid is passed, expediently, through a reactor containing hydrophobized silica gel, with a transmission speed of 5 to 20 vol. including flushing fluid at 1 vol. including silica gel per hour.
Затем на стадии г) промытый, загруженный смесью сопряженных эстрогенов гидрофобизированный силикагель обрабатывают элюирующей жидкостью в количестве, достаточном для элюирования смеси сопряженных эстрогенов, и получают элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов мочи жеребых кобыл. Применяемая согласно изобретению элюирующая жидкость представляет собой смесь воды и смешиваемого с водой простого эфира, низшего спирта и/или низшего алифатического кетона. В качестве эфирных составляющих элюирующей жидкости пригодны смешиваемые с водой циклические простые эфиры, как тетрагидрофуран или диоксан, а также смешиваемые с водой простые эфиры с открытой цепью, как, например, этиленгликольдиметиловый эфир (моноглим), диэтиленгликольдиметиловый эфир (диглим) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших спиртов пригодны смешиваемые с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3 атомами углерода, в особенности этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов пригодны смешиваемые с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, в особенности ацетон. Особенно предпочтительными являются элюирующие жидкости, в которых органическим растворителем является этанол. В элюирующей жидкости соотношение объемов смешиваемого с водой органического растворителя и воды может составлять от 40:60 до 20:80, предпочтительно около 30: 70. Используемое количество элюента может составлять примерно 3-5 объемов слоя на 1 объем слоя гидрофобизированного силикагеля. Целесообразно пропускать элюирующую жидкость через реактор, содержащий загруженный смесью эстрогенов гидрофобизированный силикагель, с такой скоростью, что время контакта достаточно для полного элюирования смеси сопряженных эстрогенов. При использовании смеси тетрагидрофурана и/или этанола с водой в объемном соотношении 30:70 пригодна, например, скорость пропускания от 5 до 20 об. ч. элюирующей жидкости на 1 об. ч. силикагеля в час. Целесообразно регулировать скорость пропускания посредством работы при слегка повышенном давлении, например при избыточном давлении до 0,2 бар, и улавливать элюат в нескольких фракциях. Содержание сопряженных эстрогенов и фенольных составляющих мочи, как, например, крезолов и ГФМФ, в отдельных фракциях элюата можно определять с помощью само по себе известного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (сокращенно "ВЭЖХ"). Then, in step g), the washed, loaded with a mixture of conjugated estrogens hydrophobized silica gel is treated with an eluting liquid in an amount sufficient to elute the mixture of conjugated estrogens, and an eluate containing a natural mixture of conjugated estrogen urine of the mares is obtained. The eluting liquid used according to the invention is a mixture of water and water-miscible ether, lower alcohol and / or lower aliphatic ketone. Suitable cyclic ethers miscible with water, such as tetrahydrofuran or dioxane, as well as open chain miscible ethers, such as ethylene glycol dimethyl ether (monoglyme), diethylene glycol dimethyl ether (diglyme) or ethyloxyethyl oxyethane, are suitable as ether components of the eluting liquid. . Suitable lower alcohols are water-miscible alkyl alcohols with 1-4, preferably 1-3 carbon atoms, in particular ethanol or isopropanol. Water-miscible ketones with 3-5 carbon atoms, in particular acetone, are suitable as lower aliphatic ketones. Especially preferred are eluting liquids in which ethanol is an organic solvent. In the eluting liquid, the ratio of the volumes of the organic solvent mixed with water and water can be from 40:60 to 20:80, preferably about 30:70. The amount of eluent used can be about 3-5 volumes per layer per layer of hydrophobized silica gel. It is advisable to pass the eluting liquid through a reactor containing hydrophobized silica gel loaded with an estrogen mixture at such a rate that the contact time is sufficient to completely elute the conjugated estrogen mixture. When using a mixture of tetrahydrofuran and / or ethanol with water in a volume ratio of 30:70, for example, a transmission rate of from 5 to 20 vol. including the eluting fluid at 1 vol. including silica gel per hour. It is advisable to control the transmission rate by operating at slightly elevated pressure, for example at an overpressure of up to 0.2 bar, and to collect the eluate in several fractions. The content of conjugated estrogens and phenolic components of urine, such as cresols and HMPF, in individual fractions of the eluate can be determined using the well-known method of high-performance liquid chromatography (abbreviated as HPLC).
