NO180271B - Immunoglobulin, fremgangsmåte til dets fremstilling og anvendelse av immunoglobulinet - Google Patents

Description

Ervervet immundefektsyndrom (acquired immune deficiency syndrome eller AIDS) er nå å anse som en kritisk situasjon innen offentlig helsevesen. Pr. desember 19 86 hadde sykdommen rammet mer enn 27700 amerikanere, hvorav halvparten nå er døde, og ingen har ennå blitt frisk fra sykdommen.•Mellom 1 og 1,5 millioner amerikanere er sannsynligvis blitt infisert med human immundefektvirus (HIV), årsaken til AIDS. Minst 20-50% av de som er infisert vil utvikle AIDS. USA's offentlige helsevesen spår at ved slutten av 1991 vil mer enn 179000 personer ha bukket under for sykdommen. Der er for tiden ingen virksom behandling, og en vaksine vil kreve minst 5 år å uvikle. Se Chem. Eng. News (8. desember 1986), pp 7-14.

Virkningen av infeksjon med HIV synes å variere. AIDS i seg selv er en alvorlig defekt i immunsystemet, kjennetegnet ved et vidt område av hva som er kjent som opportunistiske infeksjoner

- de som forårsakes ved mikroorganismer som sjelden forårsaker sykdom i individer med normale immunsystemer - og kreft som resulterer fra immundefekt. De fleste individer som er infisert med viruset, forblir asymptomatiske over forskjellige tidsrom. Der er imidlertid et økende antall infiserte pasienter som oppviser en tilstand kjent som AIDS-relatert kompleks (ARC), som er kjennetegnet ved feber, diaré og oppsvulmede lymfe-knuter. ARC er nå vidt ansett for uunngåelig å utvikle seg til

AIDS.

I motsetning til mange andre virusinfeksjoner hos mennesker, signaliserer ikke antistoffsyntese mot HIV at infeksjonen fjernes. Lenge etter at de er blitt infisert med den kan HIV fortsette å være isolert fra mange seropositive personer. Lentivirusene som infiserer andre dyr er kjent for å bevirke infeksjoner som vedvarer hele levetiden hos den infiserte vert. Uheldigvis synes det som om HIV på samme måte kan opprette en vedvarende livslang infeksjon i mennesker. Nærværet av antistoffer mot HIV i serumet er således ikke noe tegn på immunitet, men snarere, i de fleste tilfeller, er det en indikasjon på pågående inf eks j oi:. Videre er antistoffer som kan nøytralisere HIV in vitro blitt funnet i noen individer i løpet av deres infeksjon med HIV. Disse nøytraliserende antistoffer er blitt identifisert ved analyser som omfatter blanding av cellefri virus med serum oppnådd fra infiserte givere og deretter evaluering av infektiviteten av denne blanding på mottagelige målceller.

For eksempel, M. Robert-Guroff og R.C. Gallo (europeisk patentsøknad nr. 19 3 284) undersøkte HIV-infeksjonen av H9-klonen av HT-cellelinjen ved måling av ekspresjonen av HIV-kjerneprotein p24 ved bruk av indirekte immun-fluorescens-analyse. Ved tre dagers post-infeksjon var ca. 80% av de H9-celler som var inkubert med HIV på forhånd behandlet med serum fra en frisk, normal giver infisert, som antydet ved p24-ekspresjon. I motsetning til dette uttrykte bare 10% av H9-celler p24 på dag tre når de var utsatt for virus som var blitt forbehandlet med serum oppnådd fra en pasient med ARC. Nøytraliserende antistoffer ble påvist i 60% av voksne AIDS-pasienter og i 80% av voksne med ARC, men ikke i friske, heteroseksuelle sammenligningssubj ekter. Forskerne karakteri-serte imidlertid ikke ytterligere de forskjellige sera med hensyn til bindingskarakteristikker for antistoffene, men spekulerte bare over at de nøytraliserende antistoffer kan ha som et mål de viktigste kappeproteiner av HIV, f.eks. gp41 og gpl20.

