ES2243929T3 - Lineas de celulas secretoras de insulina, procedimientos de obtencion y utilizacion. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LA BIOLOGIA Y MAS EN PARTICULAR AL CAMPO DE LA BIOLOGIA CELULAR. SE REFIERE ESPECIFICAMENTE A UNA NUEVA LINEA CELULAR LLAMADA LINEA CELULAR {BE} QUE RESPONDE A LA GLUCOSA (INS.I) QUE EXPRESA GLUCOQUINASA Y TRANSPORTADOR DE GLUCOSA GLUT 2 A NIVELES COMPARABLES A LOS DE LAS CELULAS {BE} NORMALES PERO, ADEMAS, DESPROVISTAS, POR MANIPULACION GENETICA, DE LA POSIBILIDAD DE PROLIFERACION BAJO LA DEPENDENCIA DE UNA EXPRESION DE IGF II. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCESO DE PRODUCCION DE ESTA NUEVA LINEA CELULAR, DE SU AGREGACION EN FORMA DE SEUDOISLOTE, DE SU INMOVILIZACION EN UN HIDROGEL BIOCOMPATIBLE Y DE SU ENDURECIMIENTO POR UNA SOLUCION ENDURECEDORA. APLICACION EN EL TRASPLANTE DE CELULAS {BE}-INSULINOSEGRAGADORAS.

Description

Líneas de células secretoras de insulina, procedimientos de obtención y utilización.

La presente invención se refiere al campo de la biología y, de una manera más particular, al campo de la biología celular.

La invención tiene por objeto, de una manera más particular, una línea celular nueva, susceptible de ser implantada en un órgano humano para hacerle expresar el producto biológico que la línea celular nueva expresa, normalmente, en los cultivos.

La invención tiene por objeto, de una manera específica, una nueva línea celular denominada línea celular \beta que responde a la glucosa (INS-1), cuya propiedad principal consiste en la sensibilidad a la glucosa. Por lo tanto, estas células se caracterizan por un contenido elevado en insulina, por la posibilidad de expresar la glucoquinasa y del transportador de la glucosa Glut 2 a niveles comparables a los de las células \beta-normales y, además, estas células se han hecho no proliferantes mediante manipulación genética.

Esta línea celular es apta, por lo tanto, para ser injertada en los órganos de los sujetos insulino-dependientes y para asegurar un control "fisiológico" de la glicemia, en el caso de la diabetes insulino-dependiente.

El injerto de órgano o el injerto de tejido forma parte de los útiles terapéuticos utilizados en un cierto número de enfermedades. Más recientemente, las técnicas de manipulación genética han hecho entrever otras posibilidades para el tratamiento de las enfermedades incurables hasta ahora.

Así pues se propone un proyecto de investigación que combina el injerto y la terapia genética para el tratamiento de la diabetes mellitus. En efecto, los solicitantes han establecido una línea celular \beta, la línea INS-1. Esta línea secreta la insulina como respuesta a concentraciones fisiológicas de la glucosa y podría, tras manipulación genética, ser utilizada para el injerto y el control "fisiológico" de la glicemia en la diabetes insulino-dependiente.

A pesar de los esfuerzos terapéuticos realizados en el último decenio, el tratamiento de la diabetes sigue siendo muy imperfecto. Esta es la razón por la cual se han explorado nuevas terapéuticas; los injertos del páncreas o de islotes forman parte de las mismas (Hellerstrom C, Andersson, A, Groth C-G, Sandler S, Jansson L, Korsgren O, Svenne I, Petersson B, Tollemar J, Tydén G - Diabetes Care 11 (Suppl.1) 45-53 1988) (Pipelleers DG, Pipelleers-Marichal M, Bannaert J-C, Berghmans M, In't Veld PA, Rozin J, Van de Winkel M, Gepts W - Diabetes 40:908-919 1991). Se ha realizado, en el mundo, más de un millar de injertos de páncreas entero y algunas decenas de injertos de islotes. Aún cuando proporcionen esperanza, estas técnicas pesadas plantean, esquemáticamente, dos tipos de problemas: los unos inmunológicos, los otros logísticos.

