NO314144B1 - Arylsubstituerte piperaziner anvendelige ved behandling av benign prostatisk hyperplasi samt farmasöytisk preparat og mellomprodukter - Google Patents

Description

Foreliggende angår en serie arylsubstituerte piperaziner, farmasøytiske preparater inneholdende disse samt mellomprodukter til bruk ved deres fremstilling.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen inhiberer selektiv binding til den a-la-adrenergiske reseptor, en reseptor som har vært implikert i benign prostatisk hyperplasi. I tillegg reduserer forbindelsene ifølge oppfinnelsen intrauretralt trykk i en in vivo modell.

Som sådanne er forbindelsene brukbare ved behandling av denne sykdom.

Benign prostatisk hyperplasi, BPH, en ikke-malignant forstørrelse av prostata, er den vanligste benigne tumor hos menn. Ca. 50 % av alle menn over 65 år har en viss grad av BPH og en tredjedel av disse har kliniske symptomer konsistent med blæreutløps-hindring (Hieble and Caine, 1986). I USA er benigne og malignante sykdommer i prostata ansvarlige for mere kirurgi enn sykdommer i noe annet organ hos menn over 50.

Det er to komponenter av BPH, en statisk og en dynamisk komponent. Den statiske komponent skyldes forstørrelse av prostatakjertelen, noe som kan resultere i sammen-pressing av uretra og obstruksjon av urinstrømmen fra blæren. Den dynamiske komponent skyldes økt glattmuskelspenning i blærehalsen og selve prostata (som interfererer med tømming av blæren) og reguleres av ct-1 adrenergiske reseptorer (al-AR'er). De medisinske behandlinger som er tilgjengelige for BPH retter seg mot disse komponenter i varierende grad, og de terapeutiske valg utvides.

Kirurgiske behandlingsmuligheter vender seg mot den statiske komponent av BPH og inkluderer transuretral reseksjon av prostata (TURP), transuretal insisjon av prostata (TUTP), åpen prostatektomi, ballongdilatasjon, hypertermi, stenter og laserablasjon. TURP er den foretrukne behandling for pasienter med BPH og ca. 320.000 TURP'er ble gjennomført i USA i 1990, til en anslått pris på 2.2 milliarder US$ (Weis et al, 1993). Selv om det er en effektiv behandling for de fleste menn med symptomatisk BPH, har ca. 20-25% av pasientene ingen tilfredsstillende langsinntekt (Lepor og Rigaud, 1990). Komplikasjoner inkluderer retrograd ejakulering (70-75% av pasientene), impotens (5-10%), postoperativ urinveisinfeksjon (5-10%) og en viss grad av urinær inkontinens (2-4%) (Mebust et al., 1989). Videre er graden av reoperasjoner ca. 15-20% hos menn som ble evaluert i 10 år eller mer (Wennberg et al., 1987).

Bortsett fra de kirurgiske muligheter foreligger det visse medikamentterapier som vender seg mot den statiske komponent av tilstanden. Finasteride (Proscar ™) er en slik terapi, som er indikert for behandling av symptomatisk BPH. Dette medikament er en

kompetitiv inhibitor av enzymet Sa-reduktase som er ansvarlig for omdanningen av testosteron til dihydro-testosteron i prostatakjeitelen (Gormley et al., 1992). Dihydrotestosteron synes å være hovedmitogenet for prostatavekst og midler som inhiberer Sa-reduktase reduserer størrelsen av prostata og forbedrer urinstrømmen gjennom den prostatiske uretra. Selv om finasterid er en potent 5a-reduktaseinhibitor, og forårsaker en markert

reduksjon i serum- og vevkonsentrasjonene av dihydrotestosteron, er forbindelsen kun moderat effektiv ved behandling av symptomatisk BPH (Oesterling, 1995). Det tar 6-12 måneder før virkningene av finasterid blir åpenbare, og for mange menn er den kliniske forbedring minimal (Barry, 1997).

Denne dynamiske komponent av BPH er adressert ved bruk av adrenergiske reseptor-blokkeringsmidler (al-AR-blokkere) som virker ved å redusere glattmuskelspenningen i selve prostatakjertelen. En varietet av al-AR-blokkere (terazosin, prazosin og doksazo-sin) er undersøkt for behandling av symptomatisk blære-utløpsobstruksjon på grunn av BPH, der terazosin (Hytrin, Abbott) er mest studert.

Selv om al-AR-blokkerne er godt tolerert, utvikler rundt 10-15% av pasientene en kli-nisk negativ tilstand (Lepor, 1995). De uønskede virkninger fra alle medlemmer av denne klasse er like, og postural hypotensjon av den vanligste bivirkning (Lepor et al., 1992). Sammenlignet med 5a-reduktaseinhibitorene har al-AR-blokker-midlene en hurtig virkningsstart (Steers, 1995). Imidlertid er deres terapeutiske effekt, målt ved forbedring i symptombedømmelsen og toppurin-strømningshastigheten, moderat (Oesterling, 1995).

