NO317236B1 - Insulinutskillende cellelinjer, fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny cellelinje som kan implanteres i et menneskeorgan slik at den får det til å ut-trykke det biologiske produktet som den nye cellelinjen normalt uttrykker i kulturer. Oppfinnelsens gjenstand er nærmere bestemt en ny, høydifferensiert, insulinutskillende p-cellelinje som omfatter transformerte p-celler. Denne cellelinjen er kjennetegnet ved at p-cellene uttrykker insulin som svar på glukose, og hvor ekspresjon av genet for insulinlignende vekstfaktor II (IGF-II)i p-cellene er permanent inhibert ved fullstendig undertrykkelse av genet.

Denne cellelinjen kan transplanteres inn i organene til insulinavhengige individer og tilveiebringe en 11 fysiologisk" kontroll over glykemi i tilfellet med insulinavhengig diabetes.

Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av transformerte p-cellelinjer, kjennetegnet ved de følgende trinn: (i) transfeksjon av p-celler fra en høydifferensiert, insulinutskillende P-cellelinje med et plasmid som bærer et modifisert IGF-II-gen, hvor det modifiserte IGF-II-gen har innføyd i fase i ekson 4 en kassett som koder for neomycinresistensgenet, og ned-strøms for neomycingenet en kassett som koder for viral tymidinkinase, (ii) dyrking av de transfekterte p-celler i nærvær av neomycin, gancyclovir og IGF-II, og (iii) isolering av transformerte p-celler som er resistente overfor neomycin og gancyclovir, hvorved det modifiserte IGF-II-gen er blitt inkorporert ved hjelp av homolog rekombinasjon, og hvorved p-cellene er avhengige av den eksogene administrering av IGF-II for proliferasjon.

Oppfinnelsen vedrører også transplantat som er kjennetegnet ved at det omfatter pseudoøyceller fra en transformert insulinutskillende p-cellelinje ifølge krav 1, agglomerert og inkorporert i rørformede akrylmembraner som er permeable for molekyler med en molekylvekt som er lavere enn 50 000 - 80 000, og fordelt i form av fibrer.

Organtransplantasjon og vevstransplantasjon utgjør en del av de terapeutiske redskapene som brukes ved en rekke sykdommer. I den senere tid har genteknikker ført til at man ser for seg andre muligheter for behandling av sykdommer som hittil har vært uhelbredelige.

Det er derfor foreslått et forskningsprosjekt som kom-binerer transplantasjon og genterapi for behandlingen av diabetes mellitus. Oppfinnerne har faktisk etablert en p-cellelinje, INS-I-linjen. Denne linjen utskiller insulin som svar på fysiologiske konsentrasjoner av glukose og vil, etter genteknisk behandling, kunne brukes for transplantasjon og "fysiologisk" kontroll av glykemi ved insulinavhengig diabetes.

Til tross for de terapeutiske anstrengelsene som er blitt gjort i det siste tiåret, forblir behandlingen av diabetes svært utilfredsstillende. Det er grunnen til at nye behandlinger utforskes; bukspyttkjertel- eller øycelletransplantasjoner er en del av dette {Hellerstrom C, Andersson A, Groth C-G, Sander S, Jansson L, Korsgren 0, Swenne I, Petersson B, Tollemar J, Tydén G - Diabetes Care, 11 (Suppl. 1), 45-53, 1988) (Pipelleers DG, Pipelleers-Marichal M, Hannaert J-C, Berghmans M, In't Veid PA, Rozin J, Van de Winkel M, Gepts W - Diabetes, 40:908-919, 1991). Mer enn tusen transplantasjoner av hel bukspyttkjertel og noen få titalls øycelletransplanta-sjoner er blitt utført over hele verden. Selv om de er lovende, reiser disse tungvinte teknikkene skjematisk sett to typer problem: noen immunologiske, andre logi-stikkmessige.