Det er imidlertid ennå ikke kjent om immunresponsen hos slike infiserte individer kan beskytte dem mot å utvikle ytterligere immunologisk skade. Skjønt visse forandringer i mønsteret av seriologisk reaktivitet med spesifikke HIV-proteinkomponenter i løpet av progresjonen fra infeksjon til sykdom, er hittil ingen spesielle mønstre blitt funnet som korrelerer hverken med beskyttelsen av helse eller utvikling av sykdom.

I en undersøkelse brukte J. Goudsmit et al., J. Infect Diseases, 155, 558 (1987) rekombinant-HIV-kjerne og kappe-antigener for å påvise antistoffer til disse proteiner i serumet hos givere som oppviste forskjellige stadier av HIV-infeksjon. De påviste antistoffer for HIV-kappeantigen i alle de sera som ble testet, mens fem av de seks pasientene med AIDS ikke hadde noe påvisbart antistoff for kjerneantigen. 11 av de 13 andre subjekter hadde imidlertid påvisbare antistoffer for dette protein. HIV-antigen ble også analysert ved bruk av fastfase-immunanalyse og funnet å foreligge i alle syv serumprøver hvor antistoff overfor kjernen var fraværende. Antigenet ble ikke påvist i noen av de 12 serumprøver som inneholdt antistoff overfor kjernen. Skjønt Goudsmit et al. som en spekulasjon antydet at fravær av antistoff mot kjerne-HIV-protein og nærværet av HIV-antigener i asymptomatiske individer kan forutsi fremtidig klinisk sykdom, analyserte de ikke noen av serumprøvene for HIV-nøytraliserende aktivitet.

En side ved immunresponsen som er kritisk for anstrengelse for å utvikle vaksine, er den mulige eksistens av en spesiell antistoffrespons for HIV som kan hindre, begrense eller eliminere infeksjon ved viruset. Slike antistoffer vil fungere som nøytraliserende antistoffer in vivo, og et viktig mål for kandidater for vaksineimmunogener er å frembringe disse typer antistoffer.

Der er derfor et behov for metoder til å identifisere og oppnå antistoffer som er HIV-spesifikke i den grad at de er virk-ningsfulle for behandlingen og/eller forhindringen av AIDS.

Det er generelt antatt at det at man ikke kan isolere HIV fra alle infiserte personer, skyldes tekniske begrensninger i de foreliggende T-lymfocytt-dyrkningsmetoder og uttynning av målceller i fremskredne stadier av sykdommen. Søkerne har imidlertid oppdaget at et asymptomatisk undersett av infiserte personer eksisterer, som har utviklet antistoffer som reaksjon på HIV, som er effektive når det gjelder å nøytralisere HIV, i den utstrekning at HIV ikke kan dyrkes fra serumet fra disse personer og HIV-markør-antigener ikke kan påvises i serumet ved noen av de tilgjengelige vevskultur- og immunanalyse-metoder. Disse individer kan anses å være frie fra påvisbar replikerende virus i den grad denne tilstand kan bestemmes ved fremgangs-måter tilgjengelige for fagfolk. Den foreliggende oppfinnelse er derfor basert på identifisering av disse individer og isolering av en blodfraksjon som inneholder disse antistoffer

(heretter betegnet som HIV-hyperimmunt globulin eller "HIVIG")

og bruken av HIVIG for å nøytralisere HIV-infektivitet in vitro.

Den følgende oppfinnelse skaffer derfor et HlV-spesifikt immunglobulin som produseres ved en fremgangsmåte omfattende (a) identifisering av en human giver som er klinisk frisk og hvis plasma: (i) oppviser et anti-HIV p24 antistoff-titer på minst ca. 128; (ii) er HIV p24 negativt ved enzym-immunanalyse; (iii) er HIV-kultur negativt; (iv) har en T4 lymfocyttelling på minst ca. 400/ml blod;

og

(b) isolering av en prøve av immunglobulin fra blodet av den nevnte giver som har et HIV-nøytraliserende titer på anti HIV p24 antistoffer som er effektive til å nøytralisere infektiviteten av HIV in vitro.