Bruken av al-AR-antagonister ved behandling av BPH er relatert deres evne til å redusere spenningen i den prostatiske glattmuskel og fører til avspenning i de obstruktive symptomer. Adrenergiske reseptorer finnes over hele kroppen og spiller en dominant rolle ved kontroll av blodtrykk, nasal kongestion, prostratfunksjon og andre prosesser (Harrison et al., 1991). Imidlertid finnes det et antall klonede ctl-AR-reseptor-subtyper: al»-AR, alb-ARog ald-AR, (Bruno et al., 19911); Forrayet al., 1994; Hirasawaet al., 1993; Ramaro et al., 1992; Schwinn et al., 1995; Weinberg et al., 1994). Et antall laboratorier har karakterisert al-AR'ene i human prostata ved funksjonell radioligandbinding og molekylærbiologiske teknikker (Forray et al., 1994; Hatano et al., 1994; Marshall et al., 1992; Marshall et al., 1995; Yamada et al., 1994). Disse studier gir støtte for det konsept at al-AR-subtypen omfatter hovedandelen av al -AR'ene i humanprostatisk glattmuskel og medierer kontraksjon i dette vev. Disse funn antyder at utviklingen av en subtype selektiv ala-AR-antagonist ville kunne resultere i et terapeutisk effektivt middel med større selektivitet for behandling av BPH.

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser med formel I

der

A er (CH2)n der n er 1-6;

Ri er Ci-6-alkyl,

Ra er hydrogen, C i -6-alkyl, fenyl-C i -5-alkyl,

E er

der:

m er 1-5;

R3 er oksygen,

og den stiplede linje betyr en binding,

R4 er oksygen, hydrogen eller C1.5-alkoksykarbonyl,

der, hvis R4 er oksygen, den stiplede linje betyr en binding, og hvis R4 er en

hvilken som helst annen substituent, den stiplede linje er fraværende; og farmasøytisk akseptable salter derav.

Disse forbindelser er brukbare som adrenergiske reseptormodulerende midler. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen binder selektivt til ala-AR-reseptoren, modulerer aktiviteten til reseptoren og er selektive for prostatavev i forhold til aortavev. Som sådanne representerer de en brukbar behandling for ala-AR-reseptormodulerte mangler som inkluderer men ikke er begrenset til BPH.

I tillegg omfatter oppfinnelsen farmasøytiske preparater som karakteriseres ved at de inneholder forbindelser med formel I, samt en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel.

Bortsett fra forbindelsene med formel I angår oppfinnelsen også mellomprodukter med formel IT. Disse mellomprodukter er brukbare ved fremstilling av forbindelser med formel I, og karakteriseres med formelen:

der

A er (CH2)„ der n er 1-6;

Ri er C2-6-alkyl,

R7 er hydrogen, BOC eller CBZ.

I tillegg angår oppfinnelsen forbindelser med formel HI. Disse forbindelser er brukbare som mellomprodukter ved fremstilling av forbindelser med formel I og karakteriseres ved formelen:

der

m er 1,2,3,4 eller 5.

Uttrykkene som benyttes for å beskrive oppfinnelsen er de som vanligvis benyttes og som er velkjente for fagmannen. "HBSS" henviser til Hank's balanserte saltoppløsning. "Uavhengig" betyr at der det er mer enn en substituent, kan substituentene være for-skjellige. Uttrykket "alkyl" henviser til rette, cykliske og forgrenede alkylgrupper, og "alkoksy" henviser til O-alkyl, der alkyl er som kjent al-AR-antagonister, definert ovenfor. "LDA" henviser til litium-diisopropylamid, og "BOP" henviser til benzo-triazol-l-yl-oksy-tris-(dimetylamino)-fosfonium-heksafluorfosfat. "BOC" henviser til t-butoksykarbonyl, "PyBroP" henviser til brom-tris-pyrTolidino-fosfonium-heksafluorfos-fat, "CBZ" henviser til bensyloksykarbonyl og 'Ts" henviser til toluensulfonyl. "DCC" henviser til 1,3-dicykloheksyl-karbodiimid, "DMAP" henviser til 4-N',N-dimetyl-aminopyridin, "EDCI" henviser til l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydro-klorid og "HOBT" henviser til 1-hydroksybenzotriazolhydrat. Symbolet "Ph" henviser til fenyl og "PHT" til ftalimido. Uttrykket "effektiv dose" henviser til en hvilken som helst mengde av en forbindelse med formel I som binder til en eller antagoniserer virk-ningen av den ala-adrenergiske reseptor. I tillegg henviser uttrykket "effektiv dose" til en mengde av forbindelsen med formel I som reduserer symptomene på sykdommer assosiert med den alB-adrenergiske reseptor.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved de følgende reaksjonsskjemaer der noen skjemaer gir mer enn en utførelsesform av oppfinnelsen. I disse tilfeller er skjemavalget spørsmål som ligger innenfor fagområdet til syntesekjemikeren.

Forbindelser med formel I der Ri (som illustrasjon, men ikke innenfor oppfinnelsens ramme) er fenyl, R2 er hydrogen, R3 er oksygen, A er (CH^ og m er 4, kan fremstilles som vist i skjema 1. I dette skjema fremstilles molekylene med formel I i en kon-vergent syntese der to halvparter av molekylet settes sammen og til slutt kobles sammen.

Utgangsmaterialet for den ene halvpart er et mono-N-substituert piperazin av typen la. Behandling av la med en mild base som K2CO3 og et alkyleringsmiddel som akrylnitril i et inert oppløsningsmiddel som MeOH ved romtemperatur i 2-24 timer, gir ni-trilet lb. Dette mellomprodukt kan hydrogeneres ved hjelp av Raney-nikkel som kata-lysator for å oppnå propylamin-mellomproduktet lc. Den andre halvpart av molekylet settes sammen ved bruk av forbindelser av typen lc som utgangsmaterialer. e-kaprolaktam behandles med en sterk base som NaH i et inert oppløsningsmiddel ved 0°C i rundt 30 min. Det dannede anion behandles med et alkyleringsmiddel som t-butylbromacetat i et inert oppløsningsmiddel som acetonitril ved romtemperatur i 2 timer til 2 dager, og man oppnår esteren le. Hydrolyse av le med en syre som trifluoreddiksyre ved romtemperatur i 2-16 timer gir syren lf. Behandling av aminet lc og syren lf med et peptidkoblingsmiddel som BOP og et egnet amin som DMAP ved romtemperatur i 1-16 timer, gir en forbindelse med formel I, nemlig lg. Andre koblingsmidler kan nyttes i stedet for BOP. Slike midler inkluderer, men er ikke begrenset til, PyBroP, EDCI, HOBt og lignende. Egnede DMAP-erstatninger omfatter, men er ikke begrenset til, N-metylmorfolin, imidazol, DABCO, og lignende.