Además de los problemas de la tolerancia, inherentes a cada tipo de injerto, es preciso recordar que la diabetes es una enfermedad autoinmune y que el receptor, diabético, conserva una potencialidad para destruir las células \beta injertadas. Así pues, existe una necesidad absoluta para asociar una terapéutica inmuno-supresora con el injerto. Con el fin de evitar esta inmuno-supresión, algunos autores han propuesto el transplante de islotes encapsulados (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Chicheportich D, Reach G - Diabetologia 31:54-57 1988). La ventaja esencial de la protección y, principalmente, de la encapsulación consiste en substraer al tejido injertado del ataque por el sistema inmunitario. Sin embargo, la baja disponibilidad de los islotes hace difícil la preparación de cantidades suficientes del material con fines terapéuticos. Éste es el motivo por el cual se han consagrado esfuerzos considerables estos diez últimos años para establecer líneas celulares \beta como modelos de estudio de la insulinosecreción y de la diabetes. La mayor parte de estas líneas han perdido su función celular \beta esencial, a saber la respuesta a la glucosa mediante una secreción de insulina, sobreviniendo esta pérdida en el transcurso de las replicaciones y de los ciclos celulares sucesivos. Los solicitantes han podido establecer, por lo tanto, una línea celular \beta muy diferenciada (INS-1), cuyas características son muy próximas a las de las células \beta normales (Asfari M, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB - Endocrinology 130:167-178 1992) y esto constituye la esencia de la invención.

Entre las propiedades notables de estas células, se citarán, en particular, el elevado contenido en insulina, la expresión de la glucoquinasa, el transportador de glucosa Glut 2, a niveles comparables a los de la célula \beta normal, finalmente, la respuesta a factores de crecimiento o de diferenciación como la hormona del crecimiento, la prolactina IGF-1 y IGF-II a concentraciones fisiológicas. El interés esencial de estas células es, ante todo, su sensibilidad a la glucosa. Los solicitantes han podido demostrar, precedentemente, que un aumento de las concentraciones de glucosa desde 3 hasta 20 mM aumenta 4 veces la secreción de insulina de las células INS-I en presencia de substancias que elevan el grado intracelular de AMP_{c}.

Recientemente, se ha podido mostrar que la incubación de estas células con concentraciones fisiológicas de glucosa (48 horas con 5 mM) les hace todavía más sensibles a las variaciones de la concentración de glucosa. Estas características de diferenciación hacen que estas células sean las candidatas más apropiadas para xenotransplantes en cápsulas biocompatibles en el caso de los sujetos diabéticos.

Sin embargo, antes del injerto, es necesario hacer que estas células sean no proliferantes. En efecto, la inhibición de la proliferación es indispensable si se quiere evitar un crecimiento anárquico y una destrucción eventual de la cápsula protectora. Ésta se obtiene mediante destrucción de los genes implicados (directa o indirectamente) en la proliferación celular. Recientemente se ha podido demostrar que la IGF-II se expresa abundantemente en estas células. La IGF-II es un factor de crecimiento, que modula el crecimiento celular esencialmente de manera autocrina. Por lo tanto, se puede pensar, sobre la base de los resultados recientes, que están descritos más adelante, que la IGF-II está implicada en el crecimiento incontrolado de estas células y que la inhibición de la expresión del gen de la IGF-II (por destrucción del gen) es susceptible de inhibir o de disminuir considerablemente la proliferación celular. Mediante esta manipulación genética, las células INS-I estarían en condiciones de ser adaptadas a la encapsulación y al transplante, permitiendo evitar todas las complicaciones y las dificultadas relacionadas con la preparación y con el transplante de islotes pancreáticos.

Finalmente, la proliferación de las células \beta, modificadas genéticamente, cultivadas en ausencia de suero, se reduce de manera considerable cuando las células son cultivadas en presencia de proteína de enlace IGFBP-3 (Gopinath R, Walton PE, Etherton ED - Endocrinol 120:231-236 1989). En el modelo IGFBP-3, puesto a punto por los solicitantes, que secuestra IGF-II, se disminuye su actividad biológica. La adición de IGFBF inhibe la proliferación de las células INS-I. Esta observación sugiere que la IGF-II juega un papel importante en la proliferación de las células INS-I puesto que la única función conocida de las proteínas de enlace (BP) y, en particular, BP3, consiste en la de enlazarse con los IGF.