Asymptomatiske individer utsatt for HIV er blitt identifisert som oppviser påvisbare antistoffer for HIV p24 kjerneproteinet, mens de ikke oppviser påvisbart HIV-antigen. Se J. Goudsmit et al., referert til ovenfor. Man har imidlertid ikke vært klar over at visse av disse individer kan skaffe en kilde til immunglobulin som er ekstremt høyt i HIV-nøytraliserende titer. Det HIV-nøytraliserende titer er minst ca. 8000 og fortrinnsvis er det så høyt som 15000 - 20000, helst er det større enn 50000, målt i en 5 vektprosent oppløsning i fysiologisk saltoppløsning ved den metodologi som er beskrevet nedenfor.

Både blodplasmaet hos giverindividet og det anti-HIV immunglobulin (IgG) som fås fra giveren, oppviser et høyt titer av antistoffer rettet mot HIV-kjerne p24 protein. Fortrinnsvis er anti-p24-titeret av giverens plasma minst ca. 128, fortrinnsvis er det ca. 256, helst ca. 512. Anti-p24-titeret av en 5 vektprosent oppløsning av IgG som fås fra giverens blod er minst er ca. 10000, fortrinnsvis ca. 15000 og helst ca.

30.000. Antistoff-titeret av IgG-blandingen med hensyn til viruskappeproteinene (gp41 og gpl20) er ikke kritisk for virkningen av det foreliggende IgG, da nærværet og titeret av antistoffer overfor disse HIV-proteiner oppvises av AIDS-pasienter inntil de dør.

Antistoff-titrene av p24 og gp41 bestemmes ved den konkurrerende immunanalyse som er utviklet av G.J. Dawson et al.

(J.P. Allain et al., Lancet, 1233-36, (1986)) og kommersialisert av Abbott Laboratories, Inc., North Chicago, IL, som "Abbott HTLV III Confirmatory EIA". (Se Technical Bulletin: "Human T-Lymphotropic Virus III Antigen (Env/Core) (Recombinant E. Coli)-EIA", (93-3704/R1 februar 1986)).

Analysen for HIV-p24-antigen utføres i henhold til den metodologi som er beskrevet av D.A. Paul et al., J. Cell Biochem., 10, (Suppl. A), 224 (Abstract D130) (1986) og kommersialisert av Abbott Laboratories, Inc., som "Abbott HTLV III Antigen EIA", som beskrevet i Technical Bulletin "Antibody to Human T-Lymphotropic Virus Type III (Human)" (83-2100/R2, november 1986). Uttrykket "blodkultur", slik det benyttes med henvisning til påvisningen av HIV i giverblod, utføres som beskrevet av R.C. Gallo et al., Science, 224, 500-502 (1984). Uttrykket "klinisk frisk", slik det her benyttes, betegner fraværet av symptomer på ARC eller AIDS i henhold til de kriterier som er opprettet av CDC (Centers for Disease Control, Atlanta, GA) (AIDS) eller den arbeidsdefinisjon som er utviklet av the National Institutes of Health AIDS Working Group i samarbeid med CDC. (Se Ebbesen et al., AIDS: a basic guide for clinicians, København: Munksgaard (1984), side 234) (ARC). Fortrinnsvis vil T^lymfocyttallet (lymphocyte count) hos giveren være minst ca. 400 celler pr. ml blod, helst ca. 600.

Evnen til å nøytralisere HIV-infektivitet in vitro med HIVIG som inneholder et høyt titer av antistoffer for HIV-kjerne-virusproteinet p24, kan skaffe grunnlaget for analyser for virkningen av noen prototype HIV-vaksiner og vil også være nyttig i grunnleggende undersøkelser i mekanismene for HIV-infeksjon, f.eks. med hensyn til virkningen av mutasjoner på produktene av virusgenekspresjon.

Det skal forstås at den foreliggende kilde til HIVIG nødvendig-vis er givere som tidligere er blitt utsatt for HIV. Utvik-lingen av en stort sett lignende antistoffprofil i friske subjekter etter deres inokulering med vaksiner som fås fra immunogene virusproteiner eller fragmenter derav, fortrinnsvis via rekombinant-virus-DNA, ventes imidlertid å skaffe er mer regulert kilde til HIVIG.