Skjema 1 kan benyttes for å fremstille forbindelser i tillegg til lg. For å fremstille forbindelser der m er 1-5, erstatter kjente laktamer med egnet ringstørrelse, som 2-aza-cyklooktanon, e-kaprolaktam i skjema 1.

Skjema 1

Skjema 1 ^

Q-v_/NH —- Q-nCn^<cn >/ •

OPh

1c

o o

o<p>h o /-\

if

For å fremstille forbindelser ifølge oppfinnelsen, der Rj er som definert, blir la erstattet med kjente piperazinderivater som N-(2-t-butoksyfenyl)-piperazin. For å fremstille forbindelser der A er (CH2V og n er 1-6, kan akrylnitril erstattes med alkyleringsmidler som 4-klor-butyronitril. Alternativt kan mellomproduktet lc fremstilles på en annen måte, som vist i skjema 2.

Piperazinderivatet la behandles med en mild base og kjente ftalimidoderivater som N-(4-brombutyl)-ftalimid for å oppnå mellomprodukt 2a. Behandling av 2a med et hydra-zin som N-metylhydrazin i et egnet oppløsningsmiddel som MeOH eller EtOH under tilbakeløp, gir mellomprodukter av typen lc. Alternativt behandles piperazinet la med en mild base og et N-BOC-beskyttet amin som N-tert-butoksykarbonyl-4-brom-butyl-amin for derved å oppnå det tilsvarende BOC-beskyttede amin. Dette amin kan debe-skyttes ved behandling med en syre som TFA for å oppnå mellomprodukter av typen lc.

Skjema 2 (Se ovenfor)

For å fremstille forbindelser der R2 er forskjellig fra hydrogen, kan man benytte skjema 3. Behandling av forbindelser av typen lg med en sterk base som NaH, fulgt av et alkyleringsmiddel som benzylbromid, gir forbindelser av typen 3a i løpet av 1-5 timer ved temperaturer fra rundt 0-35°C.

Skjema 3 (Se ovenfor)

Forbindelser der R4 er oksygen eller Ci-5-alkoksykarbonyl, kan syntetiseres ved hjelp av skjema 4. For for eksempel å fremstille forbindelser der R4 er etoksykarbonyl, m er 2 og R3 er karbonyl, (her som eksempel utenfor oppfinnelsens ramme) behandles etyl-2-pyrrolidon-5-karboksylat med en sterk base som NaH, i et inert oppløsningsmiddel ved 0°C i rundt 30 min. Den dannede anion behandles med et alkyleringsmiddel som t-butyl-bromacetat i et inert oppløsningsmiddel som acetonitril ved romtemperatur, i 2 timer til 2 dager, for derved å oppnå esteren 4a. Sur hydrolyse av 4a med trifluor-eddik-syre ved romtemperatur i 2-16 timer, gir syren 4b. Kobling av syren 4b og mellompro-duktaminet lc med et peptidkoblingsmiddel som PryBOP, gir en forbindelse med formel 1,4c. Etylesteren av forbindelse 4c kan behandles med en varietet av midler for å gi derivater som amider, karboksylsyrer, aldehyder og så videre, der reagensene og reak-sjonsbetingelsene ligger innenfor fagmannens kunnskapsområde.

Skjema 4 (Se ovenfor)

Selv om de krevede forbindelser er brukbare som modulatorer for al-AR, er enkelte forbindelser enten foretrukket eller spesielt foretrukket. De foretrukne forbindelser i-følge oppfinnelsen omfatter:

De spesielt foretrukne "Ri"er er Ci-5-alkyl.

De spesielt foretrukne "R2" er hydrogen, Cj.s-alkenyl og Ci.s-alkynyl.

"De spesielt foretrukne "E"er er

Den spesielt foretrukne "m" er 3.

Den spesielt foretrukne "R3" er oksygen.

Den spesielt foretrukne "R4" er hydrogen.

De spesielt foretrukne "A"er er (CH2)n der ner 2-4.

De spesielt foretrukne forbindelser med formel II omfatter forbindelser der A er 2 eller 3, Ri er C2-6-alkyl og R7 er hydrogen.

De spesielt foretrukne forbindelser med formel III omfatter forbindelser der m er 3.

Forbindelsene med formel I kan benyttes i farmasøytiske preparater for å behandle pasienter med mangler relatert modulering av aktiviteten av den al-adrenergiske reseptor. Den foretrukne administreringsvei er oral administrering, selv om forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres på andre måter, inkludert men ikke begrenset til intrave-nøs infusjon. Orale doser ligger i området rundt 0,01 -100 mg/kg/dag. Det foretrukne orale doseringsområde ligger fra rundt 0,05-1,0 mg/kg/dag. Infusjonsdosene kan ligge fra rundt 0,001-100 mg/kg/minutt-inhibitor, med en farmasøytisk bærer over et tidsrom fra noen minutter til flere dager.