Un cierto número de pruebas indirectas están a favor de los resultados obtenidos: la IGF-II estimula la proliferación celular en las líneas tumorales de manera autocrina-paracrina (El-Bardy OM, Romanus JAI, Helman LH, Cooper MH, Rrchler MM, IsraelMA - J. Clin. Invest. 84:829 1989). Esto ha sido demostrado, también, en células transformadas (Park JHY, McCusker RH, Vanderhoof JA, Mohammadpour H, Harty RF, MacDonald RG - Endocrinology 131:1359-1368 1992) y sobre cultivos de islotes \beta primarios (Rabinovith A, Quigley C, Russel T, Patel Y, Mintz DH - Diabetes 31:160-164 1982) (Hill DJ, Hogg J - E.M Spencer (ed), Elsvier Science publishing CO, INC 1991 235-240).

La invención tiene por objeto, igualmente, el establecimiento de líneas celulares INS-I, genéticamente modificadas, encapsuladas, con vistas a su implantación.

Resultados preliminares

Estos resultados se refieren esencialmente a las relaciones entre la IGF-II, la concentración en glucosa en el medio de cultivo y la proliferación celular.

La proliferación celular no parece que quede modificada con 5 mM de glucosa. A partir de 5 mM hasta 20 mM, se observa un aumento de la proliferación durante períodos que van hasta 72 horas de cultivo. En paralelo, se observa un aumento de los ARN mensajeros de la IGF-II a concentraciones de glucosa que van desde 10 hasta 20 mM.

En estas células no se ha podido detectar ni la proteína IGF-I (radioinmunoensayo) (Binoux M, Seurin D, Lassarre C, Gourmelen M - J. Clin. Endocrinol. Metab. 59:453-462 1984), ni su ARN mensajero, incluso al cabo de largas exposiciones a la hormona del crecimiento.

Principio del método

El trabajo deberá desarrollarse en dos etapas:

-

establecimiento de una línea de células INS-I, portadora de un gen de IGF-II inactivo, que hace que las células sean no proliferantes al mismo tiempo que se mantiene su sensibilidad a la glucosa,

-

la encapsulación de estas células y el transplante en el caso de los animales diabéticos, con la perspectiva de realizar, ulteriormente, injertos en el caso del hombre según el mismo modo operatorio.

Protocolo experimental

Parte I

La inactivación permanente del gen de IGF-II se ha realizado mediante la técnica de recombinación homóloga (Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651 1990) (Pennington S, Wilson JH - Proc. Natl. Acad.Sci. 88:9498-9502 1991). Los solicitantes tienen a su disposición el gen clonado de IGF-II en el plásmido pUC 119 (Dr HOLTHUIZEN) (Holthuizen P, Van der Lee FM, Ikejiri K, Yamamoto M, Sussenbach JS - Biochem Biophys. Acta 1087:341-343 1990). Entre los cuatro tipos diferentes de ARN mensajero que codifica la IGF-II, se ha expresado, principalmente, el ARN mensajero de 3,6 kb en las células el INS-I. Este mensajero es transcrito a partir del promotor P3 (Matsuguchi T, Takahashi K, Ikejiri K, Ueno T, Endo H, Yamamoto M - Biochem Biophys Acta 1048:165-170 1990).

Se propone insertar una caja que codifique el gen de resistencia a la neomicina (néo) bajo control del promotor de los genes precoces del CMV, colocada en fase en el exón 4 del gen de la IGF-II. Aguas abajo de esta construcción se insertará una caja que codifique la timidina-quinasa del virus del herpes simplex. Esta construcción permite seleccionar los clones raros que tengan la construcción IGF-II-néo por recombinación homóloga y no por inserción al azar. En efecto, los clones, debidos a una recombinación homóloga, serán resistentes a la neomicina y al ganciclovir, mientras que los clones debidos a una recombinación al azar serán resistentes a la neomicina pero sensibles al ganciclovir.

