NO312163B1 - Voksestere anriket i <omega>-3 umettede fettsyrer, deres fremstilling og deres anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører sammensetninger av voksestere anriket med co-3 umettede fettsyrer, anvendelse som derav, samt diett-ernæringsintegratorer som inneholder dem.

Navnet "voks" betyr vanligvis en bred klasse lipider, som er karakterisert mer i henhold til deres fysiske trekk enn i henhold til deres kjemiske struktur. Generelt er et materiale klassifisert som en voks når det ser ut som bikake materiale.

Derimot, fra et strengt kjemisk synspunkt, er vokser spesielle karboksylestere (voksestere) . De er nemlig estere av langkjedede alifatiske syrer (fettsyrer) med lang-kjedede alifatiske alkoholer. Både syrer og alkoholer kan enten være mettede eller umettede. En full beskrivelse av natur og karakteristikker av voksestere kan bli funnet i en ar-tikkel av P.E. Kolattukudy, "Chemistry and Biodhemistry og Natural Waxes", Elsevier (1976), Amsterdam.

Utgangstmaterialet for anvendelse i fremstillingen av produkter beskrevet heri er en blanding av estere anriket med co-3 umettede fettsyrer. Denne blanding er vanligvis oppnådd ved nåværende industrielle fremgangsmåter fra naturlige kilder slik som fiskeolje, inneholdende en relativ høy mengde flerumettede ©-3 fettsyrer, slik som EPA (eikosapentaensyre) og DHA (docohexaensyre) . I en vanlig fremgangsmåte, splittes fiskeolje triglyserider ved behandling med lavt-kokende alkoholer i nærvær av en katalysator. Etter fjerning av glyserol, blir de derved oppnådde estere videre anriket med ©-3 umettede fettsyrer ved noen teknikker, slik som destillasjon og urea-fraksjonering.

Metyl- og etylestere, anriket med EPA og DHA, sammen med naturlige eller syntetiske triglyserider, og frie fettsyrer også anriket med EPA og DHA, har vært formene hittil til-gjengelige for materialer anriket med co-3 flerumettede syrer, for anvendelse som både farmasøytiske midler og mat-integratorer.

Disse formene har alvorlige ulemper, hovedsakelig på grunn av deres tendens til å oksidere. Disse produkter harskner lett når utsatt for luft. Oksidasjons-biprodukter, selv ved et lavt innhold, gjør hovedmaterialet luktende, irriterende og ufyselig, slik av dette ikke lett kan håndteres eller anvendes.

Fra et teknologisk ståsted derimot, ér flerumettede fettsyrer, deres glyserider, og deres estere med lavt-kokende alkoholer tykke oljeaktige væsker, så de er vanskelige å formulere. Den beste løsning anvendt hittil er å formulere dem i myke gelékapsler, men heller ikke denne utvei er i stand til å fjerne ubehageligheter slik som raping etter nedsvel-ging.

Overraskende har det blitt funnet at voksestere beskrevet heri lett kan overvinne disse vanskeligheter. Produkter beskrevet heri er lette å håndtere fordi de er faste og min-dre utsatt for oksidasjon. Likevel forblir de biologiske egenskaper de samme som i tilfellet av alle de oljederiva-ter nevnt over. Overraskende er det faktisk oppdaget at voksestere anriket med ©-3 flerumettede fettsyrer er mye lettere absorbert og metabolisert enn naturlige påtrufne voksestere, ved et lavt innhold av co-3 fettsyrer.

Denne oppfinnelse vedrører således en sammensetning av voksestere av co-3 flerumettede fettsyrer, særpreget ved at den har et innhold av acylrester av docohexaensyre og/eller eikosapentaensyre høyere enn 12% og 18% henholdsvis. Ytterligere trekk er angitt i kravene 2-4.

Produkter beskrevet heri er faste voksmaterialer, slik at oksidasjon er begrenset kun til overflatelaget. Derfor kan de formuleres på forskjellige måter, bevarende deres biologiske og organoleptiske egenskaper.