De farmasøytiske preparater kan fremstilles ved bruk av konvensjonelle, farmasøytiske drøyemidler og compoundingteknikker. Oraldoseformer kan være eliksirer, siruper, kapsler, tabletter og lignende. Typiske faste bærere er inertstoffer som laktose, stivelse, glukose, metylcellulose, magnesiumstearat, dikalsiumfosfat, mannitol og lignende, og typiske flytende orale drøyemidler er etanol, glycerol, vann og lignende Alle drøyemid-ler kan blandes efter behov med desintegrerings-, fortynnings-, granulerings-, smøre-, binde- og andre midler ved bruk av konvensjonelle teknikker som er velkjente av fagmannen, for fremstilling av doseringsformer. Parenterale doseringsformer kan fremstilles ved bruk av farmasøytisk akseptable bærere eller diluenter, inkludert men ikke begrenset til vann eller en annen steril bærer.

Karakteristisk blir forbindelsene med formel I isolert og benyttet som frie baser, imidlertid kan forbindelsene isoleres og benyttes som de respektive farmasøytisk akseptable salter. Eksempler uten begrensning er salter med syrer som hydrobrom-, hydrojod-, salt-, perklor-, svovel-, malein-, fumar-, eple-, vin-, sitron-, benzoe-, mandel-, metansul-fon-, hydroetansulfon-, benzensulfon-, oxal-, pamoin-, 2-naftensulfon-, p-toluensulfon-, cykloheksansulfamin- og sakkarinsyre.

For å illustrere oppfinnelsen skal det henvises til de følgende eksempler som kun er ment å foreslå en metode for å gjennomføre oppfinnelsen. Fagmannen vil kunne finne andre for ham nærliggende metoder for gjennomføring av oppfinnelsen, og slike metoder anses også å ligge innenfor rammen av den.

Preparative eksempler

Eksempel 1

l-(2-følimidoetyl)-4-(2-isopropyloksyfenyl)-piperazin

Forbindelse 1.

N-(2-brometyl)-ftalimid (7,6 g, 30 mmol) og K.2CO3 (6,2 g, 45 mmol) ble satt til en opp-løsning av N-l-(2-isopropoksyfenyl)-piperazin (6,6 g, 30 mmol) i 100 ml acetonitril, og den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakeløp i 2 dager. Blandingen ble konsentrert under vakuum og renset ved kolonnekromatografi på silikagel ved bruk av EtOAc:heksaner (30:70) som elueringsmiddel, og man oppnådde tittelforbindelsen som et faststoff:

MS m/z 394 (MH+).

Eksempel 2

(1 -(2-aminoetyl)-4-(2-2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin

Forbindelse 2.

En oppløsning av forbindelse 1 (7,5 g, 19 mmol) i 70 ml EtOH ble omrørt i 10 min. ved romtemperatur. 20 ml metylhydrazin ble tilsatt og blandingen oppvarmet ved tilbakeløp i 2,5 time. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og det resulterende, faste precipitat ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert under vakuum og man oppnådde tittelforbindelsen som et faststoff som ble benyttet uten ytterligere rensing:

MS m/z264(MH+).

Eksempel 3

1 -t-butoksykarbonylmetyl-2-piperidon

Forbindelse 3.

95 % natriumhydrid (1,67 g, 66 mmol) ble satt til en omrørt oppløsning av 8-valero-laktam (5,95 g, 60 mmol) i 100 ml toluen ved 0°C, og den resulterende suspensjon ble omrørt i 1 time. t-butylbromacetat (8,86 ml, 60 mmol) ble dråpevis tilsatt og reaksjonsblandingen oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 10 timer. Mettet, vandig NH4CI ble tilsatt og det resulterende organiske sjikt ble vasket med suksessive porsjoner av saltoppløsning og H20. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over (Na2S04) og konsentrert under vakuum, og man oppnådde forbindelse 3 som en olje. Eksempel 4

1 -karboksymetyl-2-piperdon

Forbindelse 4.

15 ml trifluoreddiksyre ble satt til en omrørt oppløsning av forbindelse 2 (12,93 g, 61 mmol) i 30 ml metylenklorid under N2- Blandingen ble omrørt i 4 timer og konsentrert under vakuum, og man oppnådde tittelforbindelsen som et faststoff:

MS m/z 158 (MH+).

Eksempel 5

N-[etyl-2-(2-iso-propyloksyfenyl)-pipCT^ amidemid

Forbindelse 5.

En oppløsning av forbindelse 2 (3,61 g, 23 mmol) i 10 ml metylenklorid ble satt til en oppløsning av forbindelse 4 (5,0 g, 19 mmol) i 10 ml metylenklorid. PyBroP (10,72 g, 23 mmol), DMAP (3,85 g, 31 mmol) og N-merylmorfolin (2,53 ml, 23 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved romtemperatur under N2 i 10 timer. Den resulterende blanding ble vasket med en porsjon vandig natriumbikarbonat, saltoppløsning og H20. Det kombinerte organiske sjikt ble tørket over Na2S04 og konsentrert under vakuum. Resten ble renset ved MPLC på silikagel ved bruk av EtOAc:MeOH:trietylamin (90:5:5) som elueringsmiddel, og man oppnådde tittelforbindelsen som en olje:

MS m/z 403 (MH+).

Behandling av den isolerte forbindelse med en ekvimolar porsjon sitronsyre i etylacetat ga citratsaltet av tittelforbindelsen som et faststoff.

Eksempel 6

N-[etyl-2-(2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin-4-yl)]-N-metyl-[r-(2-oksy-piperidinyl)]-acetamidemid

Forbindelse 6.