I tillegg til problemene med toleranse som er iboende i hver type transplantasjon, bør man huske på at diabetes er en au-to immunsykdom og at mottakeren, en diabetiker, bibeholder et po-tensial for å ødelegge p-cellene som er transplantert. Det fore-ligger derfor et absolutt behov for å kombinere en immununder-trykkende terapi med transplantasjonen. For å unngå denne immun-undertrykkelsen har noen forfattere foreslått transplantasjon av innkapslede øyceller {Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784, 1991)

(Chicheportich D, Reach G - Diabetologia 31:54-57, 1988). Hovedfordelen ved beskyttelsen og spesielt innkapslingen er å beskytte det transplanterte vev mot angrep fra immunsystemet. Den lave tilgjengeligheten av øyceller gjør imidlertid fremstillingen av tilstrekkelige mengder av materialet for terapeutiske formål

vanskelig. Følgelig har det vært gjort betydelige anstrengelser i løpet av de siste tiårene på å etablere p-cellelinjer som modell-

er for å studere insulinutskillelse og diabetes. Mesteparten av disse linjene har mistet sin essensielle p-cellefunksjon, nemlig responsen på glukose ved utskillelse av insulin, idet dette tapet inntrer under subkulturer og på hverandre følgende cellesykluser. Oppfinnerne har derfor vært i stand til å etablere en høydiffer-ensiert p-cellelinje (INS-I) hvis karakteristika er svært like med normale p-cellers (Asfari M, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB - Endocrinology 130:167-178, 1992), og dette ut-gjør essensen i oppfinnelsen.

Blant de bemerkelsesverdige egenskapene til disse cellene kan det særlig nevnes det høye insulininnhold, ekspresjonen av glukokinase, glukosebæreren Glut 2, ved nivåer som er sammenlignbare med normale p-cellers. Endelig skal det også nevnes responsen på differensiering eller vekstfaktorer, slik som veksthormon, prolaktin IGF-I og IGF-II ved fysiologiske konsentrasjoner [sic]. Hovedfordelen ved disse cellene er først og fremst deres sensitivitet overfor glukose. Oppfinnerne har tid-ligere vært i stand til å vise at en økning i glukosekonsentrasjoner fra 3 til 20 mM øker iNS-l-cellers insulinutskillelse fire ganger i nærvær av stoffer som øker det intracellulære nivå av cAMP.

I den senere tid er det dessuten blitt påvist at in-kubasjonen av disse cellene med fysiologiske konsentrasjoner av glukose (48 timer ved 5 mM) gjør dem enda mer sensitive overfor variasjoner i glukosekonsentrasjon. Disse differensieringskarak-teristika gjør disse cellene til de mest passende kandidater for xenotransplantasjoner i biologisk forenlige kapsler hos diabetes-individer.

Før transplantasjonen er det imidlertid nødvendig å gjøre disse cellene ikke-prolifererende. Inhiberingen av proliferasjon er faktisk av avgjørende betydning dersom det er ønsket å unngå ukontrollert vekst og en mulig ødeleggelse av den beskytt-ende kapsel. Dette oppnås ved å ødelegge genene som er involvert (direkte eller indirekte) i celleproliferasjonen. Det er nylig blitt mulig å vise at IGF-II uttrykkes i rikelig antall i disse cellene. IGF-II er en vekstfaktor som modulerer cellevekst hovedsakelig på en autokrin måte. Det er derfor, på bakgrunn av de ny-ere resultatene som er beskrevet senere, mulig å tenke seg at IGF-II er involvert i den ukontrollerte vekst av disse cellene, og at inhiberingen av ekspresjonen av IGF-II-genet (ved ødeleggelse av genet) er i stand til å inhibere eller i betydelig grad redusere celleproliferasjon. Ved hjelp av denne genteknikken ville INS-I-cellene være i stand til å bli tilpasset til innkapsling og til transplantasjon ved å gjøre det mulig å unngå eventu-elle komplikasjoner og vanskeligheter som fører til fremstillingen og transplantasjonen av bukspyttkjerteløyceller.