Las células, después de transfección, son cultivadas en presencia de neomicina, de ganciclovir y de IGF-II. Los clones resistentes son ensayados por su capacidad a proliferar en ausencia de IGF-II endógeno pero en presencia de IGF-II exógeno y serán estudiados por la técnica del Southern Blot y análisis mediante PCR con el fin de controlar si la integración ha sido correcta. La expresión de IGF-II será estudiada al nivel de los ARN mensajeros y de las proteínas mediante las técnicas de Northern y Western-Blot, respectivamente. Puesto que se ha establecido que, sólo el alelo parental del gen de IGF-II es activo (De Chaiara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A - Cell 64:849-859 1991), y puesto que la recombinación homóloga es más eficaz al nivel de los segmentos de ADN, transcripcionalmente activos (Nickoloff JC - MEB 12:5311-5318 1992), se puede esperar la obtención de células INS-I que no expresen ya IGF-II por una sola etapa de transfección/selección. Sin embargo, si éste no fuera el caso, podría llevarse a cabo la destrucción de la segunda copia del gen IGF-II (Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651 1990). En cada etapa de este trabajo, debe verificarse el poder de la glucosa para inducir la secreción de insulina.

Parte II

Si tiene éxito la destrucción ("knock-out") del gen de IGF-II, debe obtenerse, finalmente, una línea celular INS-I, que dependerá por completo o en gran parte de la administración exógena de IGF-II para su crecimiento. Teóricamente, esta nueva línea celular será sensible a la glucosa de la misma manera que la línea parental. En este caso, estas células podrán ser utilizadas, por lo tanto, para la encapsulación y el transplante.

1. Encapsulación de la línea celular INS-I

a)

para una encapsulación eficaz, las células deben agregarse en una forma de "pseudo-islotes". Esto puede efectuarse mediante cultivo de las células en cápsulas de cultivo no adhesivas. El tamaño de los agregados (= "pseudo-islotes") puede determinarse por la densidad de las células en el momento de la puesta en cultivo. Por otra parte, el número de células en los agregados puede verificarse después del tratamiento con tripsina de los "pseudo-islotes" (PI) recogidos.

b)

se suspende un número conocido de PI, que contiene una cantidad de insulina equivalente a la que se encuentra en 500-1.000 islotes de ratas adultas (2-4 x 10^{8} células), en una solución de alginato de sodio (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natl. Acad. Sci 88:11100-11104 1991) y se inmoviliza por encapsulación en este hidrogel biocompatible por medio de una solución acuosa de una sal de calcio. Los PI encapsulados se colocarán a continuación en membranas tubulares acrílicas permeables a moléculas de peso molecular menor que 50.000-80.000 (Lacy P, Hegre 0D, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natl. Acad. Sci 88:11100-11104 1991).

c)

los PI encapsulados son estudiados "in vitro" mediante perfusión para determinar con qué intensidad y con qué velocidad provocan un cambio de secreción de insulina como respuesta a concentraciones de glucosa modificadas. Cuando esta parte de la experiencia se muestra satisfactoria, los PI contenidos en fibras serán utilizados para el transplante.

2. Transplante

Los PI encapsulados son transplantados por vía subcutánea o intraperitoneal. Los dos métodos son eficaces para el mantenimiento de la normoglicemia en el caso de los modelos animales de la diabetes insulino-dependiente humana. Las ratas Bio-breeding (BB) y los ratones no cebados, diabéticos (NOD), que desarrollan de manera espontánea una diabetes, son asociados a un genotipo particular de histocompatibilidad y presentan los mismos defectos, en el plano inmunitario, que los sujetos diabéticos (presencia de linfocitos T citotóxicos) de los animales diabéticos transplantados (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick VL - Proc. Natl. Acad. Sci 88:11100-11104 1991). El transplante por vía intraperitoneal parece que es el más favorable para asegurar un buen ambiente biológico para las células injertadas.

Esta técnica es aplicable de la misma manera a los sujetos insulino-dependientes. Es preciso implantar entre 50.000 y 200.000 PI para alcanzar una concentración eficaz de insulina.