При элюировании сперва получают слабо окрашенную или почти бесцветную, практически свободную от эстрогенов предварительную фракцию, количество которой соответствует обычно примерно одному объему слоя. Основное количество сопряженных эстрогенов, например между 80 и 90% сопряженных эстрогенов, имеющихся в исходной моче жеребых кобыл, находится в последующих темных желто-коричневых основных фракциях элюата, количество которых составляет обычно 1-2 объема слоя. В последующих фракциях содержатся обычно лишь следы сопряженных эстрогенов. Если получают последующие фракции, которые еще содержат сопряженные эстрогены в количестве более 10 мас.% относительно сухого вещества и менее 0,6 мас.% крезолов и ГФМФ по отношению к сухому веществу, то их можно объединить с основным элюатом, обогащенным эстрогенами, для дальнейшей обработки. When eluting, first, a slightly colored or almost colorless, practically estrogen-free preliminary fraction is obtained, the amount of which usually corresponds to approximately one volume of the layer. The main amount of conjugated estrogens, for example between 80 and 90% of conjugated estrogens present in the initial urine of mares, is in the subsequent dark yellow-brown main fractions of the eluate, the amount of which is usually 1-2 layer volumes. Subsequent fractions usually contain only traces of conjugated estrogens. If subsequent fractions are obtained that still contain conjugated estrogens in an amount of more than 10 wt.% Relative to dry matter and less than 0.6 wt.% Cresols and HMPF relative to dry matter, then they can be combined with the main estrogen enriched eluate for further processing.
Основной элюат, отделенный описанным выше образом от силикагеля, содержит природную смесь сопряженных эстрогенов, имеющуюся в моче жеребых кобыл, наряду с лишь незначительной долей фенольных составляющих, содержащихся первоначально в моче жеребых кобыл. Этот элюат можно использовать в качестве исходного материала для получения лекарственных средств, содержащих природную смесь сопряженных эстрогенов. При желании элюат можно сконцентрировать далее само по себе известным образом для получения концентрата, в значительной степени свободного от органического растворителя и пригодного для дальнейшей галеновой обработки. При желании посредством сушки распылением можно получить смесь твердых веществ, свободную от элюата. Если природная смесь сопряженных эстрогенов предназначена для получения твердых лекарственных средств, то может быть целесообразным подмешивать в элюат, содержащий сопряженные эстрогены, твердый носитель уже перед концентрированием или сушкой распылением, чтобы таким образом получать смесь твердых веществ, содержащую сопряженные эстрогены и носители. Также элюат, содержащий смесь эстрогенов, как и полученный из него концентрат или высушенный распылением твердый продукт, можно известным образом вносить в твердые или жидкие галеновые препараты, как, например, таблетки, драже, капсулы или эмульсии. Эти галеновые препараты могут быть изготовлены с помощью само по себе известных методов с использованием обычных твердых или жидких носителей, как, например, крахмал, целлюлоза, молочный сахар, или тальк, или жидкие парафины, и/или с использованием обычных фармацевтических вспомогательных веществ, например средств для разрушения таблеток, средств, улучшающих растворимость, или консервантов. Содержащий сопряженные эстрогены продукт можно само по себе известным образом смешивать с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами и переводить смесь в пригодную форму дозирования. The main eluate, separated in the manner described above from silica gel, contains a natural mixture of conjugated estrogens present in the urine of mares, along with only a small fraction of the phenolic constituents originally found in the urine of mares. This eluate can be used as starting material for the manufacture of drugs containing a natural mixture of conjugated estrogens. If desired, the eluate can be further concentrated by itself in a known manner to obtain a concentrate substantially free of organic solvent and suitable for further galenic treatment. If desired, a spray mixture of solids free of eluate can be obtained by spray drying. If the natural conjugated estrogen mixture is intended for the production of solid drugs, it may be appropriate to mix the solid carrier into the eluate containing the conjugated estrogens before concentration or spray drying to thereby obtain a solid mixture containing the conjugated estrogens and carriers. Also, the eluate containing the estrogen mixture, as well as the concentrate obtained from it or the spray dried solid product, can be introduced in a known manner into solid or liquid galenic preparations, such as tablets, dragees, capsules or emulsions. These galenic preparations can be made by methods known per se using conventional solid or liquid carriers, such as starch, cellulose, milk sugar, or talc, or liquid paraffins, and / or using conventional pharmaceutical excipients, for example tablet breakers, solubility enhancers, or preservatives. The product containing conjugated estrogens can itself be mixed in a known manner with pharmaceutical carriers and excipients and the mixture can be converted into a suitable dosage form.