IgG ifølge oppfinnelsen isoleres fra sammenslått (pooled) plasma som fås ved plasmaferese fra utvalgte givere som er blitt utsatt for HIV, som ikke har noen betydelig aktiv virusreplikasjon. Giverne ble utvalgt fra en gruppe asymptomatiske sero-konverterte subjekter som senere oppviste de anti-HIV antistoff-profiler som er beskrevet nedenfor, mens de testet negativt for HIV-antigen. Plasmaet fra giverne kunne heller ikke infisere HIV-mottagelige celler.

Eventuelle forurensende vira i den sammenslåtte plasmaprøve kan inaktiveres ved alkoholfraksjonering. Morbidity and Mortality Weekly Report, 35, 231 (11. april 1986). IgG ble oppnådd fra plasmaet ved sentrifugalfraksjonering i nærvær av kald etanol (fra -10°C til 0°C) ved nøytrale pH-verdier (6,8-7,3). (Se E.J. Cohn, US-PS nr. 2 390 074 og 2 770 616). Det ønskede IgG kan også fås ved den styrte proteinfraksjoneringsmetode som er beskrevet av G.U. Bethel og R.M. Condie i US patentsøknad nr. 3 6 031. Den resulterende IgG-holdige pasta ble suspendert i et overskudd av destillert vann og lyofilisert ved en lavere temperatur enn 0°C for å fjerne resterende etanol.

IgG-produktet fortynnes fortrinnsvis med en farmasøytisk akseptabel flytende bærer, såsom et vandig IV-fluid, før det analyseres for bioaktivitet. Se Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, PA (16. utgave 1980), pp 1488-1496. Den resulterende oppløsning sterileres. f.eks. ved filtrering. Preservativer som vanligvis anvendes sammen med IgG-preparater såsom maltose, glycin eller

thimerosal, kan tilsettes i farmasøytisk akseptable mengder.

Oppfinnelsen skal beskrives ved henvisning til det følgende detaljerte eksempel.

EKSEMPEL - ISOLERING AV HØYTITER

ANTI- P24 IMMUNGLOBULIN ( HIVIG)

A. Immunanalvsemetodoloai

1. Påvisnin<g> av HlV- antiaen. Serumprøver ble analysert for HIV-antigen i en fastfase-immunoanalyse (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) som generelt beskrevet av J. Goudsmit et al., Lancet, 177 (1986). To hundre mikroliter prøve ble inkubert over natten ved værelse-temperatur (ca. 22°C) med en perle belagt med humanantistoff for HIV. Perler ble vasket med destillert vann, kanin-IgG-antistoff for HIV ble tilsatt og inkubert i 4 timer ved 45°C. Perler ble vasket som tidligere og deretter inkubert i 2 timer ved 45°C med pepperrot-perok-sidasekonjugert geit-antistoff overfor kanin-IgG. Etter en endelig vask ble perlene overført til rør og o-fenylen-diamin ble tilsatt. Etter 3 0 min i mørke ved værelsestemperatur ble 1 ml H2SO4 satt til hvert rør. A492 ble lest ved bruk av et kvantumspektrofotometer med dobbelt bølgelengde (Abbott Laboratories). En prøve ble ansett som positiv dersom dens OD var ^0,050 pluss gjennomsnittet av fem duplikater av normalt humanplasma. Prøven er mest

følsom for kjerneantigen for HIV, p24, og påviser antigen i kultursupernatant på IO<5> celler pr. ml HIV-infiserte HT-9-celler (uinfisert HT-9-cellesupernatant er negativ). Spesifisiteten for prøven bestemmes delvis ved kaninanti-stoffet som, når det anvendes på Western blot av renset HIV-lysat eller i RIPA-prosedyrer, påviser p55/24 (kjerne) sterkt og gpl20/41 (kappe) bare svakt. Renset, rekombinant kjerne av antigen er påviselig ved 5 0 pg/ml når det settes til serum eller plasma, mens renset, rekombinant kappe-

antigen er påviselig ved ca. 500 ng/ml. Kvantifisering av HIV-antigen ble utført ved sammenligning av optiske densiteter av prøvene med optiske densiteter av kjente mengder renset HIV-lysat. Ved bruk av dette antigen som referanse er påvisningsgrensen for denne analyse ca. 0,05 ng/ml.