Endelig reduseres proliferasjonen av p-celler som er modifisert genetisk og dyrket i fravær av serum, i betydelig grad når cellene dyrkes i nærvær av et bindende protein IGFBP-3 (Gopinath R, Walton PE, Etherton ED - Endocrinol 120:231-236, 1989). Ved IGFBP-3-modellen som er utviklet av oppfinnerne, hvor IGF-II sekvestreres, reduseres dens biologiske aktivitet. Tilsetningen av IGFBP inhiberer proliferasjonen av INS-I-cellene. Denne observasjonen tyder på at IGF-II spiller en hovedrolle ved proliferasjonen av INS-I-cellene ettersom den eneste kjente funksjon til de bindende proteiner (BP) og særlig BP3, er å binde til IGF-ene.

En rekke indirekte bevis understøtter de oppnådde resultater: IGF-II stimulerer celleproliferasjon i tumorlinjer på en autokrin-parakrin-måte (El-Bardy OH, Romanus JAI, Helman LH, Cooper MH, Rrchler MM, Israel MA - J. Clin. Invest., 84:829, 1989). Dette er også blitt demonstrert på transformerte celler (Park JHY, McCusker RH, Vanderhoof JA, Mohammadpour H, Harty RF, MacDonald RG - Endocrinology, 131:1359-1368, 1992) og på primære p-øycellekulturer (Rabinovith A, Quigley C, Russel T, Patel Y, Mintz DH - Diabetes, 31:160-164, 1982) (Hill DJ, Hogg J - E.M. Spencer (red.), Elsevier Science Publishing Co., Inc., 1991, 235-240) .

Foreløpige resultater

Disse resultatene vedrører hovedsakelig forholdene mellom IGF-II, glukosekonsentrasjonen i dyrkningsmediet og cellepro-lif erasjon.

Ved 5 mM glukose synes ikke celleproliferasjon å bli modifisert. Fra 5 mM og opp til 2 0 mM iakttas en økning i proliferasjon i løpet av tidsrom som varierer opp til 72 timers dyrk-ning. Parallelt med dette observeres en økning i IGF-II-budbringer-RNA-er for glukosekonsentrasjoner i området fra 10 til 20 mM.

Det var ikke mulig å påvise hverken IGF-I-proteinet (radioimmunologisk analyse) (Binoux M, Seurin D, Lassarre C, Gourmelen M - J. Clin. Endocrinol. Metab., 59:453-462, 1984), eller dets budbringer-RNA i disse cellene, selv etter langvarige eksponeringer mot veksthormon.

Metodeprinsipp

Arbeidet bør utføres i to stadier:

etablering av en cellelinje INS-I som bærer et inaktivt IGF-II-gen, som gjør cellene ikke-prolifererende samtidig som deres sensitivitet overfor glukose opp-rettholdes,

innkapsling av disse cellene og transplantasjon til diabetiske dyr med det formål å utføre transplantasjoner hos menneske etterpå i henhold til den samme fremgangsmåte.

Forsøksfremgangsmåte

Del I:

Den permanente inaktivering av IGF-II-genet ble utført ved hjelp av den homologe rekombinasjonsteknikk (Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651, 1990)

(Pennington S, Wilson JH - Proe. Nati. Acad. Sei., 88:9498-9502, 1991). Oppfinnerne har tilgjengelig det klonede IGF-II-gen i plasmidet pUC 119 (dr. Holthuizen) (Holthuizen P, Van der Lee FM, Ikejiri K, Yamamoto M, Sussenbach JS - Biochem. Biophys. Acta, 1087:341-343, 1990). Blant de fire forskjellige typene av budbringer-RNA-er som koder for IGF-II, uttrykkes den 3,6 kb store budbringer-RNA først og fremst i INS-I-cellene. Denne budbringeren transkriberes ved å bruke P3-promoteren (Matsuguchi T, Takahashi K, Ikejiri K, Ueno T, Endo H, Yamamoto M - Biochem. Biophys. Acta, 1048:165-170, 1990).

Det er foreslått å innføye en kassett som koder for resistensgenet for neomycin (neo) under kontroll av promoteren i CMV-tidliggenene, plassert i fase i ekson 4 i IGF-II-genet. Nedstrøms for denne konstruksjonen vil det bli innføyet en kassett som koder for tymidinkinasen fra herpes simplex-virus. Denne konstruksjonen gjør det mulig å velge ut de sjeldne klonene som har iGF-II-neokonstruksjonen, ved hjelp av homolog rekombinasjon og ikke ved hjelp av vilkårlig innføyelse. Klonene som skyldes en homolog rekombinasjon, vil faktisk være resistente overfor neomycin og ganciclovir, mens klonene som skyldes en vilkårlig rekombinasjon, vil være neomycinresistente, men ganciclovirsensitive.