Последующие примеры поясняют изобретение, не ограничивая его объема. The following examples illustrate the invention without limiting its scope.
Примеры 1 - 5
Общая методика получения из мочи жеребых кобыл экстракта, в значительной степени обедненного фенольными составляющими и содержащего природную смесь сопряженных эстрогенов, содержащихся в моче жеребых кобыл.Examples 1 to 5
The general method for obtaining from the urine of mares an extract substantially depleted in phenolic constituents and containing a natural mixture of conjugated estrogens contained in the urine of mares.
А) Предварительная обработка мочи жеребых кобыл
10 л мочи жеребых кобыл, отфильтрованной пропусканием через слой песка высотой 5 см или микрофильтрационную установку (содержащие сухого вещества (СВ), а также определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ приведены в нижеследующей таблице), при энергичном перемешивании путем добавления 50%-ного водного раствора гидроокиси натрия (плотность при 20oC 1,52 г/мл) доводят до значения pH 13 (добавляемое количество раствора NaOH приведено в таблице) и перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем щелочную жидкость мочи путем добавления концентрированного водного раствора соляной кислоты (примерно 35%-ной) доводят до значения pH от 8 до 8,5.A) Pre-treatment of urine for mares
10 l of urine of mares, filtered by passing through a 5 cm high sand layer or microfiltration unit (containing dry matter (CB), as well as the contents of estrogen sulfate salt, cresol and HMPF determined using high-performance liquid chromatography, are shown in the following table), with vigorous stirring by the addition of a 50% aqueous sodium hydroxide solution (density at 20 ° C. 1.52 g / ml) was adjusted to pH 13 (the added amount of NaOH solution is shown in the table) and stirred for 1 hour and room temperature. Then, the alkaline liquid of urine is adjusted by adding a concentrated aqueous solution of hydrochloric acid (approximately 35%) to a pH value of from 8 to 8.5.
Б) Адсорбция эстрогенов, содержащихся в моче жеребых кобыл, на фазообратимом силикагеле
Наполняют колонку высотой 50 см с диаметром 5 см 100 г (соответствует примерно объему около 193 мл, что равняется 1 объему слоя) фазообратимого силикагеля ("силикагель 60/производное диметилсилана" фирмы Мерк, номер заказа 7719, величина зерна 63 - 200 мкм). Сперва колонку промывают 0,5 л воды, затем 0,25 л метанола и еще раз 0,5 л воды.B) Adsorption of estrogens contained in the urine of mares on phase-reversible silica gel
A column with a height of 50 cm and a diameter of 5 cm 100 g is filled (approximately corresponds to a volume of about 193 ml, which equals 1 volume of a layer) of phase reversible silica gel (Merck silica gel 60 / dimethylsilane derivative, order number 7719, grain size 63 - 200 μm). First, the column is washed with 0.5 L of water, then 0.25 L of methanol and again 0.5 L of water.
Предварительно обработанную на стадии А) жидкость мочи при избыточном давлении 0,2 бар и со скоростью 60 мл/мин пропускают через колонку. Эстроген, содержащийся в моче жеребых кобыл, полностью адсорбируется на загруженной таким образом фазообратимым силикагелем колонке. Вытекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание сопряженных эстрогенов, и она оказывается практически свободной от эстрогенов. Процесс останавливают. The urine fluid pretreated in step A) is passed through a column at a pressure of 0.2 bar and at a rate of 60 ml / min. The estrogen contained in the urine of the mares is completely adsorbed on the column thus loaded with phase-reversible silica gel. Leaking urine fluid is examined using high performance liquid chromatography for conjugated estrogens, and it is virtually free of estrogen. The process is stopped.
В) Промывание загруженной фазообратимым силикагелем колонки
Загруженную фазообратимым силикагелем колонку промывают 2 л 0,15-молярного буферного раствора уксусная кислота/ацетат натрия (примерно 10 объемов слоя). Буферный раствор получают добавлением в 0,15-молярный водный раствор уксусной кислоты твердого ацетата натрия (около 107 г) до достижения значения pH, равного 5. Стекающую промывочную жидкость исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ, и она содержит мерее 5% исходного количества эстрогенов в моче жеребых кобыл.C) Washing the loaded phase reversible silica gel column
A column loaded with phase reversible silica gel is washed with 2 L of a 0.15 molar acetic acid / sodium acetate buffer solution (approximately 10 bed volumes). A buffer solution is prepared by adding solid sodium acetate (about 107 g) to a 0.15 molar aqueous solution of acetic acid to reach a pH value of 5. The flowing wash liquid is examined by high performance liquid chromatography to determine the content of estrogen sulfate salt, cresol and HFMP, and it contains less than 5% of the initial amount of estrogen in the urine of mares.