95 % teknisk natriumhydrid (10,6 mg, 0,44 mmol) ble satt til en omrørt oppløsning av forbindelse 5 (140,5 mg, 0,35 mmol) i 5 ml THF ved 0°C, og den resulterende suspensjon ble omrørt i 30 min. 0,37 mmol metyljodid ble tilsatt dråpevis og blandingen om-rørt over natten ved romtemperatur. Resten ble konsentrert under vakuum, oppløst i etylacetat og vasket med suksessive porsjoner vann, mettet ammoniumkloirdoppløsning, saltoppløsning og vann. Det kombinerte organiske sjikt ble tørket over Na2SC*4 og konsentrert under vakuum, og man oppnådde tittelforbindelsen som et faststoff:

MS m/z417(MH+).

Biologiske eksempler

Biologisk aktivitet og selektivitet for forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble vist ved de følgende in vitro analyser. Den første analyse testet evnen hos forbindelsene med formel I til å binde til membranbundne reseptorer a-la-AR, a-lb-AR og a-ld-AR.

Eksempel 14

DNA-sekvensen for tre klonede human-a 1-AR-subtyper er publisert. Videre er de klonede cDNA'er uttrykt både transient i COS-celler og stabilt i en varietet av mammal-cellelinjer (HeLa,LM(tk-), CHO, rotte-1-fibroblast) og er påvist å bibeholde radio-ligandbindings-aktivitet og evnen til å koble til fosfoinositid hydrolyse. Foreliggende søkere benyttet publisert DNA-sekvensinformasjon for å konstruere primere for bruk ved RT-PCR-forsterkning av hver subtype for å oppnå klonede cDNA'er. Human poly-A+-RNA ble oppnådd fra kommersielle kilder og inkluderte hippocampus- og prostata-prøver, kilder som er angitt i litteraturen. For primær screaning ble det benyttet en ra-dioligand bindingsanalyse som benyttet membranpreparater fra celler som uttrykte de individuelle klonede reseptor cDNA'er. Radiomerkede ligander med bindingsaktivitet på alle tre subtyper (ikke-selektive) er kommersielt tilgjengelige ([1251]-HEAT, [3H]-prazosin).

Hver al-reseptor-subtype ble klonet fra poly-A+-RNA ved standardmetoden med re-vers transkripsjons-polymerase-kjedereaksjon (RT-PCR). De følgende kilder for poly-A+-RNA ble benyttet for kloning av al-reseptor-subtypen: a-la-AR, human hippocampus og prostata, a-lb-AR, human hippocampus, a-ld-AR, human hippocampus. De resulterende cDNA'er ble klonet inn i pcDNA3 mammalekspresjons-vektoren (In-vitrogen Corp., San Diego, CA). Hver DNA ble sekvensert for verifisering og for å de-tektere mulige mutasjoner som kunne være innført under forsterknings-prosessen. Et-hvert avvik i sekvens fra den publiserte konsensus for hver reseptor-subtype ble korri-gert ved seterettet mutagenese.

De tre al-AR-subtyper (a, b, d) ble transfektert inn i COS-celler ved bruk av standard DEAE-dekstranprosedyrer med et klorokinsjokk. Ved denne prosedyre ble hver vevkul-turskål inokulert med 3,5 x 10<6->celler og transfektert med 10 fig DNA. Ca. 72 timer efter transfeksjon ble cellene høstet og COS-membranene preparert. Transfekterte COS-celler fra 25 plater (100 mm) ble skrapet og suspendert i 15 ml TE-buffer (30 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,4). Suspensjonen ble disruptert i en homogenisør. Den ble så sentrifugert ved lOOOxg i 10 min. ved 4°C. Supernatanten ble sentrifugert ved 34500xg i 20 min. ved 4°C. Pelleten ble resuspendert i 5 ml TNE-buffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150mMNaCl, pH 7,4). Det resulterende membranpreparat ble alikvotert og lagret ved -70°C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å følge membranoppløseliggjøring med TritonX-100.

Evnen hos hver forbindelse til å binde hver av de tre al-AR-subtyper ble bedømt i en reseptor-bindeanalyse. [125IJ-HEAT, en ikke selektiv al-AR-ligand, ble benyttet som radiomerket ligand. Hver brønn på en 96-brønners plate fikk: 140 ul TNE, 25 (il [125I]-HEAT fortynnet i TNE (50000 cpm; sluttkonsentrasjon 50 pM), lOultestfor-bindelse fortynnet i DMSO (sluttkonsentrasjon 1 pM-10 uM), 25 ml COS-cellemem-branprcparat som uttrykker en av de tre al-AR-subtyper (0,05-0,2 mg membranpro-tein). Platen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og reaksjonsblandingen filtrert gjennom en Packard GF/C-Unifilter filterplate. Filterplaten ble tørket i 1 time i en va-kuumovn. 25 ml scintillasjonsvæske ble satt til hver brønn og hver filterplate ble tellet i en Packard Topcount scintillasjonsteller. De oppnådde data ble analysert ved bruk av GraphPad Prism programvare.

Tabellene A og B angir IC50 -verdiene uttrykt i nanomolar konsentrasjon for valgte forbindelser ifølge oppfinnelsen i alle reseptor subtyper.

Eksempel 15

Antagonistaktiviteten for valgte forbindelser med formel I ble vist ved den følgende screening. Binding av en agonist til cel-AR'er forårsaker aktiveringen av PLC ved G-protein-koblede mekanismer (Minneman og Esbenshade, 1994). PLC katalyserer hydro-lysen av fosfatidyl-inositol-4,5-bisfosfat (PIP2) og genererer to andre meddeler-molekyler, inositol-l,4,5-trifosfat (IP3) og diacylglycerol (DAG), og resulterer til slutt i mobilisering av intracellulære kalsiumforråd. Treff fra den primære screeninganalyse som viste selektivitet i inhibering av radioligandbinding til ala-AR, ble evaluert for evnen til å antagonisere mobiliseringen av cytosolisk kalsium i cellelinjer som stabilt uttrykte individuelle reseptor subtyper.