Fordelaktige effekter av co-3 fettsyrer, spesielt av EPA,

og DHA, er velkjente for patologi som berører kardio-sirku-

lasjonssystemet (trombose, aterosklerose, blodplate hyperaggregering , nyperlipidemi, hyperkolesterolemi) , samt for patologi som berører immunsystemet, i inflammatoriske tilstander, og i tumorer. Dessuten har effektene av mangel på diett-DHA blitt beskrevet (Tacconi M.T., Lligona L., Salmona M., Pitsikas M., og Algeri S., Neurobiol. of Aging, 12:55-59, 1990).

Denne oppfinnelse vedrører derfor også anvendelsen av sammensetningen som angitt i krav 5 og diett-ernæringsindi-katorer som angitt i krav 6 og 7. Voksestere beskrevet heri kan også anvendes i fremstillingen av legemidler som passende kan anvendes i de ovennevnte patologier, samt i fremstillingen av dietetiske og ernærings formuleringer.

Voksestere beskrevet heri er fremstilt fra en blanding av estere av frie fettsyrer anriket med flerumettede fettsyrer, hvor alkoholdelen vanligvis er metyl- eller etylalko-hol, eller mer generelt, en lavt-kokende alkohol. Denne blanding reageres med en eller flere alkoholer via en transesterifiserings-reaksjon, forutsatt at disse alkoholer er de samme som funnet i naturlige voksestere, i henhold til det følgende skjema:

hvori

R: rest av en co-3 umettet fettsyre,

R": metyl, etyl, eller en lavt-kokende alkoholrest, R' : rest av en alkohol inneholdt i naturlige voksestere .

For R er EPA og DHA rester foretrukket. For R" er metyl og etyl fortrukket. Til slutt for R' er rester av mettede alkoholer foretrukket, med et antall karbonatomer varierende fra 12 til 40. En annen foretrukket alkohol er olenyl-alkohol.

Det ovennevnte skjema er ikke restriktivt, fordi en blanding av estere RCOOR" simultant kan reageres med en blanding av alkoholer R'OH, gitt at, som nevnt over, blandingen representert ved formel RCOOR" er anriket med co-3 umettede fettsyrer, dvs. f.eks, når RCOOR" representerer esterne av EPA og DHA, disse er inneholdt i denne blanding i prosent-deler høyere enn 18% og 12% henholdsvis, tilsvarende pro-sentdelene av disse to syrer vanligvis funnet i naturlige produkter.

Optimalt utføres reaksjonen ved å starte fra omtrent stø-kiometrisk mengde av reagenser, og den er katalysert av ba-ser, i henhold til prosedyrer vanligvis valgt for transe-sterifiseringer. Produktet oppnås med det høyeste utbytte når lavt-kokende alkohol R"OH fjernes som et reaksjonspro-dukt ved destillering under redusert trykk.

Etter fullførelse, behandles reaksjonsblandingen med varmt vann inneholdende små mengder av en syre, fortrinnsvis sitronsyre, for å kjøle og fjerne katalysatoren, sammen med små spor av såpe dannet under reaksjonen. Videre tilsetting av varmt vann separerer voksesteren som en smeltet flytende fase, som tillates å separere og å stivne.

Voksestere beskrevet ved denne oppfinnelse kan omkrystalli-seres i små hvite nål-formede krystaller. De kan også ren-ses uten noen krystallisering, ved enkelt å gjenta vaskin-gen av oljefasen med litt mer vann og sitronsyre. Produktet derved oppnådd kan gjennomgå en sluttbehandling med lukt-fjerning, for å fjerne biprodukter fra oksidering, i henhold til fremgangsmåter vanligvis anvendt i ernaeringsol je-teknologi.

I henhold til fremgangsmåten derved beskrevet, er innholdet av co-3 umettede fettsyrer i slutt-voksesteren det samme som i utgangsblandingen av estere, som vist av analysen av syredelen oppnådd ved hydrolyse av voksestere. Transesterifiserings-reaksjon er den best egnede fremgangsmåte for å oppnå voksestere høyt anriket med flerumettede fettsyrer, men også andre reaksjoner kan gi de samme produkter, ved å starte både fra estere anriket med flerumettede syrer og fra frie fettsyrer oppnådd ved hydrolyse av disse estere. Noen av disse reaksjoner kan nevnes, slik som direkte esterifisering av frie fettsyrer med alkoholer, behandling av alkoholer med respektive derivater av syrer, slik som anhydrider, klorider, isopropenylestere osv., in-teresterifisering av enten metyl- eller etylestere av fettsyrer med enten eddik- eler propionestere av langkjedede alkoholer.