Claims (16)

1. Línea celular \beta insulinosecretora altamente diferenciada, que comprende células \beta transformadas, en la que dichas células \beta expresan insulina como respuesta a la glucosa, y en la que la expresión del gen del factor de crecimiento insulinoide de tipo II (IGF-II) en dichas células \beta está inhibido de manera permanente; pudiéndose obtener dicha línea celular \beta mediante un método que comprende las etapas siguientes:

(i)

la transfección de células \beta de una línea celular \beta insulinosecretora altamente diferenciada por un plásmido que porta un gen IGF-II modificado, en el que se ha insertado en dicho gen IGF-II modificado, en fase con el exón 4, una caja que codifica el gen de resistencia a la neomicina y, aguas abajo de dicho gen de neomicina, una caja que codifica la timidina-quinasa viral,

(ii)

el cultivo de dichas células \beta transfectadas en presencia de neomicina, de ganciclovir y de IGF-II, y

(iii)

el aislamiento de las células \beta transformadas, que son resistentes a la neomicina y al ganciclovir, con lo que se obtienen células \beta transformadas,

en las que dicho gen IGF-II modificado ha sido incorporado mediante una recombinación homóloga, mediante lo cual dichas células \beta son dependientes de la administración exógena de IGF-II para su proliferación.

2. Línea celular según la reivindicación 1, en la que está totalmente reprimida la expresión del gen del factor de crecimiento insulinoide de tipo II (IGF-II) en dicha línea celular \beta.

3. Línea celular \beta según la reivindicación 1, en la que la línea celular \beta insulinosecretora altamente diferenciada es una línea celular INS-I.

4. Línea celular \beta según la reivindicación 1, en la que dicha línea celular \beta se encuentra en forma de agregados de pseudo-islotes.

5. Método para la producción de una línea celular \beta transformada según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende

(i)

la transfección de células \beta de una línea celular \beta insulinosecretora altamente diferenciada por un plásmido, que porta un gen IGF-II modificado, en el que se ha insertado en dicho gen IGF-II modificado, en fase con el exón 4, una caja que codifica el gen de resistencia a la neomicina y, aguas abajo de dicho gen de neomicina, una caja que codifica la timidina-quinasa viral,

(ii)

el cultivo de dichas células \beta transfectadas en presencia de neomicina, de ganciclovir y de IGF-II, y

(iii)

el aislamiento de las células \beta transformadas, que son resistentes a la neomicina y al ganciclovir, con lo que se obtienen células \beta transformadas,

en la que dicho gen IGF-II modificado ha sido incorporado mediante una recombinación homóloga, con lo que dichas células \beta son dependientes de la administración exógena de IGF-II para su proliferación.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la línea celular \beta insulinosecretora altamente diferenciada es una línea celular INS-I-.

7. Método según las reivindicaciones 5 o 6, en el que el plásmido es derivado de pUC 119.

8. Método según una de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la línea celular \beta, producida de este modo, es transformada ventajosamente en agregados en forma de pseudo-islotes mediante el cultivo de las células en cápsulas de cultivo no adherentes.

9. Método según la reivindicación 8, en el que los pseudo-islotes son aglomerados en suspensión en un agente gelificante e inmovilizados en un hidrogel biocompatible por adición de un agente de inmovilización.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el agente gelificante es un alginato de sodio.

11. Método según las reivindicaciones 9 o 10, en el que agente inmovilizante es una solución acuosa de una sal de calcio.

12. Método según una de las reivindicaciones 9 a 11, en el que los pseudo-islotes aglomerados e inmovilizados contienen una cantidad de insulina equivalente a la que se encuentra en 500 hasta 1.000 islotes en el caso de la rata adulta.

13. Método según una de las reivindicaciones 9 a 12, en el que los pseudo-islotes inmovilizados por encapsulación en un hidrogel biocompatible, que se ha endurecido mediante la adición de una solución acuosa de una sal de calcio, se colocan a continuación en membranas tubulares acrílicas, que son permeables a moléculas que tienen un peso molecular menor que 50.000-80.000.

14. Método según la reivindicación 13, en el que los pseudo-islotes inmovilizados y endurecidos son incorporados en fibras transplantables.

15. Dispositivo transplantable biocompatible, que comprende pseudo-islotes de una línea celular \beta insulinosecretora, transformada según una de las reivindicaciones 1 a 4, aglomerados e incorporados en membranas tubulares acrílicas, que son permeables a moléculas que tienen un peso molecular menor que 50.000-80.000, y distribuidas en forma de fibras.

16. Dispositivo transplantable según la reivindicación 15, que comprende desde 50.000 hasta 200.000 pseudo-islotes, con lo que se produce una cantidad eficaz de insulina para el tratamiento de un paciente insulino-dependiente.