Preparering av stabile cellelinjer som uttrykker hver reseptor-subtype: De ccl-adrenergiske reseptor-subtyper (a, b, d) i pcDNA3-vektoren ble transfektert inn i HEK 293s (human embryonisk nyre)-celler for å danne stabile reseptoruttrykkende celle-linjer. Transfeksjonen ble gjennomført ved bruk av DMRTE-C (GibcoBRL) kationisk lipid-reagens blandet med 2-3 ug DNA og redusert serum OPTI-MEM 1-medium (GibcoBRL). Celler i 100 mm vevkulturplater ble overlagt med lipid-DNA-kompleks og inkubert ved 37°C, 5% CO2 i 5-6 timer. Serumholdig vekstmedium ble så tilsatt og celler inkubert i ytterligere 48 timer. Efter denne inkubering ble hver plate splittet 1:5 til seleksjonsmedium inneholdende 250,300 eller 350 ug/ml G418 (geneticin)-antibioti-kum. Platene ble matet hver 4. dag med det egnede seleksjonsmedium. Efter ca. 3 dager ble kolonier plukket for hver subtype fra 300 ug/ml G418-seleksjonsplatene. Kolonier ble ekspandert og dypfryst. Tolv cellelinjer av hver subtype ble screenet på al-adrenergisk reseptorbinding ved bruk av en helcelle-reseptorbindingsanalyse. Positive kulturer ble derefter analysert ved kalsium mobiliserings-analysen.

HEK 293s-celler som uttrykker human a la-AR ble løftet med trypsin og vasket en gang med HBSS. Cellepelleten ble «suspendert i HBSS med 0,05% BSA til l-5xl0<6 >celler per ml. En 5mM Fluo-3-oppløsning (i 2/3 volum DMSO og 1/3 volum Pluron-syre) ble satt til cellesuspensjonen, noe som ga en slutt-Fluo-3-konsentrasjon på 5 uM. Cellene ble så inkubert under mild vugging ved romtemperatur i 1 time i mørke. Efter inkubering ble cellene vasket tre ganger med HBSS og resuspendert i HBSS med 1,25 mM CaCl2 tilOJxlO6 celler/ml. Cellealikvote på 100 ul ble pippettert inn i hver brønn av en 96-brønners mikroplate. Kalsiummobilisering ble indusert med 10 uM norepinefrin ved romtemperatur. 2 min. før analysen ble antagonistene satt til cellene ved bruk av en 96-brønn pippettør. Efterpå ble agonisten tilsatt og fluorescentsignalet overvåket i 2-3 min. ved bruk av en FLIPR (Molecular Devices, USA). Forbindelse 5 inhiberte mobilisering av cytosolisk kalsium ved en IC50 på 99 uM.

Eksempel 16

Antagonistaktiviteten og selektiviteten for forbindelsene ifølge oppfinnelsen for prostatavev fremfor aortavev såvel som deres antagonister ble påvist som følger: De kontraktile responser av rotte prostatisk vev og rotte aortavev ble undersøkt i nærvær og fravær av antagonistforbindelser. Som en indikasjon på selektiviteten av antagonismen ble prøveforbindelses-virkningen på vaskulaer glattmuskelkontraktilitet (alb-AR og otld-AR) sammenlignet med effektene på prostatiske glattmuskel-(ala-AR). Strimler av prostatisk vev og aortaringer ble oppnådd fra Long Evans-avledede hannrotter med kroppsvekt 275 g og avlivet ved servikal dislokasjon. Prostatavevet ble brakt under en 1 grams belastning i et 10 ml bad inneholdende fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,4, ved 32°C, og isometrisk spenning ble målt med krafttransdusere. Aortavevet ble anbrakt under 2 grams belastning i et 10 ml bad inneholdende fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,4, ved 37°C. Evnen hos prøveforbindelsen til å redusere den norepinefrininduserte kontraktilrespons med 50%, ICso ble bestemt. Forbindelse 5 inhiberte den kontraktile respons i aortavev ved en ICso på 31,9 uM og i prostatavev ved en IC50P& 1,3 uM.

Eksempel 17

Utvalgte forbindelser ifølge oppfinnelsen ble testet på sin evne til å antagonisere fenylefrin (PE)-induserte økninger i intrauretralt trykk hos hunder. Selektiviteten for disse forbindelser ble påvist ved å sammenligne deres virkning på PE-induserte økninger i det midlere arterietrykket, MAP, i hunder.

Hannhunder ble anestetisert og katerisert for å måle det intrauretale trykk (IUP) i den prostatiske uretra. Midlere arterielt trykk (MAP) ble målt ved bruk av et kateter anbrakt i femoralarterien. Hundene ble til å begynne med administrert seks i.v. bolusdoser (1 til ^ 32 mg/kg) fenylefrin (PE) for å etablere en kontroll-agonistdose-responskurve. IUP og MAP ble notert efter hver dose inntil IUP vendte tilbake til basislinjen. Hundene ble så gitt en i.v. bolusdose av antagonistforbindelsen fulgt av i.v. PE-utfordringer med syn-kende doser som i kontroU-agonistdose-responskurven. IUP- og MAP-målinger efter hver PE-utfordring ble notert. Antagonistforbindelsen ble testet over et dosisområde på 3-300 (ig/kg i halv-log-inkrementer. Intervallet mellom antagonist-doser var minst 45 min. og tre forsøk ble gjennomført per dosisnivå for hver test-forbindelse. Diagramme-ne nedenfor illustrerer den midlere prosentuale reduksjon i IUP og MAP for forbindelsene 5 henholdsvis 12.