Г) Десорбция сопряженных эстрогенов из промытой колонки фазообратимого силикагеля и отделение фракции элюата, обогащенной эстрогенами
1 л элюирующей жидкости (смесь воды и растворителя, состав приведен в последующей таблице) пропускают через колонку при избыточном давлении 0,2 бар и со скоростью потока около 60 мл/мин. Стекающий элюат собирают в несколько фракций (объем каждой фракции около 200 мл, что соответствует примерно 1 объему слоя). Отдельные фракции исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание в них эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ. Первую фракцию собирают до тех пор, пока элюат будет бесцветным или слабо желтым. Объем этой фракции составляет 150-200 мл. Эта фракция содержит лишь следы эстрогенсульфатной соли.D) Desorption of conjugated estrogens from the washed column of phase-reversible silica gel and separation of the estrogen-rich eluate fraction
1 l of the eluting liquid (mixture of water and solvent, the composition is given in the following table) is passed through the column at an overpressure of 0.2 bar and with a flow rate of about 60 ml / min. The draining eluate is collected in several fractions (the volume of each fraction is about 200 ml, which corresponds to about 1 volume of the layer). Individual fractions are examined using high performance liquid chromatography for the content of estrogen sulfate salt, cresol and HMPF. The first fraction is collected until the eluate is colorless or slightly yellow. The volume of this fraction is 150-200 ml. This fraction contains only traces of estrogen sulfate salt.
Как только произойдет изменение цвета элюата на интенсивный темно-желтый или коричневый цвет, собирают следующую фракцию объемом около 200 мл. В этой фракции содержится около 80-90% от всего количества сопряженных эстрогенов, загруженных в колонку. Остальные фракции содержат лишь незначительное количество эстрогенсульфатной соли. При необходимости остаточные фракции после отделения путем дистилляции растворителя можно еще раз подать на стадию Б) способа. As soon as the color of the eluate changes to an intense dark yellow or brown color, the next fraction is collected with a volume of about 200 ml. This fraction contains about 80-90% of the total number of conjugated estrogens loaded into the column. The remaining fractions contain only a small amount of estrogen sulfate salt. If necessary, the residual fractions after separation by distillation of the solvent can again be submitted to stage B) of the method.
В нижеследующей таблице для второй фракции, содержащей основное количество сопряженных эстрогенов, указаны содержание сухого вещества СВ в % масс. и определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ. Эта фракция представляет собой экстракт, пригодный для дальнейшей галеновой обработки. In the following table for the second fraction containing the main amount of conjugated estrogens, the dry matter content of CB in% of the mass. and the content of estrogen sulfate salt, cresol and HMPF determined by high performance liquid chromatography. This fraction is an extract suitable for further galenic treatment.
Д) Регенерация колонки фазообратимого силикагеля
Для регенерации колонки сначала промывают 2 л воды, затем 0,5 л метанола и еще раз 2 л воды. Затем колонку можно снова использовать. Колонку можно многократно, например до 10 раз, регенерировать и снова использовать.E) Regeneration of a phase reversible silica gel column
For regeneration, the columns are first washed with 2 L of water, then 0.5 L of methanol and again 2 L of water. Then the column can be used again. A column can be regenerated and reused, for example up to 10 times.