2. Påvisning av antistoffer for HIV- kierne- oa - kappeproteiner. Antistoffer ble målt ved bruk av i handelen tilgjengelige enzym-immunoanalyser (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) som generelt beskrevet av J.P. Allain et al., Lancet, 1233-36 (1986). Kort fortalt, i det første system ble perler belagt med rekombinant HlV-kjerneantigen (inneholdende hele p24gag-genproduktet så vel som partier av pl5- og pl8-gag-genproduktene) inkubert med 5 0 ul av i serie dobbelt fortynnede serum-prøver (fortynnet i normalt humanplasma) og med 200 ul pepperrot-peroksidase-konjugert humanantistoff for HIV-kjerneantigen i 16-22 timer ved værelsestemperatur. Perler ble vasket med destillert vann og farge ble utviklet som beskrevet ovenfor for antigentesten. Fordi dette er en konkurrerende enzymimmunoanalyse var intensi-teten av den farge som ble dannet omvendt relatert til mengden av antistoff overfor HIV-kjerneantigen i prøven. Avskjæringspunktet ble bestemt som summen av den midlere negative sammenligningsprøve (n=3) og den midlere positive sammenligningsprøve (n=2), dividert med 2. Antistofftiter ble ansett som den høyeste fortynning ved hvilken A492 av prøven var mindre enn avskjæringen. Den samme fremgangsmåte gjaldt for analysen for antistoff overfor kappeantigen, men perler ble belagt med rekombinant HIV-kappeantigen (inneholdende hele p41env-genproduktet så vel som 45 aminosyrer fra gpl20env-genproduktet), og pepperrot-peroksidase-konjugert humanantistoff overfor HIV-kappen ble brukt istedenfor antistoff overfor kjernen. Merkede antistoffer i prøvene for antistoff overfor kjerne og antistoff overfor kappe ble fremstilt fra sera fra pasienter med høye titere overfor henholdsvis kjerne eller kappe på Western blot.

B. Vala av givere.

Serumprøver ble oppnådd fra 25 individer som tidligere hadde testet positive for HIV-antistoff. Nivået av anti-p24- og anti-gp41-antistoff ble målt ved Abbott Laboratories' kokur-rerende enzym-immunoanalyse beskrevet i seksjon A(2) ovenfor. gpl20-antistoffet ble påvist ved Western blot, men ikke kvantifisert. Se J.P. Allain et al., ovenfor. HIV-antigen ble testet for både ved dyrking og ved den immunoanalyse som er beskrevet i seksjon A(l) ovenfor. Av de 25 individene var 11 asymptomatiske og plasmaantigen negative, mens de oppviste forholdsvis høye HIV-antistofftitere. Tre av disse givere ble utvalgt som plasmagivere som alle var blod-HIV-kulturnegative og HIV-antigen-negative. De var klinisk friske med T4-lymfo-cyttall på £400 pr. ml. Giverne oppfylte kravene ifølge Code of Federal Regulations (21 CF.R. §§640.60-640.63 (1. april 1986))for kildeplasma, med den unntagelse at de var HIV-anti-stof f-positive . Giverne ble underkastet plasmaferese i henhold til CFR-kravene og plasma ble hurtigfrosset og lagret ved lavere enn 0°C inntil fraksjonert (21 C.F.R. §640.65 (1. april 1986)). Kriteriene for utvelgelse av disse tre givere var: giver JD oppviste et lavt titer av anti-gpl20, ikke-påviselig antistoff for p24 og moderat titer for gp41; giver MD oppviste et høyt titer for gp41 og gpl20 og et ikke-påviselig titer av anti-p24; og giver DE oppviste et høyt titer for gp24 og gpl20 og et lavt titer for gp41. Disse HIV-antistoffprofiler er oppsummert i tabell I nedenfor.

To enheter med plasma fra hver giver ble slått sammen for å gi en sammenslått prøve på ca. 120 0 ml. De tre separate sammenslåtte prøver ble fraksjonert ved fremgangsmåten angitt av Cohn et al., J. Clin. Invest., 23, 417 (1944). Den resterende etanol ble fjernet fra den resulterende "fraksjon II"-IgG-pasta ved lyofilisering og en 5,0 vektprosent IgG-oppløsning ble fremstilt fra pulverne ved oppløsning av disse i 0,9% saline. Oppløsningene ble filtrert gjennom 0,2 mikrometer sterile filtre og ble lagret under sterile betingelser før de ble testet for sin nøytraliserende aktivitet. Ingen preservativer eller stabiliseringsmidler ble tilsatt. Sammenligningspartiet (5% IgG) ble fremstilt fra IgG isolert fra givere som testet ikke-reaktive for HIV.