Effekter av forbindelse 5 på IUP og MAP ved 10 ug/kg PE i hunder

■ IUP

A MAP

Effekter av forbindelse 12 på IUP og MAP ved 10 ug/kg PE i hunder

■ IUP

▲ MAP

REFERANSER

D. Breslin, DW Fields, T-C. Chou, DN Marion, M Kane, ED Caughan og D Feisen

(1993) "Medical management of benign prostatic hyperplasia: a canine model compar-ing the in vivo efficasy of a-1 adrenergic antagonist in the prostate". J. Uroi. 149: 395-399.

JF Bruno, J. Whittaker, J. Song og M Berelowitz (1991) "Molecular cloning and se-quencing of a cDNA encoding a human al A adrenergic receptor". Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 1485-1490.

DB Bylund, DC Eikenberg, JP Hieble, SZ Langer, RJ Lefkowitz, KP Minneman, PB Molinoff, RR Ruffolo og U Trendelenburg (1994) 'TV. International Union of Pharma-cology nomenclature of adrenoceptors." Pharmacol. Rev. 46: 121-136.

SG Carruthers (1994) "Adverse effects of al-adrenergic blocking drugs." Drug Safety 11: 12-20.

C Faure, C Gouhier, SZ Langer og D Graham (1995) "Quantification of al-adrenoceptor subtypes in human tissues by competitive RT-PCR-analysis." Biochem. Biophys. Res. Commun. 213: 935-943.

NA Flavahan og PM VanHoutte (1986) "al-Adrenoceptor subclassification in vascular smooth muscle." Trends Pharmacol. Sei. 7: 347-349.

APDW Ford, NF Arredondo, DR Blue, DW Bonhaus, J Jasper, MS Kawa, J Lesnick, JR Pfister, IA Shieh, RL Vimont, TJ Williams, JE McNeal, TA Stamney og DE Clarke

(1996) "RS-17053 (N-[2-(2-Cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl]-5-chloro-a,a-dimeth-yl-lH-indole-3-ethanamin hydrochloride), a selective alA-adrenoceptor antagonist, displays low affinity for functional al-adrenoceptors in human prostate: Implications for adrenoceptor classification." Mol. Pharmacol. 49: 209-215.

C Forray, JA Bard, JM Wetzel, G Chiiiu, E Shapiro, R Tang, H Lepor, PH Hartig, RL Weinshank, TA Branchek og C Gluchowski (1994) "The al-adrenergic receptor that mediates smooth muscle contraction in human prostate has the parmacological proper-ties of the cloned human ale subtype." Mol. Pharmacol. 45: 703-708.

G Gornley, E Stoner, RC Bruskewitz et al. (1992) "The effect of finasteride in men with benign prostatic hyperplasia." N.Eng. J. Med. 327: 1185-1191.

A Hatano, H Takahashi, M Tamaki, T Komeyama, T Koizumi og M Takeda (1994) "Pharmacological evidence of distinct al-adrenoceptor subtypes mediating the contraction of human prostatic urethra and peripheral artery." Br. J. Pharmacol. 113: 723-728.

JK Harrison, WR Pearson og KR Lynch (1991) "Molecular characterization of al-and a2-adrenoceptors." Trends Pharmacol. Sei. 12: 62-67.

JP Hieble og M Caine (1986) "Etiology of benign prostatic hyperplasia and approaches to pharmacological management." Fed. Proe. 45: 2601-2603.

A Hirawawa, K Horie, T Tanaka, K Takagaki, M Murai, J Yano og G Tsujimoto (1993) "Cloning, functional expression and tiwwue distribution of human cDNA for the alc-adrenergic receptor." Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 902-909.

MI Holch, CHM Jones og G Haeusler (1983) "Differential interactions of clonidine and methoxamine with postsynaptic a-adrenoceptor of rabbit main pulmonary artery." J. Cardiovasc. Pharm. 5: 240-248.

H Lepor og G Rigaud (1990) "The efficacy of transurethral resection of the prostate in men with moderate symptoms of prostatism." J. Uroi. 143: 533-537.

H. Lepor, S Auerbach, A Puras-Baez et al. (1992) "A randomized, placebo-controlled multicenter study of the efficacy and safety of terazosin in the treatment of benign prostatic hyperplasia." J. Uroi. 148: 1467-1474.

H Lepor (1995) "a-Blockade for benign prostatic hyperplasia (BPH)." J. Clin. Endoc-trinol. Metab. 80: 750-753.

I Marshall, RP Burt, Po Andersson, CR Chapple, PM Greengrass, GI Johnson og MG Wyllie (1992) "Human a lc-adrenoceptor: functional characterisation in prostate." Br. Pharmacol. 107 (Proe. Suppl. Dec.): 327P.

I Marshall, RP Burt og CR Chapple (1995) "Noradrenaline contractions of human prostate mediated by alA-(alc-) adrenoceptor subtype." Br. J. Pharmacol. 115: 781-786.

WK Mebust, Hl Holtgrewe, ATK Cockett og PC Peters (1989) "Transurethral prostatectomy: immediate and postoperative complications. A cooperative study of 13 par-ticipating institutions evaluating 3885 patients." J. Uroi., 141: 243-247.