Etter transfeksjon dyrkes cellene i nærvær av neomycin, ganciclovir og IGF-II. De resistente klonene testes med hensyn på deres evne til å proliferere i fravær av endogen IGF-II, men i nærvær av eksogen IGF-II, og vil bli studert ved hjelp av "Southern blot"-teknikken og analysert ved hjelp av PCR med det formål å sjekke om integrasjonen var korrekt. Ekspresjonen av IGF-II vil bli studert på nivået på budbringer-RNA-ene og proteinene ved hjelp av henholdsvis "Northern blot"- og "Western blot"-teknikkene. Ettersom det er fastslått at bare det paternale allel i IGF-II-genet er aktivt (De Chaiara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A - Cell, 64:849-859, 1991), og ettersom homolog rekombinasjon er mer virkningsfull på nivået til DNA-segmentene som er transkripsjonelt aktive (Nickoloff JC - MEB, 12:5311-5318, 1992), kan det forventes å oppnå INS-I-celler som ikke lenger uttrykker IGF-II, ved hjelp av et enkelt transfeksjons/selek-sjons-trinn. Dersom dette ikke var tilfellet, vil imidlertid ødeleggelsen av den andre kopien av IGF-II-genet kunne foretas (Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature, 384:649-651, 1990). På hvert stadium av dette arbeidet bør glukoses evne til å indusere utskillelsen av insulin sjekkes.

Del II:

Dersom ødeleggelsen (utslåingen) av IGF-II-genet er vellykket, burde det til sist oppnås en INS-I-cellelinje som vil være fullstendig eller i stor utstrekning avhengig av den eksogene administrering av IGF-II for sin vekst. I teorien ville denne nye cellelinjen være sensitiv overfor glukose på den samme måte som opphavslinjen. I dette tilfellet kan disse cellene så derfor brukes til innkapslingen og transplantasjonen.

1.Innkapsling av INS-I-cellelinjen

a) for en virkningsfull innkapsling bør cellene opparbeides til aggregater i en "pseudoøycelle"-form. Dette

kan utføres ved å dyrke cellene i ikke-adhesive

kulturskåler. Størrelsen til aggregatene (= "pseudo-øycellene") kan bestemmes ved hjelp av tettheten til cellene på tidspunktet for dyrkingen. På den annen side kan antallet celler i aggregatene sjekkes etter

trypsinering av "pseudoøyceliene" (PI) som innhøstes.

b) et kjent antall PI-er som inneholder en mengde insulin som er ekvivalent med det som finnes i 500-1 000 voksne

rotteøyceller (2-4 x IO<8> celler), oppslemmes i en oppløsning av natriumalginat (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science, 254:1782-1784, 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proe. Nati. Acad. Sei., 88:11100-11104, 1991) og immobiliseres ved innkapsling i denne biologisk forenlige hydrogel under anvendelse av en vandig oppløsning av et kalsiumsalt. PI-ene innkapslet vil så bli plassert i rørformede akrylmembraner som er permeable for molekyler med en molekylvekt som er mindre enn 50 000- 80 000 (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science, 254:1782-1784, 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KJ, Staruk JE, Faustmann DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proe. Nati.

Acad. Sei., 88:11100-11104, 1991).

c) de innkapslede PI-er studeres "in vi tro" ved perfu-sjon for å bestemme styrken og hastigheten hvorved de

forårsaker en endring i insulinutskillelse som svar på forskjellige glukosekonsentrasjoner. Når denne delen av forsøket er vist å være tilfredsstillende, vil PI-ene inneholdt i fibrene, bli brukt for transplantasjonen.