Voksestere beskrevet heri er mer stabile mot luftoksidasjon enn utgangseterne, som vist ved parallellbestemmelsen av peroksidtall, gjort ved økende tidsrom, av en prøve av etylester anriket med EPA og DHA og den tilsvarende voksester, når begge prøver ble tillatt å stå i en åpen beholder. Etter en uke med utsettelse for luft, økte peroksidtallet fra fem til syv ganger mer i tilfellet av etylestere enn i tilfellet av voksestere; verdier ble rettet på grunnlag av den faktiske vekt av flerumettede fettsyrer i den molekylære

formel av etylestere og av voksestere.

Lignende resultater ble oppnådd ved å overvåke dannelsen av formaldehyd som et oksidativt biprodukt. Tester ble utført i henhold til Wilbur et al., Arch.Biochem.Biophys, 24:305,1949 som modifisert av Kikugawa et al. Anal.Biochem. 202:249, 1992 og de er rapportert i tabell 1.

For absorpsjon og biotransformasjon av voksestere beskrevet av denne oppfinnelse, er det funnet at disse forbindelser er godt absorbert og at de faktisk er metabolisert, i mot-setning til det beskrevet i tilfellet av naturlige voksestere, som ikke er anriket med flerumettede fettsyrer.

Fordøyelsesevne av produktene beskrevet av denne oppfinnelse ble testet i in vitro eksperimenter. Etter fordøyelse med pankreas lipase, ble hydrolysen av voksestere overvåket på grunnlag av dannelse av både de alkohole og de syrlige deler. Som en referanse ble jojobaolje anvendt, som er en naturlig olje inneholdende en syredel hvor monomettet fettsyre er i hoveddel, og en alkohol del inneholdende alminne-lige mettede kjeder. Tynnskjikt kromatografi analyser viste klart at voksestere anriket med co-3 umettede fettsyrer ble omtrent fullstendig hydrolisert til deres bestanddeler bare etter 6 timer, mens jojobaolje forble omtrent ureagert.

In vivo tester ble utført på rotter behandlet med en enkel dose med 5 g/kg voksestere (akutt behandling) . Dyr ble de-struert 6 og 16 timer etter behandlingen. Resultatene er rapportert i tabeller 2 og 3.

Tabell 2 viser at plasma triglyserider har økt, i sammenligning med ubehandlede dyr, ved begge tidsrommene etter behandlingen. Tabell 3 viser klart at plasmaen av behand-lede dyr var tydelig anriket med EPA og DHA 6 timer etter behandling, i sammenligning med ubehandlede dyr. Ingen ef-fekt er synlig etter 16 timer etter behandlingen, antagelig på grunn av den raske metabolisme av lipider.

En protokoll ble også anvendt for å studere effektene av en kronisk behandling. Med en dose på 0,3 g/kg gjentatt i 15 dager, ble ingen forandring i vekten av dyrene oppdaget. Matforbruk minsket litt, mens intestinal gjennomgang ikke var forandret, som vist i tabell 4. Disse resultater er i skarp kontrast med resultater beskrevet i tilfellet av naturlige vokser, hvor flerumettede syrer ikke er hovedbe-standdeler av den syrlige del (se artikkelen sitert over, av P.E. Kolattukudy) . In vivo tester er i overensstemmelse med in vitro resultater og alle forsterker beviset at an-rikning av voksestere med co-3 umettede syrer resulterer i fullstendig absorpsjon og fordøyelse. Som en konklusjon, viser både studier in vivo og in vitro effektiviteten av produktene beskrevet ved denne oppfinnelse som en kilde for co-3 umettede fettsyrer, like god som andre nåværende produkter på markedet. I tillegg, motsatt av hva som er tilfellet med nåværende produkter tilbyr disse nye produkter mange fordeler fra et teknologisk og formulering synspunkt.

Noen formulerings-aspekter, som vedrører kun produktene beskrevet heri, fortjener å bli nevnt. For eksempel kan voksestere sprøytes i smeltet form og injiseres i kalt vann, hvor dråpene av produktet stivner i form av små kuler med en forhåndsbestemt radius. Fremgangsmåten kan utføres med vann behandlet med salt og naturlige dufter, for å oppnå syntetisk kaviar.