KP Minneman, C Han og PW Abel (1988) "Comparison of al-adrenergic reseptor subtypes distinguished by chloroethylclonidine and WB4101." Mol. Pharmacol. 22: 509-514.

KP Minneman og TA Esbenshade (1994) "al-Adrenergic reseptor subtypes." Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34: 117-133.

Al Morrow og I Creese (1986) "Characterization of al-adrehergic reseptor subtypes in ratbrain: A reevaluation of [3H]WB4104 og [3H]prazosin binding." Mol Pharmacol. 29: 321-330.

I Muramatsu (1992) "A pharmacological perspective of ctl-adrenoceptors: subclassification and functional aspects, in a-Adrenoceptors (M Fujiwara, T Sugimoto og K. Ko-gure eds.) " Excerpta Medica Ltd., Tokyo, 193-202.

I Muramatsu, M Oshita, T Ohmura, S Kigoshi, H Akino, M Gobara og K Okada (1994) "Pharmacological characterization of al-adrenoceptor subtypes in the human prostate: functional and binding studies." Br. J. Uroi. 74: 572-577.

JE Oesterling (1995) "Benign prostatic hyperplasia. Medical and minimally invasive treatment options." N. Engl. J. Med. 332: 99-109.

DT Price, RJ Lefkowitz, MG Caron, D Berkowitz og DA Schwinn (1994) "Localiza-tion of mRNA for three distinct al-adrenergic receptor subtypes in human tissues: implications for human a-adrenergic physiology." Mol. Pharmacol. 45: 171-175.

CS Ramarao, JM Kincade Denker, RJ Gaivin, RP Riek og RM Graham (1992) "Ge-nomic organization and expression of the human alB-adrenergic receptor." J. Biol. Chem.267: 21936-21945.

DA Schwinn, GI Johnston, SO Page, MJ Mosley, KH Wilson, NP Worman, S. Camp-bell, MD Fidock, LM Furness, DJ Parry-Smith, B Peter og DS Bailey (1995) "Cloning and pharmacological characterization of human a-l-adrenergic receptors: sequence cor-rections and direct comparison with other species homologues." JPET 272: 134-142.

DH Weinberg, P Trivedi, CP Tan, S Mitra, A Perkins-Barrow, D Borkowski, CD Strader og M Bayne (1994) "Cloning, expression and characterization of human a-adrenergic receptors al A, alB and alC." Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 1296-1304.

KA Weis, RS Epstein, DM Huse, PA Deverka og G Oster (1993) "The costs of prostatectomy for benign prostatic hyperplasia." Prostate 22: 325-334.

JE Wennberg, N Roos, L Sola, A Schori og R Jaffe (1987) "Use of claims data systems to evaluate health care outcomes: mortality and reoperation following prostatectomy." JAMA 257: 933-936.

S Yamada, C Tanaka, R Kimura og K Kawabe (1994) "a-1- adrenoceptors in human prostate: characterization and binding characteristics of a-1-antagonists." Life Sei. 54: 1845-1854.

Claims (18)

1. Forbindelse, karakterisert ved formel I: der A er (CH2)n der n er 1-6; R, er Ci-e-alkyl, R2 er hydrogen, Ci^-alkyl, fenyl-Ci-5-alkyl, E er der: m er 1-5; R3 er oksygen, og den stiplede linje betyr en binding, R4 er oksygen, hydrogen eller Ci.5-alkoksykarbonyl, der, hvis R4 er oksygen, den stiplede linje betyr en binding, og hvis R4 er en hvilken som helst annen substituent, den stiplede linje er fraværende; og farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved R| er Ci-e-alkyl, n er 2-4 ogRz er hydrogen eller Ci-e-alkyl.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R3 er oksygen og R4 er hydrogen, Ci-5-alkoksykarbonyl eller oksygen.

4. Forbindelser ifølge krav 3, karakterisert ved atR4er hydrogen og E er

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at mer 2-5.

6. Forbindelse og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen omfattende N-[etyl-2-(2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin-4-yl)]-[ 1 '-(2-oksy-piperdinyl)]-acetamid, N-[etyl-2-(2-iso-propyloksyfenyI)-piperazin-4-yl)]-N-metyi-[l '-(2-oksy-piperdinyl)]-acetamid, og N-[propyl-3-(2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin-4-yl)]-[r-(2-oksy-piperdinyl)]-acetamid.

7. Forbindelse, karakterisert ved at den er N-[etyl-2-(2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin-4-yl)]-[l '-(2-oksy-piperdinyl)]-acetamid og farmasøy-tisk akseptable salter derav.

8. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel.

9. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 6 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel.

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 8 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel.

11. Forbindelse, karakterisert ved formel II der A er (CH2)n der n er 1-6; Ri er C2-6-alkyl, R7 er hydrogen, BOC eller CBZ.

12. Forbindelse ifølge krav 11, karakterisert ved atner 2-4 og Ri er forgrenet C2-6-alkyl.

13. Forbindelse ifølge krav 11, karakterisert ved at R7 er hydrogen eller BOC.

14. Forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen 1 -(2-aminoetyl)-4-(2-2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin, 1 -(3-aminopropyl)-4-(2-2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin, og 1 -(4-aminobutyl)-4-(2-2-iso-propyloksyfenyl)-piperazin.

15. Forbindelse, karakterisert ved at den er 1-(aminoetyl)-4-(2-2-iso-propyloksyfenyI)-piperazin.

16. Forbindelse, karakterisert ved formel HJ der m er 1,3,4 eller 5.

17. Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at mer 3-5.

18. Forbindelse, karakterisert ved at den er 1-t-butoksy-karbonylmetyl-2-piperidon.