Claims (7)
А) жидкость мочи, представляющая собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, концентрат этой мочи или сконцентрированный ретентат мочи, полученный путем мембранной фильтрации этой мочи, обрабатывают водорастворимым основанием в количестве, достаточном для установления значения рН, равного по меньшей мере 12, и затем устанавливают значение рН мочи, обработанной основанием, посредством добавления достаточного количества водного кислотного раствора в диапазоне от 5 до 8,5;
Б) обработанную предварительно основанием жидкость мочи, имеющую значение рН от 5 до 8,5, приводят в контакт с гидрофобизированным силикагелем в количестве, достаточном для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов, и отделяют гидрофобизированный силикагель, загруженный смесью сопряженных эстрогенов, от остальной жидкости мочи;
В) гидрофобизированный силикагель, загруженный смесью сопряженных эстрогенов, промывают водным буферным раствором со значением рН в диапазоне от 5 до 7;
Г) промытый гидрофобизированный силикагель приводят в контакт с элюирующей жидкостью в количестве, достаточном для десорбции адсорбированной на нем смеси сопряженных эстрогенов, элюирующая жидкость представляет собой смесь воды со смешиваемым с водой органическим растворителем из группы смешиваемых с водой простых эфиров, низших спиртов и низших алифатических кетонов, и отделяют элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов, обедненную фенольными веществами, и в случае необходимости концентрируют.1. The method of obtaining a natural mixture of conjugated estrogens depleted in phenol from urine of mares, characterized in that
A) urine fluid, which is urine purified from mucus and solids, a concentrate of this urine, or concentrated retentate of urine obtained by membrane filtration of this urine, is treated with a water-soluble base in an amount sufficient to establish a pH value of at least 12, and then set the pH of the urine treated with the base by adding a sufficient amount of an aqueous acid solution in the range of 5 to 8.5;
B) a pre-treated urine liquid with a pH of 5 to 8.5 is brought into contact with hydrophobized silica gel in an amount sufficient to adsorb the conjugated estrogen mixture contained in the urine liquid, and the hydrophobized silica gel loaded with the conjugated estrogen mixture is separated from the rest urine fluids;
C) hydrophobized silica gel loaded with a mixture of conjugated estrogens, washed with an aqueous buffer solution with a pH in the range from 5 to 7;
D) the washed hydrophobized silica gel is brought into contact with the eluting liquid in an amount sufficient to desorb the conjugated estrogen mixture adsorbed on it, the eluting liquid is a mixture of water with a water-miscible organic solvent from the group of water-miscible ethers, lower alcohols and lower aliphatic ketones and the eluate containing the natural mixture of conjugated estrogens depleted in phenolic substances is separated off and, if necessary, concentrated.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99106510A RU2179029C2 (en) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | Method to obtain estrogens from mare's urine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99106510A RU2179029C2 (en) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | Method to obtain estrogens from mare's urine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99106510A RU99106510A (en) | 2001-01-27 |
| RU2179029C2 true RU2179029C2 (en) | 2002-02-10 |
Family
ID=20217861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99106510A RU2179029C2 (en) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | Method to obtain estrogens from mare's urine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2179029C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8815299B2 (en) | 2002-10-11 | 2014-08-26 | Abbott Products Gmbh | Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens depleted in non-conjugated lipophilic compounds |
-
1996
- 1996-08-30 RU RU99106510A patent/RU2179029C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| US 3769401 Oct., 30.1973. US 4528186 Jul., 9 1985. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии./Под ред. Г.В.Лисичкина. - М.: Химия, 1986, с.170-171. SHAGKLETON C.H. et. al, Use of Sep-pak cortridges for urinary steroid еxtraction: evaluation of the method for use prior to gas chromatographic anаlysis, Clin. Chim. Acta, 1980 Now 6, 107(3), 231-243. HEIKKINEN R. et al, Roversed-phase C18 cartrige for extraction of estragens from urine and plasma, Clin. Chem., 1981. J ol, 27(7), 1186-1189. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8815299B2 (en) | 2002-10-11 | 2014-08-26 | Abbott Products Gmbh | Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens depleted in non-conjugated lipophilic compounds |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5723454A (en) | Method for obtaining estrogens from pregnant mare urine by solid phase extraction on a semi-polar adsorber resin | |
| CA2263757C (en) | Method to obtain oestrogens from mare's urine | |
| JP4125788B2 (en) | How to get estrogen from mare urine | |
| RU2179029C2 (en) | Method to obtain estrogens from mare's urine | |
| US5814624A (en) | Method for obtaining estrogens from pregnant mare urine by solid-phase extraction | |
| AU2002352161B2 (en) | Method for obtaining oestrogen from mare urine | |
| US6855704B2 (en) | Process for isolating conjugated estrogens | |
| RU2179028C2 (en) | Method to isolate estrogens from mare's urine | |
| US8815299B2 (en) | Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens depleted in non-conjugated lipophilic compounds | |
| US7964586B2 (en) | Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens | |
| CN1332973C (en) | Extraction process of conjugated female hormone | |
| CN1234740A (en) | Process to obtain oestrogens from mare's urine | |
| MXPA99001923A (en) | Method toobtain oestrogens from mare's urine | |
| AU2003301237B2 (en) | Method for extracting a natural mixture of conjugated equine estrogens that is depleted of non-conjugated lipophilic compounds | |
| MXPA99001851A (en) | Process to obtain oestrogens from mare's urine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150831 |