C_. Bestemmelse av nøvtraliserinasaktivitet

5% IgG-oppløsningene ble varmeinaktivert i 30 min ved 56°C, filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filter og fortynninger i rekkefølge ble utført i vevskulturmedia (RPMI - 1640 med 10% serum fra kalvefoster (FCS) supplert med penicillin og streptomycin). En halv ml av den fortynnede prøve ble blandet med 0,5 ml HIV (100 infektiøse enheter pr. ml) og inkubert ved 37°C med 5% CO2 i to timer. En halv ml kasseres og 4,0 ml H9-celler (5 x IO<5> celler pr. ml) tilsettes, og kulturene inkuberes ved 37°C med 5% CO2. Etter 5-7 dager ble 0,45 ml av kulturen fjernet og celler lysert med tilsetning av 0,05 ml 5% Triton X-100. Cellelysat.er ble målt for HlV-antigen med 5-7

dagers intervaller i en periode av 3 uker. HIV-antigen-konsentrasjoner ble bestemt ved fastfase-immunoanalyse (Abbott Laboratories, North Chicago, IL). Inhibering av HIV-replikasjon (nøytralisering) antydes ved optiske tetthetsverdier mindre enn analysesammenligningsprøven (normalt humanserum negativt for HIV-antistoff).

HIV-nøytraliseringstiteret er rapportert som den høyeste fortynning som gir en optisk densitetsverdi som er mindre enn analysesammenligningsprøven. Nøytraliseringstitere for 5% IgG-oppløsningene er angitt i tabell 2.

D. Diskusjon

Dataene angitt i tabell 2 viser at bare den IgG-oppløsning som fås fra giver DE-2 inneholdt en betydelig mengde anti-p24-antistoff og at bare denne oppløsning kunne nøytralisere HIV in vitro. Det er også tydelig at oppløsninger som inneholder store mengder anti-gp41- og anti-gpl20-antistoffer uten anti-p24 hadde liten eller ingen nøytraliserende virkning. Disse data sammen med serologiske profildata som ikke viser noen anti-genemi i nærvær av anti-p24-antistoffer, tyder på at anti-kjerneantistoffet og ikke anti-kappeantistoffet er en utmerket serologisk markør for å identifisere givere som kan skaffe nøytraliserende antistoffer. Det antas at HIVIG som fås fra asymptomatiske givere, som oppviser høyt titer med hensyn til anti-p24-antistoffer kan være nyttig in vivo for inhibering av progresjonen av HIV-infeksjon eller behandlingen av pasienter med ARC eller AIDS.

Claims (3)

1. Immunglobulin IgG preparat som omfatter anti-HIV p24 antistoffer på en titer som er effektiv til å nøytralisere infektiviteten av HIV in vitro, karakterisert ved at det er fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter (a) å identifisere en human giver som er klinisk frisk og hvis plasma: (i) utviser en anti-HIV p24 antistoff-titer på minst ca. 128; (ii) er HIV p24 negativ ved enzym-immunoassay; (iii) er HIV-kultur negativ; og (iv) har en T4 lymfocytt-telling på minst ca. 400/ml blod; og (b) å isolere en prøve av immunglobulin fra blodet til nevnte giver som har en HIV-nøytraliserende titer på anti HIV p24 antistoffer som er effektive til å nøytralisere infektiviteten av HIV in vitro.

2. Fremgangsmåte for in vitro nøytralisering av HIV, karakterisert ved at den omfatter å anvende en mengde av immunoglobulin IgG-preparatet som angitt i krav 1 i en farmasøytisk akseptabel bærer til HIV som er virkelig effektiv til å nøytralisere infektiviteten av HIV.

3. Anvendelse av immunoglobulin IgG-preparatet som angitt i krav 1 til fremstilling av en blanding for in vitro nøytrali-sering av infektiviteten til HIV.