Som et alternativ kan voksestere absorberes på en fast matrise (mel, kli, partikler, osv.) for å oppnå mat anriket med co-3 umettede fettsyrer.

I det farmasøytiske område, kan produkter beskrevet i denne oppfinnelsen formuleres ved å anvende konvensjonelle eksi-pienter og teknikker, slik som beskrevet i "Remington's Pharmaceutical Science Handbook" Mack Publishing Company, New York, USA.

Derfor vedrører denne oppfinnelse også dietetiske og farma-søytiske formuleringer inneholdene voksestere anriket med ©-3 umettede fettsyrer som kan oppnås i henhold til frem-gangsmåtene beskrevet heri.

Følgende eksempler som rapporterer fremstillingen av noen voksestere anriket med cd-3 umettede fettsyrer, forklarer oppfinnelsen i bedre detalj.

Eksempel 1. 25 g av en anriket fiskeolje-ester (forsåpningsverdi = 170 mg KOH/g, gjennomsnittlig molekylvekt 330, EPA 33%, DHA 22% som fra gasskromatografisk areal prosent-analyse) ble blandet med 25 g behenylalkohol (molekylvekt 326) . Blandingen ble behandlet med 0,3 g natrium-metoksid og kolben ble koblet til en vakuum-pumpe (40 bar) . Tempera-turen ble hevet opp til 120°C. Den omrørte blanding mørk-net, ettersom etanol begynte å koke ved ca. 80°C. En tempe-ratur på 120°C ble beholdt i en halv time. Under denne tid sluttet etanolutvikling omtrent. Blandingen ble deretter avkjølt til 40°C, deretter ble vakuumet fjernet ved å fylle kolben med nitrogen. Væskeblandingen ble helt i en 1% van-dig løsning med sitronsyre (200 ml) omrørt under nitrogen ved romtemperatur. Omrøring ble opprettholdt i fem minutter ved romtemperatur, deretter ble blandingen, fortsatt under omrøring, avkjølt til 5°C, hvorved krystallisering oppstod. Det faste materialet ble filtrert under vakuum, vasket med vann på filteret, og omkrystallisert fra 400 ml aceton. Etter avkjøling av blandingen ved -10°C i en time ble det hvitaktige krystallinske produkt filtrert under vakuum og tørket under redusert trykk over natten ved romtemperatur. Utbytte: 42,5 g (89%) . Produktet gir en ren flekk i TLC (silikagel plater, elueringssystem; n-heksan-etyleter 9:1, R£ = 0,87, hvor R£ av utgangs-etylester = 0,75, Rf av behenylalkohol = 0,11). Smeltepunktet for voksen var 47°C.

Eksempel 2. Den samme etylester av eksempel 1 (33 g) ble reagert med 27 g stearylalkohol (molekylmekt 270) . Reaksjonsbetingelser var de samme som for eksempel 1. Utbytte: 43,5 g (67,5%), etter krystallisering fra 200 ml aceton. En klar flekk i TLC ble oppdaget (silikagel, m-heksan-etyleter 49:1, Rf = 0,23) . Ved å legge dette produkt oppå produktet av eksempel 1, kan ingen separasjon observeres. Smeltepunkt: 39°C.

Eksempel 3. 25 g av en etylester anriket med EPA (74% EPA), uten DHA, forsåpningsverdi: 170, gjennomsnittlig molekylvekt 330) ble reagert med 25 g behenylalkohol, Reaksjonsbetingelser var de samme som for eksempel 1. Produktet oppnådd fra vann var ikke helt løselig selv i store mengder varm aceton, så det ble filtrert ettersom det var en smeltet fase gjennom et papirfilter og tørket under redusert trykk. Utbytte: 39,4 g (82,7%). Smeltepunkt: 40°C.