2.Transplantasjon

De innkapslede PI-er transplanteres subkutant eller intraperitonealt. De to fremgangsmåtene er virkningsfulle når det gjelder å opprettholde normoglykemi i dyremodellene for human, insulinavhengig diabetes. De biologisk avlede (BB) rotter og de ikke-fete, diabetiske (NOD) mus som spontant utvikler diabetes, er forbundet med en spesifikk, vevsforenlig genotype og oppviser de samme defekter ut fra immunitetssynspunktet som de diabetiske individene (tilstedeværelse av cytotoksiske T-lymfocytter) av de diabetiske dyrene som har gjennomgått transplantasjoner (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science, 254:1782-1784, 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustmann DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proe. Nati. Acad. Sei., 88:11100-11104, 1991). Transplantasjonen via den intraperitoneale vei synes å være mer gunstig for å sikre et godt biologisk miljø for de transplanterte celler.

Denne teknikken er anvendbar på samme måte for de insulinavhengige individer. Mellom 50 000 og 200 000 PI-er bør implanteres for å nå en effektiv insulinkonsentrasjon.

Claims (15)

1. Høydifferensiert, insulinutskiIlende P-cellelinje som omfatter transformerte p-celler, karakterisert ved at p-cellene uttrykker insulin som svar på glukose, og hvor ekspresjon av genet for insulinlignende vekstfaktor II (IGF-II)i p-cellene er permanent inhibert ved fullstendig undertrykkelse av genet.

2. P-cellelinje ifølge krav 1, karakterisert ved at den høydif f erensierte, insulinutski11ende P-cellelinje er en INS-I-cellelinje.

3. p-cellelinje ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at P-cellelinjen er i form av pseudoøycelle-aggregater.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av transformerte p-cellelinjer ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved de følgende trinn: (i) transfeksjon av p-celler fra en høydifferensiert, insulinutskillende p-cellelinje med et plasmid som bærer et modifisert IGF-II-gen, hvor det modifiserte IGF-II-gen har innføyd i fase i ekson 4 en kassett som koder for neomycinresistensgenet, og nedstrøms for neomycingenet en kassett som koder for viral tymidinkinase, (ii) dyrking av de transfekterte P-celler i nærvær av neomycin, gancyclovir og IGF-II, og (iii) isolering av transformerte P-celler som er resistente overfor neomycin og gancyclovir, hvorved det modifiserte IGF-II-gen er blitt inkorporert ved hjelp av homolog rekombinasjon, og hvorved p-cellene er avhengige av den eksogene administrering av IGF-II for proliferasjon.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den høydif f erensiert e, insulinutskillende P-cellelinje er en INS-I-cellelinje.

6. Fremgangmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at plasmidet er avledet fra pUC 119.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den således fremstilte p-cellelinje videre opparbeides til aggregater i form av pseudo-øyceller ved dyrking av cellene i ikke-adhesive dyrkningsskåler.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at pseudoøycellene agglomereres i suspensjon i et geldannelsesmiddel og immobiliseres i en biologisk forenlig hydrogel ved å tilsette et immobiliseringsmiddel.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at geldannelsesmidlet er et natriumalginat.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at immobiliseringsmidlet er en vandig oppløsning av et kalsiumsalt.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at de agglomererte og immobiliserte pseudoøyceller inneholder en insulinmengde som er ekvivalent med den som finnes i 500-1000 øyceller hos voksne rotter.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at pseudoøyceliene immobiliseres ved innkapsling i en biologisk forenlig hydrogel som er blitt stivnet ved tilsetning av en vandig oppløsning av et kalsiumsalt, og plasseres så i rørformede akrylmembraner som er permeable for molekyler med en molekylvekt som er lavere enn 50 000 - 80 000.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at de immobiliserte og stivnede pseudoøyceller inkorporeres i transplanterbare fibrer.

14. Transplantat, karakterisert ved at det omfatter pseudoøyceller fra en transformert insulinutskillende p-cellelinje ifølge krav 1, agglomerert og inkorporert i rørformede akrylmembraner som er permeable for molekyler med en molekylvekt som er lavere enn 50 000 - 80 000, og fordelt i form av fibrer.

15. Transplantat ifølge krav 14, karakterisert ved at det omfatter 50 000 til 200 000 pseudoøyceller, hvorved det produseres en effektiv mengde insulin for behandling av en insulinavhengig pasient.