Eksempel 4. 25 g etylester (det samme som i eksempel 1) ble reagert med 16,2 g 1-tetradecanol (molekylvekt 214). Reaksjonsbetingelser var de samme som for eksempel 1. Etter å ha helt blandingen i syrlig vann ble oljefasen vasket to ganger ved 45°C med 100 ml vann. Etter separering ble oljefasen tørket under redusert trykk. Utbytte: 35 g (90%). Smeltepunkt: 23°C. Tynnsjikt-kromatografi viste en ren

flekk, med samme Rf som produktene i eksemplene 1, 2, og 3.

Eksempel 5. 33 g av den samme etylester som i eksempel 1 (33% EPA, 22% DHA) ble reagert ved samme fremgangsmåte som eksempel 1 med 24 g 1 hexadecanol (cetylalkohol). Faststof-fet filtrert fra vann ved 3°C ble omrørt i 50 ml kald aceton (ved -10°C) i en halv time, deretter ble det filtrert under vakuum og tørket under redusert trykk. Utbytte 47 g (89%). Smeltepunkt 31°C.

Eksempel 6. 33 g av den samme etylester som i eksempel 1 ble reagert med 29 g 1-eikosanol. Etter samme fremgangsmåte og samme opparbeidelse som eksempel 1 ble 42 g voksester oppnådd (75%). Smeltepunkt 43°C.

Eksempel 7. Samme fremstilling som beskrevet i eksempel 2 ble gjentatt. Krystallisering fra aceton ble omgått, men råproduktet oppnådd etter separasjon av den smeltede voks fra varmt vann ble vasket igjen ved samme fremgangsmåte. Et produkt ble oppnådd, med samme smeltepunkt og samme renhet som det beskrevet i eksempel 2. Utbytte økte til 96%.

Alle prøver (eksempler 1-7) ble utsatt for hydrolyse i henhold til betingelsene beskrevet for analysene av naturlige voksestere (Linskens, H.J. og Jackson, I.J., Essential Oils and Waxes, Springler Verlag, Berlin (1991)), fulgt av den riktige opparbeidelse og analyse av sammensetningen av den frie fettsyredel. Analyser viste det samme EPA og DHA innhold i voksesterne som i esterne anvendt som utgangsmateri-ale.

Eksempel 8. Fordøyelsestest. Effekten av pankreas lipase på voksestere har blitt bekreftet i henhold til metoden av Neumann (U. Neumann, P. Kaspar, og J. Ziegenborn, "Methods in Enzymatic Analysis", Bergmayer HV, 1984, vol.4, s.34-36) . 800 mg voksestere anriket med co-3 flerumettede fettsyrer, og i parallell for sammenligning, 800 mg jojobaolje ble inkubert i en Tris buffer 0,125 M, pH 9,2, inneholdende menneske-pankreas lipase, colipase, og deoksykolisk syre i forskjellige tidsrom ved 37°C. Etter ekstraksjon av lipider, ble deler av organiske faser inneholdende lipider tør-ket og lagt ned på en silikagel TLC-plate med konsentra-sjonsbånd. Plater ble eluert med n-hexan-etyleter-eddiksyre 80:20:1. Flekker ble gjort synlige ved utsettelse både for jod og for påsprøytet svovelsyre.

Claims (7)

1. Sammensetning av voksestere av co-3 flerumettede fettsyrer, karakterisert ved at den har et innhold av acylrester av docohexaensyre og/eller eikosapentaensyre høyere enn 12% og 18% henholdsvis.

2. Sammensetning i henhold til krav 1, karakterisert ved at alkoholdelen av voksesterne er valgt fra gruppen bestående av behenyl, stea-ryl, tetradec-l-yl, cetyl, eikos-l-yl, oleylalkohol.

3 . Sammensetning i henhold til krav 1, karakterisert ved at den er for anvendelse som et medikament.

4. Sammensetning i henhold til krav 3, karakterisert ved at den er for anvendelse i behandling av kardiosirkulasjons-sykdommer, trombose, blodplate hyperaggregering, hyperlipidemi, hyperkolesterolemi, inflammasjon, kreft, immunsystem-sykdom.

5. Anvendelse av sammensetningen i krav 1 som diett-ernæ-ringsintegrator.

6. Diett-ernæringsintegratorer , karakterisert ved at de inneholder sammensetningen i krav 1.

7. Diett-ernæringsintegratorer i henhold til krav 6, karakterisert ved at de er i form av mi-krokuler eller absorbert på en fast matrise anvendt som mat.